Summary
Den kroniske fortvilelse musemodellen (CDM) av depresjon består av repeterende tvunget svømmeøkter og en annen forsinket svømmefase som en avlesning. Det representerer en egnet modell for induksjon av en kronisk depressiv tilstandsstabil i minst 4 uker, endres for å evaluere subkroniske og akutte behandlingsintervensjoner.
Abstract
Stor depressiv lidelse er en av de mest utbredte former for psykiske lidelser og forårsaker enorm individuell lidelse og sosioøkonomisk byrde. Til tross for sin betydning er nåværende farmakologisk behandling begrenset, og nye behandlingsalternativer er presserende nødvendig. En viktig faktor i søket etter potensielle nye legemidler er å evaluere deres antidepressive styrke i passende dyremodeller. Den klassiske Porsolt-svømmetesten ble brukt til dette formålet i flere tiår for å indusere og vurdere en depressiv tilstand. Den består av to korte perioder med tvungen svømming: den første til å indusere en deprimert tilstand og den andre påfølgende dag for å evaluere den antidepressive effekten av midlet gitt mellom de to svømmeøktene. Denne modellen kan være egnet som et screeningverktøy for potensielle antidepressive midler, men ignorerer den forsinkede utbruddet av virkning av mange antidepressiva. CDM ble nylig etablert og representerte en modifikasjon av den klassiske testen med bemerkelsesverdige forskjeller. Mus blir tvunget til å svømme i 5 påfølgende dager, etter ideen om at hos mennesker blir depresjon indusert av kronisk i stedet for av akutt stress. I en hvileperiode på flere dager (1-3 uker) utvikler dyr vedvarende atferdsfortvilelse. Standard avlesningsmetode er måling av immobilitetstid i en ekstra forsinket svømmeøkt, men flere alternative metoder foreslås for å få et bredere syn på dyrets humørstatus. Flere analyseverktøy kan brukes til å målrette atferdsmessige, molekylære og elektrofysiologiske endringer. Den deprimerte fenotypen er stabil i minst 4 uker, og gir et tidsvindu for raske, men også subkrone antidepressive behandlingsstrategier. Videre kan endringer i utviklingen av en depressiv tilstand løses ved hjelp av denne tilnærmingen. CDM representerer derfor et nyttig verktøy for bedre å forstå depresjon og utvikle nye behandlingstiltak.
Introduction
Affektive lidelser, som stor depressiv lidelse, er blant de hyppigste og mest utfordrende psykiske sykdommene og er forbundet med høy individuell lidelse1, en økning av selvmordsrisiko2, og forårsaker en betydelig sosioøkonomisk byrde3 for samfunnet. Til tross for virkningen er behandlingsalternativene begrenset, og det er et presserende behov for utvikling av nye antidepressive intervensjoner, spesielt på grunn av innovasjonskrisen i psykofarmakologi de siste tiårene. For å forstå patofysiologien til depresjon og teste potensielle nye midler, er rasjonelle og gyldige dyremodeller presserende nødvendig4. I nesten et halvt århundre ble den klassiske tvungne svømmetesten (FST), opprinnelig beskrevet av Porsolt5, brukt som induksjon og avlesning for screening av potensielle nye antidepressiva. Den består av en tvungen svømmeperiode i 5-15 min på dag 1, etterfølgende engangsbruk av narkotika, og evaluering av delen mus bruker immobil i vann i en annen svømmeperiode påfølgende dag. Immobilitetstiden ble ansett for å representere en manglende naturlig rømningsadferd og ble antatt å korrelere med graden av en depresjonslignende tilstand i musene5.
Den klassiske FST har blitt sterkt kritisert, ikke bare i det vitenskapelige samfunnet6,7,8, men også i offentlige medier8. De fleste kontroverser rundt FST skyldes de korte induksjons- og behandlingsperiodene på bare 1 dag i det klassiske paradigmet. Det ble hevdet at FST representerer snarere en akutt traumemodell enn en tilstand som kan sammenlignes med menneskelig depresjon. Videre kan Porsolt-testen være egnet som et screeningverktøy for potensielle antidepressive midler, men den ignorerer den forsinkede utbruddet avvirkning av mange antidepressiva.
Den kroniske fortvilelsesmodellen (CDM)9,10,11,12,13,14,15, som er avledet fra den opprinnelige FST, representerer en mer passende dyremodell for depresjon. I CDM unngår gjentatt svømmestress over 5 påfølgende dager akutte traumatiske effekter. Ved å unnlate å unnslippe fra en gjentatt og pågående stressende situasjon, antas mus å utvikle en tilstand av hjelpeløshet, overgivelse og til slutt fortvilelse. Dette paradigmet er mer sammenlignbart med dagens psykologiske teorier for utvikling av depresjon hos mennesker enn et enkelt akutt traume, som ofte oppleves ved utbruddet av en posttraumatisk stresslidelse. Den resulterende depresjonslignende tilstanden i CDM er stabil i opptil 4 uker9 og åpner derfor muligheten for lengre behandlingsperioder, som er bedre sammenlignbare med kliniske tilstander, der antidepressiva vanligvis trenger 2-4 uker for å vise en fordel16.
