זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

הפרוטוקול מדגים שיטה מהירה לזיהוי חלבונים חיידקיים באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית וספקטרומטריית מסה. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא מהירות ופשטות. הכנת מדגם אינה מסובכת.

הטכניקה יכולה להיות מורחבת לאפיון של כל חיידקים פתוגניים, כגון גורמי ארס או עמידות לאנטיביוטיקה כדי ליידע טוב יותר טיפול מתאים לזיהום חיידקי. כדי להתחיל, השתמש בלולאת מיקרוליטר סטרילית אחת כדי לקצור חיידקים ממושבות בודדות הגדלות על צלחת אגר LB. ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה עם 2 מיליליטר עם מכסה בורג המכיל 300 מיקרוליטרים של מים באיכות HPLC.

לאחר מכן מערבולת לזמן קצר את הצינור ואת הכדור את התאים על ידי צנטריפוגה, ב 0.75 מיקרוליטר שריד מים של supernatant מדגם על יעד MALDI נירוסטה, ולאפשר לו להתייבש. לכסות את נקודת המדגם המיובשת עם 0.75 microliters של פתרון רווי של חומצה סינפינית מוכן 33%acetonitrile, 67%מים, ו 0.2% חומצה טריפלואורואצטית, ולאפשר את המקום להתייבש. ברגע שהנקודה מתייבשת, טען את המטרה בספקטרומטר המסה.

פתח את תוכנת הרכישה ולחץ על רכישת מצב ליניארי של MS או על טווח טעינה המונית ונפח לטעינה המונית של הגבולות התחתונים והעליון לשדות המתאימים שלהם. לחץ על הנקודה לדוגמה כדי להיות מנותח על תבנית היעד MALDI. לאחר מכן הלחצו את לחצן העכבר השמאלי וגררו את הסמן מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה או יינון בלייזר.

שחרר את לחצן העכבר כדי ליזום את הרכישה ולאסוף 1000 צילומי לייזר עבור כל נקודה לדוגמה. אם יונים אינם מזוהים להגדיל את עוצמת הלייזר על ידי התאמת סרגל סולם הזזה תחת עוצמת לייזר עד אות יון חלבון מזוהה. לאחר השלמת רכישת מצב ליניארי של MS, לחץ על רכישת מצב רפלקטורון MS/MS.

הזן את מסת המבשר שיש לנתח בשדה מסה מבשר. לאחר מכן, הזן רוחב בידוד בדלטון בחלון המסה של הקדמה עבור הצד המסה הנמוכה והגבוהה של המסה המבשרת. לחץ על לחצן כיבוי CID.

לאחר מכן לחץ על לחצן מדכא Metastable בהפעלה. התאם את עוצמת הלייזר ל-90% לפחות מהערך המרבי שלו על-ידי התאמת סרגל קנה המידה של ההזזה כפי שהודגם. לחץ על הנקודה לדוגמה שיש לנתח בתבנית היעד של MALDI, ולאחר מכן לחץ על לחצן העכבר השמאלי וגרור את הסמן מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה או יינון בלייזר, שחרר את לחצן העכבר כדי ליזום את הרכישה ולאסוף 10, 000 צילומי לייזר עבור כל נקודה לדוגמה כפי שהודגם.

לחץ פעמיים על קובץ ההפעלה של מחפש הסמן הביולוגי של חלבון, וחלון ממשק המשתמש הגרפי יופיע. הזן את המסה של הסמן הביולוגי של החלבון בשדה מסת חלבון בוגר, ואת שגיאת מדידת המסה בשדה סובלנות המונית. לחלופין, לחצו על כפתור מחשבון מסת חלבון החלבון המשלים b/y כדי לחשב את מסת החלבון מזוג יונים של שברים משלימים, והחלון הנפתח של כלי מחשבון מסת החלבון יופיע.

הזינו את יחס המסה לטעינה של זוג היונים של שברים משלימים, לחצו על הכפתור ‘הוסף זוג’ ומסת חלבון מחשבון תופיע. העתק הדבק ערך זה בשדה מסת חלבון בוגרת וסגור את חלון הכלי מחשבון מסת חלבון. לחץ על התיבה הגדר הגבלת שאריות.

בחר את אורך הפפטיד של אות מסוף הסיום, והחלון המוקפץ עם קנה מידה הזזה והסמן יופיע ויזיז את הסמן לאורך הפפטיד הרצוי. אם אורך הפפטיד של האות לא נבחר, תבוצע רצף בלתי מוגבל על-ידי התוכנה. תחת מצב יון קטע, בחר את שאריות עבור מחשוף עמוד השדרה של פוליפפטיד על-ידי לחיצה על התיבות של שאריות אחת או יותר, D-E-N ו/או P.ולאחר מכן לחץ על לחצן הזן יונים מקטעים פלוס אחד לחיפוש, ודף הקטע המוקפץ יופיע.

לחיצה נוספת על לחצן הוסף יון קטע, ושדה נפתח יופיע עבור כל יון קטעים להזנה. הזן את המסה לפי יחסי טעינה של יונים שבר והמסה המשויכת שלהם על ידי עמידות מטען. לאחר מכן לחץ על לחצן שמור וסגור.

בתיבה השמאלית של כמה שברים יונים צריך להיות תואם, גלול כדי לבחור את המספר המינימלי של יונים שבר שיש להתאים לזיהוי, ובחר את שאריות ציסטאין במצבם החמומצן. אם החלבונים אינם מזוהים לאחר החיפוש, חזור על החיפוש עם cysteines במצבם המופחת. תחת הגדרת הקובץ, לחץ על סמל קובץ SELECT FASTA כדי לעיין ולבחור את קובץ FASTA המכיל את רצפי חלבון סיליקו של זן החיידקים שנבנה בעבר.

לאחר מכן בחר תיקיית פלט וצור שם קובץ פלט. לחץ על הסמל הפעל חיפוש בערכי קבצים. יופיע חלון מוקפץ שכותרתו אישור פרמטרי חיפוש המציגים את פרמטרי החיפוש לפני תחילת החיפוש.

ואם פרמטרי החיפוש נכונים, לחץ על התחל חיפוש. אם הפרמטרים שגויים, לחץ על ביטול והזן מחדש את הפרמטרים הנכונים. לאחר תחילת החיפוש, חלון הפרמטר ייסגר ויופיע חלון מוקפץ חדש עם מד התקדמות, המציג את התקדמות החיפוש וספירה רצה של מספר הזיהויים שנמצאו.

עם השלמת החיפוש, מד ההתקדמות ייסגר באופן אוטומטי, וסיכום החיפוש יוצג בשדה יומן הרישום של ממשק המשתמש הגרפי יחד עם חלון מוקפץ חדש המציג את זיהויי החלבון שנמצאו. במחקר הנוכחי, תרביות חיידקים גדלו LB עם שני ריכוזים שונים של mytomycin-C. הספקטרום ההמוני של תרבית החיידקים גדל עם ריכוז מיטומיצין-C.

חלבון הלם קר C, חלבון הלם קר E, וחלבון נישא פלסמיד של תפקוד לא ידוע זוהו. יון החלבון הלא ידוע ב-9780 נותח על ידי טרשת נפוצה, והיון המבשר היה מבודד עם חלון בורר יונים של כ-100 דלטון. יון השבר במסה לטעון 9675.9 הוא שפיכה מן הניתוק של יון חלבון metastable ב 9655.

הרצף של חלבון החסינות עבור קולצין E3 מכיל שאריות בסיסיות אתרים אפשריים של יינון. יונים שבר זוהה מ מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד, כאשר הצורה המופחתת של ציסטאין שימשה במהלך החיפוש. מת’ionine N-מסוף מוסר כשינוי תרגום לאחר.

כאשר התרבות החיידקית גדלה בריכוז מיטומיצין-C גבוה, זוהה חלבון החסינות של הבקטריוצין. השיא הלא ידוע ב-9651 נותח על ידי MS/MS, והיון הקדמון היה מבודד עם חלון TIS צר יותר ואסימטרי של מינוס 75 ועוד 60 דלטון. רצף חלבון החסינות של בקטריוצין מכיל שאריות בסיסיות אתרים אפשריים של יינון.

יונים שבר זוהה מ מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד, כאשר הצורה המופחתת של ציסטאין שימשה במהלך החיפוש. עם הריכוזים השונים של אנטיביוטיקה, שפע חלבון יחסי עשוי להשתנות. ואלה נותחו באמצעות ספקטרומטריית מסה.

בעת קצירת תאים חיידקיים, התבונן במורפולוגיה של המושבה ובצמיחה חיידקית ביחס לאנטיביוטיקה וריכוז. לולאת מיקרוליטר אחת של תאים נחוצה כדי לזהות חלבונים.