Medicine

使用线性压花器在老鼠身上进行胃旁路的规程

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62575

Jerry T. Dang¹, Valentin Mocanu¹, Breanna Fang², Michael Laffin¹, Shahzeer Karmali¹, Karen Madsen³, Daniel W. Birch¹

¹Department of Surgery, University of Alberta, ²Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, ³Department of Medicine, University of Alberta

Summary

Roux-en-Y胃旁路（RYGB）是治疗肥胖症和糖尿病的。然而，RYGB疗效背后的机制尚未完全了解，而且由于技术困难导致动物模型的高死亡率，研究受到限制。本文提供了如何在成功率高的老鼠身上执行 RYGB 的说明。

Abstract

Roux-en-Y胃旁路（RYGB）通常用于治疗严重肥胖症和2型糖尿病。然而，减肥和代谢变化的机制没有得到很好的理解。多种因素被认为起着一定的作用，包括热量摄入减少、营养吸收减少、饱腹增加、促进饱腹激素的释放、胆汁酸代谢的改变和肠道微生物群的改变。

大鼠RYGB模型提供了一个理想的框架来研究这些机制。先前对小鼠模型的工作死亡率很高，从17%到52%不等，限制了它们的采用。Rat 模型展示了更多的生理储备，以手术刺激，并在技术上更容易采用，因为他们允许使用手术订书机。然而，手术订书机的一个挑战是，它们经常留下一个大胃袋，在人类中不能代表RYGB。

在这个协议中，我们提出了一个RYGB协议，在老鼠，导致一个小胃袋使用手术订书机。利用两个订书机火灾，去除大鼠的森林病变，我们得到一个较小的胃袋类似于一个典型的人类RYGB。手术停滞也会导致比尖锐的分裂更好的止血。此外，大鼠的森林瘤不包含任何腺体，其去除不应改变RYGB的生理。

与假组相比，RYGB 组群的体重减轻和代谢变化显著，14 周的葡萄糖耐受性显著降低。此外，该协议在 RYGB 之后的存活率为 88.9%。本协议中描述的技能无需以往的显微外科经验即可获得。一旦掌握，这个程序将提供一个可重复的工具，研究RYGB的机制和效果。

Introduction

肥胖症和2型糖尿病已成为世界流行的^1。虽然医疗减肥可以改善糖尿病患者，但患有严重糖尿病的患者从减肥手术中受益最大。减肥手术已被证明是安全和有效的减肥和改善或治愈2型糖尿病^2，3，即使在那些长期疾病^4。代谢减肥程序，如目前的黄金标准Roux-en-Y胃旁路（RYGB）手术，诱导葡萄糖平衡的快速和持续改善，同时也减少了糖尿病药物^5，6，7的需求。

RYGB后，葡萄糖平衡改善发生迅速，独立于减肥^8。提出了两个主要理论来解释代谢手术后发生的与糖尿病缓解相关的代谢变化。首先，后遗症假说假设，在旁路后，未消化的营养物质浓度升高到达基座肠道，增强了GLP-1等激素的释放。另一方面，前体假说表明，绕过近肠可以减少抗胰蛋白激素的分泌。这两种效果都可能导致葡萄糖代谢^{的早期改善9。}

动物模型有可能成为研究这些机制的有力工具。然而，利用鼠标或大鼠模型的一个主要障碍是执行这些程序的技术困难。大多数研究都依赖于老鼠模型^{10，11，12。}老鼠模型一直很难，因为老鼠的胃太小，不能使用订书机设备^11，死亡率是令人无法接受的高，从17到52%13。在大鼠中，由于胃血管在分裂胃^12、14之前的复杂结结^，一些协议在技术上仍然难以执行。其他模型使用订书机划分胃部，但留下一个大袋子不符合后RYGB人体解剖^学11。在此模型中，我们提供了关于如何在鼠模型中使用线性订书机执行 RYGB 的详细说明，从而产生更符合人体解剖学的胃袋。总的来说，这个程序与优良的存活率和代谢结果有关。

