Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Dit artikel presenteert een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol voor de karakterisering van Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) eiwit Cdr1, overexpressie in Saccharomyces cerevisiae. Een protease-breekbare C-terminal mGFPHis dubbele tag met een 16-residu linker tussen Cdr1 en de tag is ontworpen om de zuivering en detergent-screening van Cdr1 te vergemakkelijken.

Abstract

De succesvolle biochemische en biofysische karakterisering van ABC-transporters hangt sterk af van de keuze van het heterologe expressiesysteem. In de afgelopen twee decennia hebben we een gistmembraaneiwitexpressieplatform ontwikkeld dat is gebruikt om veel belangrijke schimmelmembraaneiwitten te bestuderen. De uitdrukking host Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ wordt verwijderd in zeven belangrijke endogene ABC-transporters en bevat de transcriptiefactor Pdr1-3 met een gain-of-function mutatie die de constitutieve overexpressie van heterologe membraaneiwitgenen stabiel geïntegreerd als enkele kopieën op de genomische PDR5-locus mogelijk maakt. De creatie van veelzijdige plasmidevectoren en de optimalisatie van kloonstrategieën in één stap maakt het snel en nauwkeurig klonen, mutagenese en expressie van heterologe ABC-transporters mogelijk. Hier beschrijven we de ontwikkeling en het gebruik van een nieuwe protease-splijtbare mGFPHis dubbele tag (d.w.z. het monomere gistversterkte groene fluorescerende eiwit yEGFP3 gefuseerd tot een zes-histidine affiniteit zuiveringslabel) dat is ontworpen om mogelijke interferentie van de tag met het eiwit van belang te voorkomen en om de bindingsefficiëntie van de His-tag aan nikkel-affiniteitsharsen te verhogen. De fusie van mGFPHis met het membraaneiwit ORF (open leesframe) maakt eenvoudige kwantificering van het eiwit mogelijk door inspectie van polyacrylamidegels en detectie van afbraakproducten die het mGFPHis-label behouden. We laten zien hoe deze functie de screening van reinigingsmiddelen op oplosbaarheid van membraaneiwitten vergemakkelijkt. Een protocol voor de efficiënte, snelle en betrouwbare isolatie van de kleinschalige plasmamembraanpreparaten van de C-terminaal gelabelde Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overexpressie in S. cerevisiae ADΔΔ, wordt gepresenteerd. Dit kleinschalige plasmamembraanisolatieprotocol genereert binnen één werkdag hoogwaardige plasmamembranen. De plasmamembraanpreparaten kunnen worden gebruikt om de enzymactiviteiten van Cdr1- en Cdr1-mutante varianten te bepalen.

Introduction

De extractie van integrale membraaneiwitten uit hun oorspronkelijke lipideomgeving kan hun structuur en functie dramatisch beïnvloeden1,2,3,4. De complexe lipidesamenstelling van biologische membranen5 zorgt ervoor dat kritisch belangrijke eiwit-lipide interacties kunnen optreden6. Lipiden behouden de structurele integriteit van membraaneiwitten, waardoor ze correct kunnen functioneren in hun membraancompartimentbestemming(en)7,8. Daarom is een cruciale eerste stap in de membraaneiwitzuivering de extractie van het eiwit uit zijn oorspronkelijke omgeving zonder de structuur en / of functie ervan te beïnvloeden.

Er zijn veel obstakels voor het karakteriseren van de structuur van membraaneiwitten, waarvan de meeste verband houden met hun hydrofobe aard, en de moeilijkheden bij het tot expressie brengen van goed gevouwen en functionele membraaneiwitten in de hoeveelheden die nodig zijn voor röntgenkristallografie of cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM)9,10,11,12. Er zijn drie soorten membraaneiwitexpressiesystemen: homoloog9,heterologe13,14,15en in vitro expressiesystemen16,17. De vaak lage expressieniveaus, of de onbetaalbare kosten, van veel expressiesystemen laten slechts een paar gastheren over als de voorkeursoptie om membraaneiwitten te produceren. Ze omvatten de bacteriële gastheer, Escherichia coli,de gisten S. cerevisiae en Pichia pastoris,en hogere eukaryoten zoals Sf9-insectencellen of zoogdiercellijnen18. Alle membraaneiwitexpressietechnologieën hebben voor- en nadelen; S. cerevisiae is echter misschien wel het best bestudeerde eukaryote modelorganisme dat geschikt is voor de productie van membraaneiwitten. Het is zeer veelzijdig met toepassingen in genetische manipulatie, geneesmiddelenontdekking, synthetische biologie en de expressie van eukaryote membraaneiwitten14,19,20,21.

In deze studie werd een gepatenteerde S. cerevisiae membraaneiwitexpressietechnologie21 gebruikt, met S. cerevisiae ADΔ14 en ADΔΔ22 als de voorkeursgastheren (Figuur 1A), om de belangrijkste C. albicans multidrug effluxpomp Cdr1 te overexpresseren en te bestuderen. Beide S. cerevisiae stammen zijn afgeleiden van AD1-8u- 23 die ofwel de ura3 (ADΔ) of zowel de ura3 als de his1 (ADΔΔ) genen verwijderd hebben om vals positieve uracil of histidine prototrofe transformaties te elimineren die ontstaan door de ongewenste integratie bij de URA3 of de HIS1 genomische loci. Het schrappen van de 7 belangrijkste multidrug effluxpompen23, aangegeven in figuur 1A, maakt ADΔΔ buitengewoon gevoelig voor de meeste xenobiotica. De gain-of-function mutante transcriptiefactor Pdr1-3 veroorzaakt de constitutieve overexpressie van heterologe membraaneiwitten zoals Cdr1 (rode achthoeken in figuur 1A) na integratie van de heterologe-ORF-bevattende transformatiecassette (figuur 1A) op de genomische PDR5-locus (blauwe rechthoek in figuur 1A) via twee homologe recombinatiegebeurtenissen. Een goede plasmamembraanlokalisatie van C-terminaal mGFPHis-gelabelde eiwitten kan worden bevestigd door confocale microscopie (Figuur 1A), en de His-tag kan worden gebruikt voor nikkel-affiniteitszuivering van het gelabelde eiwit. Het klonen van sommige schimmel ABC-transporters (bijv. Candida krusei ABC1) in pABC3-afgeleide plasmiden was echter niet mogelijk omdat ze niet konden worden vermeerderd in Escherichia coli vanwege celtoxiciteit. Dit leidde tot de ontwikkeling van het klonen in één stap van membraaneiwitten14,24 gelabeld op hun N- of C-eindpunt met verschillende affiniteits-, epitoop- of reportertags rechtstreeks in S. cerevisiae ADΔΔ (Figuur 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-stammen die verschillende CDR1-mutanten overexpresseren, kunnen op deze manier ook efficiënt worden gemaakt door maximaal vijf individuele PCR-fragmenten te gebruiken die elkaar 25 bp overlappen(figuur 1C). Met behulp van dit protocol kunnen veel ORF's van belang worden gekloond, uitgedrukt en gekarakteriseerd tegen lage kosten en met een hoog rendement binnen een zeer korte tijdspanne. De transformatie-efficiëntie vermindert slechts ~ 2-voudig met elk extra PCR-fragment.

Indien gewenst kunnen expressieniveaus ook gemakkelijk worden gemanipuleerd door primerontwerp om expressieniveaus voorspelbaar af te stemmen op ergens tussen 0,1% -50% van de meestal hoge, constitutieve expressieniveaus25. De geoptimaliseerde, multifunctionele, pABC314 afgeleide kloonvector, pABC3-XLmGFPHis26 (Figuur 1B) bevat een HRV-3C protease splitsingsplaats (X; LEVLFQ| GP), een protease die bij 4 °C beter presteert dan het veelgebruikte tabaksetsvirus (TEV) protease27. L is een vijf aminozuur (GSGGS) linker, mGFP is een monomere mutant (A206K)28,29 versie van de gist verbeterde groene fluorescentie eiwit variant yEGFP330, en His is een drie aminozuur linker (GGS) gevolgd door de zes-histidine (HHHHHH) nikkel-affiniteit eiwit zuivering tag.

