Summary
Den kroniske fortvivlelsesmusemodel (CDM) af depression består af gentagne tvungne svømmesessioner og en anden forsinket svømmefase som udlæsning. Det repræsenterer en egnet model til induktion af en kronisk depressiv-lignende tilstand stabil i mindst 4 uger, der kan ændres til at evaluere subkroniske og akutte behandlingsinterventioner.
Abstract
Major depressiv lidelse er en af de mest udbredte former for psykiske sygdomme og forårsager enorm individuel lidelse og socioøkonomisk byrde. På trods af dens betydning er den nuværende farmakologiske behandling begrænset, og der er et presserende behov for nye behandlingsmuligheder. En nøglefaktor i søgningen efter potentielle nye lægemidler er at evaluere deres antidepressive styrke i passende dyremodeller. Den klassiske Porsolt tvungne svømmetest blev brugt til dette formål i årtier for at fremkalde og vurdere en depressiv-lignende tilstand. Den består af to korte perioder med tvungen svømning: den første for at fremkalde en deprimeret tilstand og den anden den følgende dag for at evaluere den antidepressive virkning af midlet givet mellem de to svømmesessioner. Denne model kan være egnet som et screeningsværktøj for potentielle antidepressive midler, men ignorerer den forsinkede indtræden af virkning af mange antidepressiva. CDM blev for nylig etableret og repræsenterede en ændring af den klassiske test med bemærkelsesværdige forskelle. Mus er tvunget til at svømme i 5 på hinanden følgende dage efter tanken om, at depression hos mennesker induceres af kronisk snarere end af akut stress. I en hvileperiode på flere dage (1-3 uger) udvikler dyr vedvarende adfærdsmæssig fortvivlelse. Standardudlæsningsmetoden er måling af immobilitetstid i en yderligere forsinket svømmesession, men der foreslås flere alternative metoder for at få et bredere overblik over dyrets humørstatus. Flere analyseværktøjer kan bruges målrettet mod adfærdsmæssige, molekylære og elektrofysiologiske ændringer. Den deprimerede fænotype er stabil i mindst 4 uger, hvilket giver et tidsvindue for hurtige, men også subkroniske antidepressive behandlingsstrategier. Desuden kan ændringer i udviklingen af en depressiv-lignende tilstand behandles ved hjælp af denne tilgang. CDM repræsenterer derfor et nyttigt redskab til bedre at forstå depression og udvikle nye behandlingsinterventioner.
Introduction
Affektive lidelser, såsom større depressiv lidelse, er blandt de hyppigste og mest udfordrende psykiske sygdomme og er forbundet med høj individuel lidelse1, en stigning i selvmordsrisikoen2 og forårsager en betydelig socioøkonomisk byrde3 for samfundet. På trods af dens indvirkning er behandlingsmulighederne begrænsede, og der er et presserende behov for udvikling af nye antidepressive interventioner, især på grund af innovationskrisen inden for psykofarmakologi i de sidste årtier. For at forstå depressionens patofysiologi og teste potentielle nye agenser er der et presserende behov for rationelle og gyldige dyremodeller4. I næsten et halvt århundrede blev den klassiske tvungen svømmetest (FST), oprindeligt beskrevet af Porsolt5, brugt som induktion og udlæsning til screening af potentielle nye antidepressiva. Den består af en tvungen svømmeperiode i 5-15 min på dag 1, efterfølgende engangslægemiddelanvendelse og evaluering af den del, mus tilbringer immobilt i vand i en anden svømmeperiode den følgende dag. Immobilitetstiden blev anset for at repræsentere en manglende naturlig flugtadfærd og blev anset for at korrelere med graden af en depressionslignende tilstand hos musene5.
Den klassiske FST er blevet stærkt kritiseret, ikke kun i det videnskabelige samfund6,7,8, men også i offentlige medier8. De fleste kontroverser omkring FST skyldes de korte induktions- og behandlingsperioder på kun 1 dag i det klassiske paradigme. Det blev hævdet, at FST snarere repræsenterer en akut traumemodel end en tilstand, der kan sammenlignes med menneskelig depression. Desuden kan Porsolt-testen være egnet som et screeningsværktøj til potentielle antidepressive midler, men det ignorerer den forsinkede indtræden af virkningen af mange antidepressiva.
Den kroniske fortvivlelsesmodel (CDM)9,10,11,12,13,14,15, som er afledt af den oprindelige FST, repræsenterer en mere passende dyremodel for depression. I CDM undgår gentagen svømmestress over 5 på hinanden følgende dage akutte traumatiske virkninger. Ved ikke at flygte fra en gentagen og vedvarende stressende situation menes mus at udvikle en tilstand af hjælpeløshed, overgivelse og i sidste ende fortvivlelse. Dette paradigme er mere sammenligneligt med nuværende psykologiske teorier for udvikling af depression hos mennesker end et enkelt akut traume, som almindeligvis opleves ved begyndelsen af en posttraumatisk stresslidelse. Den resulterende depressionslignende tilstand i CDM er stabil i op til 4 uger9 og åbner derfor mulighed for længere behandlingsperioder, som bedre kan sammenlignes med kliniske tilstande, hvor antidepressiva normalt har brug for 2-4 uger for at vise en fordel16.
