Summary
Neuronale dendritische Morphologie liegt oft der Funktion zugrunde. Tatsächlich manifestieren sich viele Krankheitsprozesse, die die Entwicklung von Neuronen beeinflussen, mit einem morphologischen Phänotyp. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und leistungsfähige Methode zur Analyse intakter dendritischer Dornen und der dazugehörigen Stacheln.
Abstract
Die Gehirnaktivität, die elektrochemischen Signale, die zwischen Neuronen übertragen werden, wird durch die Konnektivitätsmuster neuronaler Netzwerke und durch die Morphologie von Prozessen und Unterstrukturen innerhalb dieser Neuronen bestimmt. Daher ist vieles von dem, was über die Gehirnfunktion bekannt ist, neben Entwicklungen in bildgebenden Technologien entstanden, die weitere Einblicke in die Organisation und Verbindung von Neuronen im Gehirn ermöglichen. Verbesserungen bei der Gewebereinigung haben eine hochauflösende Bildgebung dicker Hirnschnitte ermöglicht, was die morphologische Rekonstruktion und Analyse neuronaler Unterstrukturen wie dendritischer Dorne und Stacheln erleichtert. Gleichzeitig bieten Fortschritte in der Bildverarbeitungssoftware Methoden zur schnellen Analyse großer bildgebender Datensätze. Diese Arbeit stellt eine relativ schnelle Methode zur Verarbeitung, Visualisierung und Analyse dicker Scheiben von markiertem Nervengewebe in hoher Auflösung mit CLARITY-Gewebereinigung, konfokaler Mikroskopie und Bildanalyse vor. Dieses Protokoll wird die Bemühungen erleichtern, die Konnektivitätsmuster und neuronalen Morphologien zu verstehen, die gesunde Gehirne charakterisieren, und die Veränderungen dieser Eigenschaften, die in kranken Gehirnzuständen auftreten.
Introduction
Das Verständnis der räumlichen Organisation, der Konnektivitätsmuster und der Morphologie komplexer dreidimensionaler biologischer Strukturen ist für die Abgrenzung der Funktionen bestimmter Zellen und Gewebe unerlässlich. Dies gilt insbesondere für die Neurowissenschaften, in denen enorme Anstrengungen unternommen wurden, um hochauflösende neuroanatomische Karten des zentralen Nervensystems zu erstellen1,2. Eine genaue Untersuchung der Neuronen, aus denen diese Karten bestehen, ergibt unterschiedliche Morphologien mit Verbindungen und Orten, die die Funktion dieser verschiedenen Neuronensätze widerspiegeln3,4. Darüber hinaus kann die Untersuchung subzellulärer Strukturen, insbesondere dendritischer Stacheln, die Reife von Synapsen beeinflussen und dabei Entwicklungsprozesse und neurologische Krankheitszuständewiderspiegeln 5,6,7. Daher sind Ansätze, die die Bildauflösung und den Durchsatz verbessern, unerlässlich, um die Gehirnfunktion auf allen Ebenen besser zu verstehen.
Jüngste Fortschritte haben das molekulare und genetische Toolkit zur Markierung und Manipulation von Populationen von Neuronen erweitert. Die Entwicklung neuer fluoreszierender Marker, kombiniert mit neuen Methoden zur Einführung dieser Marker in Neuronen, ermöglicht eine differentielle Markierung von Populationen interagierender Neuronen innerhalb derselben Tier- oder Gehirnprobe8,9,10,11. Da Licht durch undurchsichtige Lipide gestreut wird und angesichts des hohen Lipidgehalts des Hirngewebes die Bildgebung neuronaler Populationen in erster Linie auf dünne Schnitte beschränkt war oder sich auf fortschrittliche mikroskropige Techniken (z. B. konfokale, Multiphotonen- und Lichtblattmikroskopie) stützte, um tiefe Strukturen abzubilden. Diese Bemühungen wurden jedoch durch Fortschritte bei den Gewebereinigungstechniken stark unterstützt. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) ist eine solche Technik, bei der interessante Gewebe mit Hydrogelmonomeren (Acrylamid und Bisacrylamid) infundiert und anschließend mit Reinigungsmitteln gewaschen werden12. Die Hydrogel-Monomere hybridisieren zu einem stabilen 3D-Hydrogel-Gerüst, das optisch transparent und durchlässig für Makromolekül-Etiketten ist. Nukleinsäuren und Proteine bleiben innerhalb der hybridisierten Matrix erhalten, während Lipide durch die Waschmittelwäschen entfernt werden (Abbildung 1). Dies führt zu einem stabilen Gewebe, das starr genug ist, um die ursprüngliche Form und Ausrichtung von Zellen und Nicht-Lipidmolekülen beizubehalten, während es optisch transparent genug ist, um tiefe Strukturen mit hoher Auflösung abzubilden. Diese Aufrechterhaltung der Gewebestruktur und -orientierung ermöglicht die Abbildung dicker Scheiben, wodurch Zell-zu-Zell-Verbindungen und räumliche Beziehungen erhalten bleiben. Da die Lage und Verfügbarkeit von Proteinen und Nukleinsäuren während des Clearingprozesses aufrechterhalten wird, können gereinigte Gewebe außerdem expressionsbasierte Marker sowie exogene Markierungen enthalten. Somit eignet sich CLARITY als potente Methode, um große Mengen tiefer Hirnstrukturen und die Verbindungen zwischen diesen Strukturen mit hoher Auflösung abzubilden.