Evalueringen av den depressive-lignende tilstanden bør da være flerdimensjonal. Måling av immobilitetstid, for eksempel i den klassiske FST, er nyttig, men bør ikke brukes som den eneste resultatparameteren. Ulike metoder, som er beskrevet nedenfor, bør kunne kartlegge forskjellige dimensjoner av depressiv tilstand i tråd med symptomer som vanligvis finnes hos deprimerte mennesker. Egnede avlesningsvurderinger kan omfatte rømningsatferd (immobilitetstid9,10,17), hale suspensjon test (TST)9, anhedonia (klassisk sukrose preferanse test (SPT)18), motivasjonsorientert oppførsel (nese-poke sukrose preferansetest (NPSPT)10), forventning / utforskningsatferd (respons på tvetydig signal19; Y-labyrint test9), elektrofysiologi (målinger av langsiktig plastisitet (langsiktig potensiering, LTP; langsiktig depresjon, LTD)20), molekylære vurderinger (aktiveringsmønstre av umiddelbare tidlige gener (IEGs); ytterligere stressmønstre21).
Teoretisk sett kan en gjentatt svømmetest brukes til å indusere en deprimert tilstand uten vurdering av immobilitetstid. Det anbefales imidlertid sterkt å gi minst en konseptgodkjennings eksperimentell serie med immobilitetstider. I tillegg representerer CDM en passende modell for å vurdere utviklingen av en depressiv tilstand ved å måle immobilitetstid i induksjonsfasen. Spesifikke musestammer eller mus som behandles før svømming, kan evalueres med hensyn til motstandskraft eller sårbarhet for stress og induksjon av atferdsfortvilelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med europeiske retningslinjer (EU 2010/63) og i samsvar med den tyske dyrebeskyttelsesloven (TierSchG), FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php), det nasjonale dyrevelferdsorganet GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html) guide for pleie og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av dyrevelferdskomiteen ved Universitetet i Freiburg og av Comite d'Ethique en Matiere d'Experimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS, CEEA35), samt lokale myndigheter. Begge kjønn av C57Bl6N villtype mus i alderen 10-14 uker (70-98 postnatal dager, PND) ble brukt til wild-type (WT) indikerte eksperimenter. Som en stress-elastisk linje ble den transgene muselinjen med forbedret uttrykk for adenosin A1-reseptorer under forebrain nevronal CaMKII-promotoren brukt9,15. Etter forsøkene ble mus ofret av livmorhals dislokasjon.
1. Forberedelse
- Få en dyreforskningslisens, inkludert grundig eksperimentell planlegging.
- Ankomst: Ved ankomst, heve dyrene i dyreanlegget for å utføre CDM. Hvis dyrene kjøpes fra en ekstern leverandør, la dem minst 2 uker tilpasse seg det nye miljøet.
- Bolig: For å huse dyrene, sørg for at burene ikke er opptatt med maksimalt antall dyr for å unngå ekstra stress. Garantere at boligforholdene er i tråd med internasjonale anbefalinger om musehus (for ytterligere informasjon, se22) og hele tiden opprettholde dem til enhver tid.
MERK: De viktigste standard boligforholdene inkluderer individuelt ventilerte merder med 25-120 luftforandringer per time, 12 timers lys-mørk syklus, temperatur så stabil som mulig (minst konstant mellom 20-24 °C), fuktighet så stabil som mulig (minst mellom 45% -65%), gnagemateriale og ly tilstede, ingen individuelle boliger. - Tidspunkt: Utfør alle eksperimenter samtidig på dagen.
MERK: Det er ikke gjort noen direkte vurdering for å verifisere påvirkningen fra dagtid på CDM, men de fleste atferdstester som evaluerer depressive tilstander viser variasjoner avhengig av tidspunktet på dagen23,24,25, og det er svært sannsynlig at dagtid også påvirker CDM. - Hekkemateriale: Reduser hekkematerialet til et minimum. Forsikre deg om at det ikke er noen løpehjul, etc., til stede i buret.
MERK: Beriket miljø forhindrer induksjon av deprimert tilstand. - Gruppesammensetning: La dyrene forbli i samme gruppe gjennom hele eksperimentet. Grupper de kvinnelige musene sammen selv fra forskjellige kull; gruppere de mannlige musene sammen med kullkamerat mannlige dyr. På grunn av kommende aggressivitet, spesielt av menn, kan biting og barbering bli et problem, og legger derfor særlig vekt på gruppesammensetningen. Unngå eneboliger som deprivasjon er en stor ekstra stressor.
- Dyr: Bruk forskjellige musestammer, selv om spesifikke forskjeller er observert9,10. En ofte brukt musestamme er C57Bl6N. Label mus for å utføre parret statistisk analyse (se trinn 3.2.4).
- Dyresex: Bruk både mannlige og kvinnelige mus på samme måte.
- Dyrealder: Sørg for at dyrene er minst 10 uker (70 PND) gamle. Ikke bruk yngre dyr på grunn av utmattelse forårsaket av svømming.
- Utstyr: Bruk en gjennomsiktig glasssylinder/beger med en kapasitet på minst 2 L, en diameter på 24-26 cm og en minimumshøyde på 30 cm. Ytterligere krav inkluderer et termometer for å sjekke vanntemperaturen, papirhåndklær, rødlysvarmelampe / varmematte eller sammenlignbar varmekilde, timer, stoppeklokke, stille omgivelser. Videotape svømmeøktene for offline analyse og dokumentasjon. Sørg for at datoen og klokkeslettet er kontinuerlig synlig på båndet/filen, sammen med et identifikasjonskodenummer for det enkelte dyret. Lagre filene for senere analyse og videre referanse. Film fra siden av glasssylinderen, ikke ovenfra, for å lette analysen.
