Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Abstract

ABC taşıyıcılarının başarılı biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu büyük ölçüde heterolog ekspresyon sisteminin seçimine bağlıdır. Son yirmi yılda, birçok önemli mantar zarı proteinini incelemek için kullanılan bir maya zarı proteini ekspresyon platformu geliştirdik. Ekspresyon konağı Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ yedi büyük endojen ABC taşıyıcılarında silinir ve genomik PDR5 lokusunda tek kopya olarak bıçaklanmış heterolog membran protein genlerinin konsitütif aşırı ekspresyonunu sağlayan fonksiyon kazancı mutasyonu ile pdr1-3 transkripsiyon faktörünü içerir. Çok yönlü plazmid vektörlerin oluşturulması ve tek adımlı klonlama stratejilerinin optimizasyonu, heterolog ABC taşıyıcılarının hızlı ve doğru klonlanmasını, mutajenizini ve ekspresyonunu sağlar. Burada, yeni bir proteaz-bölünebilir mGFPHis çift etiketinin geliştirilmesini ve kullanımını anlatıyoruz (yani, monomerik maya geliştirilmiş yeşil floresan protein yEGFP3 altı-histidin benzeşim saflaştırma etiketine kaynaşmış) etiketin ilgi proteini ile olası müdahalesini önlemek ve O etiketinin nikel benzeşim reçinelerine bağlama verimliliğini artırmak için tasarlanmıştır. mGFPHis'in membran proteini ORF'ye (açık okuma çerçevesi) füzyonu, poliakrilamid jellerin incelenmesi ve mGFPHis etiketini koruyan bozulma ürünlerinin tespiti ile proteinin kolayca ölçülmesini sağlar. Bu özelliğin membran proteini çözünürlüğü için deterjan taramayı nasıl kolaylaştırdığını gösteriyoruz. S. cerevisiae ADΔΔ'de aşırı ifade edilen C-terminal etiketli Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1'in küçük ölçekli plazma membran preparatlarının verimli, hızlı ve güvenilir izolasyonu için bir protokol sunulmaktadır. Bu küçük ölçekli plazma membran izolasyon protokolü, tek bir iş günü içinde yüksek kaliteli plazma membranları üretir. Plazma membran preparatları Cdr1 ve Cdr1 mutant varyantlarının enzim aktivitelerini belirlemek için kullanılabilir.

Introduction

İntegral membran proteinlerinin doğal lipit ortamlarından çıkarılması, yapılarını ve işlevlerini önemli ölçüde etkileyebilir1,2,3,4. Biyolojik membranların karmaşık lipit bileşimi5, kritik öneme sahip protein-lipit etkileşimlerinin gerçekleşebilmesini sağlar6. Lipitler membran proteinlerinin yapısal bütünlüğünü korur, böylece membran bölmesi hedeflerinde(ler) 7,8'de doğru çalışmasını sağlar. Bu nedenle, membran proteini saflaştırmasında kritik bir ilk adım, proteinin yapısını ve/veya işlevini etkilemeden doğal ortamından çıkarılmasıdır.

Çoğu hidrofobik doğası ile ilgili olan membran proteinlerinin yapısını ve X-ışını kristalografisi veya kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) 9 , 10,11,12içingerekli miktarlarda düzgün katlanmış ve fonksiyonel membran proteinlerini ifade etmenin zorluklarının karakterizesinde birçok engel vardır. Üç tür membran protein ekspresyon sistemi vardır: homolog9, heterolog13,14,15ve in vitro ekspresyon sistemleri16,17. Birçok ifade sisteminin genellikle düşük ifade seviyeleri veya yasaklayıcı maliyetleri, membran proteinleri üretmek için tercih edilen seçenek olarak sadece birkaç ana bilgisayar bırakır. Bakteri konakçısı, Escherichia coli, S. cerevisiae ve Pichia pastoris mayalarıve Sf9 böcek hücreleri veya memeli hücre hatları18gibi daha yüksek ökaryotlar içerir. Tüm membran protein ekspresyon teknolojilerinin avantajları ve dezavantajları vardır; bununla birlikte, S. cerevisiae belki de membran protein üretimi için uygun en iyi çalışılan ökaryotik model organizmadır. Genetik mühendisliği, ilaç keşfi, sentetik biyoloji ve ökaryotik membran proteinlerinin ekspresyasyonu14 , 19,20,21'dekiuygulamalarla çok yönlüdür.

Bu çalışmada, büyük C. albicans multidrug efflux pompaCdr1'i aşırı ifade etmek ve incelemek için S. cerevisiae ADΔ14 ve ADΔΔ 22 tercih edilen konaklar ( Şekil1A)ile patentli bir S. cerevisiae membran protein ekspresyon teknolojisi21 kullanılmıştır. Her iki S. cerevisiae suşu da AD1-8utürevleridir -23, URA3 veya HIS1 genomik loci'deki istenmeyen entegrasyon yoluyla ortaya çıkan yanlış pozitif urasil veya histidin prototroph dönüştürücülerini ortadan kaldırmak için silinen ura3 (ADΔ) veya hem ura3 hem de onun1 (ADΔΔ) genlerine sahiptir. Şekil 1A'dabelirtilen 7 büyük multidrug efflux pompa23'ünsilinmesi, ADΔΔ'yi çoğu ksenobiyotiklere karşı mükemmel derecede hassas hale getirir. Fonksiyon kazancı mutant transkripsiyon faktörü Pdr1-3, Cdr1 (Şekil 1A'dakikırmızı sekizgenler) gibi heterolog membran proteinlerinin konsitülatif aşırı ekspresyonuna neden olur. heterolog-ORF içeren dönüşüm kasetinin (Şekil 1A) genomik PDR5 lokusunda (Şekil 1A'damavi dikdörtgen) iki homolog rekombinasyon olayı ile entegrasyonu. C-terminal mGFPHis etiketli proteinlerin uygun plazma membran lokalizasyonu konfokal mikroskopi (Şekil 1A) ile doğrulanabilir ve O etiketi etiketli proteinin nikel benzeşim saflaştırılması için kullanılabilir. Bazı mantar ABC taşıyıcılarının (örneğin, Candida krusei ABC1)pABC3 türevi plazmidlere klonlamaları, ancak hücre toksisitesi nedeniyle Escherichia coli'de yayılamadıkları için mümkün değildi. Bu,14,24 membran proteinlerinin N veya C-terminuslarında çeşitli benzeşim, epitop veya muhabir etiketleriyle etiketlenmiş tek adımlı klonlamanın doğrudan S. cerevisiae ADΔΔ'ye(Şekil 1C)geliştirilmesine neden oldu. S. cerevisiae Çeşitli CDR1 mutantlarını aşırı ifade eden ADΔΔ suşları, 25 bp(Şekil 1C)ile çakışan beş adede kadar ayrı PCR parçası kullanılarak da verimli bir şekilde oluşturulabilir. Bu protokolü kullanarak, birçok ilgi çekici ORF çok kısa bir süre içinde düşük maliyetle ve yüksek verimlilikle klonlanabilir, ifade edilebilir ve karakterize edilebilir. Dönüşüm verimliliği, her ek PCR parçasıyla yalnızca ~2 kat azaltır. 

İstenirse, ifade düzeyleri, genellikle yüksek, kesin ifade düzeylerinin% 0,1-% 50'si arasında herhangi bir yere kadar ifade düzeylerini tahmin edilebilir şekilde ayarlamak için astar tasarımı tarafından kolayca manipüle edilebilir25. Optimize edilmiş, çok fonksiyonlu, pABC314 türev klonlama vektörü, pABC3-XLmGFPHis26 (Şekil 1B) bir HRV-3C proteaz bölünme bölgesi (X; LEVLFQ| GP), sık kullanılan tütün etch virüsünden (TEV) daha iyi performans gösteren bir proteaz27. L beş amino asit (GSGGS) bağlayıcıdır, mGFP bir monomerik mutanttır (A206K)28,maya geliştirilmiş yeşil floresan protein varyantı yEGFP330'un29 versiyonudur ve His üç amino asit bağlayıcıdır (GGS) ve ardından altı-histidin (HHHHHH) nikel benzeşim proteini saflaştırma etiketidir.

