Medicine

リニア・ステープラーを用いたラットにおけるルー・アン・Y胃バイパスのプロトコル

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62575

Jerry T. Dang¹, Valentin Mocanu¹, Breanna Fang², Michael Laffin¹, Shahzeer Karmali¹, Karen Madsen³, Daniel W. Birch¹

¹Department of Surgery, University of Alberta, ²Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, ³Department of Medicine, University of Alberta

Summary

ルーアンY胃バイパス(RYGB)は、肥満および糖尿病を治療するために行われる。しかしRYGBの有効性の根底にあるメカニズムは十分に理解されておらず、動物モデルにおける高い死亡率を引き起こす技術的困難によって研究が制限されている。この記事では、成功率の高いラットで RYGB を実行する方法について説明します。

Abstract

ルー・アン・Y胃バイパス(RYGB)は、重度の肥満および2型糖尿病の治療のために一般的に行われる。しかし、体重減少や代謝変化のメカニズムはよく理解されていません。カロリー摂取量の減少、栄養吸収の減少、満腹性の増加、満腹増進ホルモンの放出、胆汁酸代謝の変化、腸内微生物叢の変化など、複数の要因が役割を果たすと考えられている。

ラットRYGBモデルは、これらのメカニズムを研究するための理想的なフレームワークを提示します。マウスモデルの以前の作業は、17から52%の範囲で高い死亡率を有し、採用を制限している。ラットモデルは、外科的刺激に対してより多くの生理学的予備を示し、外科的ステープラーの使用を可能にするので、技術的に採用が容易である。しかし、外科用ホッチキスの1つの課題は、人間のRYGBを代表しない大きな胃袋を残すことが多いということです。

このプロトコルでは、外科用ステープラーを使用して小さな胃袋をもたらすラットにRYGBプロトコルを提示する。ラットの前胃を取り除く2つのホッチキス火災を利用して、典型的なヒトRYGBに続くような小さな胃袋を得る。外科的ホチキス止めはまた鋭い分裂よりよりよい止止めを生じる。さらに、ラットの前胃には腺が含まれておらず、その除去はRYGBの生理を変えてはならない。

RYGBコホートの減量および代謝変化は、シャムコホートと比較して有意であり、14週で有意に低い耐糖能を有する。さらに、このプロトコルはRYGB後に88.9%の優れた生存率を有する。このプロトコルに記載されているスキルは、以前の微小外科的経験なしに習得することができます。この手順を習得すると、RYGBのメカニズムと効果を研究するための再現可能なツールが提供されます。

Introduction

肥満と2型糖尿病は世界的に流行している¹.医療減量は患者の糖尿病を改善することができますが、重度の糖尿病を持つ人はバリヤード手術から最も恩恵を受けます。肥満手術は、体重減少と2型糖尿病^2、3を改善または治癒する際に安全かつ有効であることが証明^{されている4.}現在の金標準のルー・アン・Y胃バイパス(RYGB)手術のような代謝肥満の処置は、糖尿病薬^5、6、7の必要性を減らしながら、グルコース恒常性の急速かつ持続的な改善を誘発する。

RYGBの後、グルコース恒常性の改善が急速に起こり、体重減少⁸とは独立している。代謝手術後に起こる糖尿病寛解に伴う代謝変化を説明するために、2つの主要な理論が提案されている。まず、後腸仮説は、バイパス後、未消化栄養素のより高い濃度が、GLP-1などのホルモンの放出を増強する遠位腸に達すると仮定する。一方、前腸仮説は、近位腸をバイパスすると抗インクレチンホルモンの分泌を減少させることを示唆している。これらの効果の両方が早期にグルコース代謝の改善につながる可能性⁹.

動物モデルは、これらのメカニズムを研究するための強力なツールになる可能性を秘めています。しかし、マウスやラットモデルを利用する際の大きな障壁は、これらの手順を実行する際の技術的な難しさです。ほとんどの研究は、マウスまたはラットモデル^10、11、12に依存しています。マウスの胃が小さすぎてホッチキス装置¹¹を使用できないのでマウスモデルは困難であり、死亡率は17から52%の範囲で許容できないほど高い^。ラットでは、胃^12,14を分割する前に胃血管の複雑な結紮のために、技術的に実施が困難なプロトコルもある。他のモデルは、ホッチキスを使用して胃を分割しますが、ポストRYGB人体解剖学¹¹と一致しない大きなポーチを残します。本モデルでは、ラットモデルでリニアホッチを使用してRYGBを実行する方法について詳しく説明し、ヒト解剖学に合わせて胃袋を増やします。全体的に、この手順は、優れた生存率および代謝結果と関連していた。

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Protocol

動物使用プロトコルは、アルバータ大学の健康科学動物のケアと使用委員会(AUP00003000)によって承認されました。RYGB 解剖学を示す図については 、図 1 を参照してください。

1. ルー・アン・Y胃バイパス

動物の準備と手術のセットアップ
1. 手術の1週間前に、ラットに固形食と水に加えて経口補水療法と流動食を提供し、この新しい食事に順応する。
2. 手術前に12〜18時間水へのアクセスのみで高速ラット。
  1. ラットが寝具を消費できないように、上げられたワイヤープラットフォームで断食されていることを確認してください。
3. 手術直前に1mg/kgの用量で皮下長ブプレノルフィン持続放出(SR)でラットを注入する。
4. すべての手術器具、タオル、およびドレープをオートクレーブ。
5. 操作面、加熱パッド、麻酔用ノーズコーンを70%エタノールで洗浄します。
6. 手術用の外科医のための人間工学的である方法で操作の顕微鏡、麻酔機械および供給によって作動表面を設定しなさい。
7. 温度調節された加熱パッドを使用し、37 °Cに設定します。
8. 暖房パッドの上に滅菌ドレープまたはタオルを置きます。
9. 50 mLの無菌コニカルチューブを0.9%生理液で満たします。
麻酔の誘導および準備
1. 以前に確立されたプロトコル¹⁵に従って4%イオブルランを使用して麻酔を誘発する。
2. 痛みの反応がないことを確認するために、4つの手足の後ろ足に圧力をかけます。
3. 5分ごとに適切な麻酔と呼吸数を確認します。
4. 乾燥を防ぐために、両方の目に潤滑油を塗布します。
5. 腹部から髪を剃る。
6. ポビドネ-ヨウ素溶液で腹部をきれいにします。溶液を乾燥させ、滅菌手袋に変えます。
7. ラットをドレープの開口部でドレープし、腹部を露出する。
8. 手順中に簡単にアクセスできる場所に器具、縫合糸、綿棒、および10 mLの注射器を置きます。
中足腔内術
1. 目印としてxyphoidプロセスのすぐ下に、メスを使用して腹部の上部正中線に3cmの切開を行います。
2. はさみを使用して、筋膜と腹膜を分割し、直腸腹部からの出血を減らすためにリネアアルバの中線にとどまるよう注意してください。出血がある場合は、熱または電気焼灼でそれを制御します。
胃を動員する
1. 2つの湿った綿棒を使用して、ぶっきらぼうに胃の付属品を解剖する。
2. 密な付着に遭遇した場合は、熱焼灼剤を使用して胃の付着物を細分化し、胃を焼灼しないように注意してください。胃と付属の肝臓葉の間の靭帯を鋭く分け、胃の動員で肝臓が引き裂かれるリスクを減らす。
3. より大きな血管、特に短い胃動脈では、6-0ポリプロピレン縫合糸を使用してリゲート。
4. 食道の右側に窓を作成しますが、左胃動脈に近位.綿棒がこのエリアに後から届くよう。腹部の外側に外装できる場合、胃は十分に動員されます。
この二元体を識別して分割する
1. 横の中コロンに付着するまで、近位に横隔に従ってTreitzの靭帯を特定する。
2. 遠位7cmを測定し、腸間容器間の位置を特定し、マイクロハサミで腸を分割する。腸を分割する際にペイヤーのパッチを避けてください。腸を分けるだけで、腸間腸ではなく注意してください。
3. 汚染を最小限に抑えるために腸を分割する前に、清潔な生理生理的な浸漬スポンジを置きます。
4. 小腸の境界にある腸間腸内に小さな交差容器が存在することを確認し、出血を避けるために焼灼で分割します。
5. 腸間膜の基部に向かって1cmの間腸間膜を分割し続けます。
6. 近位および遠位の二分を識別する。近位性の天体をネズミの右に濡れたガーゼの下に置き、ラットの左に遠位の天体を置きます。