2. Induksjonsfase
- Før du begynner
- Observer dyrene visuelt for abnormiteter, inkludert tegn på biting eller barbering. Utelukke hele buret fra eksperimentell serie hvis et dyr viser minimale skader. Forsikre deg om at en veterinær er tilgjengelig når som helst, da skader vil forverres under eksperimentet og vil forhindre fortsettelse etter hvert som mus blir mer aggressive under påvirkning av stress.
- Oppnå kroppsvekten for hvert dyr før du starter eksperimentet. Forsikre deg om at vekttapet som ofte observeres ikke overstiger 20% av den opprinnelige kroppsvekten. Utelat dyr med et vekttap på over 20% og avlivet dem umiddelbart på grunn av antatt høy lidelse.
- Fyll opp et beger eller sylinder med vann ved romtemperatur (22-23 °C) til en høyde på minst 20 cm fra bunnen, og la det være minst 10 cm mellom vannoverflaten og fartøyets øvre kant.
- Prestasjon
- Overfør dyrene forsiktig i vannet. Under svømmefasen, hold dyret under kontinuerlig observasjon for å forhindre drukning. Vær oppmerksom fra en posisjon der dyret ikke kan se eksperimentet (for eksempel videoobservasjon fra et rom ved siden av).
- Angi et kronometer i begynnelsen av eksperimentet. Ta dyrene ut av vannet etter 10 min ved å bare ta tak i halene. Tørk dem forsiktig med et papirhåndkle og legg dem enten under et varmelys eller på en varmematte.
- Evaluer bare ett dyr om gangen. Forsikre deg om at dyr ikke kan se hverandre (for eksempel skille boligburet fra det eksperimentelle oppsettet med en romdeler).
- Utfør tvungen svømmeøkt i 10 minutter hver dag i 5 påfølgende dager.
- Etterbehandling
- Overfør dyrene tilbake til sine hjemmebur etter fem svømmeøkter og la dem hvile i minst 2 dager. Start spesifikke behandlingstiltak senere.
3. Evaluering av en antidepressiv behandling
- Tidskurs
- Vurder akutte og subkroniske behandlinger med CDM. Avhengig av det vitenskapelige spørsmålet, tilpass hvileperioden mellom induksjonsfasen og avlesningen.
- For å evaluere den akutte og hurtigvirkende styrken av ketamin, velg en kort hvileperiode (noen dager) etter induksjonsfasen av CDM. Påfør behandlingen (dvs. intraperitoneal injeksjon), og utfør deretter evalueringen (ekstra svømmeøkt eller annen evalueringsmetode) kort tid etterpå.
- For å evaluere effekten av en subkron behandling, øk behandlingsperioden opptil 4 uker (det er ingen data tilgjengelig for lengre behandlingsperioder). For eksempel, gi oral behandling med imipramin til dyrene i løpet av 4 uker etter induksjonsfasen og vurder deretter.
- Begynn å evaluere deprimert tilstand rett etter slutten av behandlingsperioden, for eksempel neste dag. Velg alltid en identisk tidsperiode for kontroll og eksperimentelle forhold.
- Immobilitetstid
- Konseptgodkjenning
- Hvis du vil bruke immobilitetstid som en avlesningsmetode, evaluerer du hver dag i induksjonsfasen og testdagen for å gi et konseptbevis (se figur 1). For ytterligere eksperimentelle serier, reduser vurderingene til dag 1, dag 5 og testdagen (se figur 1C).
- Videobånd hvert eksperiment. La to trente observatører som er blindet for de eksperimentelle forholdene, utføre analysen uavhengig av hverandre. Videoanalyse gjør det mulig for eksperimentet å observere oppførselen fra et annet rom, og minimerer derfor forstyrrelsen av testen (se for eksempel videofilen i tilleggsmaterialet).
- Forhold: Observer og identifiser de tre forskjellige atferdsforholdene under svømmetesten: sliter, svømmer og immobilitet. De fleste forskere fokuserer på immobilitet; En ytterligere differensiering mellom å slite og svømme er sjelden nyttig og øker analysens kompleksitet og varighet dramatisk.
- Sliter: Dyret prøver aktivt å unnslippe fra den truende situasjonen. Dette innebærer å pante siden av sylinderen med hodet orientert mot veggen og bevegelser av alle lemmer. Vannoverflaten er vanligvis litt turbulent.
- Svømming: Dyret beveger seg minst både bakpoter og reiser en avstand gjennom vannet. Den søker aktivt etter en vei ut, men prøver ikke å overvinne glassveggen på fartøyet. Svømming innebærer ikke å løfte potene over vannoverflaten, og kroppen er vanligvis orientert parallelt med sylinderens vegger. I denne tilstanden snur dyr ofte eller beveger seg i sirkler.
- Immobilitet: Dyret holder seg stille, i en fryselignende stilling, og beveger seg ikke i det hele tatt eller bare beveger halen, eller forpaws for å holde hodet over vannoverflaten. Ingen avstand er aktivt reist bortsett fra passiv flytende, og ingen rettet bevegelse av de fremre potene observeres.
- Sporing
- Utfør vurderingen ved hjelp av frakoblede videoopptak. Bruk blindede vurderinger av to uavhengige og erfarne sensorer, og beregn gjennomsnitt mellom de to vurderingene.
