Summary
Het chronische wanhoopsmuismodel (CDM) van depressie bestaat uit repetitieve geforceerde zwemsessies en nog een vertraagde zwemfase als uitlezing. Het vertegenwoordigt een geschikt model voor inductie van een chronische depressieve toestand die stabiel is gedurende ten minste 4 weken, aanpasbaar om subchronische en acute behandelingsinterventies te evalueren.
Abstract
Depressieve stoornis is een van de meest voorkomende vormen van psychische aandoeningen en veroorzaakt enorm individueel lijden en sociaaleconomische lasten. Ondanks het belang ervan is de huidige farmacologische behandeling beperkt en zijn nieuwe behandelingsopties dringend nodig. Een belangrijke factor in de zoektocht naar potentiële nieuwe geneesmiddelen is het evalueren van hun anti-depressieve potentie in geschikte diermodellen. De klassieke Porsolt gedwongen zwemtest werd decennialang voor dit doel gebruikt om een depressief-achtige toestand op te wekken en te beoordelen. Het bestaat uit twee korte periodes van gedwongen zwemmen: de eerste om een depressieve toestand op te wekken en de tweede op de volgende dag om het antidepressieve effect van het middel dat tussen de twee zwemsessies wordt gegeven, te evalueren. Dit model kan geschikt zijn als screeningsinstrument voor potentiële antidepressiva, maar negeert het vertraagde begin van de werking van veel antidepressiva. Het CDM werd onlangs opgericht en vertegenwoordigde een wijziging van de klassieke test met opmerkelijke verschillen. Muizen worden gedwongen om 5 opeenvolgende dagen te zwemmen, volgens het idee dat bij mensen depressie wordt veroorzaakt door chronische in plaats van acute stress. In een rustperiode van enkele dagen (1-3 weken) ontwikkelen dieren aanhoudende gedragsvertwijfeling. De standaard uitleesmethode is het meten van immobiliteitstijd in een extra vertraagde zwemsessie, maar er worden verschillende alternatieve methoden voorgesteld om een breder beeld te krijgen van de gemoedstoestand van het dier. Meerdere analysetools kunnen worden gebruikt gericht op gedrags-, moleculaire en elektrofysiologische veranderingen. Het depressieve fenotype is stabiel gedurende ten minste 4 weken, wat een tijdsvenster biedt voor snelle maar ook subchronische behandelingsstrategieën voor antidepressiva. Bovendien kunnen veranderingen in de ontwikkeling van een depressief-achtige toestand met behulp van deze aanpak worden aangepakt. CDM is daarom een nuttig hulpmiddel om depressie beter te begrijpen en nieuwe behandelingsinterventies te ontwikkelen.
Introduction
Affectieve stoornissen, zoals depressieve stoornissen, behoren tot de meest voorkomende en uitdagende psychische aandoeningen en worden geassocieerd met hoog individueel lijden1, een toename van het zelfmoordrisico2 en veroorzaken een aanzienlijke sociaaleconomische last3 voor de samenleving. Ondanks de impact zijn de behandelingsopties beperkt en is er een dringende behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe antidepressiva-interventies, vooral vanwege de innovatiecrisis in de psychofarmacologie in de afgelopen decennia. Om de pathofysiologie van depressie te begrijpen en potentiële nieuwe middelen te testen, zijn rationele en geldige diermodellen dringend nodig4. Bijna een halve eeuw lang werd de klassieke gedwongen zwemtest (FST), oorspronkelijk beschreven door Porsolt5, gebruikt als inductie en uitlezing voor screening van potentiële nieuwe antidepressiva. Het bestaat uit een gedwongen zwemperiode van 5-15 minuten op dag 1, daaropvolgende eenmalige medicijntoepassing en evaluatie van het deel dat muizen immobiel in water doorbrengen in een andere zwemperiode op de volgende dag. De immobiliteitstijd werd beschouwd als een ontbrekend natuurlijk ontsnappingsgedrag en men dacht dat het correleerde met de mate van een depressie-achtige toestand bij de muizen5.
De klassieke FST is zwaar bekritiseerd, niet alleen in de wetenschappelijke gemeenschap6,7,8 maar ook in de publieke media8. De meeste controverses rond de FST zijn te wijten aan de korte inductie- en behandelingsperioden van slechts 1 dag in het klassieke paradigma. Er werd betoogd dat FST eerder een acuut traumamodel vertegenwoordigt dan een toestand die vergelijkbaar is met menselijke depressie. Bovendien kan de Porsolt-test geschikt zijn als screeningsinstrument voor potentiële antidepressiva, maar het negeert het vertraagde begin van de werking van veel antidepressiva.
Het chronische wanhoopsmodel (CDM)9,10,11,12,13,14,15, dat is afgeleid van de oorspronkelijke FST, vertegenwoordigt een geschikter diermodel voor depressie. Bij CDM vermijdt herhaalde zwemstress gedurende 5 opeenvolgende dagen acute traumatische effecten. Door niet te ontsnappen aan een herhaalde en voortdurende stressvolle situatie, wordt gedacht dat muizen een staat van hulpeloosheid, overgave en uiteindelijk wanhoop ontwikkelen. Dit paradigma is meer vergelijkbaar met de huidige psychologische theorieën voor de ontwikkeling van depressie bij mensen dan een enkel acuut trauma, dat vaak wordt ervaren bij het begin van een posttraumatische stressstoornis. De resulterende depressie-achtige toestand in CDM is stabiel voor maximaal 4 weken9 en opent daarom de mogelijkheid voor langere behandelingsperioden, die beter vergelijkbaar zijn met klinische aandoeningen, waar antidepressiva meestal 2-4 weken nodig hebben om een voordeel te laten zien16.