Der Einsatz von CLARITY verbessert die Ansätze zur Bildgebung neuronaler Populationen erheblich. Diese Technik ist besonders geschickt bei der Erzeugung großer Mengen von Bilddaten. CLARITY funktioniert gut mit mehreren Formen der proteinbasierten Fluoreszenz. Dieses Protokoll verwendet einen lentiviral-basierten Ansatz, um Zellen mit EGFP und tdTomato spärlich zu markieren; Transgene Reporterallele, die tdTomato oder EGFP exprimieren, um Zellen für die Rekonstruktion zu markieren, wurden jedoch routinemäßig verwendet. Es ist wichtig, ein Fluorophor zu wählen, das sowohl lichtstabil als auch hell ist (z. B. EGFP oder tdTomato). Darüber hinaus führt die Verwendung eines starken Promotors zur Expression des Fluorophors zu einem überlegenen Kontrast und einer hervorragenden Bildqualität. Die Nachteile dieser Technik ergeben sich, da die richtige Analyse dieser großen Datenmenge sowohl arbeits- als auch zeitintensiv sein kann. Spezialisierte Mikroskope können dazu beitragen, den Durchsatz zu verbessern und die Arbeitsbelastung zu verringern. Der Bau, Besitz und /oder Betrieb fortschrittlicher Mikroskope ist jedoch für viele Labore oft unerschwinglich. Diese Arbeit stellt eine relativ schnelle und einfache Methode mit hohem Durchsatz dar, um große Mengen neuronalen Gewebes mit hoher Auflösung unter Verwendung von CLARITY-Gewebereinigung großer Abschnitte in Kombination mit konfokaler Standardmikroskopie zu visualisieren. Dieses Protokoll beschreibt diesen Ansatz durch die folgenden Schritte: 1) Sezieren und Vorbereiten des Nervengewebes, 2) Reinigen des Gewebes, 3) Mounten des Gewebes, 4) Abbildung der vorbereiteten Scheiben und 5) Verarbeiten von Vollschnittbildern mit Hilfe der Rekonstruktion und Analyse der Mikroskopie-Visualisierungssoftware (Abbildung 2). Diese Bemühungen führen zu hochauflösenden Bildern, die verwendet werden können, um Populationen von Neuronen, neuronale Verbindungsmuster, 3D-dendritische Morphologie, dendritische Wirbelsäulenhäufigkeit und -morphologie sowie molekulare Expressionsmuster in intaktem Hirngewebe zu analysieren.
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Protocol
Das folgende Protokoll folgt allen Tierpflegerichtlinien für das Baylor College of Medicine.
1. Dissektion und Gewebevorbereitung
- Die Maus mit einer Überdosis Isofluran einschläfern, indem Sie die Maus in einen geschlossenen Behälter mit einem mit Isofluran getränkten Handtuch legen (oder mit anderen IUCAC-zugelassenen Mitteln).
- Perfundieren Sie das Tier transkardiell mit einer 25 G Nadel mit 10 ml eiskaltem PBS, gefolgt von 10 ml 4% PFA.
- Sezieren Sie die Gehirnregion (oder das Gewebe) von Interesse.
- Legen Sie das sezierte Gewebe über Nacht bei 4 °C in 4% PFA. Die richtige Fixierung ist der Schlüssel für dieses Protokoll. Überspringen oder verkürzen Sie diesen Schritt nicht.
- Nach Fixierung in 4% PFA für mindestens 12 h wird das Gewebe für 24 h bei 4 °C in eine 4%ige Acrylamid-Hydrogel-Mischung überführt.