Bu ifade teknolojisi ilaç keşfinde ve membran proteinlerinin incelenmesinde başarıyla kullanılmıştır. Mantar azol ilaç hedefi olan S. cerevisiae Erg1131için ilk yapı bu teknoloji kullanılarak çözüldü. Ayrıca C. albicans Cdr132 , 33,34'ün ayrıntılı karakterizasyonunu ve gelecekteki yüksek çözünürlüklü yapıları doğrulamak için sistein çapraz bağlama çalışmalarına uygun sistein eksikliği olan bir Cdr1 molekülü35'in oluşturulmasını sağladı. Büyük insan mantar patojenlerinden diğer birçok ABC taşıyıcısı (yani, C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei ve Fusarium solani tür kompleksi) de bu ifade platformu24, 36,37,38,39kullanılarak ayrıntılı olarak incelenmiştir. Bu, yeni floresan efflux pompa substratı Nil kırmızısı 40 ve spesifik 41 ve geniş spektrumlu 14 ,33,42 , 43 ,44 efflux pompa inhibitörlerini keşfetmek için yüksek verimli ekranlarda kullanılanefflux pompalarını aşırı ifade eden bir S. cerevisiae suşları panelinin üretilmesini sağlamıştır. Bu sistemin kullanımı ayrıca clorgyline'ın türünün ilk geniş spektrumlu mantar çokdrug efflux pompa inhibitörü42olarak keşfedilmesini sağladı.

Membran proteinlerinin tam çözünmesi ve endojen lipitlerden yoksun homojen bir membran protein-misel preparatının oluşturulması, yüksek deterjan konsantrasyonları gerektirir45. Ancak ne yazık ki, bu genellikle membran proteini 5 ,8,45,46'yıda devre dışı bırakmaktadır. Deterjan monomerlerinin özellikleri ve çözeltideki toplamaları, hidrofobik kuyruğun fiziksel özelliklerinden, alkil zincirinin uzunluğundan ve dallanmasından, aromatik bir çekirdeğin veya floroalkil yan zincirin varlığından veya polioksiyetil ünitelerin sayısından etkilenir. Bu nedenle deterjan taraması, membran proteini çözünmesi ve saflaştırılması için en uygun deterjanı belirlemek için önemli bir ilk adımdır.

C. albicans ciddi, hayatı tehdit eden invaziv enfeksiyonlara neden olabilen immün sistemi baskılanmış bireylerin önemli bir insan mantar patojenidir47ve azol antifungal ilaçlara dirençli hale gelebilir48,49. C. albicans multidrug direncinin ana mekanizmalarından biri Cdr150plazma membranında bulunan ABCG alt familyasının tip II ATP bağlayıcı kaseti (ABC) taşıyıcı51'dir. Tam boyutlu mantar ABCG taşıyıcıları (iki nükleotid bağlama etki alanı [NBD] ve iki transmembran etki alanından [TMD]) daha yaygın olarak pleiotropik ilaç direnci (PDR) taşıyıcıları olarak bilinir ve benzersiz ters etki alanı topolojisi [NBD-TMD]2ile karakterize edilir. PDR taşıyıcıları sadece52, 53ve mantar54 bitkilerinde bulunur. Önemlerine rağmen, PDR taşıyıcıları için hiçbir yapı yoktur, ancak insan yarı boyutlu ABCG taşıyıcıları için yapılar son zamanlarda cdr133için ilk belirsiz modelin oluşturulmasına yardımcı olan çözülmüştür. Bununla birlikte, son deneysel kanıtlarımız, bu modelin muhtemelen kusurlu olduğunu göstermektedir, çünkü mantar PDR taşıyıcıları karakteristik asimetrik NBD'lere sahiptir ve bu da muhtemelen benzersiz bir taşıma mekanizmasıyla sonuçlanır. Bu nedenle, Cdr1'in yüksek çözünürlüklü bir yapısı, hem efflux aracılı ilaç direncinin üstesinden gelmeye yardımcı olabilecek yeni efflux pompa inhibitörlerinin rasyonel tasarımı hem de bu önemli ABC taşıyıcı ailesinin etki mekanizması hakkında içgörüler sağlamak için gereklidir.

Bu çalışmanın amacı, Cdr1 için yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek amacıyla, genetiği değiştirilmiş S. cerevisiae ekspresyon konağında Cdr1'in ekspresyasyonu, çözünürlüğü ve saflaştırılması için güvenilir protokoller geliştirmekti. Bu sürecin bir parçası olarak, proteaz-bölünebilir mGFPHis çift etiket (Şekil 1B) etiketi Cdr1'in C-terminusundan ayıran 16 kalıntılı bir bağlayıcı ile tasarlanmıştır, bu da ekli 6x Benzeşim etiketinin nikel benzeşim reçinesine bağlanmasını iyileştirdi ve cdr1 ifade seviyelerinin canlı hücrelerde ve tüm saflaştırma işlemi sırasında izlenmesini sağladı. Cdr1'in biyokimyasal karakterizasyonu için kullanılabilecek, yaklaşık% 10 C. albicans Cdr1 (SDS-PAGE'den sonra Coomassie boyama ile tahmin edildiği gibi) içeren küçük ölçekli maya plazma membran protein preparatları için tekrarlanabilir bir protokol de geliştirilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Taze veya dondurulmuş dönüşüm stoklarının hazırlanması yetkin ADΔ ve ADΔΔ hücreleri

  1. 2x YPCD'nin 25 mL'sini aşılayın [yani, 2x YPD; %2 (w/v) maya özü, %2 (w/v) pepton, %4 (w/v) dekstroz), %0,079 CSM (tam takviye karışımı)] Tek maya kolonili35 ortam ve dakikada 200 devirde (rpm) sallanarak 30 °C'de 16 saat boyunca gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  2. 25 mL o/n kültürü ile 225 mL 2x YPCD ortamını aşıla ve hücre optik yoğunluğunu 600 nm'de (OD600)kontrol edin; OD600 genellikle ~0.5-1.0'dır.
    NOT: Bu aşamada, aşağıdaki dönüştürme denemesi için gereken tüm malzemelerin hazır olduğundan emin olun.
  3. Hücre yoğunluğu ~6-8'in OD 600'üne ulaşana kadar 200 rpm'de sallanarak30 °C'de kültürü daha fazla ~6-8 saat büyütün.
    NOT: Aksi belirtilmedikçe aşağıdaki adımlar oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir.
  4. Bu logaritmik faz hücrelerini 3 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
  5. Hücreleri yeniden biriktirin ve steril çift damıtılmış suyla iki kez yıkayın (ddH2O; yani 200 mL ve ardından 20 mL).
  6. Hücreleri 3 dakika boyunca 3.000 x g'da hasat edin.
  7. Yavaşça (yani, 30 dakika boyunca her dakika 30 eşit dondurulmuş yetkin hücre (FCC) çözeltisi ekleyin) hücre peletini FCC'nin X mL'sinde [%5 (w/v) gliserol, Buz üzerinde %10 (v/v) dimetil sülfit (DMSO)] (burada X = OD600; örneğin, OD600 = 6 resuspend 6 mL'de veya OD600 = 3 resuspend 3 mL'de yenidense).
    NOT: Doğru FCC bileşimi dönüşüm başarısı için kritik öneme sahiptir.
  8. Dönüştürmeden önce hücreleri 2 saat boyunca buzda tutun veya aliquotları gerekli olana kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: ADΔ ve ADΔΔ hücreleri donmaya karşı çok hassastır. Bu nedenle, hücreler yavaşça -80 °C'ye kadar soğutulmalıdır: 50-600 μL hücre aliquot içeren buz gibi mikrosantrifüj tüplerini plastik bir saklama kutusuna (RT) yerleştirin. Kutuyu daha büyük bir polistiren kabına (RT) yerleştirin ve kabı uygun bir polistiren kapakla kapatın. Ardından, kabı -80 ° C dondurucuya koyun.
    DİkKAT: Yavaş donma hücre sağkalım için kritik öneme sahiptir.