De evaluatie van de depressieve toestand zou dan multidimensionaal moeten zijn. Het meten van immobiliteitstijd, zoals in de klassieke FST, is nuttig, maar mag niet worden gebruikt als de enige uitkomstparameter. Verschillende methoden, die hieronder worden beschreven, moeten in staat zijn om verschillende dimensies van een depressieve toestand in kaart te brengen in overeenstemming met symptomen die meestal bij depressieve mensen worden aangetroffen. Geschikte uitleesbeoordelingen kunnen ontsnappingsgedrag (immobiliteitstijd9,10,17), staartsuspensietest (TST)9, anhedonie (klassieke sucrosevoorkeurtest (SPT)18), motivatiegericht gedrag (nose-poke sucrose preference test (NPSPT)10), verwachtings-/exploratiegedrag (respons op dubbelzinnig signaal19) omvatten; Y-doolhoftest9), elektrofysiologie (metingen van plasticiteit op lange termijn (langdurige potentiëring, LTP; langdurige depressie, LTD)20), moleculaire beoordelingen (activeringspatronen van onmiddellijke vroege genen (IEG's); verdere stresspatronen21).
Theoretisch kan een herhaalde zwemtest worden gebruikt om een depressieve toestand te induceren zonder enige beoordeling van de immobiliteitstijd. Het wordt echter sterk aanbevolen om op zijn minst een proof-of-concept experimentele serie met immobiliteitstijden te leveren. Bovendien vertegenwoordigt CDM een geschikt model om de ontwikkeling van een depressieve toestand te beoordelen door de immobiliteitstijd tijdens de inductiefase te meten. Specifieke muizenstammen of muizen die vóór het zwemmen worden behandeld, kunnen worden geëvalueerd met betrekking tot veerkracht of kwetsbaarheid voor stress en de inductie van gedragsvertwijfeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijnen (EU 2010/63) en in overeenstemming met de Duitse dierenbeschermingswet (TierSchG), FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php), de gids van de nationale dierenwelzijnsinstantie GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, en werden goedgekeurd door de commissie voor dierenwelzijn van de Universiteit van Freiburg en door het Comite d'Ethique en Matiere d'Experimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS), CEEA35), evenals lokale autoriteiten. Beide geslachten van C57Bl6N wild-type muizen in de leeftijd van 10-14 weken (70-98 postnatale dagen, PND) werden gebruikt voor wild-type (WT) geïndiceerde experimenten. Als stressbestendige lijn werd de transgene muislijn met verbeterde expressie van adenosine A1-receptoren onder de neuronale CaMKII-promotor van de voorhersenen gebruikt9,15. Na de experimenten werden muizen opgeofferd door cervicale dislocatie.
1. Voorbereiding
- Verkrijg een vergunning voor dieronderzoek, inclusief grondige experimentele planning.
- Aankomst: Bij aankomst, breng de dieren in de dierenfaciliteit om het CDM uit te voeren. Als de dieren bij een externe leverancier worden gekocht, geef ze dan minstens 2 weken de tijd om zich aan te passen aan de nieuwe omgeving.
- Huisvesting: Om de dieren te huisvesten, moet u ervoor zorgen dat de kooien niet bezet zijn met het maximale aantal dieren om extra stress te voorkomen. Garanderen dat de huisvestingsomstandigheden in overeenstemming zijn met de internationale aanbevelingen van muizenhuisvesting (voor meer informatie, zie22) en deze te allen tijde voortdurend onderhouden.
OPMERKING: De belangrijkste standaard huisvestingsomstandigheden omvatten individueel geventileerde kooien met 25-120 luchtverversingen per uur, 12 uur licht-donkercyclus, temperatuur zo stabiel mogelijk (ten minste constant tussen 20-24 ° C), vochtigheid zo stabiel mogelijk (ten minste tussen 45% -65%), knaagmateriaal en onderdak aanwezig, geen individuele behuizing. - Tijdstip: voer alle experimenten op hetzelfde moment van de dag uit.
OPMERKING: Er is geen directe beoordeling gemaakt om de invloed van de dag op CDM te verifiëren, maar de meeste gedragstests die depressieve toestanden evalueren, vertonen variaties afhankelijk van het tijdstip van de dag23,24,25, en het is zeer waarschijnlijk dat de dag ook CDM beïnvloedt. - Nestmateriaal: Beperk het nestmateriaal tot een minimum. Zorg ervoor dat er geen loopwielen, enz., aanwezig zijn in de kooi.
OPMERKING: Verrijkte omgeving voorkomt de inductie van een depressieve toestand. - Groepssamenstelling: Laat de dieren gedurende het hele experiment in dezelfde groep blijven. Groepeer de vrouwelijke muizen samen, zelfs uit verschillende nesten; groepeer de mannelijke muizen samen met nestgenoot mannelijke dieren. Vanwege aankomende agressiviteit, vooral van mannen, kunnen bijten en kappers een probleem worden, daarom speciale nadruk leggen op de groepssamenstelling. Vermijd een enkele woning, want ontbering is een belangrijke extra stressfactor.
- Dieren: Gebruik verschillende muizenstammen, ook al zijn er specifieke verschillen waargenomen9,10. Een veelgebruikte muizenstam is C57Bl6N. Label muizen om gepaarde statistische analyse uit te voeren (zie stap 3.2.4).
- Dierlijk geslacht: Gebruik zowel mannelijke als vrouwelijke muizen.
- Leeftijd van het dier: Zorg ervoor dat de dieren minstens 10 weken (70 PND) oud zijn. Gebruik geen jongere dieren vanwege de uitputting veroorzaakt door zwemmen.
- Interieur: Gebruik een transparante glazen cilinder/beker met een inhoud van minimaal 2 L, een diameter van 24-26 cm en een minimale hoogte van 30 cm. Verdere vereisten zijn onder meer een thermometer om de watertemperatuur te controleren, papieren handdoeken, roodlicht verwarmingslamp / verwarmingsmat of vergelijkbare verwarmingsbron, timer, stopwatch, stille omgeving. Videotape de zwemsessies voor offline analyse en documentatie. Zorg ervoor dat de datum en het tijdstip continu zichtbaar zijn op de tape/het bestand, samen met een identificatiecodenummer voor het individuele dier. Sla de bestanden op voor latere analyse en verdere referentie. Film van de zijkant van de glazen cilinder, niet van bovenaf, om de analyse te vergemakkelijken.
2. Inductiefase
- Voordat u begint
- Observeer de dieren visueel op afwijkingen, waaronder tekenen van bijten of barbering. Sluit de hele kooi uit van de experimentele serie als een dier minimale verwondingen vertoont. Zorg ervoor dat een dierenarts op elk moment beschikbaar is, omdat verwondingen tijdens het experiment zullen verergeren en voortzetting zullen voorkomen als muizen agressiever worden onder invloed van stress.
- Verkrijg het lichaamsgewicht voor elk dier voordat u met het experiment begint. Zorg ervoor dat het gewichtsverlies dat vaak wordt waargenomen niet meer dan 20% van het initiële lichaamsgewicht bedraagt. Sluit dieren uit met een gewichtsverlies van meer dan 20% en euthanaseer ze onmiddellijk vanwege het veronderstelde hoge lijden.
- Vul een beker of cilinder met water bij kamertemperatuur (22-23 °C) tot een hoogte van ten minste 20 cm vanaf de bodem, met een minimum van 10 cm tussen het wateroppervlak en de bovenrand van het vat.
- Voorstelling
- Breng de dieren voorzichtig over in het water. Houd het dier tijdens de zwemfase continu in de gaten om verdrinking te voorkomen. Observeer vanuit een positie waar het dier de experimentator niet kan zien (bijvoorbeeld video-observatie vanuit een kamer naast de deur).
- Stel een chronometer in aan het begin van het experiment. Haal de dieren na 10 minuten uit het water door simpelweg hun staart te pakken. Droog ze voorzichtig af met een papieren handdoek en leg ze onder een verwarmingslampje of op een verwarmingsmat.
- Evalueer slechts één dier tegelijk. Zorg ervoor dat dieren elkaar niet kunnen zien (scheid bijvoorbeeld de woonkooi van de experimentele opstelling door een room-divider).
- Voer de geforceerde zwemsessie gedurende 10 minuten per dag gedurende 5 opeenvolgende dagen uit.
- Afwerking
- Breng de dieren na vijf zwemsessies terug naar hun thuiskooien en laat ze minstens 2 dagen rusten. Start vervolgens met specifieke behandelingsinterventies.
3. Evaluatie van een anti-depressieve behandeling
- Tijdsverloop
- Beoordeel de acute en subchronische behandelingen met het CDM. Afhankelijk van de wetenschappelijke vraag, past u de rustperiode tussen de inductiefase en de uitlezing aan.
- Om de acute en snelwerkende potentie van ketamine te evalueren, kiest u een korte rustperiode (enkele dagen) na de inductiefase van CDM. Pas de behandeling toe (d.w.z. intraperitoneale injectie) en voer kort daarna de evaluatie uit (aanvullende zwemsessie of andere evaluatiemethode).
- Om de effecten van een subchronische behandeling te evalueren, verhoogt u de behandelingsperiode tot 4 weken (er zijn geen gegevens beschikbaar voor langere behandelingsperioden). Geef bijvoorbeeld de orale behandeling met imipramine aan de dieren gedurende 4 weken na de inductiefase en evalueer daarna.
- Begin met het evalueren van de depressieve toestand direct na het einde van de behandelingsperiode, bijvoorbeeld de volgende dag. Kies altijd een identieke tijdsperiode voor controle en experimentele omstandigheden.
- Immobiliteitstijd
- Proof-of-concept
- Om immobiliteitstijd als uitleesmethode te gebruiken, evalueert u elke dag van de inductiefase en de testdag om een proof-of-concept te bieden (zie figuur 1). Voor verdere experimentele series, reduceer de beoordelingen tot dag 1, dag 5 en de testdag (zie figuur 1C).
- Videotape elk experiment. Laat twee getrainde waarnemers die blind zijn voor de experimentele omstandigheden de analyse onafhankelijk uitvoeren. Video-analyse stelt de experimentator in staat om het gedrag vanuit een andere kamer te observeren, waardoor de interferentie met de test wordt geminimaliseerd (zie bijvoorbeeld het videobestand in het aanvullende materiaal).
- Voorwaarden: Observeer en identificeer de drie verschillende gedragsomstandigheden tijdens de zwemtest: worstelen, zwemmen en immobiliteit. De meeste onderzoekers richten zich op immobiliteit; een verdere differentiatie tussen worstelen en zwemmen is zelden nuttig en verhoogt de complexiteit en duur van de analyse dramatisch.
- Worstelen: Het dier probeert actief te ontsnappen aan de bedreigende situatie. Dit omvat het poten van de zijkant van de cilinder met het hoofd gericht op de muur en bewegingen van alle ledematen. Het wateroppervlak is meestal licht turbulent.
- Zwemmen: Het dier beweegt ten minste beide achterpoten en legt een afstand af door het water. Het zoekt actief naar een uitweg, maar probeert de glazen wand van het vat niet te overwinnen. Zwemmen houdt niet in dat de poten boven het wateroppervlak worden opgetild en het lichaam is meestal parallel aan de wanden van de cilinder georiënteerd. In deze toestand draaien dieren zich vaak om of bewegen ze in cirkels.
- Immobiliteit: Het dier blijft stil, in een ijskoude positie, en beweegt helemaal niet of beweegt alleen de staart of de voorpoten om zijn kop boven het wateroppervlak te houden. Er wordt geen afstand actief afgelegd, behalve passief zweven, en er wordt geen gerichte beweging van de voorpoten waargenomen.
- Bijhouden
- Voer de beoordeling uit met behulp van offline video-opnamen. Gebruik geblindeerde beoordelingen door twee onafhankelijke en ervaren examinatoren en bereken gemiddelden tussen de twee beoordelingen.
- Herhaal de beoordelingen als de resultaten van de twee beoordelaars boven een vooraf bepaald bereik verschillen. Observeer de muizen voortdurend terwijl de verschillende omstandigheden vaak veranderen tussen worstelen, zwemmen en immobiliteit.
- Gebruik een stopwatch om de totale tijd te meten die in een gefocuste fase (meestal immobiliteit) wordt doorgebracht gedurende de 10 minuten dat de muis in het water blijft. Overweeg een korte latentie van ongeveer een seconde voordat u de lopende tijdmeting wijzigt (bijvoorbeeld, als een dier gedurende 20 s in immobiliteit blijft en slechts één keer beweegt voor minder dan een seconde en terugkeert naar immobiliteit voor nog eens 10 s, is de totale immobiliteitstijd 30 s).
- Statistieken: Vanwege de relatief hoge interindividuele standaarddeviatie (waarschijnlijk veroorzaakt door een overdracht van hiërarchieafhankelijk gedrag van de kooi naar de zwemtest), markeer of label de dieren om daarna gepaarde (in plaats van ongepaarde) parametrische tests uit te voeren. Evalueer de normaliteitsverdeling en voer, afhankelijk van de specifieke vraag, variantieanalyse (ANOVA) uit met post-hoc t-tests of gepaarde t-tests om de verschillende groepen te vergelijken. Voer de analyse uit met absolute waarden van immobiliteitstijd (en) of als genormaliseerde waarden.
- Absolute waarden: Geef gemiddelde waarden van de immobiliteitstijd van dag 1 tot dag 5 en voor de testdag ± SEM (zie figuur 1A). Vergelijk de gemiddelde waarden voor dag 1 en dag 5, bij voorkeur met behulp van een gepaarde t-test om de inductie van een depressieve toestand te valideren. Als er een significant verschil is tussen dag 1 en 5, vergelijk dan de gemiddelde waarden van dag 5 met de gemiddelde resultaten van de testdag. Zorg ervoor dat een typische groepsgrootte in één experiment tussen 6 en 10 dieren ligt en verwacht significante verschillen tussen baseline en post-inductie immobiliteitstijden bij wilde dieren. Het vergelijken van verschillende groepen met een ongepaarde t-test is moeilijk als absolute waarden worden gebruikt vanwege basislijnverschillen; gebruik daarom genormaliseerde waarden.
- Relatieve/genormaliseerde waarden: Vergelijk de verschillende behandelingseffecten door normalisatie met het individuele resultaat op dag 5 en druk de waarden vervolgens uit als een percentage van dag 5 (zie figuur 1B).
- Controle-experimenten
OPMERKING: De zwemprestaties kunnen gecorreleerd zijn met voortbeweging. Stoffen die een hyper-voortbeweging veroorzaken, kunnen vals-positieve resultaten veroorzaken (namelijk een afname van de immobiliteitstijd); evenals kalmerende middelen kunnen kunstmatig de immobiliteitstijd verhogen.- Evalueer de veranderingen in de voortbeweging voor onbekende stoffen voordat u de zwemanalyse uitvoert. Gebruik Open Field Test (OFT) in een aparte groep dieren gedurende ten minste 10 minuten.
- Kies dezelfde waarnemingstijd (10 min) in het OFT als in het CDM om niet-specifieke hyperlocomotiefeffecten van de geteste verbinding te detecteren die de CDM-uitlezing kunnen beïnvloeden via meting van immobiliteitstijd met hoge validiteit.
- In het geval van significante hyperlocomotiefeffecten, evalueer de zwemsessie niet om de anti-depressieve potentie te beoordelen, maar gebruik verschillende uitleesmethoden (bijvoorbeeld sucrosevoorkeur, staartophangingstest, enz.).
- Proof-of-concept
4. Evaluatie van de ontwikkeling van een depressief-achtige toestand
- Om de ontwikkeling van een depressieve stoornis te evalueren, beoordeelt u elke dag van de inductiefase om de immobiliteitstijd te meten.
OPMERKING: In dit geval beschrijft een kleine toename van de immobiliteitstijd tussen elke dag veerkracht, terwijl een sterkere en eerdere toename in vergelijking met onbehandelde of wilde dieren een verhoogde kwetsbaarheid voor stress-geïnduceerde wanhoop vertegenwoordigt. Door muizen vóór het zwemevenement te behandelen, kon de preventieve interventie of transgene muislijnen worden beoordeeld op de ontwikkeling van gedragsvertwijfeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de eerste zwemsessie van de inductiefase van CDM vertonen muizen meestal een gemiddelde immobiliteitstijd tussen 190 s en 230 s, die constant stijgt bij elke extra zwemsessie (figuur 1A). Deze toename is meer uitgesproken in de eerste 3 dagen en bereikt een plateau-achtige fase tijdens de laatste 2-3 dagen. De immobiliteitstijd gemeten op dag 5 blijft stabiel gedurende maximaal 4 weken, wat wijst op stabiele gedragsvertwijfeling. De antidepressieve potentie van een interventie kan worden geëvalueerd door het dier te behandelen tussen de laatste dag van de inductiefase en de testdag. Merk op dat de absolute scoringstijd tijdens de zwemsessies vrij subjectief is en afhankelijk is van de experimentator, leeftijd, geslacht en de gebruikte muislijn. Het relatieve verschil tussen de sessies is echter redelijk stabiel met slechts kleine interrater verschillen.
In figuur 1 zijn verschillende representatieve behandelingen weergegeven. Imipramine, slaapgebrek en ketamine verminderden de immobiliteitstijd aanzienlijk, terwijl slaapgebrek in combinatie met een herstelslaap geen significante verandering van het depressief-achtige fenotype vertoonde. Deze resultaten komen overeen met een anti-depressieve potentie van de toegepaste behandelingen en zijn vergelijkbaar met effecten die worden waargenomen bij menselijke patiënten. De behandeling omvatte inname van imipramine 20 mg / kg / dag gedurende 3 weken via drinkwater, 3 mg / kg ketamine door een enkele intraperitoneale injectie 24 uur vóór het testen en slaapgebrek gedurende 6 uur vóór het testen.
Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen verschillende representaties worden weergegeven. Een weergave van absolute waarden kan een echt gegevensoverzicht geven en maakt een goede evaluatie van de inductiefase en van een enkele behandeling mogelijk (figuur 1A,D). De verschillen van verschillende behandelingen zijn echter niet direct met elkaar te vergelijken; vandaar dat elke behandelingsgroep verschillende gemiddelde waarden van immobiliteitstijd op dag 5 heeft. Daarom wordt aanbevolen om in dit geval de weergave van genormaliseerde gemiddelde waarden te gebruiken (figuur 1B). Een gereduceerde weergave kan worden gekozen vanwege ruimtebeperkingen (figuur 1C). Houd er rekening mee dat het verplicht is om ten minste de resultaten van dag 1, dag 5 en de testdag te tonen.
Figuur 1: Succesvolle resultaten in absolute en genormaliseerde waarden. (A) Succesvolle inductie van een depressieve toestand bij 30 muizen kan worden waargenomen. Elke stip vertegenwoordigt de immobiliteitstijd van een enkel dier op een specifieke dag en balken vertegenwoordigen de gemiddelde waarden van de geteste dieren. Immobiliteitstijd wordt weergegeven voor elke dag van de inductiefase (dag 1 tot dag 5) en voor de testdag (na de stippellijn) met of zonder behandeling. Merk op dat in deze steekproef een significante toename kan worden waargenomen tussen dag 1 en dag 2. In sommige gevallen worden significantieniveaus voor het eerst bereikt tussen dag 1 en dag 3. Voor de voortzetting van het experiment is een statistisch significante toename tussen dag 1 en dag 5 verplicht. Let op het typische plafondeffect (toename tussen dag 1, 2 en 3, vergeleken met het verschil tussen dag 4 en 5). Tussen dag 5 en de testdagen werden de dieren gedurende 4 weken in hun thuiskooien gehuisvest, hetzij zonder verdere behandeling (CDM) of behandeld met imipramine (Imip.); slaapgebrek (SD); slaaptekort en herstelslaap (RS) en ketamine (Ket). (B) Voor elke dag wordt een voorbeeldig tijdsverloop van de prestaties van individuele dieren gegeven. (C) Genormaliseerde weergave van dezelfde resultaten die reeds in figuur 1A zijn weergegeven. De immobiliteitstijd van elk dier en elke dag werd genormaliseerd tot de overeenkomstige immobiliteitstijd op dag 5 en uitgedrukt in percentage. Nabehandelingswaarden van verschillende groepen kunnen met deze aanpak beter worden weergegeven en vergeleken. (D) Weergave van genormaliseerde waarden voor dag 1, dag 5 en de testdag (CDM). Na een succesvolle proof of concept-studie kunnen evaluatietijdpunten worden teruggebracht tot dag één, dag vijf en de testdag. Deze tijdspunten zijn nodig omdat een significante toename tussen dag 1 en dag 5 nodig is om een succesvolle inductie aan te tonen, en dag 5 moet worden vergeleken met de testdag om een verklaring te geven over de werkzaamheid van de behandeling. (E) Vergelijking van de immobiliteitstijd van drie verschillende muislijnen: Wildtype (WT) toont een succesvolle inductie; een voorbeeldige resilient-line (RL) vertoont een significant verminderd depressie-achtig gedrag op de eerste drie dagen en op de testdag. Eenrichtings-ANOVA met Bonferroni post hoc test: ∗/#p < 0.05, ∗∗/##p < 0.01, ∗∗∗/###p < 0.001, ∗∗∗∗/####p < 0.0001. (#geef verschil aan met gemiddelde waarden van dag 1, ∗indiceer verschil met gemiddelde waarden van dag 5 in figuur 1A,C en naar WT muislijn in figuur 1E). Gegevens worden uitgedrukt als het middel ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
In het geval van een ongewijzigde immobiliteitstijd gedurende alle 5 dagen (figuur 2), was de toegepaste stress niet in staat om het gedrag relevant te veranderen en kunnen er geen behandelingseffecten worden geëvalueerd; dieren moeten worden geofferd en mogen niet verder worden gebruikt.
Figuur 2: Mislukte resultaten. Een weergave van een ineffectieve inductie wordt weergegeven in de figuur. Merk op dat er geen significante toename van de immobiliteitstijd tussen dag 1 en dag 5 optreedt. Daarom werden criteria voor voortzetting van het experiment niet bereikt en is geen verdere verlenging rationeel (in dit geval werden alleen mannelijke muizen getest en na retrospectief onderzoek bleek dat ze geen nestgenoten waren). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Verdere uitleesmethoden moeten worden gebruikt om een bredere kijk op de gedragsvertwijfeling van de dieren te beschrijven. Een verscheidenheid aan gedragstests, elektrofysiologische metingen en moleculaire beoordelingen van stress-geïnduceerde veranderingen zijn beschikbaar. Voorbeeldige resultaten voor tail suspension test (TST), met CDM, imipramine en ketamine behandeling, Nose-poke-Sucrose Preference Test (NPSPT), en beoordeling van langdurige potentiëring met behulp van de patch-clamp techniek zijn gegeven in figuur 3. Deze resultaten moedigen het gebruik van de CDM-inductiefase aan als een algemeen hulpmiddel voor de inductie van gedragsvertwijfeling. Voor meer details van de gebruikte technieken (TST, NPSPT, LTP-assessment) zie9,10,17,20.
Figuur 3: Aanvullende resultaten met CDM-muizen. (A) Een voorbeeldige weergave van de effecten van CDM in de Tail Suspension Test. Muizen werden aan hun staart gesuspendeerd en de onbeweeglijke tijd werd geregistreerd (voor methodologische details zie9). Elke stip vertegenwoordigt de immobiliteitstijd van een enkel dier en balken vertegenwoordigen de gemiddelde waarden van de geteste dieren. Eenrichtings-ANOVA met Bonferroni post hoc test: ∗∗∗p < 0,001. Gegevens worden uitgedrukt als het middel ± SEM. (B) Representatieve resultaten van de onlangs vastgestelde nose-pokes sucrose voorkeurstest bij CDM-muizen. In deze taak werd sucrosevoorkeur gemeten met geleidelijk toenemende inspanning om de sucrosefles te bereiken (aantal neuspokken) (voor methodologische details zie10). Merk op dat sucrosevoorkeur was afgenomen in CDM en dat het verschil tussen CDM en controlemuizen geleidelijk toeneemt met de inspanning (gemiddelde waarden van neusprikken op elke dag aangegeven als Nspk1-7) muizen moesten aanbrengen om de zoete oplossing te drinken. Tweerichtings ANOVA met Bonferroni post hoc test: ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001. ± (C) CDM-afhankelijke veranderingen in synaptische plasticiteit op lange termijn worden gepresenteerd als veranderingen van gemiddelde waarden van EPSP's na de toepassing van een associatief LTP-inductieprotocol in hippocampus hersenplakken van WT-muizen. De gegevens werden verkregen door stimulatie van de CA3-CA1 synaps (voor details zie17,20). Ongepaarde t-test, ∗∗p < 0,01 worden gegevens uitgedrukt als het middel ± SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend materiaal. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het CDM-model vertegenwoordigt een relevant en gevestigd model voor het testen van de anti-depressieve potentie van nieuwe interventies en opent een verlengd tijdvenster voor moleculaire of elektrofysiologische experimenten om de pathofysiologie van depressie op te helderen. Vooral in combinatie met andere tests om een depressie-achtige toestand te beoordelen, heeft CDM een hoge gezichts- en conceptvaliditeit. Het combineert subchronische stress en verworven hulpeloosheid voor inductie en produceert een langdurige depressieve toestand. Het is ongevoelig voor de enkele toepassing van klassieke antidepressiva, maar reageert op subchronische toepassing en bootst daarom de situatie bij mensen na. In een tijdvenster van 4 weken tonen veel verschillende antidepressiva-interventies werkzaamheid, variërend van verschillende klassen antidepressiva, niet-invasieve hersenstimulatie, slaapgebrek tot snelwerkende antidepressiva9,10,11. Bovendien kan de meting van de immobiliteitstijd tijdens de inductiefase worden gebruikt als een marker van stressbestendigheid of kwetsbaarheid, in het geval van het testen van transgene dieren of muizen die vóór de inductiefase zijn behandeld. Al met al is het CDM economisch in termen van kosten, duur, standaardisatie en reproduceerbaarheid tussen laboratoria. Hoewel de uitvoering vrij eenvoudig lijkt - "je laat een muis in een watervat vallen en haalt hem er na 10 minuten uit" - zijn er een aantal kritieke punten die in gedachten moeten worden gehouden om redelijke en stabiele resultaten te verkrijgen. De meeste problemen zijn te wijten aan onvoldoende nauwkeurigheid tijdens de voorbereiding of analyse.
Een veel voorkomend probleem is dat muizen, vooral mannetjes, geen significante toename van de immobiliteitstijd vertonen in de inductiefase. In deze gevallen kunnen muizen al gestrest zijn voordat de inductie begint; daarom veroorzaakt extra stress tijdens het zwemprotocol geen relevante toename van wanhoop. Merk op dat immobiliteitstijd een plafondeffect lijkt te hebben, omdat de toename tussen dag 1 en 2 groter is dan tussen respectievelijk dag 2 en 3. Na dag 3 kan meestal geen verdere significante toename worden verwacht. Veel voorkomende redenen voor overmatige basislijnstress kunnen zijn: recent transport van de dieren of samenwonen van adolescente / volwassen mannelijke dieren, een aandoening die nooit in de natuur voorkomt. Daarom moet de experimentator voorzichtig zijn en er altijd voor zorgen dat dieren nestgenoten zijn, dat ze genoeg tijd hadden om te acclimatiseren aan de nieuwe omgeving en dat er geen tekenen van bijten of kappers zijn voordat het experiment begint. Bovendien moeten de dieren elke dag worden gewogen en moet het gewichtsverlies worden gecontroleerd om niet meer dan 20% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht te overschrijden. Een groter gewichtsverlies wordt als kritiek beschouwd, vanwege het feit dat repetitief zwemmen vermoeiend is en dieren die niet in staat zijn om hun lichaamsgewicht te behouden, te veel last hebben van deze uitputting. Een kritiek punt hierbij is dat dieren die te veel last hebben van uitputting waarschijnlijk niet in staat zijn om te zwemmen of te worstelen gedurende 10 minuten tijdens de test. Wanneer immobiliteitstijden van die dieren worden geanalyseerd, hebben ze de neiging om een vals negatief resultaat te vertonen als gevolg van fysieke uitputting.
Een andere problematische omstandigheid die soms optreedt, vooral wanneer langere behandelingsperioden nodig zijn, is een spontane afname van de immobiliteitstijd in de testevaluatie. Na 4 weken neemt de immobiliteitstijd meestal af in vergelijking met beoordelingen die 2 dagen na het einde van de inductieperiode worden uitgevoerd (N.B. dit komt, hoewel met een andere tijdschaal, overeen met de situatie bij mensen waar depressieve episodes meestal zelfbeperkend zijn). Om deze valkuil te minimaliseren, moet worden gegarandeerd dat er geen onnodig nestmateriaal wordt toegepast op de thuiskooi van het dier, wat kan worden beschouwd als een effectieve antidepressiva-interventie (verrijkte omgeving). Bovendien kan een toename van de groepsgrootte helpen om de variantie te verminderen. Indien nodig kan een extra zwemsessie worden toegevoegd als wijziging van het hierboven beschreven standaardprotocol. Zo zou een toename van vijf naar zeven zwemsessies op 7 opeenvolgende dagen kunnen worden uitgevoerd en zou dit moeten resulteren in een stabielere depressieve toestand van de dieren. Het wordt niet aanbevolen om de duur van de individuele zwemsessie verder te verlengen om overmatige uitputting te voorkomen.
Er is geen overeenstemming binnen de wetenschappelijke gemeenschap over het meest verstandige tijdsbestek dat moet worden geanalyseerd. Terwijl sommige groepen alle 10 minuten belangrijk vinden9,10, beweren anderen dat het gedrag binnen de eerste paar minuten een acute stresssituatie vertegenwoordigt en alleen de laatste 4 minuten of 6 minuten analyseert18. Deze laatste veronderstelling is voornamelijk afgeleid van de gangbare praktijk in het evaluatieproces van de klassieke FST. Experimenteel bewijs dat zich richt op de vraag naar het meest rationele tijdsbestek dat in CDM moet worden geanalyseerd, ontbreekt. Verschillende hooggeplaatste publicaties gebruikten de analyse van de hele 10 minuten in CDM9,10.
Ondanks het toenemende aantal commercieel beschikbare software voor geautomatiseerde video-analyse, heeft geen enkele opstelling voldoende nauwkeurigheid aangetoond om een getrainde waarnemer te vervangen. De meeste software vertrouwt op het volgen van de voortbeweging van muizen in het water en vereist een camerapositie van bovenaf. Beoordelingen door bekwame mensen hebben het voordeel dat niet alleen de voortbeweging, maar ook de veronderstelde intentie van complexere bewegingen kan worden beoordeeld, inclusief de intensiteit van pootbewegingen. Muizen bewegen bijvoorbeeld vaak door zich om hun lichaam te draaien of door subtiele staartbewegingen om hun hoofd boven het water te houden, wat software meestal volgt als zwemmen. Een ander voorbeeld is de beweging gericht op de glazen wand van het vat, inclusief frequente neus die van korte afstand wordt geprikt. Ondanks de duidelijke intentie om te ontsnappen door verticale bewegingen, volgt de software vaak immobiliteit als gevolg van weinig voortbeweging. Nauwkeurige en betrouwbare beoordelingen blijven echter moeilijk en tijdrovend. Het wordt aanbevolen om een beoordelaar te trainen door een ervaren experimentator en gezamenlijke beoordelingen van voorbeeldvideo's door de twee onafhankelijke beoordelaars voor te bereiden om gemeenschappelijke definities en dubbelzinnigheden te bespreken. Bovendien moeten de eerste resultaten van een laboratorium met het CDM worden vergeleken met eerder gepubliceerde resultaten van andere groepen.
Onderzoekers die het CDM gebruiken, kunnen vaak het idee ervaren dat verhoogde immobiliteit een nogal intelligente eindenergiebesparingsafhankelijke aangeleerde reactie van muizen is op een onontkoombare maar tijdelijke stressvolle situatie. Naar onze mening overschat dit de cognitieve flexibiliteit van muizen; het benadrukt echter de noodzaak van verdere beoordelingen van een depressieve toestand onafhankelijk van immobiliteitstijd. Verder kan worden gesteld dat andere gevestigde diermodellen van depressie als de Chronische Milde Stress test, vergelijkbare resultaten opleveren; en dat een depressieve toestand of sterke stressoren het leren belemmeren, niet verhogen, zowel bij mensen als bij dieren17,20,26,27,28,29,30.
De last van de dieren wordt meestal als hoog tot extreem beoordeeld in dieronderzoekstoepassingen. Experimentele series moeten grondig worden gepland om het aantal dieren te minimaliseren en dieren moeten met zorg en respect worden behandeld voor en na de zwemsessies. In sommige landen is het echter mogelijk dat het niet mogelijk is om een proefdierlicentie voor het CDM te verkrijgen. Het CDM maakt de beoordeling van de anti-depressieve werkzaamheid van een breed scala aan interventies en de inductie van een relatief stabiele depressieve toestand mogelijk. De heterogeniteit en complexiteit van depressieve stoornis bij mensen kan in geen enkel diermodel worden gerepliceerd. De meeste diermodellen van depressie zijn gebaseerd op stress-geïnduceerde / trauma-achtige ervaring bij muizen, wat niet noodzakelijkerwijs het geval is bij mensen, waar jeugddeprivatie, complexe leergeschiedenis en / of sociaal-culturele risicofactoren ook belangrijk lijken te zijn. Muismodellen van depressie moeten daarom worden herkend als wat ze zijn: een vereenvoudigd model voor een zeer complexe aandoening. Als het echter adequaat wordt uitgevoerd en als er meerdere uitleesmethoden worden gebruikt, is het CDM een geschikt hulpmiddel in de zoektocht naar nieuwe inzichten en doelen in depressieonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door interne fondsen van de Universiteitskliniek Freiburg, afdeling Psychiatrie en Psychotherapie en het Berta-Ottenstein-programma voor clinicuswetenschappers (aan SV). TS wordt gefinancierd door de subsidies van de Medical Research Foundation (FRM) (AJE201912009450) en het University of Strasbourg Institute of Advance Studies (USIAS) (2020-035), evenals Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Frankrijk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 2000 mL | Kimble Kimax | 14000-2000 | any vessel >2000ml and diameter of 24-26 cm possible |
| Digital Thermometer | Hanna Instruments | 846-4708 | any digital thermometer possible |
| Digitalwaage 200 g Dipse | DIPSE | tp200 | any digital scale possible |
| Lenovo ThinkCentre V50a-24IMB AiO 11FJ00DVGE - 60,5 cm | Lenovo | A 908278 | any standard Personalcomputer possible |
| Logitech PTZ Pro | Logitech | 1000005246 | any high resolution camera possible |
| Stopwatch ROTILABO | Carl Roth | L423.1 | any stopwatch possible |
| Timer ROTILABO | Carl Roth | A802.1 | any timer possible |
References
- James, S. L., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Aleman, A., Denys, D. Mental health: A road map for suicide research and prevention. Nature. 509 (7501), 421-423 (2014).
- Greenberg, P. E., Fournier, A. -A., Sisitsky, T., Pike, C. T., Kessler, R. C. The economic burden of adults with major depressive disorder in the United States (2005 and 2010). The Journal of Clinical Psychiatry. 76 (2), 155-162 (2015).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E.
- Porsolt, R. D., Le Pichon, M., Jalfre, M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature. 266 (5604), 730-732 (1977).
- Can, A., et al. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Chatterjee, M., Jaiswal, M., Palit, G. Comparative evaluation of forced swim test and tail suspension test as models of negative symptom of schizophrenia in rodents. ISRN Psychiatry. 2012, 595141 (2012).
- Reardon, S. Depression researchers rethink popular mouse swim tests. Nature. 571 (7766), 456-457 (2019).
- Serchov, T., et al. Increased signaling via adenosine A1 receptors, sleep deprivation, imipramine, and ketamine inhibit depressive-like behavior via induction of Homer1a. Neuron. 87 (3), 549-562 (2015).
- Holz, A., et al. Enhanced mGlu5 signaling in excitatory neurons promotes rapid antidepressant effects via AMPA receptor activation. Neuron. 104 (2), 338-352 (2019).
- Sun, P., et al. Increase in cortical pyramidal cell excitability accompanies depression-like behavior in mice: A transcranial magnetic stimulation study. Journal of Neuroscience. 31 (45), 16464-16472 (2011).
- Hellwig, S., et al. Altered microglia morphology and higher resilience to stress-induced depression-like behavior in CX3CR1-deficient mice. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 126-137 (2016).
- Serchov, T., Heumann, R., van Calker, D., Biber, K. Signaling pathways regulating Homer1a expression: implications for antidepressant therapy. Biological Chemistry. 397 (3), 207-214 (2016).
- van Calker, D., Serchov, T., Normann, C., Biber, K. Recent insights into antidepressant therapy: Distinct pathways and potential common mechanisms in the treatment of depressive syndromes. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 88, 63-72 (2018).
- Serchov, T., et al. Enhanced adenosine A1 receptor and Homer1a expression in hippocampus modulates the resilience to stress-induced depression-like behavior. Neuropharmacology. 162, 107834 (2020).
- Quitkin, F. M., Rabkin, J. G., Ross, D., Stewart, J. W. Identification of true drug response to antidepressants. Use of pattern analysis. Archives of General Psychiatry. 41 (8), 782-786 (1984).
- Normann, C., et al. Antidepressants rescue stress-induced disruption of synaptic plasticity via serotonin transporter-independent inhibition of L-type calcium channels. Biological Psychiatry. 84 (1), 55-64 (2018).
- Zanos, P., et al. NMDAR inhibition-independent antidepressant actions of ketamine metabolites. Nature. 533 (7604), 481-486 (2016).
- Alboni, S., et al. Fluoxetine effects on molecular, cellular, and behavioral endophenotypes of depression are driven by the living environment. Molecular Psychiatry. 22 (4), 552-561 (2017).
- Niehusmann, P., et al. Coincidence detection and stress modulation of spike time-dependent long-term depression in the hippocampus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 30 (18), 6225-6235 (2010).
- Schreiber, S. S., Tocco, G., Shors, T. J., Thompson, R. F. Activation of immediate early genes after acute stress. Neuroreport. 2 (1), 17-20 (1991).
- National centre for the replacement refinement and reduction of animals in research. , Available from: https://www.nc3rs.org.uk (2021).
- Loss, C. M., et al. Influence of environmental enrichment vs. time-of-day on behavioral repertoire of male albino Swiss mice. Neurobiology of Learning and Memory. 125, 63-72 (2015).
- Walker, W. H., Walton, J. C., DeVries, A. C., Nelson, R. J. Circadian rhythm disruption and mental health. Translational Psychiatry. 10 (1), 1-13 (2020).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Reports. 6 (10), 930-935 (2005).
- Holderbach, R., Clark, K., Moreau, J. -L., Bischofberger, J., Normann, C. Enhanced long-term synaptic depression in an animal model of depression. Biological Psychiatry. 62 (1), 92-100 (2007).
- Nissen, C., et al. Learning as a model for neural plasticity in major depression. Biological Psychiatry. 68 (6), 544-552 (2010).
- Kuhn, M., et al. State-dependent partial occlusion of cortical LTP-like plasticity in major depression. Neuropsychopharmacology. 41 (6), 1521-1529 (2016).
- Schwabe, L. Stress and the engagement of multiple memory systems: integration of animal and human studies. Hippocampus. 23 (11), 1035-1043 (2013).
- Ballan, R., Gabay, Y. Does acute stress impact declarative and procedural learning. Frontiers in Psychology. 11, 342 (2020).