HINWEIS: Stellen Sie beim Auftauen des Hydrogels sicher, dass es nicht polymerisiert ist, dies kann passieren, wenn das Hydrogel zu warm wird. Auf Eis auftauen, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.
2. Gewebereinigung
- Legen Sie das Hirngewebe (noch in Hydrogel eingetaucht) für 3 h bei 37 °C mit einem Vakuum von -90 kPa in einen Vakuuminkubator. Lassen Sie die Rohroberseite abgeschraubt, damit sich das Vakuum richtig bilden kann.
- Waschen Sie das Gewebe mit PBS für 10 min bei Raumtemperatur (25 °C) mit sanftem Schütteln.
- Legen Sie die polymerisierte Gewebeprobe in die Elektrophoresekammer und beachten Sie die Ausrichtung des Gewebes in der Kammer.
- Füllen Sie die Kammer und das Reservoir mit dem mitgelieferten Elektrophorese-SDS-Puffer.
- Führen Sie die Probe bei 70 V, 1 A und 35 ° C mit konstantem Strom für etwa 2 h / mm Gewebe aus.
- Überprüfen Sie die Probe regelmäßig; Es kann mehr Zeit in der Kammer benötigen, um richtig zu löschen. Ein guter Ausgangspunkt für die Reinigung sind 1-2 h pro mm Hirngewebe. Ein ganzes Mausgehirn benötigt 8-10 h für eine ausreichende Reinigung. Denken Sie an die Ausrichtung der Probe, bevor Sie sie aus der Kammer nehmen, und stellen Sie sicher, dass Sie sie in der gleichen Ausrichtung wieder in die Kammer ersetzen.
HINWEIS: Abbildung 3A zeigt, wie ein vollständig gereinigtes Gehirn aussehen wird. Das Gehirn wird in diesem Stadium aufgrund des Vorhandenseins von gelöstem SDS undurchsichtig und nicht klar aussehen, aber nach der Lipidextraktion sollte es wenig bis gar keinen gelben Gewebefarbton geben.
- Überprüfen Sie die Probe regelmäßig; Es kann mehr Zeit in der Kammer benötigen, um richtig zu löschen. Ein guter Ausgangspunkt für die Reinigung sind 1-2 h pro mm Hirngewebe. Ein ganzes Mausgehirn benötigt 8-10 h für eine ausreichende Reinigung. Denken Sie an die Ausrichtung der Probe, bevor Sie sie aus der Kammer nehmen, und stellen Sie sicher, dass Sie sie in der gleichen Ausrichtung wieder in die Kammer ersetzen.
3. Vorbereiten und Montieren des gereinigten Gewebes
- Nachdem die Probe fertig geklärt ist und ausreichend klar aussieht, waschen Sie PBS über Nacht bei Raumtemperatur ein. Ersetzen Sie das PBS so oft wie möglich durch frisches PBS. Dieser Schritt ist entscheidend, um SDB-Reste zu entfernen, die in späteren Schritten Ausscheidungen bilden können.
- Nach der letzten Wäsche in PBS waschen Sie das Gewebe für 5 min in entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur dreimal. Das Gewebe wird bei diesem Schritt undurchsichtig und kann sich ausdehnen.
- Inkubieren Sie das Gewebe in der Brechungsindex-Matching-Lösung (siehe Tabelle 1) für mindestens 4 h bei Raumtemperatur. Abbildung 3B zeigt ein Stück gereinigtes Gewebe nach der Inkubation in Brechungsindex-Matching-Lösung.
- Konstruieren Sie während der Inkubation von Gewebe in Brechungsindex-Matching-Lösung eine geeignete Gehäusekammer, um die Probe bei Bedarf abzubilden.
- Aufbau einer Bildgebungskammer für kleine Gewebeproben/-scheiben
- Verwenden Sie einen Glasschieber als Basis für die Montage, legen Sie entweder Gummi- oder Kunststoffabstandhalter ab und sichern Sie ihn mit Sekundenkleber. Wenn vorgefertigte Abstandhalter nicht verfügbar sind, verwenden Sie Kunststoffringe aus konischen Rohrquerschnitten.
- Stellen Sie sicher, dass diese Teile ohne Löcher am Glasobjektträger befestigt werden (Abbildung 3C).
- Legen Sie das gereinigte Gewebe in die Montagekammer, die mit einer Brechungsindex-Matching-Lösung vorgefüllt ist.
- Montieren Sie das Gewebe sicher, indem Sie einen Glasdecker darauf legen und mit Nagellack versiegeln.