2. CaCDR1-XLmGFPHis ile ADΔ ve ADΔΔ'nin dönüşümü ve koloni PCR ve DNA dizilimi ile doğru dönüştürücülerin onaylanması

NOT: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis, Lamping ve ark., 201055'te ayrıntılı olarak açıklanan geleneksel klonlama stratejileri kullanılarak oluşturulmuştur ve Şekil 1B'degösterilmiştir. Vahşi tip C. albicans CDR1, plazmid pABC3-CaCDR1A-GFP14'ten PacI /NotI parçası olarak izole edildi ve pABC3-XLmGFPHis26'yaklonlandı.

  1. PCR, tüm CDR1 dönüşüm kasetini yüksek kaliteli bir DNA polimeraz ve astar çifti PDR5-pro/PDR5-ter35 ile 1-10 ng pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis kullanarak bir DNA şablonu olarak güçlendirir veya, alternatif olarak, 2 μg pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis'i 37 °C'de 10 U kısıtlama enzimi AscI ile tamamlamaya kadar sindirin(Şekil 1A,B).
    NOT: CDR1 dönüşüm kaseti (Şekil 1A) PDR5 promotörü - CaCDR1-mGFPHis - PGK1 sonlandırıcı - URA3 seçim işaretçisi - PDR5 aşağı akış bölgesini içerir.
  2. Agarose jel elektroforezi gerçekleştirin ve ~8 kb dönüştürme kasetini jel ayıklayın.
    NOT: ~8 kb CaCDR1 dönüşüm kasetinin jel saflaştırılması, genomik PDR5 lokusuna entegre edilen doğrusal dönüşüm kaseti yerine tüm plazmid olan yanlış dönüştürücülere yol açabilecek olası sindirilmemiş plazmid DNA'ları ortadan kaldırır.
  3. Kaynar su banyosunda 10 dakika boyunca gerekli miktarda somon sperm taşıyıcı DNA'sı (2 mg/mL; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.5) denature ve buzda tutun. Kapağın açılmasını önlemek için somon sperm DNA'sını kaynatmak için vidalı tüpler kullanın.
  4. 50 μL denatüre somon sperm DNA'sını dönüşüm kasetinin 14 μL'si (500-2.000 ng) ile karıştırın ve 64 μL DNA karışımını bir sonraki kullanıma kadar buzda tutun.
    NOT: Pozitif dönüşüm kontrolü olarak 10 ng E. coli-maya mekik plazmid (örneğin, pYES2) kullanın (Şekil 2B).
  5. Taze veya donmuş yetkin hücreleri 30 °C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca hızla yeniden depolayın ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde 50 μL aliquot'a bölün.
  6. Maksimum hızda (18.000 x g) bir mikrofugede 1 dakika santrifüjleme ile hücreleri hasat edin.
  7. Üstnatant çıkarın ve hücre peletINI RT'de tutun.
  8. Her dönüşüm için, %50 (w/v) polietilen glikol (PEG 3350) ve 36 μL 1 M lityum asetat (LiAc) 260 μL kombinasyonlarının (RT) 296 μL kombinasyonunu (RT) uygun 64 μL buz gibi DNA karışımları ile tekrar pipetleme ile karıştırın.
  9. Uygun karışımı hemen 50 μL yetkin hücre pelet aliquot ekleyin.
  10. Hücre peletini 360 μL PEG-LiAc-DNA karışımında yaklaşık 30 sn boyunca iyice girdaplayarak yeniden depolayın.
  11. Hücre karışımını 30 °C su banyosunda 1 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: ADΔ ve ADΔΔ hücreleri 30 °C'de 42 °C35'tendaha iyi dönüşür.
  12. Hücreleri 10 s için 18.000 x g'da hasat edin. Süpernatant atın ve hücre peletini 80 μL ddH2O'da yeniden atın.
  13. Hücreleri bir CSM-URA agarplakasına yayın 35 [yani, amino asit içermeyen% 0.67 (w/ v) maya azot tabanı, % 0.077 (w / v) CSM eksi urasil, % 2 (w / v) glikoz ve% 2 (w / v) agar]
  14. Urasil prototrop transformatörleri açıkça görünene kadar plakaları 30 °C'de 2-3 gün kuluçkaya yatırın.
    NOT: Doğrusal ~8 kb CaCDR1 dönüştürme kasetinin μg başına ~100 dönüştürücü ve μg pYES2 başına~4 x 10 4 dönüştürücü bekleyin.
  15. Beş bağımsız dönüştürücü seçin ve urasil prototroph transformantlarını dönüştürülmemiş konak hücre kalıntılarından ayırmak için bunları taze bir CSM-URA plakasına yayın.
  16. YPG-agar plakalarındaki dönüştürücüleri [%1 (w/v) maya özü, %2 (w/v) pepton, %2 (v/v) gliseol ve %2 (w/v) agar](Şekil 2D)üzerinde büyüterek olası minyon mutantları çıkarın.
    NOT: Minyon mutantlar kusurlu mitokondrilere sahiptir ve bu nedenle fermente edilemeyen karbon kaynaklarında büyüyemezler. S. cerevisiae56'daoldukça yaygındırlar. S. cerevisiae ADΔ ve ADΔΔ özellikle minyon fenotipi almaya eğilimlidir.
  17. Maya kolonisi PCR'yi gerçekleştirin ve~8kb CaCDR1 dönüşüm kasetinin tamamını, PCR ürünlerini saf olmayan DNA şablon kaynaklarından yükseltmek için optimize edilmiş belirli bir DNA polimerazıyla güçlendirerek genomik PDR5 lokusuna ( Şekil 1C) doğru bir şekilde entegre edilecek en az üç bağımsız dönüştürücünün onayını alın. Entegrasyon alanının hemen dışına bağlanan bir astar seti ve DNA şablonu olarak tek kolonilerden türetilen 1 μL hücre süspansiyonu (ddH2O'da) kullanın.
    NOT: Bu özel DNA polimeraz, bozulmamış maya hücrelerinden ~8 kb PCR parçalarını güvenilir bir şekilde yükseltir. Bununla birlikte, güvenilir amplifikasyon için 45 PCR döngüsü gereklidir ve maya hücreleri ddH2O'da OD600 1-10'da yeniden kullanılmalıdır.
  18. PCR reaksiyonunun 1 μL'lik bir kısmının DNA agarose jel elektroforez ile doğru ~8 kb PCR amplifikasyon ürününü onaylayın.
  19. Tedavi edilen DNA örneğinin uygun astarlara sahip bölümlerini kullanarak tüm ORF'yi sıralamadan önce, tek iplikli DNA eksonucleaz enzim karışımı ve üreticinin talimatlarını takip eden bir fosfataz ile PCR reaksiyonunun 10 μL'lik bir kısmından fazla amplifikasyon astarlarını çıkarın.

3. Küçük ölçekli maya plazma membran izolasyon protokolü

  1. Büyüyen maya hücreleri
    1. Kültür öncesi, 30 °C'de 10 mL YPD'de ~7-8 saat boyunca tek bir maya kolonisi ve 200 rpm'de sallanıyor.
    2. 10 mL ön kültür ile 40 mL YPD ortamını aşıla ve hücre yoğunluğu 1-3'ün OD 600'üne ulaşana kadar 200 rpm'de sallanarak hücreleri 30 °C o/n'de(~16 h) kuluçkaya yatırın.
  2. Maya hücrelerinin toplanması
    1. 40 OD ünitesini (ODU; örneğin, 1 = 1 ODU'nun600 OD'sinde 1 mL) logaritmik fazlı hücreleri 4.200 x g'da 4 °C'de 5 dakika hasat edin.
    2. Hücreleri buz gibi steril ddH 2 O(yani, 40mL ve ardından 1 mL ile iki kez yeniden depolayıp yıkayın; hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 4.200 x g'da santrifüjleme ile basamaklar arasında hasat edin).
    3. Peletin 1 mL buz gibi steril ddH2O'ya yeniden depolanın ve hücre süspansiyonu önceden soğutulmuş (buz üzerinde) 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    4. 4 °C'de 3 dakika boyunca 3.300 x g'da hücreler toplar.
    5. Üst sıraları aspire edin.
    6. Hücre peletini 0,5 mL homojenizasyon tamponunda [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, %20 (v/v) gliserol; pH 7,5] taze olarak 1 mM fenilingetilsülfonil florür (PMSF) ile desteklenmiş olarak yeniden kullanın.
      NOT: PMSF suya maruz kalınca hızlı bir şekilde devre dışı kaldığı için PMSF'yi her zaman taze ekleyin.
      DİkKAT: PMSF, dokular için son derece aşındırıcı ve yıkıcı olan serine proteaz inhibitörüdür. Geri dönüşü olmayan göz hasarına neden olabilir.
    7. Hücre süspansiyonu -80 °C'de saklayın veya hemen kullanın.
  3. Plazma zarlarının izolasyonu
    1. Donmuşsa, buzdaki hücreleri ~1 saat buzda çözün.
    2. Toplam 1 mL hacme ulaşmak için 0,5 mL hücre süspansiyonu için buz gibi 0,5 mm çapında silika boncuklar ekleyin.
    3. Buz üzerinde 3 dakikalık soğutma süreleri ile serpiştirilmiş 1 dakika boyunca maksimum sallama yoğunluğunda 6 vorteks döngüsü ile hücreleri kırın.
    4. Isıtılmış neşter bıçağı ile tüpün dibinde ince bir delik açın.
    5. Kırık hücre homojenazını, 10 s düşük hızlı (~200 rpm) dönüşlü başka bir buz gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne takılan tüpün dibinden toplayın.
      NOT: Bu, silika boncuklarının orijinal tüpte kalmasını sağlar.
    6. Hücre kalıntılarını, kırılmamış hücreleri ve çekirdekleri gidermek için hücre homojenliğini 4 °C'de 5 dakika boyunca 5.156 x g'da santrifüj edin.
    7. 450 μL'lik süpernatantı buz gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve taze PMSF (1 mM) ile desteklenmiş ek 1 mL buz gibi HB ekleyin.
      NOT: Bu seyreltme adımı, yüksek kaliteli plazma membran proteini geri kazanımı için kritik öneme sahiptir.
    8. Plazma membranlarını 4 °C'de 1 saat boyunca 17.968 x g'da hasat edin ve plazma membran peletini tekrar pipetleme ile 1 mM PMSF ile taze olarak desteklenmiş 100 μL HB'de yeniden kullanın. 100 μL HB'yi ve yukarı ve aşağı pipetleme serbest bırakmadan önce hücre peletini 100 μL pipet ucuyla karıştırarak uygun plazma membran homojenizasyonu için hücre peletini gevşetin.
    9. Plazma membran preparatının protein konsantrasyonunu, azaltıcı madde ve deterjan içeren tamponlarla uyumlu bir protein test kiti ile ölçün.
    10. Plazma zarlarını -80 °C'de saklayın veya hemen kullanım için buzda tutun.

4. Sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE)

  1. Poliakrilamid jelleri hazırlamak için cihazı monte edin.
  2. İki ayırma jeli (%7 poliakrilamid) için% 40 akrilamid / bis-akrilamid 2.1 mL karıştırın, 3 mL 4x ayırma tamponu (1,5 M Tris, %0,4 sodyum dodecyl sülfat [SDS] (w/v); pH 8,8) ve 6,9 mL ddH2O. Akrilamidin polimerizasyonunu başlatmak için 8 μL tetrametrinediamin (TEMED) ve 60 μL% 10 amonyum persülfat (APS) ekleyin.
    DİkKAT: Akrilamid/bis-akrilamid çok toksiktir. Cilt tahrişi, periferik nöropatiye neden olur ve kanserojendir. TEMED yutulursa veya solunursa zararlıdır. APS yutulduğunda zararlıdır. Ciddi göz ve cilt tahrişleri neden olur.
  3. Bu karışımın ~4-5 mL'lik kısmını, üstten ~2 cm'ye kadar monte edilmiş jel aparatına dökün.
  4. Düzlemci bir menisküs oluşturmak için üzerine %0,1 SDS~1-2 mL'yi dikkatlice katlayın.
  5. Poliakrilamidin RT'de ~60 dakikaya ayarlamasına izin verin.
  6. % 40 akrilamid / bis-akrilamid 0,5 mL karıştırarak iki jel için bir istifleme jeli karışımı hazırlayın, 1 mL 4x istifleme tamponu (0,5 M Tris, %0,4 SDS (w/v); pH 6,8) ve 6,9 mL ddH2O. Akrilamidin polimerizasyonunu başlatmak için 2 μL TEMED ve %10 APS'nin 30 μL'sini ekleyin.
  7. %0,1 SDS tabakasını polimerize ayırma jelinden çıkarın ve SDS izlerini gidermek için ddH2O ile durulayın.
  8. İstifleme jeli karışımını ayırma jelinin üzerine dökün.
  9. İstifleme jeline bir tarak yerleştirin ve tarağın etrafındaki hava kabarcıklarını çıkarın.
  10. istifleme jelinin RT'de ~60 dakika olarak ayarlenmesine izin verin.
  11. Tarağı çıkarın ve jel yuvalarını suyla durulayın. Jeli jel tankına koyun ve jel tankını 1x çalışan tamponla (24,8 mM Tris, 190 mM glisin, % 0,1 SDS) doldurun.
    NOT: RT'de depolanan 10x tampon stoğundan (248 mM Tris, 1,9 M glisin, ddH2O'da %1 SDS (w/v) 1x çalışan tampon hazırlayın.
  12. 5-10 μL plazma membran örneklerini karıştırın (örn. 10-20 μg protein) eşit hacimlerde 2x protein yükleme boyası [120 mM Tris-HCl (pH 6.8), % 20 gliserol, % 0.02 bromofenol mavisi, % 4 SDS, 200 mM dithiothreitol (DTT)] ve hemen çalışan tampona batırılmış bireysel jel yuvalarına yüklenir.
    DİkKAT: DTT yutulduğunda zararlıdır. Ciddi göz ve cilt tahrişleri neden olur.
    NOT: 10 mL'lik 2x protein yükleme boyası, aliquot stoku yapın ve -20 °C'de saklayın. Karışık numuneleri ısıtmayın, ancak GFP etiketinin denatüre olmaması ve jel içi floresan sinyallerinin algılanabilmesi için hemen tek tek jel yuvalarına yükleyin.
  13. Protein parçalarının boyut tahminini sağlamak için protein moleküler ağırlık işaretleyicilerini (10-245 kDa aralığı) ayrı bir yuvaya yükleyin.
  14. Mavi yükleme boyası jelin dibine ulaşana kadar 200 V'ta jel elektroforezi gerçekleştirin (genellikle 45-55 dk).
  15. Jel görüntüleme sistemi ile jel içi GFP-floresan için jeli inceleyin (ekscitasyon ve emisyon dalga boyları sırasıyla 475-485 nm ve 520 nm'dir).
  16. Jel içi floresan görüntülemeyi takiben, RT'de 15 dakika boyunca jelin ~10-20 mL Protein Jel Sabitleme Çözeltisi 'nde (%40 etanol, %10 asetik asit) nazik ajitasyonu ile proteinleri sabitleyesiniz.
  17. Jeli 10 mL ddH2O ile 10 dakika boyunca iki kez durulayın ve jeli RT'de ~1 saat boyunca hafif sallama ile 10 mL kolloidal Coomassie leke çözeltisine yerleştirerek protein bantlarını görselleştirin.
  18. Protein bantlarının daha iyi görselleştirilmesi için, jel görüntüleme sistemiyle görüntü kaydetmeden önce jeli ~20 mL'de bir veya iki kez ddH2O'da ~1 saat boyunca lekeden arındırın.

5. Cdr1 ATPase Faaliyetlerinin Belirlenmesi 57

  1. HB'de plazma membran örneklerini >2,2 mg/mL ila 1-2 mg/mL arasında seyreltin.
  2. ATPase test kokteylini dengeleyin (75 mM MES-Tris, 75 mM potasyum nitrat, 0.3 mM amonyum molibdat, 7.5 mM sodyum azit; pH 7.5) ve Mg-ATP (28.8 mM ATP disodiyum tuz, 28.8 mM MgCl2; pH 7.0) ila 30 °C 30 °C inkübatörde.
    DİkKAT: Sodyum azit oldukça toksiktir.
    NOT: Tüm tampon stoklarının ve şişelerinin fosfat içermemesini sağlayın; yani, züccaciyeyi% 1 (vol / vol) HCl ile yıkayın ve ddH2O ile birkaç kez durulayın. Ayrıca, camları yıkamak için kullanılan deterjanlarda yaygın olarak bulunan fosfat izlerini içeren diğer cam eşyalardan ayrı tutun.
  3. 96 kuyulu bir mikrotiter tabağın bireysel kuyularına Cdr1-ATPase inhibitörü (20 μM oligomicin) ile veya Cdr1-ATPase inhibitörü olmadan 90 μL test kokteyli ekleyin.
    NOT: Test üç taraflı olarak gerçekleştirilir.
  4. Mikrotiter plakanın uygun kuyularına izole plazma membranlarının (~5-10 μg protein) veya fosfat standartlarının (0-100 nmoles Pi) 5 μL'sini ekleyin.
    NOT: İki ayrı fosfat standardı kümesi için ilk ve son sütunları saklayın.
  5. Tek tek kuyulara çok kanallı pipetli 25 μL önceden ısıtılmış 28,8 mM Mg-ATP (6 mM son konsantrasyon) ekleyerek teste başlayın ve 30 dakika boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.
  6. 6 M sülfürik asitte 130 μL gelişim reaktifi (%1,6 sodyum L-askorbat, %1 SDS, %12 amonyum molibdat) ekleyerek reaksiyonu durdurun.
    DİkKAT: Konsantre sülfürik asit su ile şiddetli tepki verir. Aşındırıcıdır ve cilt ve akciğer hasarına neden olabilir.
  7. RT'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
  8. Mikrotiter plaka okuyucu ile 750 nm'deki mikrotiter plaka kuyularının emiciliğini okuyun.
    NOT: Mavi boya gelişimi için 10 dakikalık kuluçka süresine (yani azaltılmış fosfor-molibden kompleksi) bağlı kalmak, test doğruluğu için kritik öneme sahiptir, çünkü mavi boya gelişimi zamanla devam eder.
  9. Oligomisin yokluğunda toplam ATPase aktivitesinden oligomisin varlığında ATPase aktivitesini çıkararak Cdr1'e özgü ATPase aktivitesini (yani oligomisin duyarlı ATPase aktivitesini) elde edin.

6. Küçük ölçekli deterjan ekranı

  1. Cdr1-mGFPHis'i aşırı ifade eden hücrelerin plazma zarı preparatlarını (yani 2,5 mg plazma membran proteini) GTED-20 tamponu [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, %20 (w/v) gliserol; pH 7,5; test deterjanının 5 mgını içeren 1 mM PMSF] ile taze takviyeli, %1 (w/v) deterjanla desteklenen toplam 0,5 mL hacme ulaşmak için.
  2. Karışımı 4-8 °C'de bir döndürme cihazıyla 2 saat döndürün.
  3. Karışımı 1 saat boyunca 4 °C'de 141.000 x g'da santrifüjleyin.
  4. Çözünür malzeme içeren süpernatantı taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Çözünmeyen pelet fraksiyonu için %2 (w/v) SDS ile desteklenmiş 0,5 mL GTED-20 tampon ekleyin ve tüm deterjan çözünmeyen membran proteinini çıkarmak için sallanan bir inkübatörde 30 °C o/n'de kuluçkaya yatırın.
  6. SDS-PAGE ile süpernatant ve çözünülmüş pelet fraksiyonlarını analiz edin ve karşılaştırın.
  7. Coomassie boyamadan önce jel içi GFP floresan için GFP etiketli proteinler içeren fotoğraf jelleri ve görüntüleme sistemi ile ekspresyon seviyelerini ölçün.
  8. Uygun deterjanları tanımlamak için floresan boyutu dışlama kromatografisi (FSEC)58 gibi aşağı akış uygulamaları için çözünür membran protein fraksiyonunu kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

pYES2(Şekil 2B)ile S. cerevisiae ADΔΔ'nin (~4 x10 4 transformant/μg) yüksek dönüşüm sıklığı elde edildi. Beklendiği gibi, DNA (yani, yalnızca ddH2O) kontrolü dönüştürücü vermedi ve doğrusal CDR1-mGFPHis dönüşüm kasetinin 1 μg'si (Şekil 1A) optimize edilmiş ADΔΔ dönüşüm protokolü ile ~50 dönüştürücü (Şekil 2C) verdi. CDR1-mGFPHis dönüştürücüleri, kusurlu mitokondri ile olası minyon mutantları ortadan kaldırmak için fermente edilemeyen bir karbon kaynağı üzerinde büyüme yetenekleri için de test edildi. Üç (sarı daireler; Şekil 2D) test edilen 25 urasil-prototrop transformant ypg agar plakalarında büyüyemedi ve daha fazla araştırmadan atıldı. Yeni oluşturulan ADΔΔ-CDR1-mGFPHis suşu tarafından ifade edilen Cdr1-mGFPHis plazma zarında düzgün bir şekilde lokalize edilir (Şekil 1A) ve Cdr1'in yapısal ve fonksiyonel karakterizasyonu için yeterli seviyelerde ifade edilir (Şekil 3). Optimize edilmiş çift etiketin tasarımı (Şekil 1B) ayrıca aşağı akış uygulamalarında etiketten olası paraziti önlemek için Cdr1-mGFPHis'in Nikel benzeşimli saflaştırılmasından sonra mGFPHis çift etiketinin kaldırılmasını sağlar. Bununla birlikte, ilk sonuçlar, Cdr1 ile HRV-3C proteaz dekolte bölgesi arasındaki 3 amino asit bağlayıcının daha hızlı, daha etkili, bölünme elde etmek için uzatılması gerekebileceğini göstermiştir. Benzer gözlemler son zamanlarda N-terminal etiketli nükleozid taşıyıcı Escherichia coli NupC için rapor edildi, hangi 59 Nikel-benzeşim reçine bağlı deterjan (DDM) çözünür NupC verimli bölünme için başlangıçta tasarlanmış 3 amino asit bağlayıcı yerinebir 15gerektiren . HRV-3C bölünme bölgesinin 5 amino asit bağlayıcı C terminali, daha önce C. utilis ABC taşıyıcı Cdr139için gözlemlediğimiz ekli ilgi proteini ile mGFPHis çift etiketinin sterik parazitini önler. yEGFP3-A206K mutasyonu, yüksek protein konsantrasyonlarında yapay GFP-dimerizasyonunu önlemek için oluşturulmuştur28ve mGFP ile Nikel benzeşimi etiketi arasındaki ek 3 amino asit bağlayıcı, etiketli proteinin nikel benzeşim reçinesine (veri gösterilmez) bağlanma verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için O etiketinin uygun yüzeye maruz kalmasını sağlar.

Figure 1
Şekil 1: Mantar plazma membran taşıyıcılarının verimli klonlama ve ekspresyöneti için maya zarı protein ifade platformu. (A) PDR5 promotörü (mavi), XLmGFPHis (yeşil), PGK1 sonlandırıcı (turuncu), URA3 seçim işaretçisi (açık mavi) ve PDR5 aşağı akış bölgesinin (mavi) bir parçası ile etiketlenmiş CDR1 (kırmızı) C-terminalini içeren bir dönüşüm kaseti, S ifade ana bilgisayarını dönüştürmek için kullanılır.cer genomik PDR5 lokusunda entegrasyonla ADΔΔΔ'yi tahliye edin. Fonksiyon kazanımı mutant transkripsiyon faktörü Pdr1-3, plazma zarında Cdr1'in (kırmızı sekizgenler) konsitutive aşırı ifadeye neden olur (altındaki konfokal mikroskopi görüntüsüne bakın). (B) Plasmid pABC3-XLmGFPHis, geleneksel bir klonlama stratejisinde veya bir dönüşüm kaseti oluşturmak için PCR şablonu olarak kullanılabilir. plazmid pABC3-XLmGFPHis'in pABC3-GFP14 üzerindeki iyileştirmeleri plazmid haritasının altında listelenmiştir. (C) ADΔΔ'nin genomik PDR5 lokusundaki dönüşüm kasetini entegre etmek için alternatif daha verimli bir tek adımlı klonlama stratejisi. Bir ORF (kırmızı), sol kolla örtükler oluşturan astarlar (oklar) kullanılarak PCR yükseltilebilir (mavi; PDR5 promotörü) ve sağ kol (yeşil; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 aşağı akış) parçaları. Mutasyonlar (siyah çizgiler) gerekirse astar tasarımı ile ORF'ye sokulabilir. PDR5 lokusta doğru entegrasyonu yönlendiren homolog rekombinasyon olayları, çapraz kesik çizgilerle gösterilir. (D) Mantar çokdrug efflux pompalarının fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılabilecek tüm hücre tahlilleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: CDR1ile ADΔΔ'nin dönüşümü -mGFPHis dönüşüm kaseti ve minyon ADΔΔ-CDR1-mGFPHis dönüştürücülerinin ortadan kaldırılması. Urasil prototrofik transformatörler, dönüştürülmüş ADΔΔ hücrelerini 3 gün boyunca 30 °C'de CSM-URA plakalarında inkübe ederek seçildi. (A) Negatif kontrol (DNA yok). (B) Pozitif kontrol (10 ng pYES2). (C) CDR1-mGFPHis transformantları (1 μg DNA). (D) ADΔΔ-CDR1-mGFPHis dönüştürücülerinin YPG agar plakalarında minyon fenotip için test edildi. Kusurlu mitokondriler nedeniyle YPG agar plakalarında yetişemeyen minyon transformantlar sarı ile çevrelenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

GFP floresan, Cdr1-mGFPHis miktarı (adım 3.3.9) ve jel floresan sinyalleri arasında doğrusal bir ilişki olduğu için Cdr1 ekspresyon seviyeleri için güvenilir bir ölçüdür (Şekil 3A). Bu projede, plazma membran proteinlerinin biyokimyasal karakterizasyonu için yüksek kaliteli küçük ölçekli plazma membran preparatlarının hızlı üretimi için tekrarlanabilir optimize edilmiş bir iş akışı geliştirilmiştir. En yüksek Cdr1 ATPase aktivitesini (φ 400 nmol/dk/mg) gösteren yaklaşık 0,5 mg plazma membran proteini(Şekil 3C; sol grafik) üretmek mümkündü; Şekil 3C; sağ grafik) logaritmik fazın 40 ODU'sını(1-3'ün 600nm OD'si) kırdığında (0,5 mL HB'de yeniden depolanmış) aynı hacimde (yani, 0,5 mL) silika boncukları ve maksimum sallama yoğunluğunda 1 dakika boyunca 6 vorteks döngüsü ve ardından buz üzerinde 3 dakikalık soğutma süreleri. Kırılma döngülerinin sayısında daha fazla artış (adım 3.3.3) izole plazma membran preparatının kalitesini düşürdü (Cdr1 ATPase aktivitesi 170 nmol / dk / mg'dan ~ 60 nmol / dk / mg'a düştü; veriler gösterilmedi). Plazma membran örneklerinin SDS-PAGE protein desenlerinde daha yüksek sayıda kırılma döngüsü ile kırılan hücrelerde sadece küçük farklılıklar olsa da (veriler gösterilmemiştir), 10 veya daha fazla kırılma döngüsünden sonra neredeyse 3 kat azaltılmış Cdr1 ATPase aktivitelerinin aşağıdakilerden biri tarafından neden olması muhtemeldir: i) Cdr1'in yüksek sıcaklığa maruz kalması nedeniyle kısmi denatürasyonu; ii) fosforilasyon veya defosforilasyon gibi çeviri sonrası değişiklikler; veya iii) izole plazma membran veziklinlerinin diğer organellerin membran fraksiyonları ile çapraz kontaminasyonunu arttırmıştır. 0,5 mL HB'de 40 ODU hücre kırılması en yüksek plazma zarı kalitesini (yani, 10 μg plazma membran proteini başına en fazla Cdr1; Şekil 3B) en yüksek Cdr1 ATPase aktivitesi ile (Şekil 3C; sağ grafik). Daha yüksek (> 40 ODU/0,5 mL HB) veya daha düşük (20 ODU/0,5 mL HB) hücre yoğunlukları izole plazma zarlarının ATPaz aktivitesini azalttı (Şekil 3C; sağ grafik), ancak verimleri artan hücre yoğunluklarıyla orantılı olarak arttı(Şekil 3C; sol grafik). Böylece 40 ODU/0,5 mL HB, en yüksek kalitede plazma zarlarının izolasyonu için optimum hücre yoğunluğu oldu. Bu nedenle, plazma membran preparatlarının küçük ölçekli izolasyonu için optimize edilmiş protokolün kullanılması, 2-3 kat daha yüksek Cdr1 spesifik ATPase aktivitelerine (~300 nmol / dk / mg; Şekil 3C; sağ grafik) başlangıçta elde edilen Cdr1 spesifik ATPase etkinlikleri ile karşılaştırıldığında (~100 nmol/dk/mg; veri gösterilmez). Bu ATPase faaliyetleri ayrıca daha önce bildirilen cdr1 ATPase faaliyetlerinden (100-200 nmol/dk/mg) daha emek yoğun ve zaman alıcı büyük ölçekli plazma membran hazırlama protokolü14 , 41,60 ile eldeedilenden önemli ölçüde dahayüksekti.

Membran proteinlerini biyolojik zarlardan çıkarmak için en yaygın yöntem deterjanla çözünür hale getirmektir. Bununla birlikte, zorluk, protein stabilitesi ve / veya katlama özellikleri üzerinde en az zararlı etkiye sahip uygun bir deterjan bulmaktır. Proteinin mGFPHis ile etiketlenerek protein ekstraksiyonu için en iyi deterjanların seçilmesi taramayı kolaylaştırır. Toplamda, 31 deterjan, Listelenen Malzemeler Tablosundaçeşitli özelliklere sahip S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis hücrelerinin ham plazma membranlarından Cdr1'i yatıştırma yetenekleri test edildi. 16 test deterjanı (A-Q) temsili bir setinin sonuçları Şekil 3D'de gösterilmiştir. T, P ve S şeritleri, deterjan çözünürlüğü (adım 6.2) ve deterjan çözünmeyen peletten (P; 0,5 mL GTED-20, %2 SDS; adım 6,5) ve deterjan çözünür süpernatant (S; adım 6,4) fraksiyonlarında çözünür hale getirilir, 141,000 x g'daultra merkezirifugation ile ayrıldıktan sonra kesirler. İstenen deterjan, yapısını ve/veya işlevini değiştirmeden mümkün olduğunca çok Cdr1-mGFPHis'i çözünmelidir. Ham plazma membran proteinleri (5 mg/mL) %1 (w/v) deterjan (T) ile 2 saat boyunca çözünür hale getirilmiş ve çözünür (S) ve çözünmeyen (P) fraksiyonları SDS-PAGE (Şekil 3D)ve daha sonra floresan algılama boyut-dışlama kromatografisi (FSEC)58 (Şekil 4)ile analiz edilmiştir. Cdr1'in verimli bir şekilde çözünmesi için minimum deterjanın 2:1 (w/w) protein oranına kadar gerekli olduğunu belirledik. Aslında, Cdr1-mGFPHis'in çözünmesi için gereken optimum deterjan (DDM) konsantrasyonunu belirlemek için, deterjanın kritik misel konsantrasyonu (x CMC) ve deterjan/membran protein oranı (w/w) araştırılmıştır. DDM'nin 10x veya 80x CMC sabit konsantrasyonları kullanılırken Cdr1-mGFPHis'in çözünme verimliliklerinde büyük farklılıklar gözlendi. Çözünürleştirme verimlilikleri, çeşitli çözünürlükasyon deneylerinde kullanılan ham plazma membranlarının miktarlarına bağlı olarak% 40 ila% 80 veya% 60 ila% 90 arasında değişmektedir. Bununla birlikte, deterjanın ≥2 (w/w) protein oranlarına seçilmesi, kullanılan plazma membran proteini miktarı ne olursa olsun, Cdr1-mGFPHis'in% > 85'inin çözünmesiyle tekrarlanabilir derecede iyi sonuçlar verdi. Bu nedenle, Cdr1-mGFPHis gibi membran proteinlerinin çözünmesi için sadece% 1 veya% 2 (w / v) deterjan seçmenin daha yaygın yaklaşımını kullanıyorsanız, deterjanı protein oranına 2(w/w) üzerinde tutmak önemlidir [yani% 1 (yani 10 mg/mL) deterjan kullanırken plazma membran protein konsantrasyonunu 5 mg/mL'nin altında tutun].

Figure 3
Şekil 3: Cdr1-mGFPHis ekspresyon seviyelerinin nicelleştirilmesi, Cdr1-mGFPHis için küçük ölçekli plazma membran izolasyon protokolünün ve deterjan ekranının optimizasyonu. (A) Cdr1-mGFPHis'in jel floresan ile nicelemesi; Coomassie lekeli ve jel floresan SDS-PAGE görüntüleri aynı 0.7% poliakrilamid jel solda gösterilir. 1 ile 6 arası şeritler 0,75, 1,5, 3, 6, 12 ve 24 μg ADΔΔ-CDR1-mGFPHis plazma membran proteini ile yüklendi. Cdr1-mGFPHis kırmızı bir okla gösterilir. M = Precision Artı Protein İşaretleyici. mGFP floresan yoğunlukları (sağda gösterilmiştir) test edilen tüm konsantrasyon aralığında doğrusaldı ve minimum arka plan floresan vardı. (B) Kırılmadaki hücre yoğunluğunun izole plazma zarlarının kalitesine etkisi. Coomassie lekeli poliakrilamid jel (%7) plazma membran protein örnekleri (10 μg) ve aynı jel cdr1-mGFPHis yeşil floresan sinyalleri Coomassie boyamadan önce. M = Precision Artı Protein İşaretleyici. Şerit 1, 3, 5 ve 7 ADΔΔ'nin plazma membran proteinleridir ve 2, 4, 6 ve 8 şeritleri sırasıyla 20, 40, 60 ve 80 ODU hücrelerinden izole edilen ADΔΔ-CDR1-mGFPHis'in plazma membran proteinleridir. Cdr1-mGFPHis kırmızı bir okla gösterilir. Yeşil floresan sinyallerin göreli yüzdeleri altında listelenir. (C) Kırılmadaki hücre yoğunluğunun izole plazma zarlarının verimine ve Cdr1-mGFPHis'in ATPase aktivitesi üzerine etkisi. Solda, hücre yoğunluğunun (ODU/0,5 mL HB) ADΔΔ ve ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1) hücrelerinden izole edilen plazma membran proteini miktarı üzerindeki etkisi. Sağda, hücre yoğunluğunun ADΔΔ-CDR1-mGFPHis hücrelerinden izole edilen plazma zarlarının Cdr1 ATPase aktivitesi üzerindeki etkisi. (D) Solubilizasyon karışımının 10 μL aliquots örnek SDS-PAGE (T; 0.5 mL), çözünürleştirme sonrası pelet (P; 0,5 mL) ve aynı jelin (altta) Coomassie lekelenmesinden önce ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (üstte) ve Cdr1-mGFPHis'in jel floresanının çözünmüş (süpernatant) fraksiyonları (S; 0,5 mL) deterjan çözünür ham plazma membran proteinleri. M = geniş MW önceden lekeli protein merdiveni (245, 180, 135, 100, 75, 63 ve 48 kDa bantları; 180 kDa ve 75 kDa bantları sırasıyla kırmızı ve yeşil oklarla gösterilir). A'dan L'ye ve N'den Q'ya kadar olan şeritler T, S, DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega için P fraksiyonları (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-choline-13 (P) ve SDS (Q). Kısaltmalar Malzeme Tablosundatanımlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Deterjan tarama sonuçlarına dayanarak (Şekil 3D), DDM (B ve C) ve Fos-kolin-13 (P), Cdr1-mGFPHis'in çözünmesi için en iyi deterjanlar olarak görünmüş. Bununla birlikte, Fos-kolin-13 kullanımı Cdr1-mGFPHis'in kısmi proteolizine neden olduğu görünmektedir (Şekil 3D'deP). LMNG (E), PCC-α-M (gösterilmez) ve muhtemelen DM (A) bir sonraki en iyi deterjanlardı. Deterjan ekranı ayrıca çözünmeyen pelet fraksiyonlarında proteinin önemli miktarda bulunduğundan, OGNG (F) ve OG (G), CHAPS (L), NM (N) ve Anzergents (gösterilmeyen) glukozin cdr1-mGFPHis'in çözünmesi için kötü seçimler olduğunu göstermiştir. SDS denatures Cdr1-XLmGFPHis, bu yüzden Q şeritlerinde yeşil floresan sinyalleri görünmüyor (Şekil 3D).

Bir deterjanın düzgün katlanmış yerli Cdr1-mGFPHis parçacıklarının çözünmesi için uygunluğu, deterjan çözünmüş plazma membran proteininin (adım 6.4 supernatant) FSEC tarafından da değerlendirildi. %1 deterjanla çözünen ADΔΔ-CDR1-mGFPHis'ten (2 mg/mL) 100 μL ham plazma membran proteini için elde edilen kromatogram örnekleri Şekil 4'tegösterilmiştir. 9 mL elüsyon hacmindeki zirve çoğunlukla boşluk hacminde geçen toplu Cdr1-mGFPHis'i temsil ederken, düzgün bir şekilde çözünmüş ve doğru katlanmış Cdr1-mGFPHis parçacıkları Gauss şeklindeki tepe ile 15,5 mL'lik elüasyon hacminde temsil edilir. 12 ila 14 mL arasındaki geniş omuz muhtemelen daha az iyi tanımlanmış Cdr1-mGFPHis misel parçacıkları içerir ve/ veya kısmi yanlış katlanma veya protein agregalarını gösterir. Maltosides ve LMNG çıkarılan proteinlerin kromatogramları, Cdr1-mGFPHis'in çoğunun 15,5 mL'de güzel şekilli bir Gauss zirvesi olarak, küçük bir omuzla 14 mL'de biraz daha erken eluting olduğunu gösterdi (Şekil 4A). Bu örneklerde boşluk hacminde cdr1-mGFPHis yoktu. Boş örnek, mGFP sinyali veren tampon artı DDM kontrolüdür. Şekil 4B'deki kromatogramlar, deterjanın çözünmüş Cdr1-mGFPHis parçacıklarının kalitesi için şeker kafa grubu tipinin önemini vurgulamaktadır. Deterjan içeren glikoz (OG, NG, OGNG), deterjan içeren sakkarozdan (DDS) daha kötü performans gösterdi ve bu da deterjan içeren maltozdan (NM, DMNG, DDM) daha kötü performans gösterdi. Cdr1-mGFPHis, Şekil 3D'degözlenen OGNG (F) ve OG (G) için pelet fraksiyonlarında Cdr1-mGFPHis çökeltisinin büyük bir oranından beklenen, agrega (OG) veya geniş bir agrega tepe (NG, OGNG) olarak elde edilen deterjan içeren glikoz içeren glikoz ile çözünür. DMNG kromatogramı olmasına rağmen (yeşil; Şekil 4B) niteliksel olarak DDM kromatograma (mavi; Şekil 4B), DDM için daha yüksek tepeler, DMNG çözünmüş Cdr1-mGFPHis'in büyük bir kısmının aslında denatüre olabileceğini gösterir. Şekil 4C, zwitterionic Fos-cholines için FSEC kromatogramlarını gösterir (Fos-kolin-8, Fos-choline-10, Fos-choline-13) ve iki iyonik olmayan deterjan (digitonin, Triton-X100) ve Şekil 4D, fos-kolin-8, -10 ve -13 ve DDM için kromatogramın kalitesi üzerinde iki kat daha fazla (200 μL) deterjan çözünürlüğü yüklemenin nasıl gözle görülür bir etkisi olmadığını göstermektedir. Sadece digitonin (turuncu; Şekil 4C) DDM'ye benzer bir kromatogram verdi (mavi; Şekil 4C) Fos-choline-13 simetrik keskin şekilli bir tepe vermesine rağmen, yine DDM'den (15,5 mL) önemli ölçüde daha düşük bir elüsyon hacmi (14 mL) ile eluted. Genel olarak, 12 veya 13 karbon kalıntısı daha uzun alifatik yan zincirlere sahip deterjanlar tarafından daha iyi çözünme eğilimi vardı; Örneğin, DDM > DM > NM (12, 10 veya 9 karbon), Fos-kolin-13 > 10 > 8 (13, 10 veya 8 karbon) ve LMNG > DMNG > OGNG (12, 10 veya 8 karbon). Bu nedenle, 12 karbondan daha az hidrofobik kuyruklu deterjanlar, Cdr1-mGFPHis'in çözünmesi için 12 veya 13 karbonluk daha uzun hidrofobik kuyruklara sahip deterjanlara göre çok daha az uygun deterjanlardı, ve iyonik olmayan deterjanlar (DDM, LMNG) genellikle Cdr1-mGFPHis'in çözünürlüğü için zwitteriyonik deterjanlardan daha uygun görünüyordu (Şekil 3D, Şekil 4).

Figure 4
Şekil 4: Cdr1-mGFPhis için deterjan taraması FSEC kullanılarak çözünür. 100 μL çözünmüş ADΔΔ-CDR1-mGFPHis ham plazma membranının (2 mg/mL) kromatogramları, deterjanların % 1'i belirtilmiş ve Superose 6-artmış 10/300 GL boyutu dışlama sütunu kullanılarak ayrılmıştır. Kromatogramlar, toplanan elüsyon tamponunun bir sütun hacminin (CV; 25 mL) göreli mGFP floresan birimlerini (FU) gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Membran proteinlerinin yapısal analizindeki son ilerlemeye rağmen, Cdr1 veya başka bir PDR taşıyıcısı için 3D yapı mevcut değildir. Bu nedenle, Cdr1 yapısı ve biyokimyasal özellikleri hakkında bilgi edinmek önemlidir, çünkü bu sadece efflux aracılı ilaç direncinin üstesinden gelmek için yeni ilaçların rasyonel tasarımı hakkında değil, aynı zamanda ABC proteinlerinin önemli bir alt familyasının işlev mekanizmasına da içgörü sağlayacaktır.

Membran proteinlerinin yapısal karakterizasyonu için temel gereksinimlerden biri, X-ışını kristalografisi veya kriyo-EM için gerekli miktarlarda doğru katlanmış ve bozulmamış membran proteininin ifade edilmesidir. Bir ifade sistemi seçerken önemli kriterler kullanım kolaylığı, büyüme oranları ve maliyetleri ve ayrıca bir proteinin işlevi ve/veya stabilitesi için kritik olabilecek çeviri sonrası değişikliklerle proteinleri ifade edebilmeyeteneğidir 61,62.

Son yirmi yılda bir S. cerevisiae membran protein ekspresyon teknolojisi60, çeşitli benzeşimli N veya C-terminuslarında etiketlenmiş24 ilgi çekici membran proteinlerinin tek adımlı klonlanması için14 optimize edilmiştir, epitope veya muhabir etiketleri ve istenirse, ifade düzeyleri tahmin edilebilir şekilde maksimum ifade düzeyi25'in%50 ila% 0.1'i arasında herhangi bir yere bastırılır. Bu çok yönlü plazma membran protein ifade platformu, araştırmacıların mantar efflux pompalarını çok ayrıntılı olarak karakterize etmesini sağlar. Pompa fonksiyonunun tüm hücre tahlillerinin geliştirilmesi ve optimizasyonu, substrat özgüllüğünün24'ün başarılı bir şekilde karakterize edilmesine ve bir dizi büyük mantar çokdrug efflux pompasının inhibitör hassasiyetine olanak sağladı ve yeni 42 , 43,44 'ü tanımlamak veya mevcut14,33,36,geniş spektrumlu efflux pompa inhibitörlerini doğrulamak veya geliştirmek için yüksek verimli ilaç ekranlarında kullanıldılar. Cdr141'eözgü yeni efflux pompa inhibitörleri.

Mevcut ifade platformu, Basidomycota(C. neoformans Mdr1), P gibi14 filamentli mantar da dahil olmak üzere bir dizi mantardan mantar ABC taşıyıcılarını ifade etmek için başarıyla kullanılmıştır. marneffei (Abc1)37 ve birçok Saccharomycotina türü (örneğin, S. cerevisiae Pdr5, C. glabrata Cdr1 ve Cdr2, C. utilis Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 ve Abc12 ve C. albicans Cdr1 ve Cdr2), 14,24,32,36,39,60,63 düzgün katlanmış insan ABC taşıyıcıları yüksek düzeyde ifade daha az başarı olmuştur64. İlk sonuçlar, bunun, bu ışınlayıcıların mayada uygun ifade ve işlev için ihtiyaç duyarları olan spesifik lipit ortamından kaynaklandığını göstermektedir. Endikasyonlar, bunun bitki ABC taşıyıcıları için de geçerli olabileceğidir, ancak bu henüz deneysel olarak doğrulanmadı.

Optimize edilmiş küçük ölçekli plazma membran izolasyon protokolü ile elde edilen önemli ölçüde daha yüksek Cdr1 ATPase spesifik faaliyetlerinin (yani daha az kirletici membranlı preparatların) başlıca nedenleri iki kattır: i) daha büyük ölçekli plazma membran preparatları için boncuk çırpıcı kullanmaya kıyasla hücrelerin daha nazik manuel kırılması; ve ii) mitokondriyal enzimlerin glikoz baskısı nedeniyle olası mitokondriyal kontaminasyonu azaltan orta kütük aşamasında hücrelerin toplanması. Altı kırılma döngüsünün her biri arasındaki 3 dakikalık soğutma süreleri, plazma membranlarının kalitesi üzerinde gözle görülür bir etki olmadan uzatılabilir. Bununla birlikte, izole plazma membranlarının Cdr1 ATPase aktiviteleri her ek donma-çözülme döngüsünde ~ % 10 oranında azaldığından, tekrar dondurma-çözme döngüleri önlenecektir. Bu nedenle, çoklu donma-çözülme döngüsü ihtiyacını azaltmak için plazma membran örneklerinin daha küçük aliquotlara bölünmesi önerilir. mGFPHis çift etiket, saflaştırma verimini artırır ve verimli tek adımlı deterjan taraması sağlar. Bu yapı kullanılarak, doğru lokalizasyon, uygun katlama / kaçakçılık ve termostizability kolayca tespit edilebilir; ve çift etiket, gerekirse, ticari olarak mevcut bir proteaz ile bölünme ile çıkarılabilir, ancak etiketin verimli bir şekilde çıkarılması için ilgi proteini ile etiket arasındaki 3 amino asit bağlayıcının genişletilmesi gerekebilir.

Bu protokollerdeki çeşitli özelliklerin kombinasyonu, yani, 8 kb dönüştürme kasetinin koloni PCR amplifikasyonu için özel olarak tasarlanmış bir DNA polimerazının kullanılması; optimize edilmiş yüksek verimli maya dönüşüm yöntemi; dondurulmuş yetkin maya stokları oluşturma yeteneği; ve optimize edilmiş küçük ölçekli plazma membran hazırlama protokolü, mantar ABC efflux pompalarının yüksek verimli klonlanması, ifadesi ve karakterizasyonu için uygun optimize edilmiş bir membran protein ekspresyon platformunun oluşturulmasını göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, Yeni Zelanda Marsden Fonu'ndan (Grant UOO1305) ve Chulalongkorn Üniversitesi, Bangkok, Tayland Tıp Fakültesi'nden (M. Niimi) bir blok hibeyi minnetle kabul ediyorlar. Otago Üniversitesi'ne G. Madani'ye doktora bursu sağladığı için teşekkür etmek istiyorlar. Yazarlar ayrıca Profesör Stefan Raunser ve meslektaşları Dr. Amir Apelbaum ve Dr. Deivanayagabarathy Vinayagam'a, G. Madani'nin Max Planck Moleküler Fizyoloji Enstitüsü'nde (MPIMP), Dortmund, Almanya'da 6 aylık ziyaretinde destekleri ve gözetimleri için şükranlarını sunmak istiyor. Yazarlar ayrıca Alman Akademik Değişim Servisi'ne (DAAD) G. Madani'ye MPIMP'yi ziyaret etmesi için bir araştırma hibesi (57381332) sağladığı için teşekkür ediyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Biyoloji Sayı 172
<em>Candida albicans</em> Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter