Beeldvorming en kwantificering van intacte neuronale dendrieten via CLARITY Tissue Clearing
Summary
Neuronale dendritische morfologie ligt vaak ten grondslag aan functie. Inderdaad, veel ziekteprocessen die de ontwikkeling van neuronen beïnvloeden, manifesteren zich met een morfologisch fenotype. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en krachtige methode voor het analyseren van intacte dendritische priëlen en hun bijbehorende stekels.
Abstract
Hersenactiviteit, de elektrochemische signalen die tussen neuronen worden doorgegeven, wordt bepaald door de connectiviteitspatronen van neuronale netwerken en door de morfologie van processen en substructuren binnen deze neuronen. Als zodanig is veel van wat bekend is over de hersenfunctie ontstaan naast ontwikkelingen in beeldvormingstechnologieën die meer inzicht geven in hoe neuronen zijn georganiseerd en verbonden in de hersenen. Verbeteringen in het opruimen van weefsel hebben beeldvorming met hoge resolutie van dikke hersenplakken mogelijk gemaakt, waardoor morfologische reconstructie en analyses van neuronale substructuren, zoals dendritische priëlen en stekels, mogelijk zijn. Tegelijkertijd biedt de vooruitgang in beeldverwerkingssoftware methoden om snel grote beeldgegevenssets te analyseren. Dit werk presenteert een relatief snelle methode voor het verwerken, visualiseren en analyseren van dikke plakken gelabeld neuraal weefsel met hoge resolutie met behulp van CLARITY-weefselzuivering, confocale microscopie en beeldanalyse. Dit protocol zal inspanningen vergemakkelijken om de connectiviteitspatronen en neuronale morfologieën te begrijpen die gezonde hersenen kenmerken, en de veranderingen in deze kenmerken die zich voordoen in zieke hersentoestanden.
Introduction
Het begrijpen van de ruimtelijke organisatie, patronen van connectiviteit en morfologie van complexe driedimensionale biologische structuren is essentieel voor het afbakenen van de functies van specifieke cellen en weefsels. Dit geldt met name in de neurowetenschappen, waar enorme inspanningen zijn besteed aan het bouwen van neuroanatomische kaarten met hoge resolutie van het centrale zenuwstelsel1,2. Nauwkeurig onderzoek van de neuronen waaruit deze kaarten bestaan, levert gevarieerde morfologieën op, met verbindingen en locaties die de functie van deze diverse sets neuronen weerspiegelen3,4. Bovendien kan onderzoek van subcellulaire structuren, met name dendritische stekels, de volwassenheid van synapsen informeren, waardoor ontwikkelingsprocessen en neurologische ziektetoestanden worden weerspiegeld5,6,7. Benaderingen die de beeldresolutie en doorvoer verbeteren, zijn dus essentieel voor een beter begrip van de hersenfunctie op alle schalen.
Recente ontwikkelingen hebben de moleculaire en genetische toolkit voor het markeren en manipuleren van populaties van neuronen uitgebreid. De ontwikkeling van nieuwe fluorescerende markers, gecombineerd met nieuwe methoden om deze markers in neuronen te introduceren, maakt differentiële labeling van populaties van interagerende neuronen binnen hetzelfde dier of hersenmonster8,9,10,11mogelijk. Omdat licht wordt verstrooid door ondoorzichtige lipiden en gezien het hoge lipidengehalte van hersenweefsel, is het afbeelden van neuronale populaties voornamelijk beperkt tot dunne secties of heeft het vertrouwd op geavanceerde microscropy-technieken (bijv. Confocale, multi-foton en lichtbladmicroscopie) om diepe structuren in beeld te brengen. Deze inspanningen zijn echter sterk versterkt door de vooruitgang in weefselreinigingstechnieken. Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) is zo’n techniek, waarbij weefsels van belang worden doordrenkt met hydrogelmonomeren (acrylamide en bis-acrylamide) en vervolgens worden gewassen met detergentia12. De hydrogelmonomeren hybridiseren om een stabiele 3D-hydrogelsteiger te creëren die optisch transparant is en doorlaatbaar voor macromolecuullabels. Nucleïnezuren en eiwitten worden binnen de gehybridiseerde matrix gehouden, terwijl lipiden worden verwijderd door de wasbeurten van het wasmiddel(figuur 1). Dit resulteert in een stabiel weefsel dat stijf genoeg is om de oorspronkelijke vorm en oriëntatie van cellen en niet-lipidemoleculen te behouden, terwijl het optisch transparant genoeg is om gemakkelijk diepe structuren met hoge resolutie in beeld te brengen. Dit behoud van weefselstructuur en oriëntatie maakt het mogelijk om dikke plakken af te beelden, waardoor cel-tot-celverbindingen en ruimtelijke relaties behouden blijven. Bovendien, omdat de locatie en beschikbaarheid van eiwitten en nucleïnezuren tijdens het clearingproces wordt gehandhaafd, kunnen geklaarde weefsels op expressie gebaseerde markers bevatten, evenals exogene labels. CLARITY leent zich dus als een krachtige methode voor het in beeld brengen van grote hoeveelheden diepe hersenstructuren en de verbindingen tussen deze structuren met hoge resolutie.