- Stellen Sie sich dieses Gewebe vor, indem Sie einen Tropfen Brechungsindex-matching-Montagelösung direkt auf das Glas geben.
- Große Gewebebildgebungskammer
- Konstruieren Sie diese Kammer, wenn das Gewebe größer als 5 mm dick ist (geeignet für ganze Gehirne oder Hemisphären).
- Platzieren Sie mit einer 10 cm großen Glasschale mit einer hohen Wand ein 50 ml großes konisches Rohr in der Mitte und stellen Sie sicher, dass der Durchmesser der konischen Glasscheibe groß genug ist, um den Lauf der verwendeten Objektivlinse aufzunehmen.
- Machen Sie 3% Agarose in Wasser und gießen Sie es in den Raum zwischen der Glasschale und dem konischen Rohr, lassen Sie es für 1 h abkühlen (Abbildung 3D). Dadurch bildet sich ein Ring aus fester Agarose (Abbildung 3E).
- Kleben Sie das Gewebe mit Sekundenkleber sicher auf den Boden der Kammer und füllen Sie die Kammer mit einer Brechungsindex-Matching-Lösung. Tragen Sie Klebstoff auf, um das Gewebe auf eine Region zu haften, die nicht abgebildet wird, um die Rückgewinnung des Gewebes aus der Schale zu ermöglichen, ohne die interessierenden Regionen zu beschädigen.
HINWEIS: Diese Zubereitung ist zeitkritisch, da die Brechungsindexmedien zu polymerisieren beginnen können, es sei denn, sie werden aus der Luft konserviert und bei 4 °C gelagert.
4. Bildgebung von freigegebenen Gewebeproben
- Erfassen Sie das Bild mit einer konfokalen Mikroskoppassform mit einem 25x/0,95 NA Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 4 mm.
- Schalten Sie alle relevanten Bildgebungsgeräte ein. Legen Sie die Probe auf die Bühne und legen Sie einen Tropfen Brechungsindex-Matching-Lösung auf die Oberseite der Montagekammer.
- Nähern Sie sich den Immersionsmedien vorsichtig mit dem Ziel und bilden Sie eine kontinuierliche Mediensäule.
- Finden Sie mit Hilfe der Epifluoreszenz ein geeignetes Bildgebungsfeld.
- Beginnen Sie mit der Bildaufnahme, indem Sie die entsprechenden Einstellungen testen.
- Legen Sie zunächst die Einstellungen für Auflösung und Scangeschwindigkeit unter Verwendung von Abbildung 4A als Richtlinie fest. Wenn Sie mit einem konfokalen Mikroskop fotografieren, schließen Sie das Loch vollständig, um den kleinsten optischen Schnitt und damit die beste Z-Auflösung zu erhalten.
- Erhöhen Sie allmählich die Laserleistung / Sensorverstärkung, bis ein geeignetes Bild mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis erhalten wird.
- Wenn Sie die standardmäßige EGFP/tdTomato-Zweifarbbildgebung verwenden, legen Sie die Einstellungen für die Lichtsammlung anhand von Abbildung 4B als Richtlinie fest.
- Stellen Sie die Z-Stack-Parameter basierend auf den beobachteten Start- und Endpunkten des Gewebes ein. Legen Sie die Schrittweite basierend auf der gewünschten Z-Auflösung anhand von Abbildung 4C als Richtlinie fest.
HINWEIS: Kleinere Schrittgrößen führen zu einer höheren Z-Auflösung, führen aber auch zu mehr Laserverweilzeit, was möglicherweise zu einer Probenbleiche führt. - Wenn Sie mit den Bildaufnahmeeinstellungen zufrieden sind, erfassen Sie das Bild.
- Stellen Sie sicher, dass das Bild ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist und deutliche Grenzen der Strukturen aufweist (Abbildung 4D).
5. Bildverarbeitung und 3D-Quantifizierung mittels Mikroskopie-Analysesoftware
HINWEIS: Softwarepakete für die mikroskopische Bildanalyse sind leistungsstarke Werkzeuge zur dreidimensionalen Bildvisualisierung und -verarbeitung. Viele dieser Programme eignen sich perfekt für die Handhabung großer Datensätze, die aus bildgebenden gereinigten Gewebeproben generiert werden. Die folgenden Schritte und zugehörigen Zahlen entsprechen dem Imaris Software Workflow.
- Öffnen Sie den Bildstapel und importieren Sie ihn in die ausgewählte Analysesoftware.
- Zeigen Sie das Bild im dreidimensionalen Raum an und nehmen Sie mit dem Anzeigeeinsteller die gewünschten Änderungen an den Nachschlagetabellen vor, um das Bild besser zu visualisieren.
HINWEIS: Abbildung 5A zeigt die mögliche extreme Bildgebungstiefe, die durch 2-Photonen-Mikroskopie in Verbindung mit CLARITY Tissue Clearing zugänglich ist. Abbildung 5B zeigt unterschiedliche Dendritenprozesse sowie deutlich sichtbare Wirbelsäulenmorphologien aus dem in Abbildung 5Adargestellten Z-Stack. - Um einen konsistenten Hintergrund herauszufiltern, klicken Sie auf die Schaltfläche Bildverarbeitung und wählen Sie den Hintergrundsubtraktionsfilter aus.
HINWEIS: Abbildung 5C zeigt das Bild mit einem konsistenten trüben Hintergrundsignal vor der Verarbeitung. Abbildung 5D zeigt das Bild, nachdem der Hintergrundsubtraktionsfilter angewendet wurde. - Beobachten Sie das 3D-Bild und machen Sie sich damit vertraut, indem Sie es aus verschiedenen Blickwinkeln und Zoomstufen betrachten.
- Starten Sie die Dendritenablaufverfolgung, indem Sie zuerst das Filament-Tracer-Werkzeug auswählen.
- Klicken Sie auf Filament manuell bearbeiten, Automatische Erstellung überspringen.
- Stellen Sie den Modus auf Automatischer Pfad ein und aktivieren Sie Auto-Center- und Auto-Durchmesser-Korrekturen.
- Umschalt + Rechtsklick auf den Zellenkörper, um einen Startpunkt festzulegen.
- Verfolgen Sie das Neuron entlang der gesamten Länge des Dendriten; Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Ende des Dendriten, um den Endpunkt festzulegen, damit die Software automatisch den Pfad zwischen dem Start- und Endpunkt berechnen kann.
- Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Dendriten und verfolgen Sie die Zellstruktur vollständig.
- Visualisieren Sie die verfolgte Zelle und bestätigen Sie ihre Genauigkeit. Nehmen Sie bei Bedarf manuelle Anpassungen vor.
- Wählen Sie die Registerkarte Erstellung aus.
- Wählen Sie die Option Dendritendurchmesser neu berechnen aus.
- Folgen Sie dem Assistenten bis zum Abschluss, um einen genauer verfolgten Dendriten zu erhalten.
- Wählen Sie die Registerkarte Zeichnen aus.
- Klicken Sie auf das Optionsfeld Wirbelsäule, um mit dem Zeichnen von Buchrücken zu beginnen.
- Stellen Sie den ungefähren Wirbelsäulendurchmesser nach Bedarf ein und verwenden Sie das Messwerkzeug, um eine genaue Darstellung der Wirbelsäulendurchmesser zu erhalten.
- Klicken Sie auf die Mitte der Wirbelsäulenköpfe, um eine neue Wirbelsäule hinzuzufügen.
- Wiederholen Sie dies für alle Stacheln auf dem Dendriten.
HINWEIS: Es ist wichtig, den Dendriten aus allen möglichen Winkeln zu beobachten, wenn Man Stacheln manuell hinzufügt. - Überprüfen Sie die neu hinzugefügten Stacheln auf Genauigkeit und nehmen Sie bei Bedarf Änderungen vor.
- Wählen Sie die Registerkarte Erstellung aus.
- Wählen Sie die Option Wirbelsäulendurchmesser neu berechnen, damit die Software die richtigen Kopf- und Halsdurchmesser bestimmen kann, die für die nachgelagerte Datenanalyse entscheidend sind.
- Folgen Sie dem Assistenten zum Erstellen des Wirbelsäulendurchmessers bis zum Abschluss.
- Beobachten Sie das Ergebnis der Berechnung und nehmen Sie bei Bedarf manuelle Anpassungen vor. Abbildung 5E zeigt ein vollständig verfolgtes Neuron mit Stacheln.
- Um eine klassifizierte Liste von Stacheln zu erstellen, wählen Sie die Registerkarte Extras.
HINWEIS: Die MATLAB-Erweiterung muss installiert sein, damit dies funktioniert.- Um die MATLAB-Erweiterung zu installieren, öffnen Sie das Einstellungsfenster.
- Wählen Sie die Option Benutzerdefinierte Tools aus.
- Fügen Sie den entsprechenden MATLAB-Laufzeit-MCR hinzu.