Deze expressietechnologie is met succes gebruikt bij het ontdekken van geneesmiddelen en de studie van membraaneiwitten. De eerste structuur voor een schimmelazol medicijn doelwit, S. cerevisiae Erg1131, werd opgelost met behulp van deze technologie. Het maakte ook de gedetailleerde karakterisering van C. albicans Cdr132,33,34 mogelijk en de creatie van een cysteïne-deficiënt Cdr1-molecuul35 geschikt voor cysteïne-crosslinking studies om toekomstige hoge resolutie structuur te verifiëren. Veel andere ABC-transporters van belangrijke menselijke schimmelpathogenen (d.w.z. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei en het Fusarium solani-soortencomplex) zijn ook in detail bestudeerd met behulp van dit expressieplatform24,36,37,38,39. Dit heeft de generatie mogelijk gemaakt van een paneel van S. cerevisiae-stammen die effluxpompen overexpressie geven en die zijn gebruikt in schermen met hoge doorvoer om het nieuwe fluorescerende effluxpompsubstraat Nile red40 en specifieke41 en breedspectrum14,33,42,43, 44 effluxpompremmers te ontdekken. Het gebruik van dit systeem maakte ook de ontdekking van clorgyline mogelijk als de eerste in zijn soort breedspectrum schimmel multidrug efflux pompremmer42.

Volledige oplosbaarheid van membraaneiwitten en de creatie van een homogeen membraaneiwit-micelpreparaat zonder endogene lipiden, vereist hoge detergentconcentraties45. Maar helaas inactiveert dit ook vaak het membraaneiwit5,8,45,46. De eigenschappen van detergentmonomeren en hun aggregatie in oplossing worden beïnvloed door de fysische eigenschappen van de hydrofobe staart, de lengte en vertakking van de alkylketen, de aanwezigheid van een aromatische kern of fluoroalkylzijketen of het aantal polyoxyethyleeneenheden. Detergentscreening is dus een belangrijke eerste stap om het meest geschikte reinigingsmiddel voor oplosbaarheid en zuivering van membraaneiwitten te bepalen.

C. albicans is een belangrijke menselijke schimmelpathogeen van immuungecompromitteerde personen die ernstige, levensbedreigende invasieve infecties kunnen veroorzaken47, en het kan resistent worden tegen azool antischimmelmiddelen48,49. Een van de belangrijkste mechanismen van C. albicans multidrugresistentie is de overexpressie van Cdr150, een type II ATP-bindende cassette (ABC) transporter51 van de ABCG-subfamilie in het plasmamembraan. Full-size schimmel ABCG-transporters (bestaande uit twee nucleotidebindingsdomeinen [NBD's] en twee transmembraandomeinen [TMD's]) zijn beter bekend als pleiotrope geneesmiddelresistentie (PDR) transporters en worden gekenmerkt door hun unieke omgekeerde domeintopologie [NBD-TMD]2. PDR-transporters komen alleen voor in planten52,53 en schimmels54. Ondanks hun belang zijn er geen structuren voor PDR-transporters, hoewel structuren voor menselijke half-size ABCG-transporters onlangs zijn opgelost, wat heeft bijgedragen aan het creëren van het eerste voorlopige model voor Cdr133. Ons recente experimentele bewijs suggereert echter dat dit model mogelijk gebrekkig is omdat schimmel PDR-transporters karakteristieke asymmetrische NBD's hebben, wat mogelijk resulteert in een uniek transportmechanisme. Een hoge-resolutie structuur van Cdr1 is daarom nodig voor zowel het rationele ontwerp van nieuwe effluxpompremmers die kunnen helpen bij het overwinnen van efflux-gemedieerde medicijnresistentie, als om inzicht te geven in het werkingsmechanisme van deze belangrijke ABC-transporterfamilie.

Het doel van deze studie was om betrouwbare protocollen te ontwikkelen voor de expressie, oplosbaarheid en zuivering van Cdr1 in de genetisch gemodificeerde S. cerevisiae expressie gastheer, met als uiteindelijk doel het verkrijgen van een hoge resolutie structuur voor Cdr1. Als onderdeel van dit proces werd een protease-knipbare mGFPHis dubbele tag (Figuur 1B) ontworpen met een 16-residu linker die de tag scheidt van de C-terminus van Cdr1, die de binding van de bijgevoegde 6x His affiniteitstag aan de nikkel-affiniteitshars verbeterde en de monitoring van Cdr1-expressieniveaus in levende cellen en tijdens het hele zuiveringsproces mogelijk maakte. Er werd ook een reproduceerbaar protocol ontwikkeld voor kleinschalige gistplasmamembraaneiwitpreparaten met ongeveer 10% C. albicans Cdr1 (zoals geschat door Coomassie-kleuring na SDS-PAGE), dat kon worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van Cdr1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van verse of bevroren voorraden van voor verwerking bevoegde ADΔ- en ADΔΔ-cellen

  1. Ent 25 ml 2x YPCD [d.w.z. 2x YPD; 2% (w/v) gistextract, 2% (w/v) pepton, 4% (w/v) dextrose), 0,079 % (w/v) CSM (volledig supplementmengsel)]35 medium met een enkele gistkolonie en incubateer een nacht (o/n) gedurende 16 uur bij 30 °C met schudden met 200 omwentelingen per minuut (rpm).
  2. Ent 225 ml 2x YPCD-medium met de 25 ml o/n-cultuur en controleer de optische celdichtheid bij 600 nm (OD600); de OD600 is meestal ~0,5-1,0.
    OPMERKING: Zorg er in dit stadium voor dat alle materialen die nodig zijn voor het volgende transformatie-experiment direct beschikbaar zijn.
  3. Kweek de cultuur bij 30 °C gedurende nog eens ~ 6-8 uur met schudden bij 200 tpm totdat de celdichtheid een OD600 van ~ 6-8 bereikt.
    OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT), tenzij anders vermeld.
  4. Oogst deze logaritmische fasecellen door centrifugering bij 3.000 x g gedurende 3 minuten.
  5. Resuspend de cellen en was ze tweemaal met steriel dubbel gedestilleerd water (ddH2O; d.w.z. 200 ml en vervolgens 20 ml).
  6. Oogst de cellen op 3.000 x g gedurende 3 minuten.
  7. Voeg langzaam (d.w.z. voeg elke minuut gedurende 30 minuten 30 gelijke hoeveelheden bevroren competente celoplossing (FCC) toe) de celkorrel in X ml FCC [5% (w/v) glycerol, 10% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO)] op ijs (waarbij X = OD600;bijvoorbeeld als OD600 = 6 resuspend in 6 ml, of als OD600 = 3 resuspend in 3 ml).
    OPMERKING: De juiste FCC-samenstelling is van cruciaal belang voor het succes van de transformatie.
  8. Houd de cellen gedurende 2 uur op ijs voordat ze worden bewerkt of bewaar aliquots bij -80 °C totdat ze nodig zijn.
    OPMERKING: ADΔ- en ADΔΔ-cellen zijn erg gevoelig voor bevriezing. Cellen moeten dus langzaam worden afgekoeld tot -80 °C: plaats ijskoude microcentrifugebuizen met 50-600 μL celaliquots in een plastic opslagdoos (RT). Plaats de doos in een grotere polystyreencontainer (RT) en sluit de container met een passend polystyreendeksel. Doe de container vervolgens in de -80 °C vriezer.
    LET OP: Langzaam bevriezen is van cruciaal belang voor de overleving van cellen.