Evalueringen af den depressive-lignende tilstand bør så være flerdimensionel. Måling af immobilitetstid, som i den klassiske FST, er nyttig, men bør ikke bruges som den eneste resultatparameter. Forskellige metoder, som er beskrevet nedenfor, bør være i stand til at kortlægge forskellige dimensioner af en depressiv tilstand i overensstemmelse med symptomer, der normalt findes hos deprimerede mennesker. Egnede udlæsningsvurderinger kan omfatte flugtadfærd (immobilitetstid9,10,17), halesuspensionstest (TST)9, anhedonia (klassisk saccharosepræferencetest (SPT)18), motivationsorienteret adfærd (næse-poke saccharosepræferencetest (NPSPT)10), forventning / udforskningsadfærd (reaktion på tvetydigt signal19; Y-labyrinttest9), elektrofysiologi (målinger af langsigtet plasticitet (langsigtet potensering, LTP; langtidsdepression, LTD)20), molekylære vurderinger (aktiveringsmønstre for umiddelbare tidlige gener (IEG'er); yderligere stressmønstre21).
Teoretisk set kan en gentagen svømmetest bruges til at fremkalde en deprimeret tilstand uden nogen vurdering af immobilitetstiden. Det anbefales dog kraftigt at levere mindst en proof-of-concept eksperimentel serie med immobilitetstider. Derudover repræsenterer CDM en passende model til at vurdere udviklingen af en depressiv-lignende tilstand ved at måle immobilitetstiden i induktionsfasen. Specifikke musestammer eller mus, der behandles før svømning, kan evalueres med hensyn til modstandsdygtighed eller sårbarhed over for stress og induktion af adfærdsmæssig fortvivlelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med europæiske retningslinjer (EU 2010/63) og i overensstemmelse med den tyske dyrebeskyttelseslov (TierSchG), FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php), det nationale dyrevelfærdsorgan GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af dyrevelfærdsudvalget ved Freiburg Universitet og af Comite d'Ethique en Matiere d'Experimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS, CEEA35) samt lokale myndigheder. Begge køn af C57Bl6N-vildtypemus i alderen 10-14 uger (70-98 postnatale dage, PND) blev anvendt til vildtype (WT) indikerede eksperimenter. Som en stressbestandig linje blev den transgene muselinje med forbedret ekspression af adenosin A1-receptorer under forhjernen neuronal CaMKII-promotor anvendt9,15. Efter forsøgene blev mus ofret ved cervikal dislokation.
1. Forberedelse
- Få en dyreforsøgstilladelse, herunder grundig eksperimentel planlægning.
- Ankomst: Ved ankomsten opdrættes dyrene i dyreanlægget for at udføre CDM. Hvis dyrene købes hos en ekstern leverandør, skal du give dem mindst 2 uger til at tilpasse sig det nye miljø.
- Boliger: For at huse dyrene skal du sørge for, at burene ikke er optaget af det maksimale antal dyr for at undgå yderligere stress. Garantere, at boligforholdene er i overensstemmelse med internationale anbefalinger fra musehuse (for yderligere information, se22), og konstant vedligeholde dem til enhver tid.
BEMÆRK: De vigtigste standardforhold omfatter individuelt ventilerede bure med 25-120 luftskift i timen, 12 timers lys-mørk cyklus, temperatur så stabil som muligt (mindst konstant mellem 20-24 °C), fugtighed så stabil som muligt (mindst mellem 45% -65%), gnavemateriale og husly til stede, intet individuelt hus. - Tidspunkt: Udfør alle eksperimenter på samme tidspunkt af dagen.
BEMÆRK: Der er ikke foretaget nogen direkte vurdering for at verificere dagtimernes indflydelse på CDM, men de fleste adfærdstest, der evaluerer depressive-lignende tilstande, viser variationer afhængigt af tidspunktet på dagen23,24,25, og det er meget sandsynligt, at dagtimerne også påvirker CDM. - Redemateriale: Reducer redematerialet til et minimum. Sørg for, at der ikke er nogen løbehjul osv. til stede i buret.
BEMÆRK: Beriget miljø forhindrer induktion af en deprimeret tilstand. - Gruppesammensætning: Lad dyrene forblive i samme gruppe under hele forsøget. Gruppér hunmusene sammen selv fra forskellige kuld; gruppere hanmusene sammen med kuldkammerathandyr. På grund af kommende aggressivitet, især hos mænd, kan bid og barbering blive et problem, og derfor lægge særlig vægt på gruppesammensætningen. Undgå enkeltboliger, da afsavn er en stor ekstra stressor.
- Dyr: Brug forskellige musestammer, selvom der er observeret specifikke forskelle9,10. En hyppigt anvendt musestamme er C57Bl6N. Mærk mus for at udføre parret statistisk analyse (se trin 3.2.4).
- Dyrekøn: Brug ligeledes både han- og hunmus.
- Dyrenes alder: Sørg for, at dyrene er mindst 10 uger (70 PND) gamle. Brug ikke yngre dyr på grund af udmattelse forårsaget af svømning.
- Udstyr: Brug en gennemsigtig glascylinder/bægerglas med en kapacitet på mindst 2 L, en diameter på 24-26 cm og en minimumshøjde på 30 cm. Yderligere krav omfatter et termometer til kontrol af vandtemperaturen, papirhåndklæder, rød lys varmelampe / varmemåtte eller sammenlignelig varmekilde, timer, stopur, rolige omgivelser. Videobånd svømmesessionerne til offline analyse og dokumentation. Sørg for, at dato og klokkeslæt løbende er synlige på båndet/filen sammen med et identifikationskodenummer for det enkelte dyr. Gem filerne til senere analyse og yderligere reference. Film fra siden af glascylinderen, ikke ovenfra, for at lette analysen.
