Dit artikel presenteert een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol voor de karakterisering van Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) eiwit Cdr1, overexpressie in Saccharomyces cerevisiae. Een protease-breekbare C-terminal mGFPHis dubbele tag met een 16-residu linker tussen Cdr1 en de tag is ontworpen om de zuivering en detergent-screening van Cdr1 te vergemakkelijken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De succesvolle biochemische en biofysische karakterisering van ABC-transporters hangt sterk af van de keuze van het heterologe expressiesysteem. In de afgelopen twee decennia hebben we een gistmembraaneiwitexpressieplatform ontwikkeld dat is gebruikt om veel belangrijke schimmelmembraaneiwitten te bestuderen. De uitdrukking host Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ wordt verwijderd in zeven belangrijke endogene ABC-transporters en bevat de transcriptiefactor Pdr1-3 met een gain-of-function mutatie die de constitutieve overexpressie van heterologe membraaneiwitgenen stabiel geïntegreerd als enkele kopieën op de genomische PDR5-locus mogelijk maakt. De creatie van veelzijdige plasmidevectoren en de optimalisatie van kloonstrategieën in één stap maakt het snel en nauwkeurig klonen, mutagenese en expressie van heterologe ABC-transporters mogelijk. Hier beschrijven we de ontwikkeling en het gebruik van een nieuwe protease-splijtbare mGFPHis dubbele tag (d.w.z. het monomere gistversterkte groene fluorescerende eiwit yEGFP3 gefuseerd tot een zes-histidine affiniteit zuiveringslabel) dat is ontworpen om mogelijke interferentie van de tag met het eiwit van belang te voorkomen en om de bindingsefficiëntie van de His-tag aan nikkel-affiniteitsharsen te verhogen. De fusie van mGFPHis met het membraaneiwit ORF (open leesframe) maakt eenvoudige kwantificering van het eiwit mogelijk door inspectie van polyacrylamidegels en detectie van afbraakproducten die het mGFPHis-label behouden. We laten zien hoe deze functie de screening van reinigingsmiddelen op oplosbaarheid van membraaneiwitten vergemakkelijkt. Een protocol voor de efficiënte, snelle en betrouwbare isolatie van de kleinschalige plasmamembraanpreparaten van de C-terminaal gelabelde Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overexpressie in S. cerevisiae ADΔΔ, wordt gepresenteerd. Dit kleinschalige plasmamembraanisolatieprotocol genereert binnen één werkdag hoogwaardige plasmamembranen. De plasmamembraanpreparaten kunnen worden gebruikt om de enzymactiviteiten van Cdr1- en Cdr1-mutante varianten te bepalen.
Inleiding
De extractie van integrale membraaneiwitten uit hun oorspronkelijke lipideomgeving kan hun structuur en functie dramatisch beïnvloeden1,2,3,4. De complexe lipidesamenstelling van biologische membranen5 zorgt ervoor dat kritisch belangrijke eiwit-lipide interacties kunnen optreden6. Lipiden behouden de structurele integriteit van membraaneiwitten, waardoor ze correct kunnen functioneren in hun membraancompartimentbestemming(en)7,8. Daaro....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van verse of bevroren voorraden van voor verwerking bevoegde ADΔ- en ADΔΔ-cellen
- Ent 25 ml 2x YPCD [d.w.z. 2x YPD; 2% (w/v) gistextract, 2% (w/v) pepton, 4% (w/v) dextrose), 0,079 % (w/v) CSM (volledig supplementmengsel)]35 medium met een enkele gistkolonie en incubateer een nacht (o/n) gedurende 16 uur bij 30 °C met schudden met 200 omwentelingen per minuut (rpm).
- Ent 225 ml 2x YPCD-medium met de 25 ml o/n-cultuur en controleer de optische celdichtheid bij 600 nm (OD600); de OD600 is meestal ~0,5-1,0.