2. Transformatie van ADΔ en ADΔΔ met CaCDR1-XLmGFPHis en bevestiging van correcte transformanten door kolonie PCR en DNA-sequencing

OPMERKING: Plasmide pABC3-CDR1-mGFPHis is gemaakt met behulp van conventionele kloonstrategieën die in detail worden beschreven in Lamping et al., 201055 en wordt geïllustreerd in figuur 1B. Wild-type C. albicans CDR1 werd geïsoleerd als een PacI /NotI-fragment uit plasmide pABC3-CaCDR1A-GFP14 en gekloond in pABC3-XLmGFPHis26.

  1. PCR versterkt de volledige CDR1-transformatiecassette met een high-fidelity DNA-polymerase en primerpaar PDR5-pro/PDR5-ter35 met behulp van 1-10 ng pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis als DNA-sjabloon of, als alternatief, verteer 2 μg pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis tot voltooiing met 10 U restrictie-enzym AscI bij 37 °C (Figuur 1A,B).
    OPMERKING: De CDR1-transformatiecassette (figuur 1A)bevat de PDR5-promotor - CaCDR1-mGFPHis - PGK1-terminator - URA3-selectiemarker - PDR5 stroomafwaarts gebied.
  2. Voer agarose gel elektroforese uit en gelextract de ~8 kb transformatiecassette.
    OPMERKING: Gelzuivering van de ~8 kb CaCDR1 transformatiecassette verwijdert alle mogelijke onverteerde plasmide DNA, wat zou kunnen leiden tot onjuiste transformanten die het volledige plasmide hebben, in plaats van de lineaire transformatiecassette, geïntegreerd op de genomische PDR5-locus.
  3. Denatureer de vereiste hoeveelheid zalmspermadrager DNA (2 mg / ml; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5) gedurende 10 minuten in een kokend waterbad en houd op ijs. Gebruik buisjes met schroefdeksel voor het koken van zalmsperma-DNA om opening van het deksel te voorkomen.
  4. Meng 50 μL gedenatureerd zalmsperma-DNA met 14 μL van de transformatiecassette (500-2.000 ng) en houd het 64 μL DNA-mengsel op ijs tot verder gebruik.
    OPMERKING: Gebruik 10 ng van een E. coli-gistshuttle plasmide (bijv. pYES2) als een positieve transformatie controle(Figuur 2B).
  5. Resuspend verse of bevroren competente cellen snel ontdooid gedurende 5 minuten in een waterbad van 30 °C en verdeel ze in 50 μL aliquots in microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
  6. Oogst cellen door centrifugeren gedurende 1 minuut in een microfuge met maximale snelheid (18.000 x g).
  7. Verwijder het supernatant en houd de celkorrel bij RT.
  8. Meng voor elke transformatie 296 μL combinaties (RT) van 260 μL 50% (w/v) polyethyleenglycol (PEG 3350) en 36 μL 1 M lithiumacetaat (LiAc), door herhaald pipetteren, met de juiste 64 μL ijskoude DNA-mengsels.
  9. Voeg het juiste mengsel onmiddellijk toe aan een 50 μL competente celkorrel aliquot.
  10. Resuspend de celkorrel in het 360 μL PEG-LiAc-DNA-mengsel door grondig te vortexen gedurende ongeveer 30 s.
  11. Incubeer het celmengsel in een waterbad van 30 °C gedurende 1 uur.
    OPMERKING: ADΔ- en ADΔΔ-cellen transformeren beter bij 30 °C dan bij 42 °C35.
  12. Oogst de cellen op 18.000 x g gedurende 10 s. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 80 μL ddH2O.
  13. Verspreid de cellen over een CSM-URA-agarplaat35 [d.w.z. 0,67% (w / v) giststikstofbasis zonder aminozuren, 0,077% (w / v) CSM minus uracil, 2% (w / v) glucose en 2% (w / v) agar].
  14. Incubeer de platen gedurende 2-3 dagen bij 30 °C totdat uracil prototrofe transformanten duidelijk zichtbaar zijn.
    OPMERKING: Verwacht ~100 transformanten per μg van de lineaire ~8 kb CaCDR1 transformatiecassette en ~4 x 104 transformanten per μg pYES2.
  15. Kies vijf onafhankelijke transformanten en verspreid ze op een verse CSM-URA-plaat om de uracil prototrofe transformanten te scheiden van overblijfselen van niet-getransformeerde gastheercellen.
  16. Verwijder alle mogelijke kleine mutanten door de transformanten te laten groeien op YPG-agarplaten [1% (w/v) gistextract, 2% (w/v) pepton, 2% (v/v) glycerol en 2% (w/v) agar](Figuur 2D).
    OPMERKING: Petite mutanten hebben defecte mitochondriën en kunnen dus niet groeien op niet-fermenteerbare koolstofbronnen. Ze komen vrij vaak voor in S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ en ADΔΔ zijn bijzonder gevoelig voor het verwerven van het petite fenotype.
  17. Voer gistkolonie PCR uit en bevestig dat ten minste drie onafhankelijke transformanten correct zijn geïntegreerd in de genomische PDR5-locus (Figuur 1C) door de volledige ~ 8 kb CaCDR1-transformatiecassette te versterken met een specifiek DNA-polymerase dat is geoptimaliseerd voor het versterken van PCR-producten uit onzuivere DNA-sjabloonbronnen. Gebruik een set primers die net buiten de integratieplaats binden en 1 μL aliquots van celsuspensies (in ddH2O) afgeleid van enkele kolonies als DNA-sjablonen.
    OPMERKING: Dit specifieke DNA-polymerase versterkt op betrouwbare wijze ~ 8 kb PCR-fragmenten van intacte gistcellen. Voor een betrouwbare versterking zijn echter 45 PCR-cycli vereist en moeten de gistcellen worden geresuspendeerd bij OD600 1-10 in ddH2O.
  18. Bevestig de juiste ~8 kb PCR-amplificatieproduct door DNA-agarosegel-elektroforese van een 1 μL-deel van de PCR-reactie.
  19. Verwijder overtollige amplificatieprimers uit een gedeelte van 10 μL van de PCR-reactie met een enzymmengsel van een enkelstrengs DNA-exonuclease en een fosfatase volgens de instructies van de fabrikant voordat u de volledige ORF sequentiseert met behulp van delen van het behandelde DNA-monster met geschikte primers.