- Klicken Sie auf Stacheln klassifizieren.
- Bearbeiten Sie die gewünschten Parameter für die Wirbelsäulenklassifizierung.
- Klicken Sie in der MATLAB-Erweiterung auf Stacheln klassifizieren. Abbildung 5F zeigt den Dendriten, der mit farbcodierten klassifizierten Stacheln überlagert ist.
- Wählen Sie die Registerkarte Statistik aus.
- Konfigurieren Sie die gewünschte Statistik, um die Daten zu quantifizieren, indem Sie auf die Schaltfläche Konfigurieren in der unteren linken Ecke dieser Registerkarte klicken.
- Sobald die Methode der Statistikdarstellung ausgewählt wurde, exportieren Sie die Daten mit der Schaltfläche Statistiken auf Registerkartenanzeige in Datei exportieren, die sich unten rechts in diesem Fenster befindet.
- Grafische Darstellung der Statistiken mit einer bevorzugten Grafikmethode.
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Representative Results
Nach der Bildaufnahme wurde die repräsentative Zellmorphologie mit Hilfe eingebetteter Statistiken und Klassifikationsskripte innerhalb der Analysesoftware analysiert. Die gesammelten Daten (Abbildung 6A) spiegeln wider, dass Neuron 2 eine größere dendritische Struktur mit einer höheren Dichte an Stacheln aufweist. Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass Neuron 2 im Vergleich zu Neuron 1 eine komplexere dendritische Struktur aufweist. Um dieses Ergebnis zu untermauern, wurde eine Standard-Sholl-Analyse durchgeführt, die bestätigt, dass Neuron 2 dendritisch komplexer ist als Neuron 1, was durch die erhöhte Anzahl von Sholl-Schnittpunkten bei 50-100 μm vom Soma gekennzeichnet ist (Abbildung 6B). Schließlich wurden die dendritischen Stacheln der beiden abgebildeten Neuronen basierend auf ihren Gesamtformen und -größen in vier Hauptkategorien eingeteilt. Stacheln, die mehr filopodienartige Formen aufweisen, sind wahrscheinlich unreife Wirbelsäulensubtypen. Stacheln mit definierten Köpfen, Pilzstacheln genannt, enthalten wahrscheinlich weiter entwickelte und reife Synapsen7. Die hier vorgestellte Analyse zeigt, dass Neuron 1 im Vergleich zu Neuron 2 einen größeren Anteil an filopodienartigen Stacheln enthält (Abbildung 6C). Basierend auf der Morphologie ist Neuron 2 entwicklungsreifer, da es größer, stärker verzweigt ist und eine höhere Dichte an reifen Stacheln enthält.
Abbildung 1: Das CLARITY-Protokoll macht Gewebe transparent und behält gleichzeitig die inhärente Struktur und die räumlichen Beziehungen zwischen Molekülen bei. (A) Ursprüngliche Orientierung von neuronalem Gewebe und interzellulären Komponenten vor der Klärung. (B)Hydrogelmonomere (violette Linien) werden in das Gewebe infundiert und zu einem Hydrogelgeflecht polymerisiert. Das Gewebe und das Hydrogelgeflecht werden durch Formaldehydfixierung vernetzt. (C) Das Gewebe wird dann mit ionischen Reinigungsmittellösungen gewaschen, während es elektrischen Feldern ausgesetzt wird. Während dieses Prozesses entfernen die Waschmittelmizellen Lipidmoleküle aus dem Gewebe und hinterlassen ein vernetztes Netzwerk aus transparentem Hydrogel und Biomolekülen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Flussdiagramm des Protokolls, Diagramm der Gewebevorbereitung, Reinigung, Montage, Bildgebung und Bildverarbeitung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bau von Montagekammern für gereinigte Gewebeproben. (A) Das gesamte Gehirn wurde vor dem Eintauchen in eine Brechungsindex-Matching-Lösung in PBS gereinigt. (B) Gehirnschnitt in Brechungsindex-Matching-Lösung. (C) Bildgebungskammer für große und kleine gereinigte Gewebeproben. Die Kammern können aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf 3D-gedruckte Kunststoffe und geschnittene konische Rohre. (D) Bildgebungskammer für die Bildgebung des gesamten Gehirns oder der Hemisphäre unter Verwendung eines konischen 50-ml-Röhrchens als Erleichterung vor dem Gießen von Agarose. (E) Bildgebungskammer des gesamten Gehirns oder der Hemisphäre mit vollständig eingestellter Agarose; Dieses Setup ist optimal für große Fass-Tauchobjektive. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Erfassen Sie qualitativ hochwertige große Datensätze aus gelöschten Gewebeproben. (A) Bildaufnahmeeinstellungen, die für die hochauflösende Bildgebung der ganzen Zelle verwendet werden. Das Loch war vollständig geschlossen, um feine optische Abschnitte zu ermöglichen. Die Scangeschwindigkeit wurde empirisch anhand optimaler Pixelverweilzeiten bestimmt. (B) Lichtwegeinstellungen: Diese hängen vom Fluorophor und der verwendeten Ausrüstung ab. (C) Z-Stack-Einstellungen; ein feiner Z-Schritt wurde verwendet, um so viele Informationen wie möglich in Z-Richtung zu erfassen. (D) Repräsentative maximale Projektion; Maßstabsleiste steht für 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: 3D-Analyse von Dendriten in der Analysesoftware. (A) Seitenansicht eines zwei Photonen erfassten 600 μm z-Stacks, der aus einem 1 mm dicken Gewebe entnommen wurde, das tdTomato exprimiert; Maßstabsleiste repräsentiert 100μm. (B) Draufsicht auf den gleichen Z-Stapel, der in Panel A erfasst wurde; Skalenbalken repräsentiert 100μm. (C) Konfokal aufgenommenes Bild von Gewebe, das EGFP exprimiert. Bilddateien können direkt in die Analysesoftware importiert und für eine höhere Bildqualität vorverarbeitet werden. Maßstabsbalken entspricht 25 μm. (D) Die Schwellenwertsubtraktion wird verwendet, um das konsistente Hintergrundsignal in C zu entfernen. (E) Filament-Tracing und Wirbelsäulenidentifikation: Dieser Vorgang wird am besten halbautomatisch mit aktivierter Auto-Depth-Funktion durchgeführt. Die Stacheln wurden dann nach vollständiger Dendritenrekonstruktion von Hand beschriftet; Maßstabsleiste stellt 25 μm dar. (F) Wirbelsäulenklassifizierung mit einer integrierten MATLAB-Erweiterung. Stacheln wurden basierend auf ihrer Morphologie farbcodiert; stumpfe Stacheln sind rot; Pilzstacheln sind grün; lange dünne Stacheln sind blau; Filopodien sind violett; Maßstabsleiste steht für 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse. (A) Tabelle der gemeinsamen morphologischen Messungen, die automatisch vom ausgewählten Analyseprogramm generiert werden. (B) Anzahl der durch Programmstatistiken erzeugten Sholl-Kreuzungen. (C) Kreisdiagramm, das die Verteilung der dendritischen Wirbelsäulenmorphologien darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Lösung | Zusammensetzung | Notizen |
| Lösung zur Anpassung des Brechungsindex | 80 g Histodenz | pH bis 7,5 mit NaOH |
| 60 mL 0,02 M Phosphatpuffer | Bei 4 °C lagern | |
| 0,01% Natriumazid | Adaptiert von Marx, V. Nature Methods Band 11, Seiten 1209–1214 (2014) | |
| Hydrogel | 13,33 ml 30% Acrylamid (no-bis) | Mischen Sie sich auf Eis, sonst beginnt die Lösung zu polymerisieren |
| 10 ml 10x PBS | Aliquot und bei -20 °C lagern | |
| 250 mg VA-044 | ||
| 76,66 ml ddH2O |
Tabelle 1: Rezepte für brechungsbildgleiche Lösung und Hydrogellösung. Die Zusammensetzung der Brechungsindex-Matching-Lösung und des Hydrogels sind aufgeführt.
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Discussion
Vor dem Aufkommen zeitgenössischer Gewebereinigungstechniken bestand das Studium der neuronalen Morphologie aus zeitintensiven Schnitten, Bildgebung und Rekonstruktion benachbarter sehr dünner Schnitte. Die elektrophoretische Gewebereinigung in Kombination mit konfokaler Bildgebung bietet einen ungehinderten Blick auf die gesamte neuronale Morphologie. Von intakten dendritischen Bäumen bis hin zum kleinsten synaptischen Bouton war die Bildgebung und Quantifizierung der neuronalen Morphologie noch nie so praktikabel wie heute.