OPMERKING: Zorg er in dit stadium voor dat alle materialen die nodig zijn voor het vol....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een hoge frequentie van transformatie van S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanten/μg) werd bereikt met pYES2(figuur 2B). Zoals verwacht gaf de controle zonder DNA (d.w.z. alleen ddH2O) geen transformanten en 1 μg van de lineaire CDR1-mGFPHis-transformatiecassette (figuur 1A)gaf ~ 50 transformanten(figuur 2C)met het geoptimaliseerde ADΔΔ-transformatieprotocol. De CDR1-.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ondanks recente vooruitgang in de structurele analyse van membraaneiwitten, is er momenteel geen 3D-structuur voor Cdr1 of een andere PDR-transporter beschikbaar. Het verkrijgen van kennis van de Cdr1-structuur en de biochemische kenmerken ervan is dus belangrijk, omdat dit niet alleen inzicht zal geven in het rationele ontwerp van nieuwe geneesmiddelen om efflux-gemedieerde medicijnresistentie te overwinnen, maar ook in het mechanisme van functie van een belangrijke subfamilie van ABC-eiwitten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen dankbaar de financiering van het Nieuw-Zeelandse Marsden Fund (Grant UOO1305) en een blokbeurs van de Faculteit geneeskunde, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). Ze willen de Universiteit van Otago bedanken voor het verstrekken van een PhD Scholarship aan G. Madani. De auteurs willen ook hun dank uitspreken aan professor Stefan Raunser en zijn collega's, dr. Amir Apelbaum en dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, voor hun steun en supervisie tijdens een bezoek van 6 maanden aan G. Madani aan het Max Planck Instituut voor Moleculaire Fysiologie (MPIMP), Dortmund, Duitsland. De auteurs bedanken ook de Duitse Academische Uitwisselingsdie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-(N-Morpholino)ethane-sulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) | Merck | 77-86-1 | |
| 2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosid | Anatrace | NG310S | LMNG |
| 2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside | Anatrace | NG311S | OGNG (MNG-OG) |
| 2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranosid | Anatrace | NG322S | DMNG |
| 4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranosid | Glycon Biochemicals GmbH | D99019-C | PCC-α-M |
| 40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) | Bio-Rad | 1610148 | |
| Acetic acid (glacial) | Merck | 64-19-7 | |
| Agar | Formedium | 009002-18-0 | |
| Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | 13106-76-8 | |
| Ammonium persulphate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| ATP disodium salt | sigma-Aldrich | A-6419 | |
| Bromophenol blue | SERVA Electrophoresis GmbH | 34725-61-6 | |
| CHAPS | Anatrace | C316S | |
| CHAPSO | Anatrace | C317S | |
| CSM | Formedium | DCS0019 | |
| CSM minus uracil | Formedium | DCS0161 | |
| Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranosid | Anatrace | C324S | CYMAL-4 |
| Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranosid | Anatrace | C327S | CYMAL-7 |
| Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranosid | Anatrace | C321S | CYMAL-1 |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 11024-24-1 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche Diagnostics | 10197785103 | |
| DMSO | Merck | 67-68-5 | |
| Ethanol | Merck | 459836 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) | Merck | 6381-92-6 | |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | Applied Biosystems | 78205 | Een mix van exonuclease en fosfatase |
| Glucose | Formedium | 50-99-7 | |
| Glycerol | Merck | 56-81-5 | |
| Glycine | Merck | G8898 | |
| HEPES | Formedium | 7365-45-9 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003172510 | |
| KOD Fx Neo | TOYOBO Co | KFX-201 | Gebruik voor betrouwbare kolonie PCR |
| lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | 546-89-4 | |
| Magnesium chloride hexa-hydrate | sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES | Formedium | 145224-94-8 | |
| n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide | Anatrace | H110S | HEGA-10 |
| n-Decanoyl-N-methyl-glucamide | Anatrace | M320S | MEGA-10 |
| n-Decyl-phosphocholine | Anatrace | F304S | Fos-choline-10 |
| n-Decyl-β-D-maltopyranosid | Anatrace | D322S | DM |
| n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ312S | Anzergent 3-12 |
| n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide | Anatrace | D360S | LDAO |
| n-Dodecyl-α-D-maltopyranosid | Anatrace | D310HA | α-DDM |
| n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid | Anatrace | D310S | β-DDM |
| n-Nonyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Nonyl-β-D-maltopyranosid | Anatrace | N330S | NM |
| n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ318S | Anzergent 3-18 |
| n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate | Anatrace | AZ308S | Anzergent 3-8 |
| n-Octyl-phosphocholine | Anatrace | F300S | Fos-choline-8 |
| n-Octyl-β-D-glucopyranoside | Anatrace | O311S | OG |
| n-Tetradecyl-phosphocholine | Anatrace | F312S | Fos-choline-14 |
| n-Tetradecyl-β-D-maltopyranosid | Anatrace | T315S | TDM |
| n-Tridecyl-phosphocholine | Anatrace | F310S | Fos-choline-13 |
| n-Tridecyl-β-D-maltopyranosid | Anatrace | T323S | - |
| n-Undecyl-β-D-maltopyranosid | Anatrace | U300S | UM (UDM) |
| N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Octylphenoxypolyethoxyethanol | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | TRITON X-100 |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Peptone | Formedium | 3049-73-7 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche Diagnostics | 329-98-6 | |
| Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase | New England Biolabs | M0535S | High-fidelity DNA polymerase |
| polyethylene glycol (PEG |
Referenties
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or compl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