3. Kleinschalig gistplasmamembraanisolatieprotocol

  1. Groeiende gistcellen
    1. Kweek een enkele gistkolonie voor in 10 ml YPD bij 30 °C gedurende ~ 7-8 uur met schudden bij 200 tpm.
    2. Ent 40 ml YPD-medium met de 10 ml voorkweek en incubeer de cellen bij 30 °C o/n (~16 h) met schudden bij 200 tpm totdat de celdichtheid een OD600 van 1-3 bereikt.
  2. Gistcellen oogsten
    1. Oogst 40 OD-eenheden (ODU; bv. 1 ml bij een OD600 van 1 = 1 ODU) logaritmische fasecellen bij 4.200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    2. Resuspend en was cellen tweemaal met ijskoude steriele ddH2O (d.w.z. 40 ml en vervolgens 1 ml; oogst cellen tussen de stappen door centrifugeren bij 4.200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C).
    3. Resuspend de pellet in 1 ml ijskoude steriele ddH2O en breng de celsuspensie over in een voorgekoelde (op ijs) microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    4. Oogst cellen bij 3.300 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
    5. Aspirateer de supernatant.
    6. Resuspend de celkorrel in 0,5 ml homogeniserende buffer [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) glycerol; pH 7,5] vers aangevuld met 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF).
      OPMERKING: Voeg PMSF altijd vers toe omdat PMSF snel wordt geïnactiveerd bij blootstelling aan water.
      LET OP: PMSF is een serineproteaseremmer, die extreem corrosief en destructief is voor weefsels. Het kan onomkeerbare oogschade veroorzaken.
    7. Bewaar de celsuspensie bij -80 °C of gebruik deze onmiddellijk.
  3. Isolatie van plasmamembranen
    1. Indien bevroren, ontdooi de cellen op ijs gedurende ~ 1 uur.
    2. Voeg ijskoude silicaparels met een diameter van 0,5 mm toe aan de celsuspensie van 0,5 ml om een totaal volume van 1 ml te bereiken.
    3. Breek cellen met 6 cycli van vortexing op maximale schudintensiteit gedurende 1 minuut afgewisseld met 3 minuten afkoelingsperioden op ijs.
    4. Maak een dun gaatje aan de onderkant van de buis met een verwarmd scalpelmesje.
    5. Verzamel het gebroken celhomogenaat via de onderkant van de buis in een andere ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 ml met een draai van 10 s met lage snelheid (~ 200 rpm).
      OPMERKING: Dit zorgt ervoor dat de silicaparels in de originele buis blijven.
    6. Centrifugeer het celhomogenaat bij 5.156 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om celresten, ongebroken cellen en kernen te verwijderen.
    7. Breng 450 μL supernatant over in een ijskoude microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg nog eens 1 ml ijskoud HB toe, aangevuld met verse PMSF (1 mM).
      OPMERKING: Deze verdunningsstap is van cruciaal belang voor het hoogwaardige plasmamembraaneiwitherstel.
    8. Oogst plasmamembranen bij 17.968 x g gedurende 1 uur bij 4 °C en resuspend de plasmamembraankorrel, door herhaald pipetteren, in 100 μL HB vers aangevuld met 1 mM PMSF. Maak de celkorrel los voor een goede plasmamembraanhomogenisatie door de celkorrel te roeren met de pipetpunt van 100 μL voordat u de 100 μL HB vrijgeeft en op en neer pipettert.
    9. Meet de eiwitconcentratie van het plasmamembraanpreparaat met een eiwittestkit die compatibel is met buffers die reductiemiddel en reinigingsmiddel bevatten.
    10. Bewaar de plasmamembranen bij -80 °C of bewaar ze op ijs voor onmiddellijk gebruik.

4. Natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE)

  1. Monteer het apparaat voor het bereiden van polyacrylamidegels.
  2. Meng voor twee scheidende gels (7% polyacrylamide) 2,1 ml 40% acrylamide/bis-acrylamide, 3 ml 4x scheidingsbuffer (1,5 M Tris, 0,4% natriumdodecylsulfaat [SDS] (w/v); pH 8,8) en 6,9 ml ddH2O. Voeg 8 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED) en 60 μL 10% ammoniumperssulfaat (APS) toe om de polymerisatie van acrylamide te initiëren.
    LET OP: Acrylamide/bis-acrylamide is zeer giftig. Het veroorzaakt huidirritatie, perifere neuropathie en is kankerverwekkend. TEMED is schadelijk bij inslikken of inademen. APS is schadelijk als het wordt ingeslikt. Het veroorzaakt ernstige oog- en huidirritaties.
  3. Giet ~ 4-5 ml van dit mengsel in het geassembleerde gelapparaat, tot ~ 2 cm van de bovenkant.
  4. Leg voorzichtig ~1-2 ml 0,1% SDS bovenop om een planaire meniscus te creëren.
  5. Laat de polyacrylamide gedurende ~60 min op RT inharden.
  6. Bereid een stapelgelmengsel voor twee gels door 0,5 ml 40% acrylamide /bis-acrylamide, 1 ml 4x stapelbuffer (0,5 M Tris, 0,4% SDS (w / v); pH 6,8) en 6,9 ml ddH2O te mengen.
  7. Verwijder de 0,1% SDS-laag uit de gepolymeriseerde scheidingsgel en spoel af met ddH2O om sporen van SDS te verwijderen.
  8. Giet het stapelgelmengsel op de scheidingsgel.
  9. Plaats een kam in de stapelgel en verwijder eventuele luchtbellen rond de kam.
  10. Laat de stapelgel ~60 min instelen bij RT.
  11. Verwijder de kam en spoel de gelsleuven af met water. Doe de gel in de geltank en vul de geltank tot de bovenkant met 1x lopende buffer (24,8 mM Tris, 190 mM glycine, 0,1% SDS).
    OPMERKING: Bereid 1x lopende buffer voor uit een 10x buffervoorraad (248 mM Tris, 1,9 M glycine, 1% SDS (w/v) in ddH2O) opgeslagen bij RT.
  12. Meng 5-10 μL plasmamembraanmonsters (d.w.z. 10-20 μg eiwit) met gelijke volumes 2x eiwitbeladingskleurstof [120 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glycerol, 0,02% broomfenolblauw, 4% SDS, 200 mM dithiothreitol (DTT)] en laad onmiddellijk in individuele gelsleuven ondergedompeld in lopende buffer.
    LET OP: DTT is schadelijk als het wordt ingeslikt. Het veroorzaakt ernstige oog- en huidirritaties.
    OPMERKING: Maak een voorraad van 10 ml van 2x eiwitbeladende kleurstof, aliquot en bewaar bij -20 °C. Verwarm de gemengde monsters niet, maar laad ze onmiddellijk in afzonderlijke gelsleuven, zodat de GFP-tag niet wordt gedenatureerd en de in-gel fluorescentiesignalen kunnen worden gedetecteerd.
  13. Laad eiwitmoleculaire gewichtsmarkers (10-245 kDa-bereik) in een aparte sleuf om de grootteschatting van individuele eiwitfragmenten mogelijk te maken.
  14. Voer gel-elektroforese uit bij 200 V totdat de blauwe ladingskleurstof de bodem van de gel bereikt (meestal 45-55 min).
  15. Onderzoek de gel op in-gel GFP-fluorescentie met een gelbeeldvormingssysteem (excitatie- en emissiegolflengten zijn respectievelijk 475-485 nm en 520 nm).
  16. Na beeldvorming van in-gel fluorescentie, fixeert u eiwitten door zachte agitatie van de gel in ~ 10-20 ml Protein Gel Fixing Solution (40% ethanol, 10% azijnzuur) gedurende 15 minuten bij RT.
  17. Spoel de gel tweemaal gedurende 10 minuten met 10 ml ddH2O en visualiseer eiwitbanden door de gel in 10 ml colloïdale Coomassie-vlekoplossing te plaatsen met zacht schudden gedurende ~ 1 uur bij RT.
  18. Voor een betere visualisatie van eiwitbanden, de-kleuring van de gel een of twee keer in ~ 20 ml ddH2O gedurende ~ 1 uur voordat u beelden opneemt met het gelbeeldvormingssysteem.

