Summary
Den kroniska förtvivlan musmodellen (CDM) av depression består av repetitiva påtvingade simpass och en annan fördröjd simfas som en avläsning. Det representerar en lämplig modell för induktion av en kronisk depressiv-liknande tillstånd stabil i minst 4 veckor, gottgörbar för att utvärdera subkroniska och akuta behandling interventioner.
Abstract
Egentlig depression är en av de vanligaste formerna av psykiska sjukdomar och orsakar enormt individuellt lidande och socioekonomisk börda. Trots dess betydelse är nuvarande farmakologiska behandling begränsad, och nya behandlingsalternativ är brådskande. En nyckelfaktor i sökandet efter potentiella nya läkemedel är att utvärdera deras antidepressiva styrka i lämpliga djurmodeller. Det klassiska Porsolt-testet användes för detta ändamål i årtionden för att inducera och bedöma ett depressivt tillstånd. Den består av två korta perioder av påtvingad simning: den första att inducera ett deprimerat tillstånd och den andra följande dagen för att utvärdera den antidepressiva effekten av det medel som ges mellan de två simpassen. Denna modell kan vara lämplig som ett screeningverktyg för potentiella antidepressiva medel men ignorerar fördröjd uppkomst av verkan av många antidepressiva. CDM grundades nyligen och representerade en modifiering av det klassiska testet med anmärkningsvärda skillnader. Möss tvingas simma i 5 dagar i följd, efter tanken att hos människor induceras depression av kronisk snarare än av akut stress. Under en viloperiod på flera dagar (1-3 veckor) utvecklar djur ihållande beteendemässig förtvivlan. Standardavläsningsmetoden är mätning av orörlighetstid i ytterligare ett försenat simpass, men flera alternativa metoder föreslås för att få en bredare bild av djurets humörstatus. Flera analysverktyg kan användas för att rikta beteendemässiga, molekylära och elektrofysiologiska förändringar. Den deprimerade fenotypen är stabil i minst 4 veckor, vilket ger ett tidsfönster för snabba men också subkroniska antidepressiva behandlingsstrategier. Dessutom kan förändringar i utvecklingen av ett depressivt liknande tillstånd åtgärdas med detta tillvägagångssätt. CDM är därför ett användbart verktyg för att bättre förstå depression och utveckla nya behandlingsinterventioner.
Introduction
Affektiva störningar, såsom egentlig depression, är bland de vanligaste och mest utmanande psykiska sjukdomarna och är förknippade med högt individuellt lidande1, en ökning av självmordsrisken2, och orsakar en betydande socioekonomisk börda3 för samhället. Trots dess inverkan är behandlingsalternativen begränsade, och det finns ett akut behov av utveckling av nya antidepressiva interventioner, särskilt på grund av innovationskrisen inom psykofarmakologi under de senaste decennierna. För att förstå patofysiologin av depression och testa potentiella nya medel, rationella och giltiga djurmodeller är brådskande4. Under nästan ett halvt sekel användes det klassiska tvångssimtestet (FST), som ursprungligen beskrevs av Porsolt5, som induktion och avläsning för screening av potentiella nya antidepressiva medel. Den består av en påtvingad simperiod i 5-15 min på dag 1, efterföljande engångsdrogapplikation och utvärdering av den del möss spenderar orörlig i vatten i en annan simperiod följande dag. Orörlighetstiden ansågs representera ett saknat naturligt flyktbeteende och ansågs korrelera med graden av ett depressionsliknande tillstånd hos mössen5.
Den klassiska FST har kritiserats hårt, inte bara i det vetenskapliga samfundet6,7,8 utan också i offentliga medier8. De flesta kontroverser runt FST beror på de korta induktions- och behandlingsperioderna på endast 1 dag i det klassiska paradigmet. Det hävdades att FST representerar snarare en akut trauma modell än ett tillstånd jämförbart med mänsklig depression. Dessutom kan Porsolt-testet vara lämpligt som ett screeningverktyg för potentiella antidepressiva medel, men det ignorerar den fördröjda uppkomsten av verkan av många antidepressiva medel.
Den kroniska förtvivlan modell (CDM)9,10,11,12,13,14,15, som härrör från den ursprungliga FST, representerar en lämpligare djurmodell för depression. I CDM, upprepad simstress över 5 på varandra följande dagar undviker akuta traumatiska effekter. Genom att misslyckas med att fly från en upprepad och pågående stressig situation, möss tros utveckla ett tillstånd av hjälplöshet, kapitulation och slutligen förtvivlan. Detta paradigm är mer jämförbart med nuvarande psykologiska teorier för utveckling av depression hos människor än ett enda akut trauma, som ofta upplevs vid uppkomsten av en posttraumatisk stressstörning. Det resulterande depressionsliknande tillståndet i CDM är stabilt i upp till 4 veckor9 och öppnar därför möjligheten för längre behandlingsperioder, som är bättre jämförbara med kliniska tillstånd, där antidepressiva vanligtvis behöver 2-4 veckor för att visa en fördel16.