Die Herstellung von gereinigtem Hirngewebe ist unkompliziert und erfordert nur ein Stück Spezialausrüstung. Gewebe, das mit diesem Protokoll gereinigt und abgebildet wird, untergräbt die Notwendigkeit eines mühsamen Dünnschnitts, der Handhabung und der Montage, wodurch die Zeit vom Experimentieren bis zur Bildaufnahme drastisch verkürzt wird. Darüber hinaus bleibt das ohne Schnitt abgebildete Gewebe den ursprünglichen Strukturen treuer, da es keine Schadensquellen oder eine notwendige Post-hoc-Bildrekonstruktion gibt. Schließlich spart dieses Protokoll Zeit, da es die gleichzeitige Abbildung von großräumigen Merkmalen wie dendritischen Bäumen neben kleinräumigen Submikronmerkmalen wie Stacheln ermöglicht.
Eine wichtige Sammlung von Schritten in diesem Protokoll sind die Waschschritte, die dem Clearing-Prozess folgen. Diese Schritte sind entscheidend, um alle Spuren des elektrophoretischen SDS-Clearing-Puffers zu entfernen. Wenn das gereinigte Gewebe nicht ausreichend gewaschen wird, bilden sich während des Montageschritts Ausscheidungen. Diese Ausfällungen können manchmal durch kurze Inkubation des Gewebes bei 37-55 °C wieder gelöst werden. Wenn die Ausscheidungen jedoch bestehen bleiben, streuen sie Licht und führen zu einer schlechten Bildgebungstiefe und -qualität.
Die Montage großer Gewebestücke stellt im Vergleich zur herkömmlichen Dünnschnittbildgebung eine Herausforderung dar. Hier stellen wir mehrere Prozesse vor, um großes Gewebe zu montieren, die von der Bildgebungstechnik, den Objektivlinseneigenschaften und der Größe der Gewebeprobe abhängen. Zunächst ist es wichtig, eine Objektivlinse zu verwenden, die für das Eintauchen in die verwendeten spezifischen Brechungsindex-Matching-Medien geeignet ist und über einen ausreichenden Arbeitsabstand für die Abbildung großer Gewebeproben verfügt. Dieses Protokoll ist weitgehend durch die optischen Eigenschaften der verwendeten Bildgebungsplattform begrenzt, insbesondere durch den Arbeitsabstand von Objektiven. Die Bildgebung in der Tiefe wird mit diesem Protokoll leicht erreicht. Wenn jedoch kein Objektiv mit ausreichendem Arbeitsabstand verfügbar ist, stellt das Gewebe selbst eine physische Barriere für die Aufnahme großer Bilder dar. Die nächste wichtige Entscheidung ist die bildgebende Technik. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie wird typischerweise wegen ihrer hervorragenden Bildqualität, Bildgebungstiefe und Aufnahmegeschwindigkeit eingesetzt. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht die Bildgebung von bis zu 1 mm in CLARITY gereinigtes Gewebe ohne Verlust der Bildqualität, wie in Abbildung 5A,Bgezeigt. Sehr ähnliche Ergebnisse können jedoch bei der Verwendung der traditionellen konfokalen Mikroskopie erzielt werden, wenn auch mit einem Opfer der Abbildungstiefe im Vergleich zur Zwei-Photonen-Mikroskopie (Abbildung 5C,D).
Zusammenfassend bietet diese Methode eine robuste und bequeme Plattform für die Analyse der neuronalen Morphologie sowohl auf großer als auch auf kleiner Skala. Darüber hinaus minimiert diese Methode weitgehend die Handhabungs- und Verarbeitungszeit und liefert gleichzeitig genauere und vollständigere dreidimensionale Bilder. Zelluläre Morphologie ist ein häufig verwendeter Proxy zur Beurteilung der Schaltkreisfunktion und der Gesundheit, die vielen Krankheiten und Pathologien zugrundeliegen 13,14,15. Die bildgebende Neuronenmorphologie ist leistungsstark, unkompliziert und eignet sich gut für den Assay in einer Vielzahl von Krankheitsmodellen.
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Disclosures
Die Autoren haben zu diesem Zeitpunkt nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir möchten dem viralen Kern NRDDC am Jan and Dan Duncan Neurological Institute für die Herstellung der in diesen Experimenten verwendeten AAVs und Lentiviren danken. Darüber hinaus möchten wir uns beim Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine für die Maushaltung und die allgemeine Wartung der verwendeten Mäuse bedanken. Wir danken der American Heart Association für ihre Unterstützung unter der Preisnummer 20PRE35040011 und BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists für ihre Unterstützung (PJH). Abschließend möchten wir logos dafür danken, dass sie unserem Labor das elektrophoretische Gewebereinigungssystem Logos X-Clarity zur Verfügung gestellt haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
References
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