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Protocol

动物使用协议已获得艾伯塔大学健康科学动物护理和使用委员会（AUP00003000）的批准。有关显示 RYGB 解剖学的图表，请参阅图 1。

1. Roux- en - y 胃旁路

动物和操作设置的准备
1. 手术前一周，为大鼠提供口服补液疗法和液体饮食，以及固体饮食和水，使其适应这种新饮食。
2. 手术前12-18小时只能取水的快鼠。
  1. 确保大鼠在凸起的电线平台上禁食，使其不能消耗床上用品。
3. 在手术前立即以1毫克/千克的剂量给大鼠注射皮下长丁丙诺啡持续释放（SR）。
4. 自动将所有手术器械、毛巾和窗帘都放飞。
5. 用 70% 乙醇清洁手术面、加热垫和麻醉鼻锥。
6. 使用手术显微镜、麻醉机设置手术表面，并以符合手术外科医生人体工程学的方式供应。
7. 使用温度调节加热垫，并设置为 37 °C。
8. 将无菌窗帘或毛巾放在加热垫上。
9. 用 0.9% 的盐水填充 50 mL 无菌锥形管。
麻醉诱导和制备
1. 诱导麻醉使用4%异黄酮根据先前建立的协议^15。
2. 对所有四肢的后脚施加压力，以确保没有疼痛反应。
3. 每5分钟后检查一次足够的麻醉和呼吸速率。
4. 将润滑剂涂抹在双眼上，以防止干燥。
5. 剃掉腹部的头发。
6. 用孔酮碘溶液清洁腹部。让溶液干燥，并更换为无菌手套。
7. 用窗帘上的开口把老鼠拉到腹部。
8. 将仪器、缝合线、棉签和 10 mL 注射器放置在允许在手术过程中轻松进入的位置。
腹腔切除术中位数
1. 使用手术刀在腹部上中线切口 3 厘米，正好低于 xyphoid 过程作为地标。
2. 使用剪刀，将筋膜和腹膜分开，小心地保持中线的线性阿尔巴，以减少从直肠腹部出血。如果有出血，用热或电切控制它。
动员胃部
1. 使用两个湿棉签，直截了当地解剖胃附件。
2. 当遇到密集的粘合物时，使用热烧灼热来小心地分割胃附件，以避免胃灼热。将韧带在胃和附属肝叶之间急剧划分，以降低胃部运动导致肝脏撕裂的风险。
3. 对于较大的血管，特别是在短胃动脉，使用6-0聚丙烯缝合线。
4. 在食道的右侧创建一个窗口，但接近左胃动脉。确保棉签可以到达这个区域后。胃在腹部外侧外化时，可以充分调动。
识别和划分杰朱努姆
1. 通过近似跟随 jejunum 来识别 Treitz 的韧带，直到观察它附着在横向间质上。
2. 测量7厘米远，确定中间血管之间的位置，并用微型剪刀划分肠道。在划分肠道时避免佩耶的斑块。小心只划分肠子，而不是肠子。
3. 在分隔肠道之前放置一块干净的盐水浸泡海绵，以尽量减少污染。
4. 检查小肠边界的夹板是否有小渡船，并将其与烧灼处分开，以避免出血。
5. 继续将夹层向中性基座分割 1 厘米。
6. 识别近亲和相形的杰朱努姆。将近亲的果冻放在大鼠右侧的湿纱布下，将离形的杰朱努姆放在大鼠的左边。
刺痛胃部
1. 在森林的白线中插入一个 45 mm 线性切割订书机，主食高度为 3.5 mm，以创建一个较小的袋子。等待 10s 然后再发射订书机。
2. 使用纱布在主食线上放置压力 1 分钟，以确保止血。如果单靠压力无法实现血吸虫病，则使用 8 条缝合线的 6-0 聚丙烯图，主食线的出血会过缝。
3. 将第二个主食火穿过胃进入以前创建的窗口。等待 10s 然后再发射订书机。沿着主食线施加压力，以确保止血，可能需要超压。
胃耶朱诺切除术
1. 胃部受紧后立即进行胃切除术。延迟可导致胃部消散和吸入，因为胃在第二胃主食后是不连续的。
2. 使用 11 刀片手术刀，在致命袋中创建胃切除术。通过胃切除术快速表达胃部内容。这对于防止胃消散和渴望很重要。使用微型剪刀将胃切除术延长至约5毫米。胃切除术是足够大的棉签尖端只是为了适应通过。
3. 调动与胃切除术相邻的 jejunum 的分端，并放置这样，使插管不扭曲。
4. 在浸泡腺病时，通过用盐水浸泡纱布覆盖肠道并定期重新涂抹盐水，确保肠道保持湿润。
5. 使用 6-0 聚二恶英或聚丙烯缝合线，将留缝线置于麻醉剂的低边边缘，然后用捕捉轻轻缩回。用三个结绑住。
6. 将留缝线放在麻醉的优越边缘，然后用捕捉轻轻缩回。绑六节。
7. 以连续的方式缝合麻醉肿的前侧，小心地咬住1毫米宽和1毫米的间隔，以避免背部。
8. 一旦缝合线达到劣质的保持缝合，将这些与额外的六节绑在一起。
9. 一旦前侧完成，翻转肠和胃，并通过中性缺陷的低劣停留缝合。重新应用快照，并低级缩回。
10. 对于腹膜沉着的后侧，放置全厚中断 6-0 缝合线，1 毫米宽，间隔 1 毫米分开，小心避免采取背面。每个都绑着六个结。
  注：麻醉的前侧以连续的方式被缝合，而后侧则以中断的方式完成。这可防止与连续环闭相关的潜在严格或狭窄。
11. 通过轻轻地将发光内容物推过麻醉物来检查泄漏情况。如果有泄漏区域，小心地用中断的缝合线加固它们。在用额外的缝合线加固时，请注意避免后壁。
杰朱诺耶朱诺切除术
1. 从胃耶君诺切除术，测量20厘米远。
2. 使用 11 刀片手术刀在非时间感性一侧创建一个jejuno切除术。避免在佩耶的补丁上做耶稣切除术。
3. 使用微型剪刀延长这种耶稣会切除术，使其与胆管板肢体大小相同。确保棉签正好适合里面。
4. 放置双翼板肢体，使内骨没有扭曲。
5. 执行麻醉术类似于胃耶朱诺切除术与 6 - 0 保持缝合在上级和低等的一面。前侧以连续缝合进行，后侧用中断的缝合进行。
6. 确保肠道在这种腺瘤期间保持盐水湿润。
7. 通过轻轻推动发光内容通过麻醉检查泄漏。如果有泄漏区域，则用中断的缝合线加固它们。
重新定位肠道和胃部
1. 确保没有扭曲的袋子，残余胃，或肝脏。确保肝脏的左叶是胃前叶，而不是被困在袋后面，因为这可能会导致压缩性肝缺血。
2. 将肠子放在腹部的自然位置，这样不会扭动。
腹部关闭
1. 以 3 -0 多胶素连续关闭筋膜。3-0 多二恶英也可以使用。
2. 以 2： 0 丝绸连续关闭皮肤。
麻醉剂出现
1. 将异黄素降至零，但继续补充氧气。
2. 管理局部麻醉剂作为切口的飞溅块。
3. 在颈部后面的皮下组织中，在正常盐水（D5NS）中施用 10 mL 皮下 5% 的脱氧糖。
4. 在老鼠完全清醒之前放置一个伊丽莎白老鼠领子。小心贴合，但不要太紧，造成不适。
  注意：衣领一直保持到第5天，以防止伤口脱伤。