Utvärderingen av det depressiva tillståndet bör då vara flerdimensionell. Mätningen av orörlighetstid, till exempel i den klassiska FST, är användbar, men bör inte användas som den enda utfallsparametern. Olika metoder, som beskrivs nedan, bör kunna kartlägga olika dimensioner av ett depressivt tillstånd i linje med symtom som vanligtvis finns hos deprimerade människor. Lämpliga avläsningsbedömningar kan inkludera escape-beteende (orörlighetstid9,10,17), svansfjädringstest (TST)9, anhedonia (klassiskt sackarospreferenstest (SPT)18), motivationsorienterat beteende (nose-poke sackaros preferenstest (NPSPT)10), förväntan / utforskningsbeteende (svar på tvetydig signal19; Y-maze test9), elektrofysiologi (mätningar av långsiktig plasticitet (långsiktig potentiering, LTP; långvarig depression, LTD)20), molekylära bedömningar (aktiveringsmönster för omedelbara tidiga gener (IEGs); ytterligare stressmönster21).
Teoretiskt kan ett upprepat simtest användas för att inducera ett deprimerat tillstånd utan någon bedömning av orörlighetstiden. Det rekommenderas dock starkt att tillhandahålla åtminstone en proof-of-concept experimentell serie med orörlighetstider. Dessutom representerar CDM en lämplig modell för att bedöma utvecklingen av ett depressivt tillstånd genom att mäta orörlighetstiden under induktionsfasen. Specifika musstammar eller möss som behandlas före simning kan utvärderas med avseende på motståndskraft eller sårbarhet för stress och induktion av beteendemässig förtvivlan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med europeiska riktlinjer (EU 2010/63) och i enlighet med den tyska djurskyddslagen (TierSchG), FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php), det nationella djurskyddsorganet GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) för vård och användning av laboratoriedjur, och godkändes av djurskyddskommittén vid universitetet i Freiburg och av Comite d'Ethique en Matiere d'Experimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS). CEEA35) samt lokala myndigheter. Båda könen av C57Bl6N vilda möss i åldern 10-14 veckor (70-98 postnatala dagar, PND) användes för vilda-typ (WT) indicerade experiment. Som en stress-resilient linje, den transgena mus linjen med förbättrat uttryck av adenosin A1 receptorer under forebrain neuronal CaMKII promotorn användes9,15. Efter experimenten offrades möss av livmoderhalscancer förskjutning.
1. Förberedelse
- Få en djurforskningslicens, inklusive grundlig experimentell planering.
- Ankomst: Vid ankomsten, höj djuren i djuranläggningen för att utföra CDM. Om djuren köps från en extern leverantör, låt dem minst 2 veckor anpassa sig till den nya miljön.
- Hölje: För att hysa djuren, se till att burarna inte är upptagna med maximalt antal djur för att undvika ytterligare stress. Garantera att bostadsförhållandena är i linje med internationella rekommendationer om mushus (för ytterligare information, se22) och ständigt upprätthålla dem hela tiden.
OBS: De viktigaste standardhusförhållandena inkluderar individuellt ventilerade burar med 25-120 luftförändringar per timme, 12 h ljus-mörk cykel, temperaturen så stabil som möjligt (minst konstant mellan 20-24 °C), fuktighet så stabil som möjligt (minst mellan 45%-65%), gnagmaterial och skydd närvarande, inget individuellt hus. - Tidspunkt: Utför alla experiment vid samma tid på dagen.
OBS: Ingen direkt bedömning har gjorts för att verifiera påverkan av dagtid på CDM, men de flesta beteendetester utvärdera depressiva-liknande tillstånd visar variationer beroende på tiden på dagen23,24,25, och det är mycket troligt att dagtid också påverkar CDM. - Kapslingsmaterial: Minska kapslingsmaterialet till ett minimum. Se till att det inte finns några löphjul etc., i buret.
OBS: Berikad miljö förhindrar induktion av ett deprimerat tillstånd. - Gruppsammansättning: Låt djuren stanna kvar i samma grupp under hela försöket. Gruppera honmössen tillsammans även från olika kullar; gruppera hanmössen tillsammans med nedskräpande handjur. På grund av kommande aggressivitet, särskilt hos män, kan bitning och barbering bli ett problem, ge därför särskild tonvikt åt gruppkompositionen. Undvik enstaka bostäder eftersom fattigdom är en stor extra stressfaktor.
- Djur: Använd olika musstammar, även om särskilda skillnader har observerats9,10. En ofta använd musstam är C57Bl6N. Etikettmöss för att utföra parad statistisk analys (se steg 3.2.4).
- Djursex: Använd också både manliga och kvinnliga möss.
- Djurålder: Se till att djuren är minst 10 veckor gamla. Använd inte yngre djur på grund av utmattningen som orsakas av simning.
- Utrustning: Använd en genomskinlig glascylinder/bägare med en kapacitet på minst 2 L, en diameter på 24-26 cm och en minimihöjd på 30 cm. Ytterligare krav inkluderar en termometer för att kontrollera vattentemperaturen, pappershanddukar, värmelampa/värmematta för rött ljus eller jämförbar värmekälla, timer, stoppur, tysta omgivningar. Videofilma simsessionerna för offlineanalys och dokumentation. Se till att datum och tid kontinuerligt syns på bandet/filen, tillsammans med ett identifieringsnummer för det enskilda djuret. Lagra filerna för senare analys och ytterligare referens. Filma från sidan av glascylindern, inte ovanifrån, för att underlätta analysen.