2. Induktionsfase
- Før du starter
- Overhold visuelt dyrene for abnormiteter, herunder tegn på bid eller barbering. Ekskluder hele buret fra forsøgsserien, hvis et dyr viser minimale skader. Sørg for, at en dyrlæge er tilgængelig til enhver tid, da skader vil forværres under forsøget og forhindre fortsættelse, da mus bliver mere aggressive under påvirkning af stress.
- Få kropsvægten for hvert dyr, inden forsøget påbegyndes. Sørg for, at det vægttab, der ofte observeres, ikke overstiger 20% af den oprindelige kropsvægt. Ekskluder dyr med et vægttab på over 20% og afliv dem straks på grund af den formodede høje lidelse.
- Et bægerglas eller en cylinder fyldes med vand ved stuetemperatur (22-23 °C) i en højde på mindst 20 cm fra bunden, hvoraf mindst 10 cm efterlades mellem vandoverfladen og beholderens øvre kant.
- Præstation
- Overfør forsigtigt dyrene i vandet. I svømmefasen skal du holde dyret under kontinuerlig observation for at forhindre drukning. Observer fra en position, hvor dyret ikke kan se eksperimentatoren (for eksempel videoobservation fra et rum ved siden af).
- Indstil et kronometer i begyndelsen af eksperimentet. Tag dyrene op af vandet efter 10 min ved blot at tage fat i halen. Tør dem forsigtigt med et papirhåndklæde og læg dem enten under et varmelys eller på en varmemåtte.
- Evaluer kun et dyr ad gangen. Sørg for, at dyrene ikke kan se hinanden (f.eks. adskille staldburet fra forsøgsopsætningen ved hjælp af en rumdeler).
- Udfør den tvungne svømmesession i 10 minutter hver dag i 5 på hinanden følgende dage.
- Efterbehandling
- Overfør dyrene tilbage til deres hjemmebure efter fem svømmesessioner og lad dem hvile i mindst 2 dage. Start specifikke behandlingsinterventioner efterfølgende.
3. Evaluering af en antidepressiv behandling
- Tidsforløb
- Vurder de akutte og subkroniske behandlinger med CDM. Afhængigt af det videnskabelige spørgsmål skal du tilpasse hvileperioden mellem induktionsfasen og udlæsningen.
- For at evaluere den akutte og hurtigtvirkende styrke af ketamin, vælg en kort hvileperiode (et par dage) efter induktionsfasen af CDM. Anvend behandlingen (dvs. intraperitoneal injektion), og udfør derefter evalueringen (yderligere svømmesession eller anden evalueringsmetode) kort tid efter.
- For at evaluere virkningerne af en subkronisk behandling skal du øge behandlingsperioden op til 4 uger (der er ingen data tilgængelige for længere behandlingsperioder). Giv f.eks. den orale behandling med imipramin til dyrene i løbet af 4 uger efter induktionsfasen og vurder derefter.
- Begynd at evaluere den deprimerede tilstand lige efter afslutningen af behandlingsperioden, f.eks. den følgende dag. Vælg altid en identisk tidsperiode for kontrol og eksperimentelle forhold.
- Immobilitet tid
- Proof-of-concept
- For at bruge immobilitetstid som en udlæsningsmetode skal du evaluere hver dag i induktionsfasen og testdagen for at give et proof-of-concept (se figur 1). For yderligere eksperimentelle serier reduceres vurderingerne til dag 1, dag 5 og testdagen (se figur 1C).
- Videobånd hvert eksperiment. Tillad to uddannede observatører, der er blindet for de eksperimentelle forhold, at udføre analysen uafhængigt. Videoanalyse gør det muligt for eksperimentatoren at observere adfærden fra et andet rum og dermed minimere interferensen med testen (se f.eks. Videofilen i det supplerende materiale).
- Betingelser: Overhold og identificer de tre forskellige adfærdsmæssige forhold under svømmetesten: kamp, svømning og immobilitet. De fleste forskere fokuserer på immobilitet; en yderligere differentiering mellem kamp og svømning er sjældent nyttig og øger analysens kompleksitet og varighed dramatisk.
- Kæmper: Dyret forsøger aktivt at flygte fra den truende situation. Dette indebærer pote siden af cylinderen med hovedet orienteret mod væggen og bevægelser af alle lemmer. Vandoverfladen er typisk lidt turbulent.
- Svømning: Dyret bevæger sig i det mindste begge bagpoter og bevæger sig en afstand gennem vandet. Det søger aktivt efter en vej ud, men forsøger ikke at overvinde skibets glasvæg. Svømning indebærer ikke at løfte poterne over vandoverfladen, og kroppen er normalt orienteret parallelt med cylinderens vægge. I denne tilstand vender dyrene ofte rundt eller bevæger sig i cirkler.
- Immobilitet: Dyret holder stille, i en fryselignende position, og bevæger sig slet ikke eller bevæger kun halen eller forpoterne for at holde hovedet over vandoverfladen. Ingen afstand tilbagelægges aktivt bortset fra passiv flydende, og der observeres ingen rettet bevægelse af de forreste poter.