5. Bepaling van Cdr1 ATPase-activiteiten 57

  1. Verdun plasmamembraanmonsters >2,2 mg / ml tot 1-2 mg / ml in HB.
  2. Balanceer de ATPase-testcocktail (75 mM MES-Tris, 75 mM kaliumnitraat, 0,3 mM ammoniummolybdaat, 7,5 mM natriumazide; pH 7,5) en Mg-ATP (28,8 mM ATP-disodiumzout, 28,8 mM MgCl2; pH 7,0) tot 30 °C in een incubator van 30 °C.
    LET OP: Natriumazide is zeer giftig.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle buffervoorraden en flessen fosfaatvrij zijn; d.w.z. was glaswerk met 1% (vol/vol) HCl en spoel het meerdere keren af met ddH2O. Houd het ook gescheiden van ander glaswerk dat waarschijnlijk sporen van fosfaat bevat die vaak aanwezig zijn in wasmiddelen die worden gebruikt om glaswerk te wassen.
  3. Voeg 90 μL testcocktail met of zonder Cdr1-ATPase-remmer (20 μM oligomycine) toe aan individuele putjes van een 96-well microtiterplaat.
    OPMERKING: De test wordt in drievoud uitgevoerd.
  4. Voeg 5 μL van de geïsoleerde plasmamembranen (~ 5-10 μg eiwit) of fosfaatstandaarden (0-100 nmol Pi) toe aan de juiste putten van de microtiterplaat.
    OPMERKING: Bewaar de eerste en laatste kolom voor twee afzonderlijke sets fosfaatstandaarden.
  5. Begin de test door 25 μL voorgewarmde 28,8 mM Mg-ATP (6 mM eindconcentratie) met een meerkanaalspipet toe te voegen aan individuele putten en incubateer bij 30 °C gedurende 30 minuten.
  6. Stop de reactie door toevoeging van 130 μL ontwikkelingsreagens (1,6% natrium L-ascorbaat, 1% SDS, 12% ammoniummolybdaat in 6 M zwavelzuur).
    LET OP: Geconcentreerd zwavelzuur reageert heftig met water. Het is corrosief en kan huid- en longschade veroorzaken.
  7. Incubeer bij RT gedurende 10 min.
  8. Lees de absorptie van de microtiterplaatputten bij 750 nm af met een microtiterplaatlezer.
    OPMERKING: Vasthouden aan de incubatietijd van 10 minuten voor de ontwikkeling van blauwe kleurstof (d.w.z. een verminderd fosfor-molybdeencomplex) is van cruciaal belang voor de nauwkeurigheid van de test, omdat de ontwikkeling van de blauwe kleurstof met de tijd doorgaat.
  9. Verkrijg de Cdr1-specifieke ATPase-activiteit (d.w.z. de oligomycine-gevoelige ATPase-activiteit) door de ATPase-activiteit in aanwezigheid van oligomycine af te trekken van de totale ATPase-activiteit in afwezigheid van oligomycine.

6. Kleinschalig wasmiddelscherm

  1. Combineer de plasmamembraanpreparaten (d.w.z. 2,5 mg plasmamembraaneiwit) van cellen die Cdr1-mGFPHis overexpressie geven met GTED-20-buffer [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (w/v) glycerol; pH 7,5; vers aangevuld met 1 mM PMSF] met 5 mg van het testdemiddel, tot een totaal volume van 0,5 ml aangevuld met 1% (w/v) demiddel.
  2. Draai het mengsel gedurende 2 uur bij 4-8 °C, met een rotatie-apparaat.
  3. Centrifugeer het mengsel bij 141.000 x g bij 4 °C gedurende 1 uur.
  4. Breng het supernatant met oplosbare stof over in een verse microcentrifugebuis.
  5. Voeg 0,5 ml GTED-20-buffer aangevuld met 2% (w/v) SDS toe aan de onoplosbare pelletfractie en incubeer bij 30 °C o/n in een schudincubator om alle detergent-onoplosbare membraaneiwitten te extraheren.
  6. Analyseer en vergelijk de supernatant en oplosbare pelletfracties door SDS-PAGE.
  7. Fotografeer gels die GFP-gelabelde eiwitten bevatten voor in-gel GFP-fluorescentie vóór Coomassie-kleuring en kwantificeer expressieniveaus met het beeldvormingssysteem.
  8. Gebruik de oplosbare membraaneiwitfractie voor downstreamtoepassingen zoals fluorescentiegrootte-uitsluitingschromatografie (FSEC)58 om geschikte detergent(en) te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een hoge frequentie van transformatie van S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanten/μg) werd bereikt met pYES2(figuur 2B). Zoals verwacht gaf de controle zonder DNA (d.w.z. alleen ddH2O) geen transformanten en 1 μg van de lineaire CDR1-mGFPHis-transformatiecassette (figuur 1A)gaf ~ 50 transformanten(figuur 2C)met het geoptimaliseerde ADΔΔ-transformatieprotocol. De CDR1-mGFPHis-transformanten werden ook getest op hun vermogen om te groeien op een niet-fermenteerbare koolstofbron om mogelijke kleine mutanten met defecte mitochondriën te elimineren. Drie (gele cirkels; Figuur 2D) van de 25 geteste uracil-prototrofe transformanten kon niet groeien op YPG-agarplaten en werd weggegooid uit verder onderzoek. De Cdr1-mGFPHis uitgedrukt door de nieuw gecreëerde stam ADΔΔ-CDR1-mGFPHis is correct gelokaliseerd in het plasmamembraan (Figuur 1A) en werd uitgedrukt op voldoende niveaus voor de structurele en functionele karakterisering van Cdr1 (Figuur 3). Het ontwerp van de geoptimaliseerde dubbele tag(Figuur 1B)maakt het ook mogelijk om de dubbele tag van mGFPHis te verwijderen na nikkelaffiniteitszuivering van Cdr1-mGFPHis om mogelijke interferentie van de tag in downstream-toepassingen te voorkomen. Voorlopige resultaten hebben echter aangetoond dat de 3 aminozuur linker tussen Cdr1 en de HRV-3C protease splitsingsplaats mogelijk moet worden uitgebreid om een snellere, effectievere splitsing te bereiken. Soortgelijke waarnemingen werden onlangs gemeld voor de N-terminaal gelabelde nucleoside transporter Escherichia coli NupC, die een 15 in plaats van de oorspronkelijk ontworpen 3 aminozuur linker nodig had voor een efficiënte splitsing van het detergent (DDM) opgeloste NupC gebonden aan de nikkel-affiniteitshars59. De 5 aminozuur linker C-terminal van de HRV-3C splitsingsplaats voorkomt sterische interferentie van de mGFPHis dubbele tag met het bijgevoegde eiwit van belang, die we eerder hebben waargenomen voor C. utilis ABC transporter Cdr139. De yEGFP3-A206K-mutatie is gemaakt om kunstmatige GFP-dimerisatie bij hoge eiwitconcentraties28te voorkomen, en de extra 3 aminozuur linker tussen mGFP en de His Nickel-affinity tag zorgt voor een juiste oppervlakteblootstelling van de His-tag om de bindingsefficiëntie van het gelabelde eiwit aan de nikkelaffiniteitshars te maximaliseren (gegevens niet weergegeven).