2. Induktionsfasen
- Innan du börjar
- Observera djuren visuellt för avvikelser, inklusive tecken på bitning eller barbering. Uteslut hela buret från experimentserien om ett djur uppvisar några minimala skador. Se till att en veterinär är tillgänglig när som helst eftersom skadorna kommer att förvärras under experimentet och förhindra fortsättning när möss blir mer aggressiva under påverkan av stress.
- Få kroppsvikten för varje djur innan du påbörjar experimentet. Se till att den viktminskning som ofta observeras inte överstiger 20% av den ursprungliga kroppsvikten. Uteslut djur med en viktminskning på över 20% och avliva dem omedelbart på grund av det förmodade höga lidandet.
- Fyll en bägare eller cylinder med vatten vid rumstemperatur (22–23 °C) till en höjd av minst 20 cm från botten och lämna minst 10 cm mellan vattenytan och fartygets övre kant.
- Föreställning
- Överför försiktigt djuren i vattnet. Under simfasen, håll djuret under kontinuerlig observation för att förhindra drunkning. Observera från en position där djuret inte kan se experimenteraren (till exempel videoobservation från ett rum bredvid).
- Ställ in en kronometer i början av experimentet. Ta djuren ur vattnet efter 10 min genom att helt enkelt ta tag i svansen. Torka dem försiktigt med en pappershandduk och lägg dem antingen under en värmelampa eller på en värmematta.
- Utvärdera endast ett djur i taget. Se till att djuren inte kan se varandra (till exempel separera buret från den experimentella uppsättningen av en rumsavdelare).
- Utför det påtvingade simpasset i 10 minuter varje dag i 5 dagar i följd.
- Fulländande
- Överför djuren tillbaka till sina hemburar efter fem simpass och låt dem vila i minst 2 dagar. Påbörja specifika behandlingsinterventioner därefter.
3. Utvärdering av en antidepressiv behandling
- Tidskurs
- Utvärdera de akuta och subkronic behandlingarna med CDM. Beroende på den vetenskapliga frågan, anpassa viloperioden mellan induktionsfasen och avläsningen.
- För att utvärdera den akuta och snabbverkande styrkan av ketamin, välj en kort viloperiod (några dagar) efter induktionsfasen av CDM. Applicera behandlingen (dvs. intraperitoneal injektion) och utför sedan utvärderingen (ytterligare simsession eller annan utvärderingsmetod) kort därefter.
- För att utvärdera effekterna av en subkron behandling, öka behandlingsperioden upp till 4 veckor (det finns inga tillgängliga data för längre behandlingsperioder). Ge till exempel oral behandling med imipramin till djuren under 4 veckor efter induktionsfasen och utvärdera därefter.
- Börja utvärdera det deprimerade tillståndet direkt efter behandlingsperiodens slut, t.ex. följande dag. Välj alltid en identisk tidsperiod för kontroll och experimentella förhållanden.
- Orörlighetstid
- Proof-of-concept
- Om du vill använda orörlighetstid som avläsningsmetod, utvärdera varje dag i induktionsfasen och testdagen för att tillhandahålla ett konceptbevis (se figur 1). För ytterligare experimentella serier, minska bedömningarna till dag 1, dag 5 och testdagen (se figur 1C).
- Videoband varje experiment. Låt två utbildade observatörer som är blinda för de experimentella förhållandena utföra analysen självständigt. Videoanalys gör det möjligt för experimenteraren att observera beteendet från ett annat rum, vilket minimerar störningen med testet (se till exempel videofilen i det kompletterande materialet).
- Villkor: Observera och identifiera de tre olika beteendeförhållandena under simtestet: kamp, simning och orörlighet. De flesta forskare fokuserar på orörlighet; en ytterligare differentiering mellan kämpande och simning är sällan användbar och ökar dramatiskt analysens komplexitet och varaktighet.
- Kämpar: Djuret försöker aktivt fly från den hotande situationen. Detta innebär att tafsa på cylinderns sida med huvudet ienterat mot väggen och rörelserna i alla lemmar. Vattenytan är vanligtvis något turbulent.
- Simning: Djuret rör sig åtminstone båda bakpottarna och reser ett avstånd genom vattnet. Den söker aktivt efter en väg ut men försöker inte övervinna kärlets glasvägg. Simning innebär inte att lyfta tassarna ovanför vattenytan, och kroppen är vanligtvis orienterad parallellt med cylinderns väggar. I detta tillstånd vänder djur ofta eller rör sig i cirklar.
- Orörlighet: Djuret håller sig stilla, i ett frysliknande läge, och rör sig inte alls eller flyttar bara svansen, eller forepawsna för att hålla huvudet ovanför vattenytan. Inget avstånd är aktivt tillrygga med undantag för passiv flytande, och ingen riktad rörelse av de främre tassarna observeras.
- Spårning
- Utför utvärderingen med offlinevideoinspelningar. Använd blindade betyg av två oberoende och erfarna examinatorer och beräkna medelvärden mellan de två betygen.
- Upprepa betygen om resultaten för de två klassarna skiljer sig över ett tidigare bestämt intervall. Observera kontinuerligt mössen eftersom de olika förhållandena ofta förändras mellan kämpande, simning och orörlighet.
- Använd ett stoppur för att mäta den totala tiden som tillbringas i ett fokuserat skede (vanligtvis orörlighet) under de 10 minuter musen stannar i vattnet. Tänk på en kort latens på ungefär en sekund innan du ändrar den pågående tidsmätningen (t.ex. om ett djur förblir i 20 s i orörlighet och bara rör sig en gång i mindre än en sekund och återgår till orörlighet i ytterligare 10 s, är den totala orörlighetstiden 30 s).
- Statistik: På grund av den relativt höga interpersonala standardavvikelsen (troligen orsakad av en överföring av hierarkiberoende beteende från buret till simtestet), markera eller märka djuren för att utföra parade (istället för oparade) parametriska tester efteråt. Utvärdera normalitetsfördelningen och, beroende på den specifika frågan, utföra variansanalys (ANOVA) med post-hoc t-tester eller parade t-tester för att jämföra de olika grupperna. Utför analysen med absoluta värden för orörlighetstid (er) eller som normaliserade värden.
- Absoluta värden: Ge medelvärden av orörlighetstiden från dag 1 till dag 5 och för testdagen ± SEM (se figur 1A). Jämför medelvärdena för dag 1 och dag 5, helst med hjälp av ett parat t-test för att validera induktion av ett deprimerat tillstånd. Om det finns en signifikant skillnad mellan dag 1 och 5 jämför du medelvärdena för dag 5 med testdagens genomsnittliga resultat. Se till att en typisk gruppstorlek i ett experiment är mellan 6 och 10 djur och förvänta dig betydande skillnader mellan baslinjen och efter induktions orörlighetstiderna hos vilda djur. Det är svårt att jämföra olika grupper med ett oparat t-test om absoluta värden används på grund av skillnader i baslinjen. Använd därför normaliserade värden.
- Relativa/normaliserade värden: Jämför de olika behandlingseffekterna genom normalisering med det enskilda resultatet dag 5 och uttryck sedan värdena i procent av dag 5 (se figur 1B).
- Kontrollexperiment
OBS: Simprestandan kan vara korrelerad med rörelse. Ämnen som orsakar en hyper-rörelse kan inducera falskt positiva resultat (nämligen en minskning av orörlighetstiden); samt lugnande medel kan artificiellt öka orörlighetstiden.- Utvärdera förändringarna i rörelse för okända ämnen innan du utför simanalysen. Använd Open Field Test (OFT) i en separat grupp djur i minst 10 minuter.
- Välj samma observationstid (10 min) i OFT som i CDM för att upptäcka ospecificerade hyperlokseffekter av den testade föreningen som kan påverka CDM-avläsningen via mätning av orörlighetstid med hög validitet.
- Vid betydande hyperlokseffekter, utvärdera inte simpasset för att bedöma den antidepressiva styrkan utan använd olika avläsningsmetoder (t.ex. sackarospreferens, svansfjädringstest osv.).
- Proof-of-concept
4. Utvärdering av utvecklingen av ett depressivt tillstånd
- För att utvärdera utvecklingen av en depressiv sjukdom, utvärdera varje dag i induktionsfasen för att mäta orörlighetstiden.
OBS: I detta fall beskriver en mindre ökning av orörlighetstiden mellan varje dag motståndskraft, medan en starkare och tidigare ökning jämfört med obehandlade eller vilda djur utgör en ökad sårbarhet för stressinducerad förtvivlan. Genom att behandla möss före simhändelsen kunde förebyggande ingripande eller transgena muslinjer bedömas när det gäller utvecklingen av beteendemässig förtvivlan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den första simsessionen i induktionsfasen av CDM visar möss vanligtvis en genomsnittlig orörlighetstid mellan 190 s och 230 s, som ständigt stiger med varje ytterligare simsession (figur 1A). Denna ökning är mer uttalad under de första 3 dagarna och når en platåliknande fas under de senaste 2-3 dagarna. Orörlighet-tiden mätt på dag 5 förblir stabil under upp till 4 veckor, vilket indikerar stabil beteendemässig förtvivlan. Den antidepressiva styrkan i ett ingrepp kan utvärderas genom att behandla djuret mellan den sista dagen av induktionsfasen och testdagen. Observera att den absoluta poängtiden under simsessionerna är ganska subjektiv och beror på den experimenterare, ålder, kön och den muslinje som används. Den relativa skillnaden mellan sessionerna är dock ganska stabil med endast små interraterskillnader.
I figur 1 visas flera representativa behandlingar. Imipramin, sömnbrist och ketamin minskade avsevärt orörligheten-tiden, medan sömnbrist i kombination med en återhämtningssömn inte visade en betydande förändring av den depressiva-liknande fenotypen. Dessa resultat överensstämmer med en antidepressiv styrka av de tillämpade behandlingarna och liknar effekter som observerats hos mänskliga patienter. Behandlingen omfattade intag av imipramin 20 mg/kg/dag i 3 veckor via dricksvatten, 3 mg/kg ketamin med en enda intraperitoneal injektion 24 h före testning och sömnbrist i 6 timmar före testning.
Beroende på forskningsfrågan kan olika representationer visas. En representation av absoluta värden kan ge en verklig dataöversikt och möjliggör en bra utvärdering av induktionsfasen och av en enda behandling (figur 1A,D). Skillnaderna mellan olika behandlingar kan dock inte direkt jämföras. därför har varje behandlingsgrupp olika medelvärden av orörlighetstid dag 5. Därför rekommenderas att man använder representationen av normaliserade medelvärden i detta fall (figur 1B). En minskad representation kan väljas på grund av utrymmesbegränsningar (figur 1C). Observera att det är obligatoriskt att visa åtminstone resultaten från dag 1, dag 5 och testdagen.
Figur 1: Lyckade resultat i absoluta och normaliserade värden. (A) Framgångsrik induktion av ett deprimerat tillstånd hos 30 möss kan observeras. Varje prick representerar orörlighetstiden för ett enda djur på en viss dag och stänger representerar medelvärdena för de testade djuren. Orörlighetstiden representeras för varje dag i induktionsfasen (dag 1 till dag 5) och för testdagen (efter den prickade linjen) med eller utan behandling. Observera att i detta prov kan en betydande ökning observeras mellan dag 1 och dag 2. I vissa fall uppnås signifikansnivåer först mellan dag 1 och dag 3. För att fortsätta experimentet är en statistiskt signifikant ökning mellan dag 1 och dag 5 obligatorisk. Observera den typiska takeffekten (ökning mellan dag 1, 2 och 3, jämfört med skillnaden mellan dag 4 och 5). Mellan dag 5 och testdagarna hölls djur i 4 veckor i sina hemburar, antingen utan ytterligare behandling (CDM) eller behandlades med imipramin (Imip.); sömnbrist (SD); sömnbrist och återhämtningssömn (RS) och ketamin (Ket). B) Föredömlig tid för enskilda djurs prestationer ges för varje dag. C) Normaliserad representation av samma resultat som redan visas i figur 1A. Orörlighetstiden för varje djur och dag normaliserades till motsvarande orörlighetstid på dag 5 och uttrycktes i procent. Värden efter behandling för olika grupper kan visas bättre och jämföras med den här metoden. D) Representation av normaliserade värden för dag 1, dag 5 och testdag (CDM). Efter ett framgångsrikt konceptbevis kan utvärderingspoängen minskas till dag ett, dag fem och testdag. Dessa tidpunkter behövs eftersom en betydande ökning mellan dag 1 och dag 5 är nödvändig för att påvisa en framgångsrik induktion, och dag 5 måste jämföras med testdagen för att ge ett uttalande om behandlingseffekt. E) Jämförelse av orörlighetstiden för tre olika muslinjer: Wildtype (WT) visar en lyckad induktion; en exemplarisk resilient-line (RL) visar ett signifikant minskat depressionsliknande beteende under de första tre dagarna och på testdagen. Enkelriktad ANOVA med Bonferroni post hoc-test : ∗/#p < 0,05, ∗∗/##p < 0,01, ∗∗∗/###p < 0.001, ∗∗∗∗/####p < 0.0001. (#ange skillnad mot medelvärden för dag 1, ∗indikerad skillnad till medelvärden för dag 5 i figur 1A, C och WT-muslinjen i figur 1E). Data uttrycks som medel ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vid oförändrad orörlighetstid under alla 5 dagar (figur 2) kunde den applicerade stressen inte ändra beteendet relevant, och inga behandlingseffekter kan utvärderas. djur måste offras och får inte användas vidare.
Figur 2: Resultat som inte har lyckats. En representation av en ineffektiv induktion visas i figuren. Observera att ingen signifikant ökning av orörlighetstiden mellan dag 1 och dag 5 inträffar. Därför uppnåddes inte kriterier för fortsatt försök, och ingen ytterligare förlängning är rationell (i detta fall testades endast hanmöss, och efter retrospektiv undersökning konstaterades det att de inte var skräpkamrater). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Ytterligare utläsningsmetoder måste användas för att beskriva en bredare syn på djurens beteendeförtvivring. En mängd olika beteendemässiga tester, elektrofysiologiska mätningar och molekylära bedömningar av stress-inducerade förändringar finns tillgängliga. Föredömliga resultat för Tail Suspension Test (TST), med CDM, imipramin och ketaminbehandling, Nose-poke-Sackaros preferenstest (NPSPT) och bedömning av långsiktig potentiering med hjälp av patch-clamp tekniken ges i figur 3. Dessa resultat uppmuntrar att använda CDM induktionsfasen som ett allmänt verktyg för induktion av beteendemässiga förtvivlan. För ytterligare information om de använda teknikerna (TST, NPSPT, LTP-assessment) se9,10,17,20.