Het gebruik van CLARITY verbetert de benaderingen voor het in beeld brengen van neuronale populaties aanzienlijk. Deze techniek is vooral bedreven in het genereren van grote hoeveelheden beeldgegevens. CLARITY werkt goed met meerdere vormen van op eiwitten gebaseerde fluorescentie. Dit protocol maakt gebruik van een lentivirale benadering om cellen spaarzaam te labelen met EGFP en tdTomato; transgene reporter-allelen die tdTomato of EGFP tot expressie brengen om cellen voor reconstructie te labelen, zijn echter routinematig gebruikt. Het is belangrijk om een fluorofoor te kiezen die zowel fotostabiel als helder is (bijv. EGFP of tdTomato). Bovendien levert het gebruik van een sterke promotor om de fluorofoor uit te drukken een superieur contrast en beeldkwaliteit op. De nadelen van deze techniek ontstaan omdat het goed analyseren van deze grote hoeveelheid data zowel arbeids- als tijdsintensief kan zijn. Gespecialiseerde microscopen kunnen helpen de doorvoer te verbeteren en de werklast te verminderen. Het bouwen, bezitten en / of bedienen van geavanceerde microscopen is echter vaak onbetaalbaar voor veel laboratoria. Dit werk presenteert een hoge doorvoer, relatief snelle en eenvoudige methode om grote hoeveelheden neuraal weefsel met hoge resolutie te visualiseren met behulp van CLARITY-weefselzuivering van grote secties, gecombineerd met standaard confocale microscopie. Dit protocol beschrijft deze aanpak door middel van de volgende stappen: 1) het ontleden en voorbereiden van het neurale weefsel, 2) het opruimen van het weefsel, 3) het monteren van het weefsel, 4) het in beeld brengen van de voorbereide plakjes en 5) het verwerken van volledige plakbeelden met behulp van microscopie visualisatiesoftware reconstructie en analyse(Figuur 2). Deze inspanningen resulteren in beelden met een hoge resolutie die kunnen worden gebruikt om populaties van neuronen, neuronale verbindingspatronen, 3D-dendritische morfologie, dendritische wervelkolomrijkdom en morfologie en moleculaire expressiepatronen in intact hersenweefsel te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vóór de komst van hedendaagse weefselzuiveringstechnieken bestond het bestuderen van neuronale morfologie uit tijdsintensieve secties, beeldvorming en reconstructie van aangrenzende zeer dunne secties. Het gebruik van elektroforetische weefselverwijdering in combinatie met confocale beeldvorming biedt een onbelemmerd beeld van de volledige neuronale morfologie. Van intacte dendritische bomen tot de kleinste synaptische bouton, beeldvorming en kwantificering van neuronale morfologie is nog nooit zo haalbaar geweest.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de virale kern NRDDC van het Jan en Dan Duncan Neurological Institute bedanken voor het produceren van de AAV’s en lentivirussen die in deze experimenten worden gebruikt. Daarnaast willen we het Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine bedanken voor het houden van muizen en het algemene onderhoud van de gebruikte muizen. We willen de American Heart Association bedanken voor hun steun onder awardnummer 20PRE35040011, en BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists voor hun steun (PJH). Tot slot willen we Logos bedanken voor het leveren van het Logos X-Clarity elektroforetische weefselverwijderingssysteem aan ons lab.
Materials
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
References
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), (2015).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Martínez-Cerdeño, V. Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models. Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).
- Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. Optical probes for neurobiological sensing and imaging. Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Ledda, F., Paratcha, G. Mechanisms regulating dendritic arbor patterning. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).
- Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin. Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).