2. 沙姆手术

注：沙姆手术的进行类似于 RYGB，但是，没有执行麻醉剂。

胃切除术被创建，然后关闭与6-0聚二恶烷或聚丙烯缝合线。
Jejunotomy 被创建 7 厘米的切口到 Treitz 的韧带，然后关闭与 6 - 0 聚二恶英或聚丙烯缝合线.

3. 术后护理

术后护理
1. 单独饲养老鼠，并将它们放在凸起的电线平台上，直到重新引入固体食物，以防止食用床上用品和发光障碍物。
  注：术后饮食逐渐恢复，因为胃切除术的水肿会随着固体饮食的早日恢复而造成阻塞。
2. 每天检查脚，而老鼠在凸起的电线平台上的任何皮肤变化。
3. 让大鼠在前72小时保持水和口服补液治疗饮食。
4. 前 72 小时每 12 小时管理 10 mL 的 D5NS。
5. 如果大鼠看起来疼痛，则以0.01毫克/千克的皮下短效丁丙诺啡进行管理。鼠格里姆斯量表用于评估疼痛^16。
6. 在术后第3天，加入啮齿动物液体饮食。继续提供水和口服补液疗法。
7. 在术后第5天，重新开始高脂肪饮食。继续提供水和液体饮食。取下伊丽莎白的衣领。
8. 术后第7天停止液体饮食。
9. 术后第10-14天切除皮肤缝合线。

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Representative Results

动物和住房
36只雄性威星大鼠成对饲养，从6周大开始喂养60%的无菌啮齿动物高脂肪饮食（图2）。在16周大的时候，他们接受了RYGB或假手术。术后第一周后，大鼠恢复高脂肪饮食。一半的老鼠在术后2周被安乐死，另一半在术后14周被安乐死。

死亡率
总的来说，33只（91.7%）大鼠存活到计划的研究终点。所有接受早期安乐死的老鼠都接受了兽医的尸检。两只老鼠在24小时内被安乐死。一只 Rygb 患有吸入性肺炎，一只假老鼠患有无法挽救的肠道。另一只RYGB大鼠在两周内因胃切除术的麻醉性泄漏而安乐死。总体而言，88.9%的RYGB大鼠存活下来研究终点。

体重
接受 RYGB 的老鼠比假老鼠术后体重轻。图3 显示了大鼠术后绝对重量，图 4 显示了术后体重变化的术后百分比变化，这在术后的所有时间点都具有统计学意义。在14周时，有RYGB的老鼠的平均体重变化为6.4%，而做假手术的老鼠的平均体重变化为23.7%（p = 0.0001）。

腹内葡萄糖耐受性测试
禁食血糖在任何一组人之间没有显著差异。然而，与13周假（18.1 vs 23.8 mmol-h/L，p=0.046， 图5）相比，RYGB的曲线下区域明显较低，但1周时RYGB与假区（20.8对23.3 mmol-h/L，p=0.68）相同。

图1：Roux-en-Y胃旁路解剖学请点击这里查看这个数字的较大版本。

图2：高脂肪饮食术前绝对体重：RYGB， Roux-en-Y 胃旁路请单击此处查看此图的较大版本。

图3：高脂肪饮食术后绝对体重：RYGB， Roux-en-Y 胃旁路请单击此处查看此图的较大版本。

图4：高脂肪饮食术后体重变化百分比：RYGB， Roux-en-Y 胃旁路请单击此处查看此图的较大版本。

图5：胃旁路与假体的腹内葡萄糖耐受性测试，在13周内进行。RYGB， Roux-en-Y 胃旁路请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

RYGB 涉及创建一个小胃袋（小于 30 mL），以及创建胆小板肢体和 Roux 肢体（图 1）。在人类中，胆小板肢体通常为30至50厘米，从胃残余物、肝脏和胰腺中输送分泌物。Roux肢体的长度通常为75至150厘米，是摄入食物的主要通道。常见的通道是剩余的小肠，两肢连接的地方，是大部分消化和吸收发生的地方，因为胰腺酶和胆汁与摄入的食物^混合17。

RYGB 的减肥机制是多模式的。小胃袋通过机械限制减少食物摄入量。旁路会导致吸收不良成分，因为小肠的很大一部分不会吸收卡路里和营养物质。最近，研究表明，肠道激素在RYGB之后的减肥中也起着重要作用。这些主要是通过ghrelin，肽-YY，胆囊素（CCK）和GLP-1激素通路^18。

鼠模型提供了一个强大的方法来研究RYGB的重量和代谢效应背后的机制。在本文中，我们提出了一个 RYGB 协议，具有低死亡率，具有显著的减肥和代谢效果。一旦操作员熟悉了该技术，该过程大约需要 90 分钟才能完成。该协议也可以修改与更长的胆小板和鲁克斯肢体长度，以潜在的增加减肥和代谢效果。此外，它在技术上比其他模型更可行，因为它允许使用手术订书机，以实现止血和最小化手术时间。依靠胃的锐利分裂而不停滞的模型通常会导致由于大量失血而导致更高的死亡率。执行程序所需的技术技能相对容易获得，学习者在大约五到十个非恢复程序后能够舒适地执行程序。

该协议的关键步骤之一是限制胃部动员过程中的失血。小心使用热烧灼与血管缝合结合是很重要的。以中断的方式执行至少一半的麻醉剂周长也很重要。这可以防止对麻醉剂进行过度严格。此外，检查泄漏是至关重要的，因为这些可能导致败血症和死亡。在关闭腹部之前，肝脏的左叶必须放在其自然、前部位置，并且肠道或胃部没有旋转，因为这可能导致内脏缺血。

术后护理对本协议至关重要。由于固体材料的消耗会导致麻醉障碍物，因此在禁食和术后期间都需要凸起的电线平台。提供皮下液体至关重要，因为大鼠在术后立即不能耐受口服液。大鼠应适应口服补液疗法和液体饮食，因为大鼠可能因与术后疼痛有关而避免新的饮食。这种饮食协议有助于在RYGB和假组的术后立即显著减肥，而假组的体重恢复大约需要五个星期。然而，严格遵守这一术后协议对于降低 RYGB 之后的发病率和死亡率至关重要。此外，使用鼠格里姆斯量表频繁检查大鼠对检测发病率非常重要。在我们的研究中，一只老鼠发展了一个晚期的麻醉泄漏，使用这种尺度迅速检测，并允许早期安乐死，以减少痛苦。

这种方法的优点之一是，它通过使用手术订书机来减少胃出血，导致一个较小的袋子。当我们试图在没有订书机的情况下急剧分割胃部时，它会导致过度出血和更高的死亡率。然而，这也会导致森林病的清除，这可能导致生理变化，不同于人类RYGB。然而，森林病是啮齿动物独有的，不含腺体，不应引起肠道激素的任何变化。

这种方法最重要的局限性是，它需要每只大鼠两个手术订书机重新加载，这可能代价高昂。然而，优良的生存结果可能通过减少对大鼠的研究而降低成本，从而更好地利用畜牧业设施、手术设备和科研人员。

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Disclosures

Ethicon 提供了两台 45 毫米线性切割订书机、多个 3.5 毫米订书机重装和 6-0 聚丙烯缝合线。作者没有其他利益冲突要声明。

Acknowledgments

这项研究由美国代谢和减肥外科研究奖资助。Ethicon 亲切地提供缝合线、订书机和夹子。主要作者的博士研究由艾伯塔大学临床调查员项目和艾伯塔省创新临床研究员奖学金资助。我们还要感谢米歇尔·特兰对RYGB解剖学的医学说明。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 Silk Sutures	Ethicon	K533
3-0 Vicryl Sutures	Ethicon	J219H
4% Isoflurane	N/A	N/A
5% Dextrose and 0.9% Sodium Chloride Solution - 1000 mL	Baxter	2B1064
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8805H
Anesthetic Machine	N/A	N/A
Animal Hair Shaver	N/A	N/A
Betadine Solution	N/A	N/A
Castrojievo Needle Holder with lock 14 cm (smooth curved)	World Precision Instruments	503258
ECHELON FLEX Articulating Endoscopic Linear Cutter	Ethicon	EC45A
Economy Tweezers #4	World Precision Instruments	501978
ENDOPATH ETS Articulating Linear Cutter 45mm Reloads	Ethicon	6R45B
Far Infrared Warming Pad Controller with warming pad (15.2 cm W x 20.3 cm L), pad temperature probe, and 10 disposable, non-sterile sleeve protectors	Kent Scientific	RT-0515
Large Rat Elizabethan Collar	Kent Scientific	EC404VL-10
Liquid Diet Feeding Tube (150 mL)	Bio-Serv	9007
Liquid Diet Feeding Tube Holder (short adjustable)	Bio-Serv	9015
Micro Mosquito Forceps	World Precision Instruments	500452
Micro Scissors	World Precision Instruments	503365
Mouse Diet, High Fat Fat Calories (60%), Soft Pellets	Bio-Serv	S3282
No. 11 Blade and Scalpel Handle	N/A	N/A
OPMI Vario Surgical Microscope	ZEISS	S88
Raised Floor Grid	Tecniplast	GM500150 Raised Floor Grid
Rodent Liquid Diet, Lieber-DeCarli '82, Control, 4 Liters/Bag	Bio-Serv	F1259
Sodium Chloride Irrigation 0.9% Solution - 500 mL	Baxter	JF7633
Sterile Cotton Swabs	N/A	N/A
Sterile Drape	N/A	N/A
Sterile Towel	N/A	N/A
Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293