- Gjenta vurderingene hvis resultatene av de to raterne er forskjellige over et tidligere bestemt område. Observer musene kontinuerlig når de forskjellige forholdene ofte endres mellom å slite, svømme og immobilitet.
- Bruk en stoppeklokke for å måle den totale tiden som brukes i et fokusert stadium (vanligvis immobilitet) i løpet av de 10 minutter musen forblir i vannet. Vurder en kort ventetid på omtrent et sekund før du endrer den pågående tidsmålingen (f.eks. hvis et dyr forblir i 20 s i immobilitet og bare beveger seg en gang i mindre enn et sekund og går tilbake til immobilitet i ytterligere 10 s, er den totale immobilitetstiden 30 s).
- Statistikk: På grunn av det relativt høye inter-individuelle standardavviket (sannsynligvis forårsaket av overføring av hierarkiavhengig oppførsel fra buret til svømmetesten), merk eller merk dyrene for å utføre parvise (i stedet for uparrede) parametriske tester etterpå. Evaluer normalitetsfordelingen og, avhengig av det spesifikke spørsmålet, utfør variansanalyse (ANOVA) med post-hoc t-tester eller parvise t-tester for å sammenligne de forskjellige gruppene. Utfør analysen ved hjelp av absolutte verdier av immobilitetstid(er) eller som normaliserte verdier.
- Absolutte verdier: Gi gjennomsnittsverdier for immobilitetstiden fra dag 1 til dag 5 og for testdagen ± SEM (se figur 1A). Sammenlign gjennomsnittsverdiene for dag 1 og dag 5, helst ved hjelp av en parvis t-test for å validere induksjonen av en deprimert tilstand. Hvis det er en signifikant forskjell mellom dag 1 og 5, sammenligner du gjennomsnittsverdiene for dag 5 med de gjennomsnittlige resultatene for testdagen. Sørg for at en typisk gruppestørrelse i ett eksperiment er mellom 6 og 10 dyr og forvent betydelige forskjeller mellom baseline og post-induksjon immobilitet ganger hos ville dyr. Det er vanskelig å sammenligne ulike grupper med en ikke-reparert t-test hvis absolutte verdier brukes på grunn av grunnlinjeforskjeller. Bruk derfor normaliserte verdier.
- Relative/normaliserte verdier: Sammenlign de ulike behandlingseffektene ved normalisering med det enkelte resultatet på dag 5, og uttrykk verdiene som en prosentandel av dag 5 (se figur 1B).
- Kontrollere eksperimenter
MERK: Svømmeytelsen kan være korrelert med bevegelse. Stoffer som forårsaker hyper-bevegelse kan indusere falske positive resultater (nemlig en reduksjon av immobilitetstid); så vel som beroligende midler kan kunstig øke immobilitetstiden.- Evaluer endringene i bevegelse for ukjente stoffer før du utfører svømmeanalysen. Bruk Open Field Test (OFT) i en egen gruppe dyr i minst 10 min.
- Velg samme observasjonstid (10 min) i OFT som i CDM for å oppdage uspesifiserte hyperlokomotiveffekter av den testede forbindelsen som kan påvirke CDM-avlesning via måling av immobilitetstid med høy validitet.
- Ved betydelige hyperlokomotiveffekter må du ikke evaluere svømmeøkten for å vurdere den antidepressive styrken, men bruke forskjellige avlesningsmetoder (for eksempel sukrosepreferanse, halefjæringstest, etc.).
- Konseptgodkjenning
4. Evaluering av utviklingen av en depressiv tilstand
- For å evaluere utviklingen av en depressiv lidelse, vurder hver dag i induksjonsfasen for å måle immobilitetstiden.
MERK: I dette tilfellet beskriver en liten økning av immobilitetstid mellom hver dag motstandskraft, mens en sterkere og tidligere økning sammenlignet med ubehandlede eller ville dyr representerer en forbedret sårbarhet for stressindusert fortvilelse. Ved å behandle mus før svømmehendelsen, kan forebyggende intervensjon eller transgene muselinjer vurderes angående utviklingen av atferdsfortvilelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den første svømmeøkten i induksjonsfasen av CDM viser mus vanligvis en gjennomsnittlig immobilitetstid mellom 190 s og 230 s, som stadig stiger med hver ekstra svømmeøkt (figur 1A). Denne økningen er mer uttalt i de første 3 dagene og når en platålignende fase i løpet av de siste 2-3 dagene. Immobilitetstiden målt på dag 5 forblir stabil over opptil 4 uker, noe som indikerer stabil atferdsfortvilelse. Den antidepressive styrken til en intervensjon kan evalueres ved å behandle dyret mellom den siste dagen i induksjonsfasen og testdagen. Legg merke til at den absolutte poengsumtiden under svømmeøktene er ganske subjektiv og avhenger av eksperimentering, alder, kjønn og muselinjen som brukes. Den relative forskjellen mellom øktene er imidlertid ganske stabil med bare små interraterforskjeller.
I figur 1 vises flere representative behandlinger. Imipramin, søvnmangel og ketamin reduserte immobilitetstiden betydelig, mens søvnmangel kombinert med en restitusjonssøvn ikke viste en betydelig endring av den depressive-lignende fenotypen. Disse resultatene er konkordanse med en antidepressiv styrke av de anvendte behandlingene og ligner effekter observert hos menneskelige pasienter. Behandlingen innebar inntak av imipramin 20 mg/kg/dag i 3 uker via drikkevann, 3 mg/kg ketamin med en enkelt intraperitoneal injeksjon 24 timer før testing, og søvnmangel i 6 timer før testing.
Avhengig av problemstillingen kan ulike representasjoner vises. En representasjon av absolutte verdier kan gi en reell dataoversikt og gir en god vurdering av induksjonsfasen og en enkelt behandling (figur 1A,D). Forskjellene i ulike behandlinger kan imidlertid ikke sammenlignes direkte; Derfor har hver behandlingsgruppe forskjellige gjennomsnittsverdier av immobilitetstid på dag 5. Derfor anbefales det å bruke representasjonen av normaliserte gjennomsnittsverdier i dette tilfellet (figur 1B). En redusert representasjon kan velges på grunn av plassbegrensninger (figur 1C). Vær oppmerksom på at det er obligatorisk å vise minst resultatene av dag 1, dag 5 og testdagen.
Figur 1: Vellykkede resultater i absolutte og normaliserte verdier. (A) Vellykket induksjon av en deprimert-lignende tilstand hos 30 mus kan observeres. Hver prikk representerer immobilitetstiden til et enkelt dyr på en bestemt dag, og barer representerer gjennomsnittsverdiene til de testede dyrene. Immobilitetstid er representert for hver dag i induksjonsfasen (dag 1 til dag 5) og for testdagen (etter den stiplede linjen) med eller uten behandling. Vær oppmerksom på at i denne prøven kan det observeres en betydelig økning mellom dag 1 og dag 2. I noen tilfeller oppnås signifikansnivåer først mellom dag 1 og dag 3. For videreføring av eksperimentet er en statistisk signifikant økning mellom dag 1 og dag 5 obligatorisk. Legg merke til den typiske takeffekten (øk mellom dag 1, 2 og 3, sammenlignet med forskjellen mellom dag 4 og 5). Mellom dag 5 og testdagene ble dyr plassert i 4 uker i sine hjemmebur, enten uten videre behandling (CDM) eller behandlet med imipramin (Imip.); søvnmangel (SD); søvnmangel og restitusjonssøvn (RS) og ketamin (Ket). (B) Eksemplarisk tidsforløp for utførelsen av individuelle dyr er gitt for hver dag. (C) Normalisert representasjon av de samme resultatene som allerede er vist i figur 1A. Immobilitetstiden til hvert dyr og hver dag ble normalisert til tilsvarende immobilitetstid på dag 5 og uttrykt i prosent. Etterbehandlingsverdier for ulike grupper kan vises bedre og sammenlignes ved hjelp av denne tilnærmingen. (D) Representasjon av normaliserte verdier for dag 1, dag 5 og testdagen (CDM). Etter et vellykket konseptbevisstudie kan vurderingstidspoeng reduseres til dag én, dag fem og testdagen. Disse tidspunktene er nødvendige fordi en betydelig økning mellom dag 1 og dag 5 er nødvendig for å demonstrere en vellykket induksjon, og dag 5 må sammenlignes med testdagen for å gi en uttalelse om behandlingseffektivitet. (E) Sammenligning av immobilitetstiden til tre forskjellige muselinjer: Wildtype (WT) viser en vellykket induksjon; en eksemplarisk spenstig linje (RL) viser en betydelig redusert depresjonslignende oppførsel de første tre dagene og på testdagen. Enveis ANOVA med Bonferroni post hoc-test: ∗/#p < 0,05, ∗∗/##p < 0,01, ∗∗∗/###p < 0,001, ∗∗∗∗/###p < 0,0001. (#angi differanse til gjennomsnittsverdier for dag 1, ∗indisere differanse til gjennomsnittsverdier for dag 5 i figur 1A,C og til WT-muselinje i figur 1E). Data uttrykkes som midler ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ved uendret immobilitetstid i løpet av alle de 5 dagene (figur 2) var det anvendte stresset ikke i stand til å endre atferden relevant, og ingen behandlingseffekter kan evalueres; dyr må ofres og må ikke brukes videre.
Figur 2: Mislykkede resultater. En representasjon av en ineffektiv induksjon er vist i figuren. Vær oppmerksom på at ingen signifikant økning i immobilitetstid mellom dag 1 og dag 5 oppstår. Derfor ble kriterier for videreføring av eksperimentet ikke oppnådd, og ingen ytterligere forlengelse er rasjonell (i dette tilfellet ble bare mannlige mus testet, og etter retrospektiv undersøkelse ble det funnet at de ikke var kullkamerater). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Videre avlesningsmetoder må brukes til å beskrive et bredere syn på dyrenes atferdsmessige fortvilelse. En rekke atferdstester, elektrofysiologiske målinger og molekylære vurderinger av stressinduserte endringer er tilgjengelige. Eksemplariske resultater for tail suspension test (TST), med CDM, imipramin og ketamin behandling, Nose-poke-Sucrose Preference Test (NPSPT), og vurdering av langsiktig potensiering ved hjelp av patch-clamp teknikken er gitt i figur 3. Disse resultatene oppmuntrer til å bruke CDM-induksjonsfasen som et generelt verktøy for induksjon av atferdsfortvilelse. For ytterligere detaljer om brukte teknikker (TST, NPSPT, LTP-vurdering) se9,10,17,20.
Figur 3: Ytterligere resultater med CDM-mus. (A) En eksemplarisk fremstilling av effektene av CDM i halefjæringstesten. Mus ble suspendert av halen, og tiden som ble brukt immobile ble registrert (for metodologiske detaljer se9). Hver prikk representerer immobilitetstiden til et enkelt dyr, og barer representerer gjennomsnittsverdiene til de testede dyrene. Enveis ANOVA med Bonferroni post hoc-test: ∗∗∗p < 0,001. Data uttrykkes som midler ± SEM. (B) Representative resultater av den nylig etablerte nese-pokes sukrose preferanse test i CDM mus. I denne oppgaven ble sukrosepreferanse målt med gradvis økende innsats for å nå sukroseflasken (antall nesestikk) (for metodologiske detaljer se10). Legg merke til at sukrosepreferansen ble redusert i CDM, og at forskjellen mellom CDM og kontrollmus gradvis øker med innsatsen (gjennomsnittlige verdier av nese pokes på hver dag angitt som Nspk1-7) mus måtte søke om å drikke den søte løsningen. Toveis ANOVA med Bonferroni post hoc-test: ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001. Data uttrykkes som midler ± SEM. (C) CDM-avhengige endringer i langsiktig synaptisk plastisitet presenteres som endringer av gjennomsnittlige verdier av EPSP etter anvendelsen av en assosiativ LTP-induksjonsprotokoll i hippocampale hjerneskiver av WT-mus. Data ble innhentet ved stimulering av CA3-CA1 synapse (for detaljer se17,20). Unpaired t-test, ∗∗p < 0.01, data uttrykkes som midler ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsmateriale. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CDM-modellen representerer en relevant og etablert modell for testing av antidepressiv styrke av nye intervensjoner og åpner et utvidet tidsvindu for molekylære eller elektrofysiologiske eksperimenter for å belyse depresjonens patofysiologi. Spesielt når kombinert med andre tester for å vurdere en depresjonslignende tilstand, har CDM et høyt ansikt og konsept gyldighet. Den kombinerer subkronisk stress og ervervet hjelpeløshet for induksjon og produserer en langvarig depressiv tilstand. Det er ufølsomt for den enkle anvendelsen av klassiske antidepressiva, men reagerer på subkronisk applikasjon og etterligner derfor situasjonen hos mennesker. I et tidsvindu på 4 uker viser mange forskjellige antidepressive intervensjoner effekt, alt fra forskjellige klasser av antidepressiva, ikke-invasiv hjernestimulering, søvnmangel til hurtigvirkende antidepressiva9,10,11. Videre kan måling av immobilitetstid i induksjonsfasen brukes som en markør for stressresistens eller sårbarhet, i tilfelle testing av transgene dyr eller mus behandlet før induksjonsfasen. Alt i alt er CDM økonomisk når det gjelder kostnader, varighet, standardisering og reproduserbarhet mellom laboratorier. Selv om ytelsen virker ganske enkel- "slipper du en mus inn i et vannbeholder og tar den ut etter 10 min"-det er flere kritiske punkter som må huskes for å oppnå rimelige og stabile resultater. De fleste problemer skyldes utilstrekkelig nøyaktighet under forberedelse eller analyse.
Et vanlig erfarent problem er at mus, spesielt menn, ikke viser en betydelig økning i immobilitetstid i induksjonsfasen. I disse tilfellene kan mus allerede ha blitt stresset før induksjonen starter; Derfor forårsaker ytterligere stress under svømmeprotokollen ikke en relevant økning av fortvilelse. Vær oppmerksom på at immobilitetstiden ser ut til å ha en takeffekt siden økningen mellom dag 1 og 2 er større enn mellom dag 2 og 3. Etter dag 3, vanligvis, kan det ikke forventes ytterligere betydelig økning. Vanlige årsaker til overdreven baseline stress kan være nylig transport av dyr eller samliv av unge / voksne mannlige dyr, en tilstand som aldri forekommer i naturen. Derfor bør eksperimentet være forsiktig og alltid sikre at dyr er kullkamerater, at de hadde nok tid til å akklimatisere seg til de nye omgivelsene, og at det ikke er tegn til biting eller barbering før eksperimentet starter. Videre må dyrene veies hver dag, og vekttap må kontrolleres for ikke å overstige 20% av den opprinnelige kroppsvekten. Et større vekttap anses som kritisk, på grunn av det faktum at repeterende svømming er utmattende og dyr som ikke er i stand til å opprettholde kroppsvekten, lider for mye av denne utmattelsen. Et kritisk poeng her er at dyr som lider for mye av utmattelse sannsynligvis ikke er i stand til å svømme eller kjempe i 10 minutter under testen. Når immobilitetstider for disse dyrene analyseres, har de en tendens til å vise et falskt negativt utfall på grunn av fysisk utmattelse.
En annen problematisk omstendighet som noen ganger oppstår, spesielt når lengre behandlingsperioder er nødvendig, er en spontan reduksjon av immobilitetstid i testevalueringen. Etter 4 uker reduseres immobilitetstiden vanligvis sammenlignet med vurderinger utført 2 dager etter slutten av induksjonsperioden (N.B. dette tilsvarer, men med en annen tidsskala, til situasjonen hos mennesker der deprimerte episoder vanligvis er selvbegrensende). For å minimere denne fallgruven, bør det garanteres at det ikke påføres unødvendig hekkemateriale på dyrets hjemmebur, som kan betraktes som en effektiv antidepressiv intervensjon (beriket miljø). Videre kan en økning i gruppestørrelsen bidra til å redusere variansen. Om nødvendig kan en ekstra svømmeøkt legges til som en endring av standardprotokollen som er beskrevet ovenfor. For eksempel kan en økning fra fem til syv svømmeøkter på 7 påfølgende dager utføres og bør resultere i en mer stabil deprimert tilstand av dyrene. Det anbefales ikke å øke varigheten av den enkelte svømmeøkten ytterligere for å unngå overdreven utmattelse.
Det er ingen enighet i det vitenskapelige samfunnet om den mest fornuftige tidsrammen som skal analyseres. Mens noen grupper anser alle 10 min viktig9,10, hevder andre at oppførselen i løpet av de første minuttene representerer en akutt stresssituasjon og analyserer bare de siste 4 min eller 6 min18. Sistnevnte antagelse er hovedsakelig avledet fra vanlig praksis i evalueringsprosessen til den klassiske FST. Eksperimentelle bevis som tar for seg spørsmålet om den mest rasjonelle tidsrammen som skal analyseres i CDM, mangler. Ulike høyt rangerte publikasjoner brukte analysen av hele 10 min i CDM9,10.
Til tross for økende antall kommersielt tilgjengelig programvare for automatisert videoanalyse, har ingen oppsett vist tilstrekkelig nøyaktighet til å erstatte en opplært observatør. De fleste programvarer er avhengige av sporing av bevegelse av mus i vannet og krever en kameraposisjon ovenfra. Vurderinger av dyktige mennesker har fordelen at ikke bare bevegelse, men også antatt intensjon om mer komplekse bevegelser kan vurderes, inkludert intensiteten av potebevegelser. For eksempel beveger mus seg ofte ved å snu kroppen eller ved subtile halebevegelser for å holde hodet over vannet, hvilken programvare sporer vanligvis som svømming. Et annet eksempel er bevegelsen rettet mot glassveggen på fartøyet, inkludert hyppig nese stakk fra kort avstand. Til tross for den klare intensjonen om å unnslippe av vertikale bevegelser, sporer programvaren ofte immobilitet på grunn av liten bevegelse. Nøyaktige og pålitelige vurderinger forblir imidlertid vanskelige og tidkrevende. Det anbefales å trene en rater av en erfaren eksperimenterer og forberede felles vurderinger av prøvevideoer av de to uavhengige raterne for å diskutere vanlige definisjoner og tvetydigheter. Videre bør de første resultatene av et laboratorium med CDM sammenlignes med tidligere publiserte resultater fra andre grupper.
Forskere som bruker CDM kan ofte oppleve forestillingen om at økt immobilitet er en ganske intelligent slutt energibesparende lært reaksjon av mus til en uunngåelig, men midlertidig stressende situasjon. Etter vår mening overvurderer dette musenes kognitive fleksibilitet; Det understreker imidlertid nødvendigheten av ytterligere vurderinger av en deprimert tilstand uavhengig av immobilitetstid. Det kan videre hevdes at andre veletablerte dyremodeller av depresjon som kronisk mild stresstest, gir lignende resultater; og at en deprimert tilstand eller sterke stressfaktorer hindrer, ikke øker læringen både hos mennesker og hos dyr17,20,26,27,28,29,30.
Dyrets byrde er vanligvis vurdert som høy til ekstrem i dyreforskningsapplikasjoner. Eksperimentell serie bør planlegges grundig for å minimere antall dyr, og dyr bør behandles med forsiktighet og respekt før og etter svømmeøktene. I noen land er det imidlertid ikke sikkert det er mulig å få en dyreforskningslisens for CDM. CDM tillater vurdering av antidepressiv effekt av et bredt spekter av intervensjoner og induksjon av en relativt stabil deprimert tilstand. Heterogeniteten og kompleksiteten til store depressive lidelser hos mennesker kan ikke replikeres i noen dyremodell. De fleste dyremodeller av depresjon er basert på stressindusert/traumelignende erfaring hos mus, noe som ikke nødvendigvis er tilfelle hos mennesker, der barndomsmangel, kompleks læringshistorie og/eller sosiokulturelle risikofaktorer også synes å være viktige. Musemodeller av depresjon bør derfor gjenkjennes som hva de er: en forenklet modell for en svært kompleks lidelse. Men hvis det utføres tilstrekkelig, og hvis flere avlesningsmetoder brukes, er CDM et passende verktøy i søket etter ny innsikt og mål i depresjonsforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av interne midler fra Universitetsklinikken Freiburg, Institutt for psykiatri og psykoterapi og Berta-Ottenstein-programmet for klinikerforskere (til SV). TS er finansiert av stipendene til Medical Research Foundation (FRM) (AJE201912009450) og University of Strasbourg Institute of Advance Studies (USIAS) (2020-035), samt Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Frankrike.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker, 2000 mL | Kimble Kimax | 14000-2000 | any vessel >2000ml and diameter of 24-26 cm possible |
| Digital Thermometer | Hanna Instruments | 846-4708 | any digital thermometer possible |
| Digitalwaage 200 g Dipse | DIPSE | tp200 | any digital scale possible |
| Lenovo ThinkCentre V50a-24IMB AiO 11FJ00DVGE - 60,5 cm | Lenovo | A 908278 | any standard Personalcomputer possible |
| Logitech PTZ Pro | Logitech | 1000005246 | any high resolution camera possible |
| Stopwatch ROTILABO | Carl Roth | L423.1 | any stopwatch possible |
| Timer ROTILABO | Carl Roth | A802.1 | any timer possible |
References
- James, S. L., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Aleman, A., Denys, D. Mental health: A road map for suicide research and prevention. Nature. 509 (7501), 421-423 (2014).
- Greenberg, P. E., Fournier, A. -A., Sisitsky, T., Pike, C. T., Kessler, R. C. The economic burden of adults with major depressive disorder in the United States (2005 and 2010). The Journal of Clinical Psychiatry. 76 (2), 155-162 (2015).
- Nestler, E. J., Hyman, S. E.
- Porsolt, R. D., Le Pichon, M., Jalfre, M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatments. Nature. 266 (5604), 730-732 (1977).
- Can, A., et al. The mouse forced swim test. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3638 (2012).
- Chatterjee, M., Jaiswal, M., Palit, G. Comparative evaluation of forced swim test and tail suspension test as models of negative symptom of schizophrenia in rodents. ISRN Psychiatry. 2012, 595141 (2012).
- Reardon, S. Depression researchers rethink popular mouse swim tests. Nature. 571 (7766), 456-457 (2019).
- Serchov, T., et al. Increased signaling via adenosine A1 receptors, sleep deprivation, imipramine, and ketamine inhibit depressive-like behavior via induction of Homer1a. Neuron. 87 (3), 549-562 (2015).
- Holz, A., et al. Enhanced mGlu5 signaling in excitatory neurons promotes rapid antidepressant effects via AMPA receptor activation. Neuron. 104 (2), 338-352 (2019).
- Sun, P., et al. Increase in cortical pyramidal cell excitability accompanies depression-like behavior in mice: A transcranial magnetic stimulation study. Journal of Neuroscience. 31 (45), 16464-16472 (2011).
- Hellwig, S., et al. Altered microglia morphology and higher resilience to stress-induced depression-like behavior in CX3CR1-deficient mice. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 126-137 (2016).
- Serchov, T., Heumann, R., van Calker, D., Biber, K. Signaling pathways regulating Homer1a expression: implications for antidepressant therapy. Biological Chemistry. 397 (3), 207-214 (2016).
- van Calker, D., Serchov, T., Normann, C., Biber, K. Recent insights into antidepressant therapy: Distinct pathways and potential common mechanisms in the treatment of depressive syndromes. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 88, 63-72 (2018).
- Serchov, T., et al. Enhanced adenosine A1 receptor and Homer1a expression in hippocampus modulates the resilience to stress-induced depression-like behavior. Neuropharmacology. 162, 107834 (2020).
- Quitkin, F. M., Rabkin, J. G., Ross, D., Stewart, J. W. Identification of true drug response to antidepressants. Use of pattern analysis. Archives of General Psychiatry. 41 (8), 782-786 (1984).
- Normann, C., et al. Antidepressants rescue stress-induced disruption of synaptic plasticity via serotonin transporter-independent inhibition of L-type calcium channels. Biological Psychiatry. 84 (1), 55-64 (2018).
- Zanos, P., et al. NMDAR inhibition-independent antidepressant actions of ketamine metabolites. Nature. 533 (7604), 481-486 (2016).
- Alboni, S., et al. Fluoxetine effects on molecular, cellular, and behavioral endophenotypes of depression are driven by the living environment. Molecular Psychiatry. 22 (4), 552-561 (2017).
- Niehusmann, P., et al. Coincidence detection and stress modulation of spike time-dependent long-term depression in the hippocampus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 30 (18), 6225-6235 (2010).
- Schreiber, S. S., Tocco, G., Shors, T. J., Thompson, R. F. Activation of immediate early genes after acute stress. Neuroreport. 2 (1), 17-20 (1991).
- National centre for the replacement refinement and reduction of animals in research. , Available from: https://www.nc3rs.org.uk (2021).
- Loss, C. M., et al. Influence of environmental enrichment vs. time-of-day on behavioral repertoire of male albino Swiss mice. Neurobiology of Learning and Memory. 125, 63-72 (2015).
- Walker, W. H., Walton, J. C., DeVries, A. C., Nelson, R. J. Circadian rhythm disruption and mental health. Translational Psychiatry. 10 (1), 1-13 (2020).
- Merrow, M., Spoelstra, K., Roenneberg, T. The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes. EMBO Reports. 6 (10), 930-935 (2005).
- Holderbach, R., Clark, K., Moreau, J. -L., Bischofberger, J., Normann, C. Enhanced long-term synaptic depression in an animal model of depression. Biological Psychiatry. 62 (1), 92-100 (2007).
- Nissen, C., et al. Learning as a model for neural plasticity in major depression. Biological Psychiatry. 68 (6), 544-552 (2010).
- Kuhn, M., et al. State-dependent partial occlusion of cortical LTP-like plasticity in major depression. Neuropsychopharmacology. 41 (6), 1521-1529 (2016).
- Schwabe, L. Stress and the engagement of multiple memory systems: integration of animal and human studies. Hippocampus. 23 (11), 1035-1043 (2013).
- Ballan, R., Gabay, Y. Does acute stress impact declarative and procedural learning. Frontiers in Psychology. 11, 342 (2020).