- Tracking
- Udfør vurderingen ved hjælp af offline videooptagelser. Brug blindede bedømmelser af to uafhængige og erfarne eksaminatorer og beregn gennemsnit mellem de to bedømmelser.
- Gentag vurderingerne, hvis resultaterne af de to raters afviger over et tidligere bestemt interval. Observer kontinuerligt musene, da de forskellige forhold ofte skifter mellem kamp, svømning og immobilitet.
- Brug et stopur til at måle den samlede tid brugt i et fokuseret stadium (normalt immobilitet) over de 10 minutter, musen forbliver i vandet. Overvej en kort latenstid på ca. et sekund, før du ændrer den igangværende tidsmåling (f.eks. Hvis et dyr forbliver i 20 s i immobilitet og kun bevæger sig en gang i mindre end et sekund og vender tilbage til immobilitet i yderligere 10 s, er den samlede immobilitetstid 30 s).
- Statistik: På grund af den relativt høje inter-individuelle standardafvigelse (sandsynligvis forårsaget af en overførsel af hierarki-afhængig adfærd fra buret til svømmetesten), skal du markere eller mærke dyrene til at udføre parrede (i stedet for uparrede) parametriske tests bagefter. Evaluer normalitetsfordelingen, og udfør afhængigt af det specifikke spørgsmål variansanalyse (ANOVA) med post-hoc t-test eller parrede t-tests for at sammenligne de forskellige grupper. Udfør analysen ved hjælp af absolutte værdier af immobilitetstid (er) eller som normaliserede værdier.
- Absolutte værdier: Angiv gennemsnitsværdier for immobilitetstiden fra dag 1 til dag 5 og for testdagen ± SEM (se figur 1A). Sammenlign de gennemsnitlige værdier for dag 1 og dag 5, helst ved hjælp af en parret t-test for at validere induktionen af en deprimeret tilstand. Hvis der er en signifikant forskel mellem dag 1 og 5, skal gennemsnitsværdierne for dag 5 sammenlignes med de gennemsnitlige resultater af testdagen. Sørg for, at en typisk gruppestørrelse i et forsøg er mellem 6 og 10 dyr, og forvent betydelige forskelle mellem baseline og post-induktion immobilitetstider hos vildtypedyr. Det er vanskeligt at sammenligne forskellige grupper med en uparret t-test, hvis der anvendes absolutte værdier på grund af baselineforskelle; Brug derfor normaliserede værdier.
- Relative/normaliserede værdier: Sammenlign de forskellige behandlingseffekter ved normalisering med det enkelte resultat på dag 5, og udtryk derefter værdierne som en procentdel af dag 5 (se figur 1B).
- Kontrol eksperimenter
BEMÆRK: Svømmepræstationen kan være korreleret med bevægelse. Stoffer, der forårsager en hyperbevægelse, kan fremkalde falsk-positive resultater (nemlig et fald i immobilitetstiden); såvel som beroligende midler kunne kunstigt øge immobilitetstiden.- Evaluer ændringerne i bevægelse for ukendte stoffer, inden du udfører svømmeanalysen. Brug Open Field Test (OFT) i en separat gruppe dyr i mindst 10 minutter.
- Vælg den samme observationstid (10 min) i OFT som i CDM for at detektere uspecifikke hyperlokomotiveffekter af den testede forbindelse, der kan påvirke CDM-udlæsning via måling af immobilitetstid med høj validitet.
- I tilfælde af signifikante hyperlokomotiveffekter skal du ikke evaluere svømmesessionen for at vurdere den antidepressive styrke, men bruge forskellige udlæsningsmetoder (for eksempel saccharosepræference, halesuspensionstest osv.).
- Proof-of-concept
4. Evaluering af udviklingen af en depressiv-lignende tilstand
- For at evaluere udviklingen af en depressiv lidelse skal du vurdere hver dag i induktionsfasen for at måle immobilitetstiden.
BEMÆRK: I dette tilfælde beskriver en mindre stigning i immobilitetstiden mellem hver dag modstandsdygtighed, mens en stærkere og tidligere stigning sammenlignet med ubehandlede eller vildtypedyr repræsenterer en øget sårbarhed over for stressinduceret fortvivlelse. Ved at behandle mus før svømmebegivenheden kunne den forebyggende intervention eller transgene muselinjer vurderes med hensyn til udviklingen af adfærdsmæssig fortvivlelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den første svømmesession i induktionsfasen af CDM viser mus normalt en gennemsnitlig immobilitetstid mellem 190 s og 230 s, som konstant stiger med hver ekstra svømmesession (figur 1A). Denne stigning er mere udtalt i de første 3 dage og når en plateaulignende fase i løbet af de sidste 2-3 dage. Immobilitetstiden målt på dag 5 forbliver stabil over op til 4 uger, hvilket indikerer stabil adfærdsmæssig fortvivlelse. Den antidepressive styrke af en intervention kan evalueres ved at behandle dyret mellem den sidste dag i induktionsfasen og testdagen. Bemærk, at den absolutte scoringstid under svømmesessionerne er ret subjektiv og afhænger af eksperimentatoren, alder, køn og den anvendte muselinje. Den relative forskel mellem sessionerne er dog ret stabil med kun små interraterforskelle.
I figur 1 er der vist flere repræsentative behandlinger. Imipramin, søvnmangel og ketamin reducerede immobilitetstiden signifikant, mens søvnmangel kombineret med en restitutionssøvn ikke viste en signifikant ændring af den depressive fænotype. Disse resultater er i overensstemmelse med en antidepressiv styrke af de anvendte behandlinger og ligner virkninger observeret hos humane patienter. Behandlingen omfattede indtagelse af imipramin 20 mg/kg/dag i 3 uger via drikkevand, 3 mg/kg ketamin ved en enkelt intraperitoneal injektion 24 timer før testning og søvnmangel i 6 timer før testning.
Afhængigt af forskningsspørgsmålet kan forskellige repræsentationer vises. En repræsentation af absolutte værdier kan give et reelt dataoverblik og muliggør en god evaluering af induktionsfasen og af en enkelt behandling (figur 1A,D). Forskellene i forskellige behandlinger kan imidlertid ikke sammenlignes direkte; derfor har hver behandlingsgruppe forskellige middelværdier af immobilitetstid på dag 5. Derfor anbefales det at anvende repræsentationen af normaliserede middelværdier i dette tilfælde (figur 1B). En reduceret repræsentation kan vælges på grund af pladsbegrænsninger (figur 1C). Bemærk, at det er obligatorisk at vise mindst resultaterne af dag 1, dag 5 og testdagen.
Figur 1: Succesfulde resultater i absolutte og normaliserede værdier. (A) Vellykket induktion af en deprimeret tilstand hos 30 mus kan observeres. Hver prik repræsenterer et enkelt dyrs immobilitetstid på en bestemt dag, og søjler repræsenterer gennemsnitsværdierne for de testede dyr. Immobilitetstiden er repræsenteret for hver dag i induktionsfasen (dag 1 til dag 5) og for testdagen (efter den prikkede linje) med eller uden behandling. Bemærk, at der i denne prøve kan observeres en signifikant stigning mellem dag 1 og dag 2. I nogle tilfælde opnås signifikansniveauer først mellem dag 1 og dag 3. For fortsættelsen af eksperimentet er en statistisk signifikant stigning mellem dag 1 og dag 5 obligatorisk. Bemærk den typiske loftseffekt (stigning mellem dag 1, 2 og 3 sammenlignet med forskellen mellem dag 4 og 5). Mellem dag 5 og testdagene blev dyrene opholdt i 4 uger i deres hjemmebure, enten uden yderligere behandling (CDM) eller behandlet med imipramin (Imip.); søvnmangel (SD); søvnmangel og restitution søvn (RS) og ketamin (Ket). (B) Der gives eksemplarisk tidsforløb for de enkelte dyrs præstationer for hver dag. (C) Normaliseret repræsentation af de samme resultater, der allerede er vist i figur 1A. Immobilitetstiden for hvert dyr og dag blev normaliseret til den tilsvarende immobilitetstid på dag 5 og udtrykt i procent. Efterbehandlingsværdier for forskellige grupper kan bedre vises og sammenlignes ved hjælp af denne tilgang. (D) Repræsentation af normaliserede værdier for dag 1, dag 5 og testdagen (CDM). Efter en vellykket proof of concept-undersøgelse kan evalueringstidspunkterne reduceres til dag et, dag fem og testdagen. Disse tidspunkter er nødvendige, fordi en signifikant stigning mellem dag 1 og dag 5 er nødvendig for at demonstrere en vellykket induktion, og dag 5 skal sammenlignes med testdagen for at give en erklæring om behandlingseffektivitet. (E) Sammenligning af immobilitetstiden for tre forskellige muselinjer: Wildtype (WT) viser en vellykket induktion; en eksemplarisk elastisk linje (RL) viser en signifikant nedsat depressionslignende adfærd på de første tre dage og på testdagen. Envejs ANOVA med Bonferroni post hoc test: ∗/#p < 0,05, ∗∗/##p < 0,01, ∗∗∗/###p < 0,001, ∗∗∗∗/####p < 0,0001. (#angiv forskel til middelværdier for dag 1, ∗indiker forskel til middelværdier for dag 5 i figur 1A, C og til WT-muselinje i figur 1E). Data udtrykkes som det middel, ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
I tilfælde af en uændret immobilitetstid i løbet af alle de 5 dage (figur 2) var den anvendte stress ikke i stand til at ændre adfærden relevant, og ingen behandlingseffekter kan evalueres; dyr skal ofres og må ikke anvendes yderligere.
Figur 2: Mislykkede resultater. En repræsentation af en ineffektiv induktion er vist i figuren. Bemærk, at der ikke forekommer nogen signifikant stigning i immobilitetstiden mellem dag 1 og dag 5. Derfor blev kriterier for fortsættelse af eksperimentet ikke opnået, og ingen yderligere forlængelse er rationel (i dette tilfælde blev kun hanmus testet, og efter retrospektiv undersøgelse blev det konstateret, at de ikke var kuldkammerater). Klik her for at se en større version af denne figur.
Yderligere udlæsningsmetoder skal bruges til at beskrive et bredere syn på dyrenes adfærdsmæssige fortvivlelse. En række adfærdsmæssige tests, elektrofysiologiske målinger og molekylære vurderinger af stressinducerede ændringer er tilgængelige. Eksemplariske resultater for Tail Suspension Test (TST) med CDM-, imipramin- og ketaminbehandling, Nose-poke-Sucrose Preference Test (NPSPT) og vurdering af langsigtet potensering ved hjælp af patch-clamp-teknikken er angivet i figur 3. Disse resultater tilskynder til at bruge CDM-induktionsfasen som et generelt værktøj til induktion af adfærdsmæssig fortvivlelse. For yderligere oplysninger om de anvendte teknikker (TST, NPSPT, LTP-vurdering) se9,10,17,20.
Figur 3: Yderligere resultater med CDM-mus. (A) En eksemplarisk repræsentation af virkningerne af CDM i Tail Suspension Test. Mus blev suspenderet af deres hale, og den tid, der blev brugt immobil, blev registreret (for metodologiske detaljer se9). Hver prik repræsenterer et enkelt dyrs immobilitetstid, og søjler repræsenterer gennemsnitsværdierne for de testede dyr. Envejs ANOVA med Bonferroni post hoc test: ∗∗∗p < 0,001. Data udtrykkes som det middel, ± SEM. (B) Repræsentative resultater af den nyligt etablerede nose-pokes saccharose præference test i CDM mus. I denne opgave blev saccharosepræference målt med gradvis stigende indsats for at nå saccharoseflasken (antal næsepokes) (for metodologiske detaljer se10). Bemærk, at saccharosepræference blev reduceret i CDM, og at forskellen mellem CDM og kontrolmus gradvist øges med indsatsen (gennemsnitsværdier af næsestik på hver dag angivet som Nspk1-7) mus måtte anvende for at drikke den søde opløsning. Tovejs ANOVA med Bonferroni post hoc test: ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001. Data udtrykkes som middel ± SEM. (C) CDM-afhængige ændringer i langsigtet synaptisk plasticitet præsenteres som ændringer af gennemsnitsværdier af EPSP'er efter anvendelse af en associativ LTP-induktionsprotokol i hippocampale hjerneskiver af WT-mus. Data blev opnået ved stimulering af CA3-CA1-synapsen (for detaljer se17,20). Uparret t-test, ∗∗p < 0.01, data udtrykkes som middel ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende materiale. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CDM-modellen repræsenterer en relevant og etableret model til test af den antidepressive styrke af nye interventioner og åbner et forlænget tidsvindue for molekylære eller elektrofysiologiske eksperimenter for at belyse depressionens patofysiologi. Især når det kombineres med andre tests for at vurdere en depressionslignende tilstand, har CDM en høj ansigts- og konceptgyldighed. Det kombinerer subkronisk stress og erhvervet hjælpeløshed til induktion og producerer en langvarig depressiv-lignende tilstand. Det er ufølsomt over for den enkelte anvendelse af klassiske antidepressiva, men reagerer på subkronisk anvendelse og efterligner derfor situationen hos mennesker. I et tidsvindue på 4 uger viser mange forskellige antidepressive interventioner effektivitet, lige fra forskellige klasser af antidepressiva, ikke-invasiv hjernestimulering, søvnmangel til hurtigtvirkende antidepressiva9,10,11. Desuden kan måling af immobilitetstiden i induktionsfasen anvendes som markør for stressrobusthed eller -sårbarhed i tilfælde af test af transgene dyr eller mus, der er behandlet før induktionsfasen. Alt i alt er CDM økonomisk med hensyn til omkostninger, varighed, standardisering og reproducerbarhed mellem laboratorier. Selvom præstationen virker ret simpel - "du taber en mus i et vandfartøj og tager den ud efter 10 minutter" - der er flere kritiske punkter, der skal huskes for at opnå rimelige og stabile resultater. De fleste problemer skyldes utilstrækkelig nøjagtighed under forberedelse eller analyse.
Et almindeligt oplevet problem er, at mus, især hanner, ikke viser en signifikant stigning i immobilitetstiden i induktionsfasen. I disse tilfælde kan mus allerede have været stressede, før induktionen starter; derfor forårsager yderligere stress under svømmeprotokollen ikke en relevant stigning i fortvivlelse. Bemærk, at immobilitetstiden synes at have en loftseffekt, da stigningen mellem dag 1 og 2 er større end mellem henholdsvis dag 2 og 3. Efter dag 3 kan der normalt ikke forventes yderligere signifikant stigning. Almindelige årsager til overdreven baseline stress kan omfatte nylig transport af dyrene eller samliv mellem unge / voksne handyr, en tilstand, der aldrig forekommer i naturen. Derfor bør eksperimentatoren være forsigtig og altid forsikre, at dyr er kuldkammerater, at de havde tid nok til at akklimatisere sig til de nye omgivelser, og at der ikke er tegn på at bide eller barbere, før eksperimentet starter. Desuden skal dyrene vejes hver dag, og vægttabet skal kontrolleres, så det ikke overstiger 20 % af den oprindelige kropsvægt. Et større vægttab betragtes som kritisk på grund af det faktum, at gentagen svømning er udmattende, og dyr, der ikke er i stand til at opretholde deres kropsvægt, lider for meget af denne udmattelse. Et kritisk punkt her er, at dyr, der lider for meget af udmattelse, sandsynligvis ikke er i stand til at svømme eller kæmpe i 10 minutter under testen. Når immobilitetstider for disse dyr analyseres, har de en tendens til at vise et falsk negativt resultat på grund af fysisk udmattelse.
En anden problematisk omstændighed, der undertiden opstår, især når der kræves længere behandlingsperioder, er et spontant fald i immobilitetstiden i testevalueringen. Efter 4 uger falder immobilitetstiden normalt sammenlignet med vurderinger udført 2 dage efter afslutningen af induktionsperioden (N.B. dette svarer, men med en anden tidsskala, til situationen hos mennesker, hvor deprimerede episoder normalt er selvbegrænsende). For at minimere denne faldgrube bør det garanteres, at der ikke påføres unødvendigt redemateriale på dyrets hjemmebur, hvilket kan betragtes som et effektivt antidepressivt indgreb (beriget miljø). Desuden kan en stigning i gruppestørrelse bidrage til at mindske variansen. Om nødvendigt kan der tilføjes en ekstra svømmesession som en ændring af standardprotokollen beskrevet ovenfor. For eksempel kan en stigning fra fem til syv svømmesessioner på 7 på hinanden følgende dage udføres og bør resultere i en mere stabil deprimeret tilstand hos dyrene. Det anbefales ikke at øge varigheden af den enkelte svømmesession yderligere for at undgå overdreven udmattelse.
Der er ingen enighed i det videnskabelige samfund om den mest fornuftige tidsramme, der skal analyseres. Mens nogle grupper anser alle 10 min for vigtige9,10, hævder andre, at adfærden inden for de første par minutter repræsenterer en akut stresssituation og kun analyserer de sidste 4 min eller 6 min18. Sidstnævnte antagelse er hovedsagelig afledt af den almindelige praksis i evalueringsprocessen for den klassiske FST. Eksperimentelle beviser, der adresserer spørgsmålet om den mest rationelle tidsramme, der skal analyseres i CDM, mangler. Forskellige højtstående publikationer brugte analysen af hele 10 minutter i CDM9,10.
På trods af et stigende antal kommercielt tilgængelige software til automatiseret videoanalyse har ingen opsætning vist tilstrækkelig nøjagtighed til at erstatte en uddannet observatør. Det meste software er afhængig af sporing af bevægelse af mus i vandet og kræver en kameraposition ovenfra. Vurderinger foretaget af dygtige mennesker har den fordel, at ikke kun bevægelse, men også antaget hensigt om mere komplekse bevægelser kan vurderes, herunder intensiteten af potebevægelser. For eksempel bevæger mus sig ofte ved at dreje rundt om deres krop eller ved subtile halebevægelser for at holde hovedet over vandet, hvilket software normalt sporer som svømning. Et andet eksempel er bevægelsen rettet mod fartøjets glasvæg, herunder hyppig næse stukket fra kort afstand. På trods af den klare hensigt om at undslippe ved lodrette bevægelser sporer softwaren ofte immobilitet på grund af lidt bevægelse. Nøjagtige og pålidelige vurderinger er dog fortsat vanskelige og tidskrævende. Det anbefales at træne en rater af en erfaren eksperimentator og udarbejde fælles vurderinger af prøvevideoer af de to uafhængige raters for at diskutere fælles definitioner og tvetydigheder. Desuden bør de første resultater af et laboratorium med CDM sammenlignes med tidligere offentliggjorte resultater fra andre grupper.
Forskere, der bruger CDM, kan ofte opleve forestillingen om, at øget immobilitet er en ret intelligent ende energibesparende lært reaktion fra mus på en uundgåelig, men midlertidig stressende situation. Efter vores mening overvurderer dette musens kognitive fleksibilitet; Det understreger imidlertid nødvendigheden af yderligere vurderinger af en deprimeret tilstand uafhængig af immobilitetstid. Det kan endvidere hævdes, at andre veletablerede dyremodeller for depression som kronisk mild stresstest giver lignende resultater; og at en deprimeret tilstand eller stærke stressfaktorer hæmmer, ikke øger læringen både hos mennesker og hos dyr17,20,26,27,28,29,30.
Dyrenes byrde vurderes normalt som høj til ekstrem i dyreforskningsapplikationer. Forsøgsserier bør planlægges grundigt for at minimere antallet af dyr, og dyr skal behandles med omhu og respekt før og efter svømmesessionerne. I nogle lande er det dog muligvis ikke muligt at få en dyreforskningslicens til CDM. CDM tillader vurdering af antidepressiv effekt af en bred vifte af interventioner og induktion af en relativt stabil deprimeret tilstand. Heterogeniteten og kompleksiteten af større depressiv lidelse hos mennesker kan ikke replikeres i nogen dyremodel. De fleste dyremodeller for depression er baseret på stress-induceret/traume-lignende erfaring hos mus, hvilket ikke nødvendigvis er tilfældet hos mennesker, hvor afsavn i barndommen, kompleks læringshistorie og/eller sociokulturelle risikofaktorer også synes at være vigtige. Musemodeller af depression bør derfor anerkendes som det, de er: en forenklet model for en meget kompleks lidelse. Men hvis det udføres tilstrækkeligt, og hvis der anvendes flere udlæsningsmetoder, er CDM et passende værktøj i søgen efter nye indsigter og mål i depressionsforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af interne midler fra Universitetsklinikken Freiburg, Institut for Psykiatri og Psykoterapi og Berta-Ottenstein-programmet for klinikerforskere (til SV). TS finansieres af bevillinger fra Medical Research Foundation (FRM) (AJE201912009450) og University of Strasbourg Institute of Advance Studies (USIAS) (2020-035) samt Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Frankrig.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 2000 mL | Kimble Kimax | 14000-2000 | any vessel >2000ml and diameter of 24-26 cm possible |
| Digital Thermometer | Hanna Instruments | 846-4708 | any digital thermometer possible |
| Digitalwaage 200 g Dipse | DIPSE | tp200 | any digital scale possible |
| Lenovo ThinkCentre V50a-24IMB AiO 11FJ00DVGE - 60,5 cm | Lenovo | A 908278 | any standard Personalcomputer possible |
| Logitech PTZ Pro | Logitech | 1000005246 | any high resolution camera possible |
| Stopwatch ROTILABO | Carl Roth | L423.1 | any stopwatch possible |
| Timer ROTILABO | Carl Roth | A802.1 | any timer possible |
References
- James, S. L., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Aleman, A., Denys, D. Mental health: A road map for suicide research and prevention. Nature. 509 (7501), 421-423 (2014).
- Greenberg, P. E., Fournier, A. -A., Sisitsky, T., Pike, C. T., Kessler, R. C. The economic burden of adults with major depressive disorder in the United States (2005 and 2010). The Journal of Clinical Psychiatry. 76 (2), 155-162 (2015).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E.
- Porsolt, R. D., Le Pichon, M., Jalfre, M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature. 266 (5604), 730-732 (1977).
- Can, A., et al. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Chatterjee, M., Jaiswal, M., Palit, G. Comparative evaluation of forced swim test and tail suspension test as models of negative symptom of schizophrenia in rodents. ISRN Psychiatry. 2012, 595141 (2012).
- Reardon, S. Depression researchers rethink popular mouse swim tests. Nature. 571 (7766), 456-457 (2019).
- Serchov, T., et al. Increased signaling via adenosine A1 receptors, sleep deprivation, imipramine, and ketamine inhibit depressive-like behavior via induction of Homer1a. Neuron. 87 (3), 549-562 (2015).
- Holz, A., et al. Enhanced mGlu5 signaling in excitatory neurons promotes rapid antidepressant effects via AMPA receptor activation. Neuron. 104 (2), 338-352 (2019).
- Sun, P., et al. Increase in cortical pyramidal cell excitability accompanies depression-like behavior in mice: A transcranial magnetic stimulation study. Journal of Neuroscience. 31 (45), 16464-16472 (2011).
- Hellwig, S., et al. Altered microglia morphology and higher resilience to stress-induced depression-like behavior in CX3CR1-deficient mice. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 126-137 (2016).
- Serchov, T., Heumann, R., van Calker, D., Biber, K. Signaling pathways regulating Homer1a expression: implications for antidepressant therapy. Biological Chemistry. 397 (3), 207-214 (2016).
- van Calker, D., Serchov, T., Normann, C., Biber, K. Recent insights into antidepressant therapy: Distinct pathways and potential common mechanisms in the treatment of depressive syndromes. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 88, 63-72 (2018).
- Serchov, T., et al. Enhanced adenosine A1 receptor and Homer1a expression in hippocampus modulates the resilience to stress-induced depression-like behavior. Neuropharmacology. 162, 107834 (2020).
- Quitkin, F. M., Rabkin, J. G., Ross, D., Stewart, J. W. Identification of true drug response to antidepressants. Use of pattern analysis. Archives of General Psychiatry. 41 (8), 782-786 (1984).
- Normann, C., et al. Antidepressants rescue stress-induced disruption of synaptic plasticity via serotonin transporter-independent inhibition of L-type calcium channels. Biological Psychiatry. 84 (1), 55-64 (2018).
- Zanos, P., et al. NMDAR inhibition-independent antidepressant actions of ketamine metabolites. Nature. 533 (7604), 481-486 (2016).
- Alboni, S., et al. Fluoxetine effects on molecular, cellular, and behavioral endophenotypes of depression are driven by the living environment. Molecular Psychiatry. 22 (4), 552-561 (2017).
- Niehusmann, P., et al. Coincidence detection and stress modulation of spike time-dependent long-term depression in the hippocampus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 30 (18), 6225-6235 (2010).
- Schreiber, S. S., Tocco, G., Shors, T. J., Thompson, R. F. Activation of immediate early genes after acute stress. Neuroreport. 2 (1), 17-20 (1991).
- National centre for the replacement refinement and reduction of animals in research. , Available from: https://www.nc3rs.org.uk (2021).
- Loss, C. M., et al. Influence of environmental enrichment vs. time-of-day on behavioral repertoire of male albino Swiss mice. Neurobiology of Learning and Memory. 125, 63-72 (2015).
- Walker, W. H., Walton, J. C., DeVries, A. C., Nelson, R. J. Circadian rhythm disruption and mental health. Translational Psychiatry. 10 (1), 1-13 (2020).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Reports. 6 (10), 930-935 (2005).
- Holderbach, R., Clark, K., Moreau, J. -L., Bischofberger, J., Normann, C. Enhanced long-term synaptic depression in an animal model of depression. Biological Psychiatry. 62 (1), 92-100 (2007).
- Nissen, C., et al. Learning as a model for neural plasticity in major depression. Biological Psychiatry. 68 (6), 544-552 (2010).
- Kuhn, M., et al. State-dependent partial occlusion of cortical LTP-like plasticity in major depression. Neuropsychopharmacology. 41 (6), 1521-1529 (2016).
- Schwabe, L. Stress and the engagement of multiple memory systems: integration of animal and human studies. Hippocampus. 23 (11), 1035-1043 (2013).
- Ballan, R., Gabay, Y. Does acute stress impact declarative and procedural learning. Frontiers in Psychology. 11, 342 (2020).