お腹をホチキス止めする
1. 前胃の白い線を横切って3.5mmのステープル高さの45mmリニアカットホッチを挿入して、より小さなポーチを作成します。ホチキスを発射する前に10 sを待ちます。
2. 止止めを確実にするために、主に1分間、主にガーゼを使用して圧力を入れ。圧が単独で達成されない場合、8つの縫合糸の6-0ポリプロピレン図を用いてステープルラインに沿った出血が過剰に行なわれた。
3. 以前に作成されたウィンドウに胃全体に第二の定番火を実行します。ホチキスを発射する前に10 sを待ちます。止まり止めを確実にするためにステープルラインに沿って圧力が保持され、過剰縫製が必要になる可能性があります。
胃腸管内術
1. 胃をホチキス止めした直後に胃の胃を作ります。この遅延は、胃が2番目の胃ステープルの後に不連続であるため、胃の崩壊と吸引を引き起こす可能性があります。
2. 11枚刃のメスを使用して、遠位ポーチに胃道を作ります。胃切り出しを通して胃の内容物を表現する。これは、胃の不血圧や吸引を防ぐために重要です。マイクロハサミを使用してこの胃道を約5mmに延長します。胃切りは綿棒先端がちょうど通り通るのに十分な大きさに作られる。
3. 胃道に隣接する、心間膜の遠位の端を動員し、腸間膜がねじれないように配置します。
4. 吻合を縫合しながら、生理的なガーゼで覆い、生理的な生理を定期的に再適用することによって、腸を湿らせておくようにしてください。
5. 6-0ポリジオキサノまたはポリプロピレン縫合を使用して、吻合の下マージンに縫合を置き、スナップを使用して穏やかに引き込みます。3つの結び目で結びます。
6. 吻合の上部マージンに滞在縫合糸を置き、スナップを使用してそっと引き込みます。6つの結び目で結びます。
7. 連続的に吻合の前側を縫合し、裏側を取らないように注意して1mm幅と1mm離して噛みます。
8. 縫合糸が下の滞在縫合糸に達したら、これらを追加の6ノットと結びます。
9. 前側が完了したら、腸と胃をひっくり返し、腸間膜欠損を通して下の縫合糸を渡します。スナップを再適用し、引き込み下ろします。
10. 吻合の後部側のために、完全な厚さは6-0縫合糸を中断し、幅1mm、および1mm離して、裏側を取らないように注意して置きます。これらはそれぞれ6つの結び目で結ばれています。
  注:吻合の前側は連続的に縫合され、後部側は中断された方法で行われます。これは連続的な円周閉鎖に関連する潜在的な厳密さまたは狭窄を防ぐ。
11. 肛門に光の内容物をそっと押し込み、漏れを確認します。漏れのある領域がある場合は、縫合糸を中断して慎重に補強してください。余分な縫合糸で補強するとき背壁を取らないように注意してください。
済州イェジュノジュノスノストミー
1. 胃二腸管の間に、遠位20cmを測定します。
2. 11枚刃のメスを使用して、前腸側にジェジュノトミーを作成します。ペイヤーのパッチの上にジェジュノトミーを作ることを避けてください。
3. ビリオ膵肢と同じ大きさになるように、マイクロハサミを使用してこのジェジュノトミーを拡張します。綿棒がちょうど中に収まることを確認してください。
4. 腸間神経のねじれが生じなさそうに、ビリオ膵肢を置く。
5. 上側と下側に6-0の滞在縫合糸を伴う胃二分化術と同様に吻合を行う。前部側は連続的な縫合糸で行われ、後部側は中断された縫合糸で行われる。
6. この吻合の間、腸が生理的に湿っていることを確認してください。
7. 吻当を通して、発光内容物を軽く押して漏れを確認します。漏れのある領域がある場合は、縫合糸を中断して補強します。
腸と胃の位置を変更する
1. ポーチ、残りの胃、肝臓のねじれがないことを確認してください。肝臓の左葉が胃の前部であり、圧迫性肝虚血を引き起こす可能性がありますので、ポーチの後ろに閉じ込められていないことを確認してください。
2. ひねくれがなさそうに自然な位置に腹部に腸を置く。
腹部閉鎖
1. 連続的な方法で3-0ポリグラクチンと筋膜を閉じます。3-0ポリジオキサンロンも使用することができる。
2. 連続的な方法で2-0シルクで肌を閉じます。
麻酔薬の出現
1. イオブルランをゼロに減らすが、補足酸素を続ける。
2. 切開にスプラッシュブロックとして局所麻酔薬を投与する。
3. 首の後ろの皮下組織で正常食節(D5NS)の皮下5%デキストロースの10 mLを投与する。
4. ネズミが完全に目を覚ます前にエリザベスネズミの首輪を置きます。ぴったりとフィットするように注意してくださいが、不快感を引き起こすにはきつすぎではありません。
  注意:首輪は傷の欠損を防ぐために5日目まで保持されます。

2. シャム手術

注:シャム手術はRYGBと同様に行われますが、アナストモーゼは行われません。

胃管病は作成され、6-0ポリジオキサニまたはポリプロピレン縫合糸で閉じる。
ジェジュノトミーは、Treitzの靭帯に7cm遠位に作成され、その後、6-0ポリジオキサノーネまたはポリプロピレン縫合糸で閉じる。

3. 術後ケア

術後ケア
1. ラットを個別に飼育し、固形食品が再導入されるまで上げワイヤープラットフォーム上に保管し、寝具や発光閉塞の消費を防ぎます。
  注:胃二腸間術で浮腫が固形食の早期再開で閉塞を引き起こす可能性があるとして、術後食が徐々に再開されます。
2. ラットが上げられたワイヤープラットフォーム上にあり、皮膚の変化がないか、毎日足を検査します。
3. 最初の72時間は、水と経口補水療法の食事療法にラットを保ちます。
4. 最初の72時間に対して12時間ごとに10 mLのD5NSを管理します。
5. ラットが痛みを感じているように見える場合は、0.01 mg/kg で皮下短時間作用性ブプレノルフィンを投与する。ラットグリマズスケールは、痛み¹⁶を評価するために使用されます。
6. 術後3日目にげっ歯類の流動食を加える。水および経口補水療法を提供し続ける。
7. 術後5日目に、高脂肪食を再開する。水と流動食を提供し続けます。エリザベスの襟を取り外します。
8. 術後7日目に、流動食を中止する。
9. 術後10~14日目に皮膚縫合を除去する。

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Representative Results

動物と住宅
36匹の雌雄のウィスターラットを対に収容し、6週齢から60%無菌げっ歯類高脂肪食を摂取した(図2)。16週齢で、彼らはRYGBまたは偽の手術を受けた。術後の最初の週の後、ラットは高脂肪食で再開された。ラットの半数は術後2週間で安楽死させ、残りの半分は術後14週で安楽死させた。

死亡率
全体として、33(91.7%)ラットが計画された研究エンドポイントまで生存した。早期安楽死を受けたすべてのラットは、獣医師によって壊死を受けた。2匹のラットを24時間以内に安楽死させた。1つのRYGBは吸引性肺炎を有し、1つの偽のラットは救済不可能な腸との魅惑的な脱ヒスセンスを持っていた。別のRYGBラットは、胃二腸切除術からの鼻血性漏れのために2週間で安楽死させた。全体として、RYGBラットの88.9%がエンドポイントを研究するために生き残った。

体重
RYGBを受けているラットは、シャムラットよりも術後体重が低かった。図3 はラットの術後の絶対重量を示し 、図4 は術後にすべての時点で統計的に有意であった術後の体重変化を示している。14週で、RYGBを有するラットは6.4%の平均割合の体重変化を有し、恥の手術を受けたラットは23.7%であった(p = 0.0001)。