Bild 3: Ytterligare resultat med CDM-möss. (A) En föredömlig framställning av effekterna av CDM i tail suspension test. Möss suspenderades av svansen, och den tid som tillbringades orörlig registrerades (för metodologiska detaljer se9). Varje prick representerar orörlighetstiden för ett enda djur, och stänger representerar medelvärdena för de testade djuren. Enkelriktad ANOVA med Bonferroni post hoc-test: ∗∗∗p < 0,001. Data uttrycks som medel ± SEM. (B) Representativa resultat av det nyligen etablerade nos pokes sackarospreferenstestet hos CDM-möss. I denna uppgift mättes sackarospreferensen med gradvis ökande ansträngning för att nå sackarosflaskan (antal näskoppor) (för metodologiska detaljer se10). Observera att sackarospreferensen minskade i CDM och att skillnaden mellan CDM och kontrollmöss gradvis ökar med ansträngningen (medelvärden av näsprickor på varje dag indikeras som Nspk1-7) möss var tvungna att ansöka om att dricka den söta lösningen. Tvåvägs ANOVA med Bonferroni post hoc-test: ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001. Data uttrycks som medel ± SEM. (C) CDM-beroende förändringar i långsiktig synaptisk plasticitet presenteras som förändringar av medelvärden av EPSPs efter tillämpning av ett associativt LTP induktionsprotokoll i hippocampal hjärnskivor av WT möss. Data erhölls genom stimulering av CA3-CA1 synaps (för detaljer se17,20). Oparerat t-test, ∗∗p < 0,01, uttrycks data som medel ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande material. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CDM-modellen representerar en relevant och etablerad modell för att testa den antidepressiva styrkan hos nya interventioner och öppnar ett förlängt tidsfönster för molekylära eller elektrofysiologiska experiment för att klargöra patofysiologin av depression. Särskilt i kombination med andra tester för att bedöma ett depressionsliknande tillstånd har CDM en hög ansikts- och koncept validitet. Den kombinerar subkronisk stress och förvärvad hjälplöshet för induktion och producerar ett långvarigt depressivt tillstånd. Det är okänsligt för den enda tillämpningen av klassiska antidepressiva men svarar på subkronisk tillämpning och efterliknar därför situationen hos människor. I ett tidsfönster på 4 veckor visar många olika antidepressiva interventioner effekt, allt från olika klasser av antidepressiva, icke-invasiv hjärnstimulering, sömnbrist till snabbverkande antidepressiva medel9,10,11. Dessutom kan mätningen av orörlighetstiden under induktionsfasen användas som en markör för stresstålighet eller sårbarhet vid testning av transgena djur eller möss som behandlats före induktionsfasen. Sammantaget är CDM ekonomisk när det gäller kostnad, varaktighet, standardisering och reproducerbarhet mellan labb. Även om prestandan verkar ganska enkel -"du släpper en mus i ett vattenkärl och tar ut den efter 10 min"-det finns flera kritiska punkter som måste hållas i åtanke för att få rimliga och stabila resultat. De flesta problem beror på otillräcklig noggrannhet under förberedelse eller analys.
Ett vanligt problem är att möss, särskilt män, inte visar en signifikant ökning av orörlighetstiden i induktionsfasen. I dessa fall kan möss redan ha stressats innan induktion börjar; Därför orsakar ytterligare stress under simprotokollet inte en relevant ökning av förtvivlan. Observera att orörlighetstiden verkar ha en takeffekt eftersom ökningen mellan dag 1 och 2 är större än mellan dag 2 respektive 3. Efter dag 3 kan vanligtvis ingen ytterligare betydande ökning förväntas. Vanliga orsaker till överdriven baslinjestress kan vara den senaste tidens transport av djur eller samlevnad av ungdomar/vuxna handjur, ett tillstånd som aldrig uppstår i naturen. Därför bör experimenteraren vara försiktig och alltid försäkra sig om att djur är skräpmat, att de hade tillräckligt med tid att acklimatisera sig till den nya omgivningen och att det inte finns några tecken på bitning eller barbering innan experimentet börjar. Dessutom måste djuren vägas varje dag och viktminskningen måste kontrolleras till högst 20% av den ursprungliga kroppsvikten. En större viktminskning anses vara kritisk, på grund av det faktum att repetitiv simning är utmattande och djur som inte kan behålla sin kroppsvikt lider för mycket av denna utmattning. En kritisk punkt här är att djur som lider för mycket av utmattning förmodligen inte kan simma eller kämpa i 10 min under testet. När orörlighetstider hos dessa djur analyseras tenderar de att visa ett falskt negativt resultat på grund av fysisk utmattning.
En annan problematisk omständighet som ibland uppstår, särskilt när längre behandlingsperioder krävs, är en spontan minskning av orörlighetstiden i testutvärderingen. Efter 4 veckor minskar orörlighetstiden vanligtvis jämfört med bedömningar som utförs 2 dagar efter slutet av induktionsperioden (N.B. detta motsvarar, även om det med en annan tidsskala, motsvarar situationen hos människor där deprimerade episoder vanligtvis är självbegränsande). För att minimera denna fallgrop bör det garanteras att inget onödigt bomaterial appliceras på djurets hembur, vilket kan betraktas som ett effektivt antidepressivt ingripande (berikad miljö). Dessutom kan en ökning av gruppstorleken bidra till att minska variansen. Vid behov kan ytterligare ett simpass läggas till som en ändring av standardprotokollet som beskrivs ovan. Till exempel kan en ökning från fem till sju simpass på 7 på varandra följande dagar utföras och bör resultera i ett stabilare deprimerat tillstånd hos djuren. Det rekommenderas inte att ytterligare öka varaktigheten av den enskilda simsessionen för att undvika överdriven utmattning.