Figure 1
Figuur 1: Een gistmembraaneiwitexpressieplatform voor het efficiënt klonen en uitdrukken van schimmelplasmamembraantransporters. (A) Een transformatiecassette bestaande uit de PDR5-promotor (blauw), CDR1 (rood) C-terminaal gelabeld met XLmGFPHis (groen), de PGK1-terminator (oranje), de URA3-selectiemarker (lichtblauw) en een stuk van het PDR5-stroomafwaartse gebied (blauw) wordt gebruikt om de expressie gastheer S te transformeren.cer evisiae ADΔΔ door integratie op de genomische PDR5 locus. De gain-of-function mutant transcriptiefactor Pdr1-3 veroorzaakt de constitutieve overexpressie van Cdr1 (rode achthoeken) in het plasmamembraan (zie confocale microscopie afbeelding hieronder). (B) Plasmide pABC3-XLmGFPHis, dat kan worden gebruikt in een traditionele kloonstrategie of als een PCR-sjabloon om een transformatiecassette te genereren. Verbeteringen van plasmide pABC3-XLmGFPHis ten opzichte van pABC3-GFP14 worden vermeld onder de plasmidekaart. (C) Een alternatieve, efficiëntere kloonstrategie in één stap om de transformatiecassette te integreren op de genomische PDR5-locatie van ADΔΔ. Een ORF (rood) kan PCR worden versterkt met behulp van primers (pijlen) die overlappingen creëren met de linkerarm (blauw; PDR5 promotor) en rechterarm (groen; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 downstream) fragmenten. Mutaties (zwarte lijnen) kunnen indien nodig door middel van primerontwerp in de ORF worden geïntroduceerd. Homologe recombinatiegebeurtenissen die de juiste integratie op de PDR5-locus sturen, worden aangegeven door de gekruiste stippellijnen. (D) Hele cel assays die kunnen worden gebruikt voor de functionele karakterisering van schimmel multidrug efflux pompen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Transformatie van ADΔΔ met de CDR1-mGFPHis transformatiecassette en eliminatie van kleine ADΔΔ-CDR1-mGFPHis-transformanten. Uracil prototrofe transformanten werden geselecteerd door getransformeerde ADΔΔ Op CSM-URA platen bij 30 °C gedurende 3 dagen te incuberen. (A) Negatieve controle (geen DNA). (B) Positieve controle (10 ng pYES2). (C) CDR1-mGFPHis transformanten (1 μg DNA). (D) Testen van ADΔΔ-CDR1-mGFPHis transformanten voor een klein fenotype op YPG-agarplaten. Kleine transformanten die niet op YPG-agarplaten konden groeien vanwege defecte mitochondriën, zijn omcirkeld in geel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De GFP-fluorescentie is een betrouwbare maat voor Cdr1-expressieniveaus omdat er een lineair verband was tussen de hoeveelheid Cdr1-mGFPHis (stap 3.3.9) en in-gel fluorescentiesignalen (figuur 3A). In dit project werd een reproduceerbare geoptimaliseerde workflow ontwikkeld voor het snel genereren van hoogwaardige kleinschalige plasmamembraanpreparaten voor de biochemische karakterisering van plasmamembraaneiwitten. Het was mogelijk om bijna 0,5 mg plasmamembraaneiwit te genereren(figuur 3C;linkergrafiek) met de hoogste Cdr1 ATPase-activiteit (̃400 nmol/min/mg; Figuur 3C; rechtergrafiek) bij het breken van 40 ODU logaritmische fase (OD600nm van 1-3) cellen (geresuspendeerd in 0,5 ml HB) met hetzelfde volume (d.w.z. 0,5 ml) silicaparels en 6 cycli van vortexing gedurende 1 minuut met maximale schudintensiteit gevolgd door 3 min afkoelingsperioden op ijs. Verdere toename van het aantal breukcycli (stap 3.3.3) verminderde de kwaliteit van het geïsoleerde plasmamembraanpreparaat (de Cdr1 ATPase-activiteit daalde van 170 nmol / min / mg tot ~ 60 nmol / min / mg; gegevens niet weergegeven). Hoewel er slechts kleine verschillen waren in de SDS-PAGE-eiwitpatronen van de plasmamembraanmonsters geïsoleerd uit cellen die zijn gebroken met een hoger aantal breukcycli (gegevens niet getoond), is het waarschijnlijk dat de bijna 3-voudig verminderde Cdr1 ATPase-activiteiten na 10 of meer breukcycli werden veroorzaakt door: i) gedeeltelijke denaturatie van Cdr1 als gevolg van blootstelling aan verhoogde temperatuur; ii) post-translationele modificaties zoals fosforylering of defosforylering; of door iii) verhoogde kruisbesmetting van de geïsoleerde plasmamembraanblaasjes met membraanfracties van andere organellen. Het breken van 40 ODU van cellen in 0,5 ml HB leverde de hoogste kwaliteit plasmamembranen op (d.w.z. de meeste Cdr1 per 10 μg plasmamembraaneiwit; Figuur 3B) met de hoogste Cdr1 ATPase-activiteit(figuur 3C;rechtergrafiek). Hogere (> 40 ODU/0,5 ml HB) of lagere (20 ODU/0,5 ml HB) celdichtheden verminderden de ATPase-activiteit van de geïsoleerde plasmamembranen(figuur 3C;rechtergrafiek), hoewel hun opbrengst toenam in verhouding tot toenemende celdichtheden(figuur 3C;linkergrafiek). Zo was 40 ODU/0,5 ml HB de optimale celdichtheid voor de isolatie van de hoogste kwaliteit plasmamembranen. Dus, het gebruik van het geoptimaliseerde protocol voor de kleinschalige isolatie van plasmamembraanpreparaten leidde tot 2-3 keer hogere Cdr1-specifieke ATPase-activiteiten (~ 300 nmol / min / mg; Figuur 3C; rechter grafiek) vergeleken met de Cdr1 specifieke ATPase-activiteiten die aanvankelijk werden verkregen (~ 100 nmol / min / mg; gegevens niet weergegeven). Deze ATPase-activiteiten waren ook significant hoger35 dan alle eerder gerapporteerde Cdr1 ATPase-activiteiten (100-200 nmol / min / mg) die waren verkregen met een arbeidsintensiever en tijdrovender grootschalig plasmamembraanvoorbereidingsprotocol14,41,60.

De meest gebruikelijke methode om membraaneiwitten uit biologische membranen te extraheren, is oplosbaarheid met wasmiddel. De uitdaging is echter om een geschikt wasmiddel te vinden dat het minst schadelijke effect heeft op de eiwitstabiliteit en/of vouweigenschappen. Het labelen van het eiwit met mGFPHis vergemakkelijkt screening om het beste wasmiddel (en) voor eiwitextractie te selecteren. In totaal werden 31 detergentia, vermeld in de tabel met materialen,met verschillende eigenschappen getest op hun vermogen om Cdr1 op te ruimen uit ruwe plasmamembranen van S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis-cellen. De resultaten voor een representatieve set van 16 testmiddelen (A-Q) zijn weergegeven in figuur 3D. Lanes T, P en S bevatten 10 μL aliquots van totaal (T) plasmamembraaneiwit onmiddellijk na detergentoplosbaarheid (stap 6.2) en de detergent onoplosbare pellet (P; opgelost o/n in 0,5 ml GTED-20, 2% SDS; stap 6.5) en de detergent oplosbare supernatant (S; stap 6.4) fracties na scheiding door ultracentrifugatie bij 141.000 x g. Het gewenste reinigingsmiddel moet zoveel mogelijk Cdr1-mGFPHis opslokken zonder de structuur en/of functie ervan te veranderen. De ruwe plasmamembraaneiwitten (5 mg/ml) werden gedurende 2 uur opgelost met 1% (w/v) wasmiddel (T) en aliquots van de oplosbare (S) en onoplosbare (P) fracties werden geanalyseerd door SDS-PAGE (Figuur 3D) en later ook door fluorescentie-detectie size-exclusion chromatography (FSEC)58 (Figuur 4). We stelden vast dat een minimale verhouding tussen wasmiddel en eiwit van 2:1 (w/w) nodig was voor een efficiënte oplosbaarheid van Cdr1. Om de optimale detergent (DDM) concentratie te bepalen die nodig is voor de oplosbaarheid van Cdr1-mGFPHis, werden de kritische micelconcentratie van het wasmiddel (x CMC) en de verhouding tussen detergent en membraaneiwit (w/w) onderzocht. Grote verschillen in de oplosefficiëntie van Cdr1-mGFPHis werden waargenomen bij gebruik van vaste concentraties van 10x of 80x CMC van DDM. De oplosefficiëntie varieerde tussen 40% en 80% of 60% en 90%, afhankelijk van de hoeveelheden ruwe plasmamembranen die in de verschillende oplosbaarheidsexperimenten werden gebruikt. Het kiezen van wasmiddel-eiwitverhoudingen van ≥2 (w / w) gaf echter reproduceerbaar goede resultaten met >85% van cdr1-mGFPHis werd oplosbaar, ongeacht de hoeveelheid plasmamembraaneiwit die werd gebruikt. Dus, als de meer gebruikelijke aanpak wordt gebruikt om eenvoudigweg 1% of 2% (w / v) wasmiddel te kiezen voor de oplosbaarheid van membraaneiwitten zoals Cdr1-mGFPHis, is het belangrijk om de verhouding tussen wasmiddel en eiwit boven 2 (w / w) te houden [d.w.z. houd de plasmamembraaneiwitconcentratie onder 5 mg / ml bij gebruik van 1% (dwi 10 mg / ml) wasmiddel].