腹腔内グルコース耐性試験
空腹時血糖はいずれのコホート間でも有意に異なっていなかった。しかし、カーブの下の領域は、13週のシャム(18.1対23.8 mmol-h/L、p=0.046、 図5)と比較してRYGBで有意に低かったが、RYGB対シャムの場合は1週間(20.8対23.3 mmol-h/L、p=0.68)では同じであった。

図1:Roux-en-Y胃バイパス解剖学この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:高脂肪食の術前絶対重量;RYGB、ルー・アン・Y胃バイパスこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:高脂肪食の術後絶対重量;RYGB、ルー・アン・Y胃バイパスこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:高脂肪食の術後割合の体重変化。RYGB、ルー・アン・Y胃バイパスこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:胃バイパスと13週のシャムでの腹腔内グルコース耐性試験RYGB、ルー・アン・Y胃バイパスこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

RYGBは小さな胃袋(30mL未満)の作成と、ビリオ膵肢とルー四肢の作成を含む(図1)。ヒトでは、ビリオ膵肢は典型的には30〜50cmであり、胃残骸、肝臓および膵臓からの分泌物を輸送する。ルー四肢は通常、75〜150cmの長さであり、摂取した食品の主要なチャネルです。共通チャネルは、2つの肢が結合する場所に残っている小腸遠位であり、消化吸収の大部分が発生する場所であり、膵酵素および胆汁は摂取した食物¹⁷と混合する。

RYGBの減量のメカニズムは、マルチモーダルです。小さい胃袋は機械の制限によって食物摂取を減らす。バイパスは、小腸の重要な部分がカロリーおよび栄養素を吸収していないとして、マラボルプティブ成分をもたらす。最近, 研究は、同様にRYGBの後に減量に腸ホルモンが重要な役割を果たしていることを実証しています。.これらは主にグレリン、ペプチド-YY、コレシストキニン(CCK)、およびGLP-1ホルモン経路¹⁸を介して行う。

ラットモデルは、RYGBの体重と代謝効果の両方の背後にあるメカニズムを研究するための強力な方法を提供します。本論文では、有意な体重減少および代謝効果を有する低死亡率を有するRYGBプロトコルを提示する。オペレータが技術に慣れると、手順は約90分かかりました。プロトコルはまた、潜在的に減量と代謝効果を高めるために、より長いビリオ膵臓およびルー四肢の長さで変更することができます。さらに、手術用ステープラーを使用して止まり止めを達成し、手術時間を最小限に抑えることを可能にするため、技術的には他のモデルよりも実現可能です。ホチキス止めを行わずに胃の鋭い分裂に依存するモデルは、多くの場合、有意な失血のためにより高い死亡率をもたらす。この手順を実行するために必要な技術的スキルは比較的入手が容易で、学習者は約5〜10回の非回収手順の後に快適に手順を実行することができました。

このプロトコルの重要なステップの1つは、胃の動員中の失血を制限することです。血管の縫合結と組み合わせた熱焼灼器の注意深い使用が重要である。また、少なくとも半分のアナストモーゼの円周を中断された方法で行うことも重要です。これは、アナストモーゼで過度の厳格化を防ぎます。さらに、漏れのチェックは敗血症や死につながる可能性がありますので非常に重要です。腹部を閉じる前に、肝臓の左葉を自然な前葉位置に置き、内臓虚血を引き起こす可能性があるので、腸や胃の中に回転が存在することが不可欠です。

術後の注意は、このプロトコルに不可欠です。固体材料の消費は、アナストモティック障害につながるので、上げられたワイヤープラットフォームは、断食および術後の両方の期間に必要とされます。ラットは、即時術後の期間に経口液を許容しない可能性があるため、皮下液を提供することが極めて重要である。ラットは術後の痛みとの関連のために新しい食事を避けるかもしれないので、ラットは経口水分補給療法と流動食に順応する必要があります。この食事プロトコルは、RYGBとシャムコホートの両方で即時術後期間に有意な体重減少に寄与し、シャム群の体重回復は約5週間かかった。しかし、この術後のプロトコルの厳格な遵守は、RYGB後の罹患率と死亡率を減らすために不可欠です。さらに、ラットグリマズスケールを使用してラットの頻繁な検査は、罹患率を検出するために重要です。我々の研究では、1つのラットは、このスケールを使用して急速に検出され、早期安楽死が苦しみを減らすことを可能にする後期の解剖学的漏れを発症した。

この方法の利点の1つは、胃出血を軽減するために外科用ホッチを使用することにより、より小さなポーチをもたらすということです。ホチキスを使わずに胃を急激に分けようとすると、過度の出血と死亡率がはるかに高くなります。しかし、これはまた、前胃の除去につながり、これは人間のRYGBのそれとは異なる生理学的変化につながる可能性があります。しかし、前胃はげっ歯類に特有であり、腺を含まないし、腸ホルモンに変化を引き起こすべきではない。

この方法の最も重要な制限は、ラットあたり2つの外科的ホッチキスを必要とし、コストがかかる可能性があることである。しかし、優れた生存結果は、研究のためにより少ないラットを必要とすることによってコストを削減する可能性があり、その結果、畜産施設、外科用機器および研究要員のより良い利用をもたらす。

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Disclosures

エチコンは、2つの45mmリニア切断ステープラー、複数の3.5mmホッチキスリロード、および6-0ポリプロピレン縫合糸を供給しました。著者は、宣言する他の利益相反はありません。

Acknowledgments

この研究は、米国代謝・肥満外科学会研究賞によって資金提供されました。エチコンは優雅に縫合糸、ホッチキス、クリップを供給しました。主著者の博士研究は、アルバータ大学臨床医研究者プログラムとアルバータイノベートクリニアンフェローシップによって資金提供されました。また、RYGB解剖学の彼女の医学的イラストのためにミシェル・トランに感謝したいと思います。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 Silk Sutures	Ethicon	K533
3-0 Vicryl Sutures	Ethicon	J219H
4% Isoflurane	N/A	N/A
5% Dextrose and 0.9% Sodium Chloride Solution - 1000 mL	Baxter	2B1064
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
6-0 Prolene Sutures	Ethicon	8805H
Anesthetic Machine	N/A	N/A
Animal Hair Shaver	N/A	N/A
Betadine Solution	N/A	N/A
Castrojievo Needle Holder with lock 14 cm (smooth curved)	World Precision Instruments	503258
ECHELON FLEX Articulating Endoscopic Linear Cutter	Ethicon	EC45A
Economy Tweezers #4	World Precision Instruments	501978
ENDOPATH ETS Articulating Linear Cutter 45mm Reloads	Ethicon	6R45B
Far Infrared Warming Pad Controller with warming pad (15.2 cm W x 20.3 cm L), pad temperature probe, and 10 disposable, non-sterile sleeve protectors	Kent Scientific	RT-0515
Large Rat Elizabethan Collar	Kent Scientific	EC404VL-10
Liquid Diet Feeding Tube (150 mL)	Bio-Serv	9007
Liquid Diet Feeding Tube Holder (short adjustable)	Bio-Serv	9015
Micro Mosquito Forceps	World Precision Instruments	500452
Micro Scissors	World Precision Instruments	503365
Mouse Diet, High Fat Fat Calories (60%), Soft Pellets	Bio-Serv	S3282
No. 11 Blade and Scalpel Handle	N/A	N/A
OPMI Vario Surgical Microscope	ZEISS	S88
Raised Floor Grid	Tecniplast	GM500150 Raised Floor Grid
Rodent Liquid Diet, Lieber-DeCarli '82, Control, 4 Liters/Bag	Bio-Serv	F1259
Sodium Chloride Irrigation 0.9% Solution - 500 mL	Baxter	JF7633
Sterile Cotton Swabs	N/A	N/A
Sterile Drape	N/A	N/A
Sterile Towel	N/A	N/A
Thermal Cautery Unit	World Precision Instruments	501293