Det finns ingen enighet inom forskarvärlden om den mest förnuftiga tidsramen som ska analyseras. Medan vissa grupper anser att alla 10 min är viktiga9,10, hävdar andra att beteendet inom de första minuterna representerar en akut stresssituation och analyserar endast de sista 4 minuterna eller 6 min18. Det senare antagandet härrör huvudsakligen från den gemensamma praxisen i utvärderingsprocessen av den klassiska FST. Experimentella bevis som behandlar frågan om den mest rationella tidsramen som ska analyseras i CDM saknas. Olika högt rankade publikationer använde analysen av hela 10 min i CDM9,10.
Trots ett ökande antal kommersiellt tillgängliga program för automatiserad videoanalys har ingen uppsättning visat tillräcklig noggrannhet för att ersätta en utbildad observatör. De flesta programvaror förlitar sig på spårning av rörelse av möss i vattnet och kräver en kameraposition ovanifrån. Bedömningar av skickliga människor har fördelen att inte bara rörelse utan också förmodad avsikt med mer komplexa rörelser kan bedömas, inklusive intensiteten av tassrörelser. Till exempel rör sig möss ofta genom att vända sin kropp eller genom subtila svansrörelser för att hålla huvudet ovanför vattnet, vilket programvara vanligtvis spårar som simning. Ett annat exempel är rörelsen riktad mot kärlets glasvägg, inklusive frekvent nos som petas från kort avstånd. Trots den tydliga avsikten att fly genom vertikala rörelser spårar programvaran ofta orörlighet på grund av liten rörelse. Korrekta och tillförlitliga bedömningar är dock fortfarande svåra och tidskrävande. Det rekommenderas att träna en rater av en erfaren experimenterare och utarbeta gemensamma bedömningar av exempelvideor av de två oberoende graderarna för att diskutera gemensamma definitioner och tvetydigheter. Dessutom bör de första resultaten från ett laboratorium med CDM jämföras med tidigare publicerade resultat från andra grupper.
Forskare som använder CDM kan ofta uppleva uppfattningen att ökad orörlighet är en ganska intelligent energibesparande lärd reaktion hos möss till en ofrånkomlig men tillfällig stressig situation. Enligt vår mening överskattar detta mössens kognitiva flexibilitet; Det betonar dock behovet av ytterligare bedömningar av ett deprimerat tillstånd oberoende av orörlighetstid. Det kan vidare hävdas att andra väletablerade djurmodeller av depression som chronic mild stress test, producerar liknande resultat; och att ett deprimerat tillstånd eller starka stressfaktorer hindrar, inte ökar inlärningen både hos människor och hos djur17,20,26,27,28,29,30.
Djurens börda är vanligtvis klassad som hög till extrem i djurforskningstillämpningar. Experimentella serier bör planeras noggrant för att minimera antalet djur, och djur bör behandlas med försiktighet och respekt före och efter simpassen. Men i vissa länder kanske det inte är möjligt att få en djurforskningslicens för CDM. CDM möjliggör bedömning av antidepressiv effekt av ett brett spektrum av interventioner och induktion av ett relativt stabilt deprimerat tillstånd. Heterogeniteten och komplexiteten hos egentlig depression hos människor kan inte replikeras i någon djurmodell. De flesta djurmodeller av depression är baserade på stressinducerad/traumaliknande erfarenhet hos möss, vilket inte nödvändigtvis är fallet hos människor, där barndomsbrist, komplex inlärningshistoria och/ eller sociokulturella riskfaktorer också verkar vara viktiga. Musmodeller av depression bör därför erkännas som vad de är: en förenklad modell för en mycket komplex störning. Men om det utförs på ett adekvat sätt och om flera avläsningsmetoder används är CDM ett lämpligt verktyg i sökandet efter nya insikter och mål i depressionsforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av interna medel från universitetskliniken Freiburg, Institutionen för psykiatri och psykoterapi och Berta-Ottenstein-programmet för kliniker (till SV). TS finansieras av anslagen från Medical Research Foundation (FRM) (AJE20191912009450) och University of Strasbourg Institute of Advance Studies (USIAS) (2020-035), samt Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Frankrike.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 2000 mL | Kimble Kimax | 14000-2000 | any vessel >2000ml and diameter of 24-26 cm possible |
| Digital Thermometer | Hanna Instruments | 846-4708 | any digital thermometer possible |
| Digitalwaage 200 g Dipse | DIPSE | tp200 | any digital scale possible |
| Lenovo ThinkCentre V50a-24IMB AiO 11FJ00DVGE - 60,5 cm | Lenovo | A 908278 | any standard Personalcomputer possible |
| Logitech PTZ Pro | Logitech | 1000005246 | any high resolution camera possible |
| Stopwatch ROTILABO | Carl Roth | L423.1 | any stopwatch possible |
| Timer ROTILABO | Carl Roth | A802.1 | any timer possible |
References
- James, S. L., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Aleman, A., Denys, D. Mental health: A road map for suicide research and prevention. Nature. 509 (7501), 421-423 (2014).
- Greenberg, P. E., Fournier, A. -A., Sisitsky, T., Pike, C. T., Kessler, R. C. The economic burden of adults with major depressive disorder in the United States (2005 and 2010). The Journal of Clinical Psychiatry. 76 (2), 155-162 (2015).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E.
- Porsolt, R. D., Le Pichon, M., Jalfre, M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature. 266 (5604), 730-732 (1977).
- Can, A., et al. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Chatterjee, M., Jaiswal, M., Palit, G. Comparative evaluation of forced swim test and tail suspension test as models of negative symptom of schizophrenia in rodents. ISRN Psychiatry. 2012, 595141 (2012).
- Reardon, S. Depression researchers rethink popular mouse swim tests. Nature. 571 (7766), 456-457 (2019).
- Serchov, T., et al. Increased signaling via adenosine A1 receptors, sleep deprivation, imipramine, and ketamine inhibit depressive-like behavior via induction of Homer1a. Neuron. 87 (3), 549-562 (2015).
- Holz, A., et al. Enhanced mGlu5 signaling in excitatory neurons promotes rapid antidepressant effects via AMPA receptor activation. Neuron. 104 (2), 338-352 (2019).
- Sun, P., et al. Increase in cortical pyramidal cell excitability accompanies depression-like behavior in mice: A transcranial magnetic stimulation study. Journal of Neuroscience. 31 (45), 16464-16472 (2011).
- Hellwig, S., et al. Altered microglia morphology and higher resilience to stress-induced depression-like behavior in CX3CR1-deficient mice. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 126-137 (2016).
- Serchov, T., Heumann, R., van Calker, D., Biber, K. Signaling pathways regulating Homer1a expression: implications for antidepressant therapy. Biological Chemistry. 397 (3), 207-214 (2016).
- van Calker, D., Serchov, T., Normann, C., Biber, K. Recent insights into antidepressant therapy: Distinct pathways and potential common mechanisms in the treatment of depressive syndromes. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 88, 63-72 (2018).
- Serchov, T., et al. Enhanced adenosine A1 receptor and Homer1a expression in hippocampus modulates the resilience to stress-induced depression-like behavior. Neuropharmacology. 162, 107834 (2020).
- Quitkin, F. M., Rabkin, J. G., Ross, D., Stewart, J. W. Identification of true drug response to antidepressants. Use of pattern analysis. Archives of General Psychiatry. 41 (8), 782-786 (1984).
- Normann, C., et al. Antidepressants rescue stress-induced disruption of synaptic plasticity via serotonin transporter-independent inhibition of L-type calcium channels. Biological Psychiatry. 84 (1), 55-64 (2018).
- Zanos, P., et al. NMDAR inhibition-independent antidepressant actions of ketamine metabolites. Nature. 533 (7604), 481-486 (2016).
- Alboni, S., et al. Fluoxetine effects on molecular, cellular, and behavioral endophenotypes of depression are driven by the living environment. Molecular Psychiatry. 22 (4), 552-561 (2017).
- Niehusmann, P., et al. Coincidence detection and stress modulation of spike time-dependent long-term depression in the hippocampus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 30 (18), 6225-6235 (2010).
- Schreiber, S. S., Tocco, G., Shors, T. J., Thompson, R. F. Activation of immediate early genes after acute stress. Neuroreport. 2 (1), 17-20 (1991).
- National centre for the replacement refinement and reduction of animals in research. , Available from: https://www.nc3rs.org.uk (2021).
- Loss, C. M., et al. Influence of environmental enrichment vs. time-of-day on behavioral repertoire of male albino Swiss mice. Neurobiology of Learning and Memory. 125, 63-72 (2015).
- Walker, W. H., Walton, J. C., DeVries, A. C., Nelson, R. J. Circadian rhythm disruption and mental health. Translational Psychiatry. 10 (1), 1-13 (2020).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Reports. 6 (10), 930-935 (2005).
- Holderbach, R., Clark, K., Moreau, J. -L., Bischofberger, J., Normann, C. Enhanced long-term synaptic depression in an animal model of depression. Biological Psychiatry. 62 (1), 92-100 (2007).
- Nissen, C., et al. Learning as a model for neural plasticity in major depression. Biological Psychiatry. 68 (6), 544-552 (2010).
- Kuhn, M., et al. State-dependent partial occlusion of cortical LTP-like plasticity in major depression. Neuropsychopharmacology. 41 (6), 1521-1529 (2016).
- Schwabe, L. Stress and the engagement of multiple memory systems: integration of animal and human studies. Hippocampus. 23 (11), 1035-1043 (2013).
- Ballan, R., Gabay, Y. Does acute stress impact declarative and procedural learning. Frontiers in Psychology. 11, 342 (2020).