Figure 3
Figuur 3: Kwantificering van Cdr1-mGFPHis expressieniveaus, optimalisatie van een kleinschalig plasmamembraanisolatieprotocol en detergentscreening voor Cdr1-mGFPHis. (A) Kwantificering van Cdr1-mGFPHis met in-gel fluorescentie; de Coomassie gekleurde en in-gel fluorescentie SDS-PAGE afbeeldingen van dezelfde 0,7% polyacrylamide gel zijn links weergegeven. De banen 1 tot en met 6 werden geladen met 0,75, 1,5, 3, 6, 12 en 24 μg ADΔΔ-CDR1-mGFPHis plasmamembraaneiwit. Cdr1-mGFPHis wordt aangegeven met een rode pijl. M = Precisie Plus Eiwit Marker. De mGFP-fluorescentie-intensiteiten (rechts weergegeven) waren lineair over het gehele geteste concentratiebereik en er was minimale achtergrondfluorescentie. B)Effect van celdichtheid bij breuk op de kwaliteit van geïsoleerde plasmamembranen. Coomassie bevlekte polyacrylamidegel (7%) van plasmamembraaneiwitmonsters (10 μg) en groene fluorescentiesignalen van Cdr1-mGFPHis van dezelfde gel vóór Coomassie-kleuring. M = Precisie Plus Eiwit Marker. Lanes 1, 3, 5 en 7 zijn plasmamembraaneiwitten van ADΔΔ en lanes 2, 4, 6 en 8 zijn plasmamembraaneiwitten van ADΔΔ-CDR1-mGFPHis geïsoleerd uit respectievelijk 20, 40, 60 en 80 ODU van cellen. Cdr1-mGFPHis wordt aangegeven met een rode pijl. De relatieve percentages van de groene fluorescerende signalen staan hieronder vermeld. (C) Effect van celdichtheid bij breuk op de opbrengst van geïsoleerde plasmamembranen en de ATPase-activiteit van Cdr1-mGFPHis. Aan de linkerkant, effect van de celdichtheid (ODU / 0,5 ml HB) op de hoeveelheid plasmamembraaneiwit geïsoleerd uit ADΔΔ en ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1) cellen. Rechts, effect van de celdichtheid op de Cdr1 ATPase-activiteit van de plasmamembranen geïsoleerd uit ADΔΔ-CDR1-mGFPHis-cellen. (D) Voorbeeldige SDS-PAGE van 10 μL aliquots van het oplosbaarheidsmengsel (T; 0,5 ml), de pellet na oplosbaarheid (P; 0,5 ml) en de opgeloste (supernatant) fracties (S; 0,5 ml) van detergent opgeloste ruwe plasmamembraaneiwitten van ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (boven) en in-gel fluorescentie van Cdr1-mGFPHis vóór Coomassie-kleuring van dezelfde gel (onder). M = brede MW voorgekleurde eiwitladder (245, 180, 135, 100, 75, 63 en 48 kDa banden; de 180 kDa en 75 kDa banden worden aangegeven met respectievelijk rode en groene pijlen). De rijstroken A tot L en N tot en met Q zijn de T-, S- en P-fracties voor respectievelijk DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OG (F), OG (G), LDAO (H), Hega (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-choline-13 (P) en SDS (Q). Afkortingen worden gedefinieerd in de tabel met materialen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Op basis van de screeningsresultaten van detergenten(figuur 3D)bleken DDM (B en C) en Fos-choline-13 (P) de beste detergentia te zijn voor de oplosbaarheid van Cdr1-mGFPHis. Het gebruik van Fos-choline-13 leek echter gedeeltelijke proteolyse van Cdr1-mGFPHis te veroorzaken (P in figuur 3D). LMNG (E), PCC-α-M (niet getoond) en mogelijk ook DM (A) waren de op een na beste wasmiddelen. Het wasmiddelscherm toonde ook aan dat glucosiden OGNG (F) en OG (G), CHAPS (L), NM (N) en Anzergents (niet getoond) slechte keuzes waren voor de oplosbaarheid van Cdr1-mGFPHis omdat significante hoeveelheden van het eiwit werden gevonden in de onoplosbare pelletfracties (figuur 3D). SDS denatureert Cdr1-XLmGFPHis, daarom zijn er geen groene fluorescentiesignalen zichtbaar in de Q-rijstroken(Figuur 3D).

De geschiktheid van een reinigingsmiddel voor de oplosbaarheid van goed gevouwen inheemse Cdr1-mGFPHis-deeltjes werd ook beoordeeld door FSEC van het detergent opgelost plasmamembraaneiwit (stap 6.4 supernatant). Voorbeelden van chromatogrammen verkregen voor 100 μL ruw plasmamembraaneiwit uit ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 mg/ml) opgelost met 1% detergent zijn weergegeven in figuur 4. De piek bij 9 ml elutievolume vertegenwoordigt meestal geaggregeerde Cdr1-mGFPHis die elueert in het leegtevolume, terwijl goed opgeloste en correct gevouwen Cdr1-mGFPHis-deeltjes worden weergegeven door de Gaussvormige piek bij 15,5 ml elutievolume. De brede schouder tussen 12 en 14 ml elutievolume bevat mogelijk minder goed gedefinieerde Cdr1-mGFPHis miceldeeltjes en/of duidt op partiële misvouwen of eiwitaggregaten. Chromatogrammen van maltosiden en LMNG geëxtraheerde eiwitten toonden het grootste deel van Cdr1-mGFPHis eluting als een mooi gevormde Gaussische piek bij 15,5 ml met een kleine schouder die iets eerder eluteerde bij 14 ml(figuur 4A). Deze monsters hadden geen Cdr1-mGFPHis eluting in het lege volume. Het blanco monster is de buffer plus DDM-besturing die geen mGFP-signaal gaf. De chromatogrammen in figuur 4B benadrukken het belang van het type suikerhoofdgroep voor de kwaliteit van het wasmiddel opgeloste Cdr1-mGFPHis-deeltjes. Glucosehoudende detergentia (OG, NG, OGNG) presteerden slechter dan sucrosebevattende detergentia (DDS), die op hun beurt slechter presteerden dan maltosebevattende detergentia (NM, DMNG, DDM). Cdr1-mGFPHis opgelost met glucose bevattende detergentia geëlueerd als een geaggregeerde (OG) of brede geaggregeerde piek (NG, OGNG), wat te verwachten was van het grote aandeel Cdr1-mGFPHis neerslag in de pelletfracties voor OGNG (F) en OG (G) waargenomen in figuur 3D. Hoewel het DMNG-chromatogram (groen; Figuur 4B) was kwalitatief vergelijkbaar met het DDM-chromatogram (blauw; Figuur 4B), de hogere pieken voor DDM geven aan dat een groot deel van DMNG opgeloste Cdr1-mGFPHis daadwerkelijk gedenatureerd kan zijn. Figuur 4C toont de FSEC-chromatogrammen voor de zwitterionische Fos-cholines (Fos-choline-8, Fos-choline-10, Fos-choline-13) en twee niet-ionische detergentia (digitonine, Triton-X100), en figuur 4D laat zien hoe het laden van twee keer zoveel (200 μL) wasmiddel opgelost eiwit geen merkbaar effect had op de kwaliteit van het chromatogram voor Fos-choline-8, -10 en -13 en DDM. Alleen digitonin (oranje; Figuur 4C) gaf een vergelijkbaar chromatogram als DDM (blauw; Figuur 4C) en hoewel Fos-choline-13 een symmetrische scherp gevormde piek gaf, eluteerde het opnieuw met een aanzienlijk lager elutievolume (14 ml) dan dat voor DDM (15,5 ml). Over het algemeen was er een duidelijke trend van betere oplosbaarheid door detergentia met langere alifatische zijketens van 12 of 13 koolstofresiduen; DDM > DM > NM (12, 10 of 9 koolstofatomen), Fos-choline-13 > respectievelijk 10 > 8 (13, 10 of 8 koolstofatomen) en LMNG > DMNG > OGNG (12, 10 of 8 koolstofatomen). Detergentia met hydrofobe staarten van minder dan 12 koolstofatomen waren dus veel minder geschikte detergentia voor oplosbaarheid van Cdr1-mGFPHis dan detergentia met langere hydrofobe staarten van 12 of 13 koolstofatomen, en niet-ionische detergentia (DDM, LMNG) leken over het algemeen geschikter voor oplosbaarheid van Cdr1-mGFPHis dan zwitterionische detergentia (Figuur 3D, Figuur 4).

Figure 4
Figuur 4: Detergent screening voor Cdr1-mGFPHis oplosbaarheid met behulp van FSEC. Chromatogrammen van 100 μL opgeloste ADΔΔ-CDR1-mGFPHis ruw plasmamembraan (2 mg/ml) met 1% van de detergentia geïndiceerd en gescheiden met behulp van een Superose 6-increase 10/300 GL grootte uitsluitingskolom. De chromatogrammen tonen de relatieve mGFP-fluorescentie-eenheden (FU) van één kolomvolume (CV; 25 ml) van de verzamelde elutiebuffer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ondanks recente vooruitgang in de structurele analyse van membraaneiwitten, is er momenteel geen 3D-structuur voor Cdr1 of een andere PDR-transporter beschikbaar. Het verkrijgen van kennis van de Cdr1-structuur en de biochemische kenmerken ervan is dus belangrijk, omdat dit niet alleen inzicht zal geven in het rationele ontwerp van nieuwe geneesmiddelen om efflux-gemedieerde medicijnresistentie te overwinnen, maar ook in het mechanisme van functie van een belangrijke subfamilie van ABC-eiwitten.

Een van de belangrijkste vereisten voor de structurele karakterisering van membraaneiwitten is de expressie van correct gevouwen en intact membraaneiwit in hoeveelheden die nodig zijn voor röntgenkristallografie of cryo-EM. Belangrijke criteria bij het selecteren van een expressiesysteem zijn gebruiksgemak, groeisnelheden en kosten, en ook het vermogen om eiwitten tot expressie te brengen met posttransla translationele modificaties die van cruciaal belang kunnen zijn voor de functie en/of stabiliteit van een eiwit61,62.

In de afgelopen twee decennia is een S. cerevisiae membraaneiwitexpressietechnologie60 geoptimaliseerd14 om het klonen in één stap van membraaneiwitten van belangte vergemakkelijken 24 getagd op hun N- of C-eindpunt met verschillende affiniteits-, epitoop- of reportertags en, indien gewenst, hun expressieniveaus voorspelbaar onderdrukt tot ergens tussen 50% tot zo laag als 0,1% van het maximale expressieniveau25. Dit veelzijdige plasmamembraaneiwitexpressieplatform stelt onderzoekers in staat om schimmeleffluxpompen tot in detail te karakteriseren. De ontwikkeling en optimalisatie van hele cel assays van pompfunctie maakte de succesvolle karakterisering van de substraatspecificiteit24 en de inhibitorgevoeligheid van een aantal belangrijke schimmel multidrug efflux pompen mogelijk, en ze werden gebruikt in high-throughput medicijnschermen om nieuwe42, 43,44te identificeren of bestaande 14, 33, 36, breedspectrum effluxpompremmers te bevestigen of om bestaande 14,33, 36,breedspectrum effluxpompremmers te ontwikkelen of om bestaande 14, 33, 36, breedspectrum effluxpompremmers te ontwikkelen of om bestaande14, 33,36,breedspectrum effluxpompremmers te ontwikkelen of om te ontwikkelen nieuwe effluxpompremmers specifiek voor Cdr141.

Hoewel het bestaande expressieplatform met succes is gebruikt om schimmel ABC-transporters uit te drukken uit een reeks schimmels, waaronder Basidomycota (C. neoformans Mdr1),14 filamenteuze schimmels zoals P. marneffei (Abc1)37 en vele Saccharomycotina-soorten (bijv. S. cerevisiae Pdr5, C. glabrata Cdr1 en Cdr2, C. utilis Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 en Abc12 en C. albicans Cdr1 en Cdr2), 14,24,32,36,39,60,63 er is minder succes geweest met het uitdrukken van hoge niveaus van goed gevouwen menselijke ABC-transporters64. Voorlopige resultaten geven aan dat dit te wijten is aan de specifieke lipideomgeving die deze transporters nodig hebben voor een goede expressie en functie in gist. Er zijn aanwijzingen dat dit ook kan gelden voor plant ABC-transporters, hoewel dit nog experimenteel moet worden bevestigd.

De belangrijkste redenen voor de aanzienlijk hogere Cdr1 ATPase-specifieke activiteiten (d.w.z. preparaten met minder vervuilende membranen) verkregen met het geoptimaliseerde kleinschalige plasmamembraanisolatieprotocol zijn tweeledig: i) de zachtere handmatige breuk van cellen in vergelijking met het gebruik van een kralenklopper voor plasmamembraanpreparaten op grotere schaal; en ii) het oogsten van cellen in de midlogfase, wat mogelijke mitochondriale besmetting als gevolg van glucoserepressie van mitochondriale enzymen vermindert. De afkoelingsperioden van 3 minuten tussen elk van de zes breukcycli konden worden verlengd zonder merkbaar effect op de kwaliteit van de plasmamembranen. Herhaalde vries-dooicycli moeten echter worden vermeden omdat de Cdr1 ATPase-activiteiten van de geïsoleerde plasmamembranen met ~ 10% verminderen bij elke extra vries-dooicyclus. Daarom wordt aanbevolen om de plasmamembraanmonsters in kleinere aliquots te splitsen om de behoefte aan meerdere vries-dooicycli te verminderen. De dubbele tag van mGFPHis verbetert de zuiveringsopbrengst en maakt een efficiënte wasmiddelscreening in één stap mogelijk. Door deze constructie te gebruiken, kunnen correcte lokalisatie, juiste vouwing / handel en thermostabiliteit gemakkelijk worden gedetecteerd; en de dubbele tag kan, indien nodig, worden verwijderd door splitsing met een in de handel verkrijgbaar protease, hoewel de 3 aminozuur-linker tussen het eiwit van belang en de tag mogelijk moet worden uitgebreid voor een efficiënte verwijdering van de tag.

De combinatie van verschillende kenmerken in deze protocollen, namelijk het gebruik van een DNA-polymerase dat speciaal is ontworpen voor de kolonie PCR-amplificatie van de 8 kb transformatiecassette; de geoptimaliseerde hoogrenderende gisttransformatiemethode; het vermogen om bevroren competente gistvoorraden te creëren; en het geoptimaliseerde kleinschalige plasmamembraanvoorbereidingsprotocol demonstreren de creatie van een geoptimaliseerd membraaneiwitexpressieplatform dat geschikt is voor het klonen, expressie en karakteriseren van schimmel ABC-effluxpompen met hoge doorvoer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen dankbaar de financiering van het Nieuw-Zeelandse Marsden Fund (Grant UOO1305) en een blokbeurs van de Faculteit geneeskunde, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). Ze willen de Universiteit van Otago bedanken voor het verstrekken van een PhD Scholarship aan G. Madani. De auteurs willen ook hun dank uitspreken aan professor Stefan Raunser en zijn collega's, dr. Amir Apelbaum en dr. Deivanayagabarathy Vinayagam, voor hun steun en supervisie tijdens een bezoek van 6 maanden aan G. Madani aan het Max Planck Instituut voor Moleculaire Fysiologie (MPIMP), Dortmund, Duitsland. De auteurs bedanken ook de Duitse Academische Uitwisselingsdienst (DAAD) voor het verstrekken van een onderzoeksbeurs (57381332) aan G. Madani om de MPIMP te bezoeken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Biologie Nummer 172
Kleinschalige plasmamembraanvoorbereiding voor de analyse van <em>Candida albicans</em> Cdr1-mGFPHis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter