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Biology

कैंडिडा एल्बिकान कमांडर 1-mGFPHis के विश्लेषण के लिए छोटे पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली तैयारी

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख कैंडिडा एल्बिकान एबीसी (एटीपी-बाइंडिंग कैसेट) प्रोटीन कमांडर 1 के लक्षण वर्णन के लिए एक छोटे पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली अलगाव प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो सैकरोमाइसेस सेरेविसिया में अधिक प्रसारित होता है। Cdr1 के बीच 16 अवशेष लिंकर के साथ एक प्रोटीज़-क्लीवेबल सी-टर्मिनल एमजीएफपीहिस डबल टैग और टैग को Cdr1 के शुद्धिकरण और डिटर्जेंट-स्क्रीनिंग की सुविधा के लिए डिज़ाइन किया गया था।

Abstract

एबीसी ट्रांसपोर्टरों के सफल जैव रासायनिक और जैव भौतिक लक्षण वर्णन विषमतापूर्ण अभिव्यक्ति प्रणाली की पसंद पर काफी निर्भर करता है। पिछले दो दशकों में, हमने एक खमीर झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति मंच विकसित किया है जिसका उपयोग कई महत्वपूर्ण फंगल झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए किया गया है। अभिव्यक्ति होस्ट सैकरोमाइसेस सेरेविसिया एडीडब्ल्यू को सात प्रमुख अंतर्जात एबीसी ट्रांसपोर्टरों में हटा दिया गया है और इसमें ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पीडीआर 1-3 शामिल है जिसमें एक लाभ-कार्य उत्परिवर्तन है जो जीनोमिक पीडीआर 5 लोकस में एकल प्रतियों के रूप में एकीकृत विषम झिल्ली प्रोटीन जीनस के संविलियन ओवरएक्सप्रेशन को सक्षम बनाता है। बहुमुखी प्लाज्मिड वैक्टर का निर्माण और एक-कदम क्लोनिंग रणनीतियों का अनुकूलन तेजी से और सटीक क्लोनिंग, म्यूटेनेसिस और विषम एबीसी ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति को सक्षम बनाता है। यहां, हम एक उपन्यास प्रोटीज़-क्लीवेबल एमजीएफपी के डबल टैग (यानी, मोनोमेरिक यीस्ट ने ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन yEGFP3 को छह-हिस्टिडीन आत्मीयता शुद्धिकरण टैग से जोड़ा) के विकास और उपयोग का वर्णन किया है जो ब्याज के प्रोटीन के साथ टैग के संभावित हस्तक्षेप से बचने और निकल-आत्मीयता reins के लिए उनके टैग की बाध्यकारी दक्षता को बढ़ाने के लिए डिज़ाइन किया गया था। झिल्ली प्रोटीन ओआरएफ (ओपन रीडिंग फ्रेम) के लिए एमजीएफपीहिस का संलयन पॉलीएक्रेलैमाइड जैल के निरीक्षण और एमजीएफपीहिस टैग को बनाए रखने वाले गिरावट उत्पादों का पता लगाने से प्रोटीन की आसान मात्राकरण को सक्षम बनाता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह सुविधा झिल्ली प्रोटीन घुलनशीलता के लिए डिटर्जेंट स्क्रीनिंग की सुविधा कैसे प्रदान करती है। सी-टर्मिनल टैग कैंडिडा एल्बिकान मल्टीड्रग एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर कमांडर1 के छोटे पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली की तैयारी के कुशल, तेज और विश्वसनीय अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह छोटे पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली अलगाव प्रोटोकॉल एक ही कार्य दिवस के भीतर उच्च गुणवत्ता वाले प्लाज्मा झिल्ली उत्पन्न करता है। प्लाज्मा झिल्ली तैयारी Cdr1 और Cdr1 उत्परिवर्ती वेरिएंट की एंजाइम गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

उनके मूल लिपिड वातावरण से अभिन्न झिल्ली प्रोटीन निकालने से उनकी संरचना और कार्य प्रभावित हो सकता है1,2,3,4. जैविक झिल्ली की जटिल लिपिड संरचना5 यह सुनिश्चित करती है कि गंभीर रूप से महत्वपूर्ण प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन6हो सकता है। लिपिड झिल्ली प्रोटीन की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखते हैं, इस प्रकार उन्हें अपने झिल्ली कंपार्टमेंट गंतव्य(7,8)में सही ढंग से कार्य करने में सक्षम बनाता है। इसलिए, झिल्ली प्रोटीन शुद्धिकरण में एक महत्वपूर्ण पहला कदम अपनी संरचना और/या समारोह को प्रभावित किए बिना अपने मूल वातावरण से प्रोटीन का निष्कर्षण है ।

झिल्ली प्रोटीन की संरचना को चिह्नित करने के लिए कई बाधाएं हैं, जिनमें से अधिकांश उनकी हाइड्रोफोबिक प्रकृति से संबंधित हैं, और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम)9,10, 11,12के लिए आवश्यक मात्रा में ठीक से मुड़ा हुआ और कार्यात्मक झिल्ली प्रोटीन व्यक्त करने की कठिनाइयां हैं। झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियां तीन प्रकार की होती हैं: समरूप9, विषम13,14,15और इन विट्रो अभिव्यक्ति प्रणाली16,17. अक्सर कम अभिव्यक्ति का स्तर, या निषेधात्मक लागत, कई अभिव्यक्ति प्रणालियों की झिल्ली प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए पसंदीदा विकल्प के रूप में केवल कुछ मेजबान छोड़ देते हैं । इनमें बैक्टीरियल होस्ट, एस्चेरिचिया कोलाई,यीस्ट एस सेर्विसिया और पिचिया पादरी,और एसएफ 9 कीट कोशिकाओं या स्तनधारी कोशिका लाइनों18जैसे उच्च यूकेरियोट्स शामिल हैं। सभी झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकियों के फायदे और नुकसान हैं; हालांकि, एस सेरेविसिया शायद झिल्ली प्रोटीन उत्पादन के लिए उपयुक्त सबसे अच्छा अध्ययन किया गया यूकेरियोटिक मॉडल जीव है। यह जेनेटिक इंजीनियरिंग, दवा की खोज, सिंथेटिक जीव विज्ञान, और यूकेरियोटिकझिल्ली प्रोटीन14, 19,20, 21में अनुप्रयोगों के साथ अत्यधिक बहुमुखीहै।

इस अध्ययन में, एक पेटेंट एस सेरेविसिया झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी21 का उपयोग किया गया था, जिसमें एस सेरेविसिया एडी14 और एडीएक्स22 पसंदीदा मेजबान(चित्रा 1 ए)के रूप में प्रमुख सी एल्बिकान मल्टीड्रग एफ्लक्स पंप सीडीआर 1 का अधिक प्रयोग और अध्ययन करने के लिए किया गया था। दोनों एस सेरेविसिया उपभेदों AD1-8uकेडेरिवेटिव हैं -23 कि या तो ura3 (ADΤ) या दोनों ura3 और his1 (AD 1) जीन URA3 या HIS1 जीनोमिक लोकी में अवांछित एकीकरण के माध्यम से उत्पन्न होने वाले किसी भी झूठी सकारात्मक uracil या histidine प्रोटोट्रोफ ट्रांसफॉर्मेंट को खत्म करने के लिए हटा दिया है। चित्रा 1 एमें दर्शाए गए 7 प्रमुख मल्टीड्रग एफ्लक्स पंप23को हटाने से एडी को सबसे अधिक ज़ेनोबायोटिक्स के प्रति अति संवेदनशीलबनाता है। लाभ-कार्य उत्परिवर्ती प्रतिलेखन कारक Pdr1-3 इस तरह के Cdr1 (चित्रा 1Aमें लाल अष्टकोण) के रूप में विषम झिल्ली प्रोटीन के संविलियन अतिउत्पादन का कारण बनता है विषाणु-ORF युक्त परिवर्तन कैसेट(चित्रा 1A)के एकीकरण के बाद जीनोमिक PDR5 लोकस (चित्रा 1Aमें नीली आयत) दो केसात पुनः संयोजन घटनाओं के माध्यम से । सी-मरणासन्न mGFPHis टैग प्रोटीन के उचित प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण कंफोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1A)द्वारा पुष्टि की जा सकती है, और उसके टैग का उपयोग टैग किए गए प्रोटीन के निकल-आत्मीयता शुद्धिकरण के लिए किया जा सकता है। पीएबीसी3-व्युत्पन्न प्लाज्मिड्स में कुछ फंगल एबीसी ट्रांसपोर्टर्स (जैसे, कैंडिडा क्रूसी एबीसी 1)की क्लोनिंग करना हालांकि संभव नहीं था क्योंकि सेल विषाक्तता के कारण उन्हें एस्चेरिचिया कोलाई में प्रचारित नहीं किया जा सकता था। इससे झिल्ली प्रोटीन14,24 के एक-चरण क्लोनिंग के विकास को प्रेरित कियागया,जो विभिन्न आत्मीयता, एपिटोप, या रिपोर्टर टैग के साथ सीधे एस सेरेविसिया एडी(चित्रा 1C)में टैग किया गया था। एस सेरेविसिया विभिन्न CDR1 म्यूटेंट को अधिकएक्सप्रेस करने वाले एडीएक्सप्रेस करने वाले एडीएक्सेस को पांच व्यक्तिगत पीसीआर टुकड़ों का उपयोग करके भी कुशलतापूर्वक इस तरह से बनाया जा सकता है जो 25 बीपी(चित्रा 1C)द्वारा ओवरलैप करते हैं। इस प्रोटोकॉल को नियोजित करते हुए, ब्याज के कई ओआरएफ का क्लोन, व्यक्त किया जा सकता है, और कम लागत पर और बहुत कम समय अवधि के भीतर उच्च दक्षता पर विशेषता हो सकती है। परिवर्तन दक्षता प्रत्येक अतिरिक्त पीसीआर टुकड़े के साथ केवल ~ 2 गुना कम कर देता है। 

यदि वांछित है, तो अभिव्यक्ति के स्तर को प्राइमर डिज़ाइन द्वारा आसानी से हेरफेर किया जा सकता है ताकि अभिव्यक्ति के स्तर को आमतौर पर उच्च, संविलियन अभिव्यक्ति स्तर25के 0.1%-50% के बीच कहीं भी ट्यून किया जा सके। अनुकूलित, मल्टीफंक्शनल, पीएबीसी314 डेरिवेटिव क्लोनिंग वेक्टर, पीएबीसी3-XLmGFPHis26 (चित्रा 1B)में एचआरवी-3सी प्रोटीज क्लीवेज साइट (एक्स; लेवफ्लाक| जीपी), एक प्रोटीज़ जो अक्सर इस्तेमाल किए जाने वाले तंबाकू विकेट वायरस (टीईवी) प्रोटीज27की तुलना में 4 डिग्री सेल्सियस पर बेहतर प्रदर्शन करता है। एल एक पांच अमीनो एसिड (GSGGS) लिंकर है, mGFP एक मोनोमेरिक उत्परिवर्ती (A206K)28,खमीर के29 संस्करण बढ़ाया हरी फ्लोरेसेंस प्रोटीन संस्करण yEGFP330है, और उसके एक तीन अमीनो एसिड लिंकर (GGS) छह histidine (HHHH) निकल-एफ़िनिटी प्रोटीन टैग शुद्धि के बाद है ।

इस अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी का दवा खोज और झिल्ली प्रोटीन के अध्ययन में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। एक कवक अजोल दवा लक्ष्य के लिए पहली संरचना, एस सेरेविसियाई एर्ग1131,इस तकनीक का उपयोग करके हल किया गया था। इसने सी एल्बिकन सीडीआर 132, 33,34के विस्तृत लक्षण वर्णन और भविष्य के किसी भी उच्च-संकल्प संरचना को सत्यापित करने के लिए सिस्टीन-क्रॉसलिंकिंग अध्ययनों के लिए उपयुक्त सिस्टीन-क्रॉसलिंकिंग अध्ययनों के लिए उपयुक्त सिस्टीन-कमी सीडीआर1 अणु35 के निर्माण को भी सक्षम बनाया। प्रमुख मानव कवक रोगजनकों से कई अन्य एबीसी ट्रांसपोर्टर (यानी, सी एल्बिकान, कैंडिडा ग्लेब्रेटा, कैंडिडा ऑरिस, कैंडिडा क्रुसी, कैंडिडा उपयोग, क्रिप्टोकोकस नियोफॉर्मन्स, एस्परगिलस फ्यूमिगेटस, पेनिसिलियम मार्नेफी, और फ्यूसरियम सोलानी प्रजाति परिसर) का भी इस अभिव्यक्ति24,36, 37,38,39का उपयोग करके विस्तार से अध्ययन किया गया है। इसने एस सेरेविसिया उपभेदों के एक पैनल की पीढ़ी को अधिक एक्सप्रेसिंग करने वाले एफफ्लक्स पंपों को सक्षम बनाया है जिनका उपयोग उच्च थ्रूपुट स्क्रीन में उपन्यास फ्लोरोसेंट एफ्फ्लक्स पंप सब्सट्रेट नील लाल40 और विशिष्ट 41 और व्यापक स्पेक्ट्रम14, 33,42,43,44 एफफ्लक्स पंप अवरोधकों की खोज करने के लिए किया गया है। इस प्रणाली के उपयोग ने क्लोर्जीलिन की खोज को अपनी तरह के पहले व्यापक स्पेक्ट्रम फंगल मल्टीड्रग एफ्लक्स पंप अवरोधक42के रूप में भी सक्षम बनाया।

झिल्ली प्रोटीन का पूर्ण घुलनशीलता और अंतर्जात लिपिड से रहित एक सजातीय झिल्ली प्रोटीन-मिसेल तैयारी का निर्माण, उच्च डिटर्जेंट सांद्रता45की आवश्यकता होती है। लेकिन दुर्भाग्य से, यह भी अक्सर झिल्लीप्रोटीन5, 8,45,46निष्क्रिय करता है। डिटर्जेंट मोनोमर के गुण और समाधान में उनके एकत्रीकरण हाइड्रोफोबिक पूंछ के भौतिक गुणों, एल्किल श्रृंखला की लंबाई और शाखाओं में बंटी, सुगंधित नाभिक या फ्लोरोएल्किल साइड चेन की उपस्थिति, या पॉलीऑक्सीथीन इकाइयों की संख्या से प्रभावित होते हैं। इस प्रकार, डिटर्जेंट स्क्रीनिंग झिल्ली प्रोटीन घुलनशीलता और शुद्धिकरण के लिए सबसे उपयुक्त डिटर्जेंट निर्धारित करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम है।

सी एल्बिकैन इम्यूनोसमझी व्यक्तियों का एक प्रमुख मानव फंगल रोगजनक है जो गंभीर, जीवन की धमकी देने वाले आक्रामक संक्रमण47का कारण बन सकता है, और यह अजोल एंटीफंगल दवाओं48, 49के लिए प्रतिरोधी बन सकता है। सी एल्बिकैन मल्टीड्रग प्रतिरोध के मुख्य तंत्रों में से एक Cdr150का अतिव्यवजन है, जो प्लाज्मा झिल्ली में स्थित एबीसीजी उपपरिवार के एक प्रकार II एटीपी-बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर51 है। पूर्ण आकार के फंगल एबीसीजी ट्रांसपोर्टर (जिसमें दो न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग डोमेन [एनबीडी] और दो ट्रांसमेम्ब्रान डोमेन [टीएमडी]) शामिल हैं, आमतौर पर प्लियोट्रोपिक ड्रग रेजिस्टेंस (पीडीआर) ट्रांसपोर्टर के रूप में जाने जाते हैं और उनके अद्वितीय उल्टे डोमेन टॉपोलॉजी [एनबीडी-टीएमडी]2की विशेषता है। पीडीआर ट्रांसपोर्टर केवल52 , 53और कवक54 पौधों में पाए जाते हैं । उनके महत्व के बावजूद, पीडीआर ट्रांसपोर्टरों के लिए कोई संरचना नहीं है, हालांकि मानव आधे आकार के एबीसीजी ट्रांसपोर्टरों के लिए संरचनाएं हाल ही में हल की गई हैं जिन्होंने Cdr133के लिए पहला अस्थायी मॉडल बनाने में मदद की। हालांकि, हमारे हालिया प्रयोगात्मक साक्ष्य से पता चलता है कि यह मॉडल संभवतः त्रुटिपूर्ण है क्योंकि फंगल पीडीआर ट्रांसपोर्टरों में विशिष्ट असममित एनबीडी हैं जिसके परिणामस्वरूप एक अद्वितीय परिवहन तंत्र में काफी संभवतः होता है। इसलिए, Cdr1 की एक उच्च-संकल्प संरचना उपन्यास एफ्लक्स पंप अवरोधकों के तर्कसंगत डिजाइन के लिए आवश्यक है जो एफ्लक्स-मध्यस्थता दवा प्रतिरोध को दूर करने में मदद कर सकता है, और इस महत्वपूर्ण एबीसी ट्रांसपोर्टर परिवार की कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए।

इस अध्ययन का उद्देश्य Cdr1 के लिए एक उच्च संकल्प संरचना प्राप्त करने के अंतिम उद्देश्य के साथ आनुवंशिक रूप से संशोधित एस सेरेविसिया अभिव्यक्ति मेजबान में Cdr1 की अभिव्यक्ति, घुलनशीलता और शुद्धिकरण के लिए विश्वसनीय प्रोटोकॉल विकसित करना था। इस प्रक्रिया के भाग के रूप में, एक प्रोटीज़-क्लीवेबल एमजीएफपीआई डबल टैग(चित्रा 1 बी)को 16-अवशेष लिंकर के साथ डिजाइन किया गया था, जो सी-टर्मिनस से टैग को अलग करता है, जिसने निकेल-एफ़िनिटी राल के लिए संलग्न 6x अपने आत्मीयता टैग के बाध्यकारी में सुधार किया और जीवित कोशिकाओं में और पूरी शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान Cdr1 अभिव्यक्ति के स्तर की निगरानी को सक्षम किया। छोटे पैमाने पर खमीर झिल्ली प्रोटीन तैयारी के लिए एक प्रजनन प्रोटोकॉल जिसमें लगभग 10% सी एल्बिकान सीडीआर 1 (जैसा कि एसडीएस-पेज के बाद कूमासी स्टेनिंग द्वारा अनुमानित) भी विकसित किया गया था, जिसका उपयोग Cdr1 के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. परिवर्तन सक्षम ADΤ और ADΤS कोशिकाओं के ताजा या जमे हुए शेयरों की तैयारी

  1. 2x वाईपीसीडी के 25 एमएल टीका [यानी, 2x YPD; 2% (w/v) खमीर निकालने, 2% (w/v) पेप्टोन, 4% (w/v) डेक्सट्रोस), ०.०७९% (w/v) सीएसएम (पूर्ण पूरक मिश्रण)] एक एकल खमीर कॉलोनी के साथ३५ माध्यम और 16 घंटे के लिए रात भर (o/n) 30 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए प्रति मिनट (rpm) ।
  2. 25 एमएल ओ/एन कल्चर के साथ 2x वाईपीसीडी मीडियम के 225 एमएल को टीका करें और 600 एनएम (ओडी 600) पर सेल ऑप्टिकल डेंसिटी की जांचकरें; ओडी600 आमतौर पर ~ 0.5-1.0 है।
    नोट: इस स्तर पर सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित परिवर्तन प्रयोग के लिए आवश्यक सभी सामग्री आसानी से उपलब्ध हैं।
  3. 200 आरपीएम पर मिलाते हुए एक और ~ 6-8 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बढ़ें जब तक कि सेल घनत्व ~6-8 के ओडी 600 तक न पहुंच जाए।
    नोट: निम्नलिखित कदम कमरे के तापमान (आरटी) पर किए जाते हैं जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है।
  4. 3 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा इन लॉगरिथम-चरण कोशिकाओं को काटा।
  5. कोशिकाओं को फिर से खर्च करें और उन्हें बाँझ डबल-डिस्टिल्ड पानी (डीडीएच 2 ओ;यानी, 200एमएल और फिर 20 एमएल) से धोएं।
  6. 3 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर कोशिकाओं को फसल।
  7. धीरे-धीरे (यानी, 30 मिनट के लिए हर मिनट जमे हुए सक्षम सेल (एफसीसी) समाधान के 30 बराबर एलिकोट जोड़ें) एफसीसी के एक्स एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें [5% (w/v) ग्लिसरोल, बर्फ पर 10% (v/v) डिमेथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ)) (जहां एक्स = ओडी600;उदाहरण के लिए, यदि ओडी600 = 6 6 6 6 एमएल में रिसिपेंड, या यदि ओडी600 = 3 3 3 एमएल में रिसिपेंड) ।
    नोट: सही एफसीसी संरचना परिवर्तन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है ।
  8. परिवर्तन से पहले 2 घंटे के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को रखें या आवश्यकता पड़ने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर अलीकोट स्टोर करें।
    नोट: ADΤ और ADDS कोशिकाओं ठंड के लिए बहुत संवेदनशील हैं। इस प्रकार, कोशिकाओं को धीरे-धीरे -80 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाना चाहिए: 50-600 माइक्रोल सेल एलिकोट्स वाली बर्फ-ठंडी माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों को प्लास्टिक स्टोरेज बॉक्स (आरटी) में रखें। बॉक्स को एक बड़े पॉलीस्टीरिन कंटेनर (आरटी) में रखें और कंटेनर को फिटिंग पॉलीस्टीरिन ढक्कन के साथ बंद करें। फिर, कंटेनर को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में डाल दें।
    सावधानी: सेल के अस्तित्व के लिए धीमी ठंड महत्वपूर्ण है।

2. CaCDR1-XLmGFPHis के साथ ADDD और AD.AD.AD.AD.A1 का परिवर्तन और कॉलोनी पीसीआर और डीएनए अनुक्रमण द्वारा सही ट्रांसफॉर्मेंट की पुष्टि

नोट: प्लाज्मिड pABC3-CDR1-mGFPHis पारंपरिक क्लोनिंग रणनीतियों का उपयोग कर बनाया गया था Lamping एट अल में विस्तार से वर्णित है, २०१०५५ और चित्रा 1Bमें सचित्र है । जंगली प्रकार सी एल्बिकन CDR1 एक पीएसीमैं के रूप में अलग किया गया था/नहीं मैं प्लाज्मिड pABC3-CaCDR1A-GFP14 से टुकड़ा और pABC3-XLmGFPHis26में क्लोन ।

  1. पीसीआर एक उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक और प्राइमर जोड़ी PDR5-प्रो/PDR5-ter३५ के साथ पूरे CDR1 परिवर्तन कैसेट बढ़ाना pABC3 के 1-10 एनजी का उपयोग कर-CaCDR1-XLmGFPHis एक डीएनए टेम्पलेट के रूप में या, वैकल्पिक रूप से, 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 1A,B)पर 10 यू प्रतिबंध एंजाइम एएससीI के साथ पूरा करने के लिए pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis के 2 माइक्रोग्राम को पचाएं।
    नोट: CDR1 परिवर्तन कैसेट(चित्रा 1A) PDR5 प्रमोटर-CaCDR1-mGFPHis-PGK1 टर्मिनेटर-URA3 चयन मार्कर-PDR5 डाउनस्ट्रीम क्षेत्र शामिल हैं ।
  2. एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस करें और जेल ~ 8 केबी ट्रांसफॉर्मेशन कैसेट निकालें।
    नोट: ~ 8 केबी CaCDR1 परिवर्तन कैसेट के जेल शुद्धिकरण किसी भी संभव अपाच्य प्लाज्मिड डीएनए को हटा देता है, जो गलत ट्रांसफॉर्मेंट का कारण बन सकता है, जिसमें रैखिक परिवर्तनकारी कैसेट के बजाय पूरे प्लाज्मिड होते हैं, जीनोमिक पीडीआर 5 लोकस में एकीकृत होते हैं।
  3. एक उबलते पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए सामन शुक्राणु वाहक डीएनए (2 मिलीग्राम/एमएल; 10 एमएम ट्रिस, 1 एमएम ईडीटीए; पीएच ७.५) की आवश्यक मात्रा को विकृत करें और बर्फ पर रखें । ढक्कन खोलने से बचने के लिए उबलते सामन शुक्राणु डीएनए के लिए स्क्रू-कैप्ड ट्यूब का उपयोग करें।
  4. परिवर्तन कैसेट (500-2000 एनजी) के 14 माइक्रोन के साथ विकृत सामन शुक्राणु डीएनए के 50 माइक्रोन मिलाएं और आगे के उपयोग तक बर्फ पर डीएनए मिश्रण के 64 माइक्रोन रखें।
    नोट: एक सकारात्मक परिवर्तन नियंत्रण(चित्रा 2B)के रूप में एक ई. कोलाई-खमीरशटल प्लाज्मिड (जैसे, pYES2) के 10 एनजी का उपयोग करें ।
  5. ताजा या जमे हुए सक्षम कोशिकाओं को 30 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 5 मिनट के लिए जल्दी से डिफ्रॉस्टेड करें और उन्हें 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में 50 माइक्रोल एलिकोट्स में विभाजित करें।
  6. अधिकतम गति (18,000 x ग्राम)पर माइक्रोफ्यूज में 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा फसल कोशिकाएं।
  7. सुपरनेट निकालें और सेल पेलेट को आरटी पर रखें।
  8. प्रत्येक परिवर्तन के लिए, बर्फ-ठंडे डीएनए मिश्रण के उपयुक्त 64 माइक्रोन के साथ, 50% (w/v) पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी 3350) और 1 एम लिथियम एसीटेट (LiAc) के 36 माइक्रोन के 266 माइक्रोन संयोजनों (आरटी) को मिलाएं।
  9. एक 50 μL सक्षम सेल गोली aliquot करने के लिए तुरंत उपयुक्त मिश्रण जोड़ें।
  10. खूंटी-LiAc-डीएनए मिश्रण के 360 μL में सेल गोली को अच्छी तरह से 30 एस के लिए भंवर से पुनर्व्यवस्थित करें।
  11. 1 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में सेल मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    नोट: ADΤ और AD ADS कोशिकाओं को 42 डिग्री सेल्सियस 35 की तुलना में30डिग्री सेल्सियस पर बेहतर बदलना.
  12. 10 एस के लिए 18,000 x ग्राम पर कोशिकाओं को फसल। सुपरनेट को त्यागें और सेल पेलेट को डीडीएच2ओ के 80 माइक्रोन में फिर से रीसस्ट करें।
  13. कोशिकाओं को सीएसएम-उरा आगर प्लेट35 [यानी, 0.67% (w/v) खमीर नाइट्रोजन बेस पर अमीनो एसिड के बिना फैलाएं, 0.077% (w/v) सीएसएम माइनस uracil, 2% (w/v) ग्लूकोज, और 2% (w/v) आगर] ।
  14. प्लेटों को 30 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों तक इनक्यूबेट करें जब तक कि उरासिल प्रोटोट्रोफ ट्रांसफॉर्मेंट स्पष्ट रूप से दिखाई न दें।
    नोट: लीनियर ~ 8 केबी CaCDR1 परिवर्तन कैसेट और ~ 4 x 104 μg pYES2 प्रति परिवर्तनकर्ताओं के प्रति μg प्रति ~ 100 ट्रांसफॉर्मेंट की अपेक्षा करें।
  15. पांच स्वतंत्र ट्रांसफॉर्मेंट चुनें और उन्हें एक ताजा सीएसएम-उरा प्लेट पर फैलाएं ताकि उरासिल प्रोटोट्रोफ ट्रांसफॉर्मेंट को गैर-परिवर्तित मेजबान कोशिकाओं के अवशेषों से अलग किया जा सके।
  16. YPG-agar प्लेटों पर ट्रांसफॉर्मेंट बढ़ रही द्वारा किसी भी संभावित खूबसूरत म्यूटेंट निकालें [1% (w/v) खमीर निकालने, 2% (w/v) पेप्टोन, 2% (v/v) ग्लिसरोल, और 2% (w/v) आगर](चित्रा 2 डी)।
    नोट: खूबसूरत म्यूटेंट में दोषपूर्ण माइटोकॉन्ड्रिया होता है और इस प्रकार, गैर-किण्वनीय कार्बन स्रोतों पर विकसित नहीं हो सकता है। वे एस सेरेविसिया56में काफी आम हैं। एस सेरेविसिया ADΤ और AD. विशेष रूप से खूबसूरत फेनोटाइप प्राप्त करने के लिए प्रवण हैं।
  17. खमीर कॉलोनी पीसीआर करें और कम से कम तीन स्वतंत्र ट्रांसफॉर्मेंट को सामान्य रूप से जीनोमिक पीडीआर 5 लोकस(चित्रा 1 सी)में एक विशिष्ट डीएनए पॉलीमरेज के साथ पूरे ~ 8 केबी सीएसीडीआर1 ट्रांसफॉर्मेशन कैसेट को बढ़ाना है जो अशुद्ध डीएनए टेम्पलेट स्रोतों से पीसीआर उत्पादों को बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जाता है की पुष्टि करें। प्राइमर्स के एक सेट का उपयोग करें जो एकीकरण साइट के ठीक बाहर बांधता है और डीएनए टेम्पलेट्स के रूप में एकल उपनिवेशों से प्राप्त सेल निलंबन (डीडीएच 2 ओ में) के1 माइक्रोनएलिकोट्स।
    नोट: यह विशेष डीएनए बहुलक मज़बूती से बरकरार खमीर कोशिकाओं से ~ 8 kb पीसीआर टुकड़े बढ़ाना । हालांकि, विश्वसनीय प्रवर्धन के लिए, 45 पीसीआर चक्रों की आवश्यकता होती है, और खमीर कोशिकाओं को डीडीएच2ओ में ओडी600 1-10 पर फिर से निलंबित किया जाना चाहिए।
  18. पीसीआर प्रतिक्रिया के 1 μL भाग के डीएनए एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा सही ~ 8 केबी पीसीआर प्रवर्धन उत्पाद की पुष्टि करें।
  19. उचित प्राइमर के साथ इलाज डीएनए नमूने के कुछ हिस्सों का उपयोग कर पूरे ORF अनुक्रमण से पहले निर्माता के निर्देशों के बाद एक एकल-कतरा डीएनए एक्सोन्यूलेस के एंजाइम मिश्रण और एक फॉस्फेटेस के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया के 10 μL भाग से अतिरिक्त प्रवर्धन प्राइमर निकालें ।

3. छोटे पैमाने पर खमीर प्लाज्मा झिल्ली अलगाव प्रोटोकॉल

  1. बढ़ती खमीर कोशिकाओं
    1. पूर्व संस्कृति वाईपीडी के 10 एमएल में एक खमीर कॉलोनी ~ 7-8 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम पर मिलाते हुए।
    2. 10 मिलीएल पूर्व संस्कृति के साथ वाईपीडी माध्यम के 40 मिलीएल टीका और 30 डिग्री सेल्सियस o/n (~ 16 घंटे) पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट 200 आरपीएम पर मिलाते हुए जब तक सेल घनत्व1-3 के एक OD 600 तक पहुंचता है।
  2. खमीर कोशिकाओं की कटाई
    1. क्रॉन 40 ओडी इकाइयां (ओडीयू; उदाहरण के लिए, 1 = 1 ओडीयू के ओडी600 पर 1 एमएल) लॉगरिथम-चरण कोशिकाओं की 4,200 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए।
    2. बर्फ ठंड बाँझ ddH 2 O (यानी, 40 मिलीएल और फिर1मिलीएल) के साथ दो बार कोशिकाओं को फिर से उठाया और धोएं; 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 4,200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा चरणों के बीच में फसल कोशिकाएं)।
    3. बर्फ ठंडे बाँझ ddH2O के 1 मिलील में गोली को फिर से खर्च करें और सेल निलंबन को प्री-कूल्ड (बर्फ पर) 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 3,300 x ग्राम पर फसल कोशिकाएं।
    5. सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
    6. 0.5 एमएल समरूप बफर [एचबी; 50 एमएम ट्रिस, 0.5 एमएम ईडीटीए, 20% (v/v) ग्लाइसरोल; पीएच 7.5] में सेल पेलेट को रीसुस्पेंड करें 1 एमएम फिनाइलमिथाइलसुलफोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) के साथ ताजा पूरक।
      नोट: हमेशा पीएमएसएफ को ताजा जोड़ें क्योंकि पीएमएसएफ पानी के संपर्क में आने पर जल्दी निष्क्रिय हो जाता है।
      सावधानी: पीएमएसएफ एक सेरीन प्रोटीज अवरोधक है, जो ऊतकों के लिए बेहद संक्षारक और विनाशकारी है। यह अपरिवर्तनीय आंख क्षति का कारण बन सकता है।
    7. सेल सस्पेंशन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या तुरंत इस्तेमाल करें।
  3. प्लाज्मा झिल्ली का अलगाव
    1. यदि जमे हुए हैं, तो कोशिकाओं को ~ 1 घंटे के लिए बर्फ पर डिफ्रॉस्ट करें।
    2. 1 मिली की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए 0.5 एमएल सेल सस्पेंशन में आइस-कोल्ड 0.5 मिमी व्यास सिलिका मोतियों को जोड़ें।
    3. बर्फ पर 3 मिनट शीतलन अवधि के साथ 1 मिनट के लिए अधिकतम मिलाते तीव्रता पर भंवर के 6 चक्रों के साथ कोशिकाओं को तोड़ें।
    4. एक गर्म स्केलपेल ब्लेड के साथ ट्यूब के तल पर एक पतला छेद बनाओ।
    5. टूटी हुई कोशिका को एक और बर्फ-ठंडे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में लगे ट्यूब के नीचे के माध्यम से 10 एस कम गति (~ 200 आरपीएम) स्पिन के साथ ले लीजिए।
      नोट: यह सुनिश्चित करता है कि सिलिका मोती मूल ट्यूब में रहते हैं।
    6. सेल मलबे, अटूट कोशिकाओं और नाभिक को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5,156 x ग्राम पर सेल समरूप होता है।
    7. एक बर्फ ठंड 1.5 मिलील माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सुपरनैंट के 450 माइक्रोनल को स्थानांतरित करें और ताजा पीएमएसएफ (1 mM) के साथ पूरक बर्फ-ठंडे एचबी का एक अतिरिक्त 1 मिलियन जोड़ें।
      नोट: यह कमजोर पड़ने कदम उच्च गुणवत्ता वाले प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन वसूली के लिए महत्वपूर्ण है ।
    8. 1 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 17,968 x ग्राम पर हार्वेस्ट प्लाज्मा झिल्ली और प्लाज्मा झिल्ली गोली को फिर से खर्च करें, दोहराने के पाइपिंग द्वारा, एचबी के 100 माइक्रोन में 1 m PM PMSF के साथ ताजा पूरक। एचबी के 100 माइक्रोन को जारी करने से पहले सेल पेलेट को 100 माइक्रोन पाइपट टिप के साथ हिलाकर उचित प्लाज्मा झिल्ली समरूपता के लिए सेल पेलेट को ढीला करें।
    9. प्लाज्मा झिल्ली तैयारी के प्रोटीन एकाग्रता को प्रोटीन परख किट के साथ मापें जो एजेंट और डिटर्जेंट को कम करने वाले बफ़र्स के साथ संगत है।
    10. प्लाज्मा झिल्ली को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर रखें।

4. सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज)

  1. पॉलीएक्रीलामाइड जैल तैयार करने के लिए उपकरण को इकट्ठा करें।
  2. दो अलग जैल (7% पॉलीएक्रिलेमाइड) के लिए, 40% एक्रिलैमाइड/बीआईएस-एक्रिलमाइड के 2.1 एमएल, 4x अलग बफर के 3 एमएल (1.5 एम ट्रिज़, मिलाएं 0.4% सोडियम डोडेसिल सल्फेट [एसडीएस] (डब्ल्यू/वी); पीएच 8.8), और डीडीएच 2 ओ के6.9एमएल में टेट्रामेथाइलेल्लीनडिमाइन (टेमेड) के 8 माइक्रोन और 10% अमोनियम अल्फेट (एपीएस) के 60 माइक्रोन जोड़ें ताकि एक्रिलमाइड का पॉलीकरण शुरू किया जा सके।
    सावधानी: एक्रिलैमाइड/बीआईएस-एक्रिलैमाइड बहुत विषाक्त है। यह त्वचा में जलन, परिधीय न्यूरोपैथी का कारण बनता है और एक कैंसरजन है। निगल लिया या साँस लेने पर TEMED हानिकारक है। एपीएस अगर निगल लिया जाता है तो हानिकारक है। इससे आंखों और त्वचा में गंभीर जलन होती है।
  3. इस मिश्रण के ~ 4-5 एमएल को इकट्ठे जेल उपकरण में डालें, ऊपर से ~ 2 सेमी तक।
  4. ध्यान से एक प्लैनर मेनिस्कस बनाने के लिए शीर्ष पर 0.1% एसडीएस के ~ 1-2 एमएल परत।
  5. पॉलीएक्रेलैमाइड को आरटी में ~ 60 मिनट के लिए सेट करने की अनुमति दें।
  6. 40% एक्रिलैमाइड/बीआईएस-एक्रिलैमाइड के 0.5 एमएल को मिलाकर दो जैल के लिए एक स्टैकिंग जेल मिश्रण तैयार करें, 4x स्टैकिंग बफर (0.5 एम ट्रिस, 0.4% एसडीएस (डब्ल्यू/वी); पीएच 6.8) और डीडीएच 2 ओ के 6.9 मिलीएल के 1 एमसीएल जोड़ें। TEMED के2माइक्रोन और 10% एपीएस के 30 माइक्रोल जोड़ें एक्रिडाइड का बहुलीकरण शुरू करने के लिए।
  7. पॉलीमराइज्ड अलग जेल से 0.1% एसडीएस लेयर निकालें और एसडीएस के निशान हटाने के लिए डीडीएच2ओ से कुल्ला करें।
  8. अलग जेल पर स्टैकिंग जेल मिश्रण डालो।
  9. स्टैकिंग जेल में एक कंघी रखें और कंघी के चारों ओर से किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।
  10. स्टैकिंग जेल को आरटी में ~ 60 मिनट के लिए सेट करने की अनुमति दें।
  11. कंघी निकालें और पानी के साथ जेल स्लॉट कुल्ला। जेल टैंक में जेल रखो और 1x चल बफर (24.8 mM Tris, 190 mm ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस) के साथ शीर्ष करने के लिए जेल टैंक भरें।
    नोट: आरटी में संग्रहित डीडीएच 2 ओ में 10x बफर स्टॉक (248 एमएम ट्रिस, 1.9 एम ग्लाइसिन, 1% एसडीएस (डब्ल्यू/वी) से1xरनिंग बफर तैयार करें।
  12. मिक्स 5-10 μL प्लाज्मा झिल्ली नमूने (यानी, 10-20 माइक्रोन प्रोटीन) 2x प्रोटीन लोडिंग डाई [120 m Tris-HCl (पीएच 6.8), 20% ग्लाइसरोल, 0.02% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 4% एसडीएस, 200 mM dithiothreitol (DTT) की बराबर मात्रा के साथ और तुरंत चल रहे बफर में डूबे व्यक्तिगत जेल स्लॉट में लोड।
    सावधानी: डीटीटी अगर निगल लिया हानिकारक है। इससे आंखों और त्वचा में गंभीर जलन होती है।
    नोट: 2x प्रोटीन लोडिंग डाई, एलिकोट और स्टोर का 10 एमएल स्टॉक -20 डिग्री सेल्सियस पर बनाएं। मिश्रित नमूनों को गर्म न करें लेकिन तुरंत उन्हें व्यक्तिगत जेल स्लॉट में लोड करें ताकि जीएफपी टैग विकृत न हो, और इन-जेल फ्लोरेसेंस संकेतों का पता लगाया जा सके।
  13. प्रोटीन आणविक वजन मार्कर (10-245 केडीए रेंज) को एक अलग स्लॉट में लोड करें ताकि व्यक्तिगत प्रोटीन टुकड़ों के आकार का अनुमान सक्षम हो सके।
  14. 200 वी पर जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस करें जब तक कि ब्लू लोडिंग डाई जेल के नीचे तक न पहुंच जाए (आमतौर पर 45-55 मिनट)।
  15. जेल इमेजिंग सिस्टम के साथ इन-जेल जीएफपी-फ्लोरेसेंस के लिए जेल की जांच करें (उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य क्रमशः 475-485 एनएम और 520 एनएम हैं)।
  16. इन-जेल फ्लोरेसेंस इमेजिंग के बाद, आर टी में 15 मिनट के लिए ~ 10-20 मिलीएल प्रोटीन जेल फिक्सिंग सॉल्यूशन (40% इथेनॉल, 10% एसिटिक एसिड) में जेल के कोमल आंदोलन द्वारा प्रोटीन को ठीक करें।
  17. डीएच2ओ के 10 एमएल के साथ 10 मिनट के लिए जेल को दो बार कुल्ला करें और आरटी में ~ 1 एच के लिए कोमल मिलाते हुए 10 एमएल कॉलोइडल कूमासी दाग समाधान में जेल रखकर प्रोटीन बैंड की कल्पना करें।
  18. प्रोटीन बैंड के बेहतर दृश्य के लिए, जेल इमेजिंग सिस्टम के साथ छवियों को रिकॉर्ड करने से पहले ~ 1 एच के लिए डीडीएच 2 ओ के ~20एमएल में एक या दो बार जेल को डी-दाग दें।

5. Cdr1 ATPase गतिविधियों का निर्धारण 57

  1. तनु प्लाज्मा झिल्ली के नमूने एचबी में >2.2 मिलीग्राम/एमएल से 1-2 मिलीग्राम/एमएल तक।
  2. एटीपैस परख कॉकटेल को बराबर करें (75 mM एमईएस-ट्रिज़, 75 एमएम पोटेशियम नाइट्रेट, 0.3 एमएम अमोनियम मोलिबडेट, 7.5 एमएम सोडियम एजाइड; पीएच 7.5) और एमजी-एटीपी (28.8 एमएम एटीपी डिसोडियम नमक, 28.8 एमएम एमजीसीएल2;पीएच 7.0) से 30 डिग्री सेल्सियस में 30 डिग्री सेल्सियस।
    सावधानी: सोडियम एजाइड अत्यधिक विषाक्त है।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी बफर स्टॉक और बोतलें फॉस्फेट मुक्त हैं; यानी, 1% (vol/vol) एचसीएल के साथ कांच के बर्तन धोएं और इसे डीडीएच2ओ के साथ कई बार कुल्ला । इसके अलावा, इसे अन्य कांच के बर्तनों से अलग रखें जिसमें कांच के बर्तन धोने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिटर्जेंट में आमतौर पर मौजूद फॉस्फेट के निशान होते हैं।
  3. 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में Cdr1-ATPase अवरोधक (ओलिगोमाइसिन के 20 माइक्रोन) के साथ या उसके बिना परख कॉकटेल के 90μL जोड़ें।
    नोट: परख त्रिपाल में किया जाता है।
  4. माइक्रोटिटर प्लेट के उपयुक्त कुओं में पृथक प्लाज्मा झिल्ली (~ 5-10 माइक्रोग्राम प्रोटीन) या फॉस्फेट मानकों (0-100 nmoles Pi) के 5 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: फॉस्फेट मानकों के दो अलग-अलग सेट के लिए पहला और आखिरी कॉलम रखें।
  5. अलग-अलग कुओं में मल्टी-चैनल पिपेट के साथ प्रीवार्म्ड 28.8 एमएम एमजी-एटीपी (6 एमएम अंतिम एकाग्रता) के 25 माइक्रोन जोड़कर परख शुरू करें और 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 6 एम सल्फ्यूरिक एसिड में 130 माइक्रोन डेवलपमेंट रिएजेंट (1.6% सोडियम एल-एस्कॉर्बेट, 1% एसडीएस, 12% अमोनियम मोलिब्डेट) जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करें।
    सावधानी: केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड पानी के साथ हिंसक प्रतिक्रिया करता है। यह संक्षारक है और त्वचा और फेफड़ों को नुकसान पहुंचा सकता है।
  7. 10 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  8. माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं का अवशोषण 750 एनएम पर माइक्रोटिटर प्लेट रीडर के साथ पढ़ें।
    नोट: नीले रंग के विकास के लिए समय इनक्यूबेशन 10 मिनट से चिपके हुए (यानी, एक कम फॉस्फोर-मोलिब्डेनम कॉम्प्लेक्स) परख सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि नीले रंग का विकास समय के साथ जारी है।
  9. ओलिगोमाइसिन की अनुपस्थिति में कुल एटपेस गतिविधि से ओलिगोमाइसिन की उपस्थिति में एटीपेस गतिविधि को घटाकर CDr1-विशिष्ट ATPase गतिविधि (यानी, ओलिगोमाइसिन-संवेदनशील ATPase गतिविधि) प्राप्त करें।

6. छोटे पैमाने पर डिटर्जेंट स्क्रीन

  1. प्लाज्मा झिल्ली तैयारी (यानी, 2.5 मिलीग्राम प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन) कोशिकाओं के साथ GTED-20 बफर [10 mM Tris, 0.5 m EDTA, 20% (w/v) ग्लिसरोल; पीएच 7.5; 1 एमएमएम पीएमएसएफ के साथ हौसले से पूरक] जिसमें 5 मिलीग्राम परीक्षण डिटर्जेंट होता है, 1% (w/v) डिटर्जेंट के साथ पूरक 0.5 mL की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए।
  2. मिश्रण को 2 घंटे के लिए 4-8 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं, एक रोटेशन डिवाइस के साथ।
  3. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 141,000 x ग्राम पर मिश्रण अपकेंद्रित्र।
  4. घुलनशील सामग्री वाले सुपरनेट को एक ताजा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. सभी डिटर्जेंट-अघुलनशील झिल्ली प्रोटीन निकालने के लिए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 2% (w/v) एसडीएस के साथ 0.5 एमएल जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस o/n पर इनक्यूबेट करें।
  6. एसडीएस-पेज द्वारा सुपरनैंट और घुलनशील पैलेटेड पैलेट की तुलना करें।
  7. कूमासी धुंधला होने से पहले इन-जेल जीएफपी-फ्लोरेसेंस के लिए जीएफपी-टैग किए गए प्रोटीन वाले फोटोग्राफ जैल और इमेजिंग सिस्टम के साथ अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा निर्धारित करते हैं।
  8. उपयुक्त डिटर्जेंट (एस) की पहचान करने के लिए फ्लोरेसेंस आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एफएसईसी)58 जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए घुलनशील झिल्ली प्रोटीन अंश का उपयोग करें।

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Representative Results

PYES2(चित्रा 2B)के साथ एस सेरेविसिया एडीएक्स (~ 4 x10 4 ट्रांसफॉर्मेंट/माइक्रोन) के परिवर्तन की एक उच्च आवृत्ति हासिल की गई थी। जैसा कि अपेक्षित था, नो डीएनए(यानी,डीडीएच 2 ओ केवल) नियंत्रण ने कोई ट्रांसफॉर्मेशन नहीं दिया, और रैखिक सीडीआर 1का 1 माइक्रोन -mGFPHis परिवर्तन कैसेट(चित्रा 1A)ने अनुकूलित एडीजे ट्रांसफॉर्मेशन प्रोटोकॉल के साथ ~ 50 ट्रांसफॉर्मेंट(चित्रा 2 सी)दिया। CDR1-mGFPHis ट्रांसफॉर्मेंट भी दोषपूर्ण माइटोकॉन्ड्रिया के साथ किसी भी संभावित खूबसूरत म्यूटेंट को खत्म करने के लिए एक गैर-किण्वनीय कार्बन स्रोत पर बढ़ने की क्षमता के लिए परीक्षण किया गया था। तीन (पीले घेरे; चित्रा 2D) परीक्षण किए गए 25 उरासिल-प्रोटोट्रोफ ट्रांसफॉर्मेंट वाईपीजी एगर प्लेटों पर नहीं बढ़ सके और आगे की जांच से त्याग दिए गए। नए बनाए गए तनाव ADΤΤ-CDR1-mGFPHis द्वारा व्यक्त Cdr1-mGFPHis ठीक से प्लाज्मा झिल्ली(चित्रा 1A)में स्थानीयकृत है और सीडीआर 1(चित्रा 3)के संरचनात्मक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए पर्याप्त स्तर पर व्यक्त किया गया था । डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में टैग से संभावित हस्तक्षेप को रोकने के लिए सीडीआर1-mGFPHis के निकल-आत्मीयता शुद्धिकरण के बाद अनुकूलित डबल टैग(चित्रा 1B)का डिजाइन भी mGFPHis डबल टैग को हटाने में सक्षम बनाता है। हालांकि, प्रारंभिक परिणामों से पता चला है कि Cdr1 और HRV-3C प्रोटीज क्लीवेज साइट के बीच 3 अमीनो एसिड लिंकर को तेजी से, अधिक प्रभावी, दरार प्राप्त करने के लिए विस्तारित करना पड़ सकता है। इसी तरह की टिप्पणियों को हाल ही में एन-मरणासन्न टैग किए गए न्यूक्लियोसाइड ट्रांसपोर्टर एस्चेरिचिया कोलाई एनयूपीसी के लिए सूचित किया गया था, जिसके लिए डिटर्जेंट (डीडीएम) के कुशल दरार के लिए मूल रूप से डिजाइन किए गए 3 अमीनो एसिड लिंकर के बजाय 15 की आवश्यकता थी, निकेल-ए आत्मीयता राल59से बंधे नुपसी। एचआरवी-3 सी क्लीवेज साइट का 5 अमीनो एसिड लिंकर सी-टर्मिनल ब्याज के संलग्न प्रोटीन के साथ mGFPHis डबल टैग के स्टेरिक हस्तक्षेप को रोकता है, जिसे हमने पहले सी उपयोग एबीसी ट्रांसपोर्टर Cdr139के लिए देखा है । YEGFP3-A206K उत्परिवर्तन उच्च प्रोटीन सांद्रता28पर कृत्रिम GFP-dimerization को रोकने के लिए बनाया गया था, और एमजीएफपी और उसके निकल-एफ़िनिटी टैग के बीच अतिरिक्त 3 अमीनो एसिड लिंकर निकल एफ़िनिटी राल (डेटा नहीं दिखाया) के लिए टैग प्रोटीन की बाध्यकारी दक्षता को अधिकतम करने के लिए अपने टैग के उचित सतह जोखिम सुनिश्चित करता है ।

Figure 1
चित्रा 1:फंगल प्लाज्मा झिल्ली ट्रांसपोर्टरों की कुशल क्लोनिंग और अभिव्यक्ति के लिए एक खमीर झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति मंच। (A) पीडीआर5 प्रमोटर (नीला), CDR1 (लाल) सी-टर्मिनली XLmGFPHis (ग्रीन), PGK1 टर्मिनेटर (नारंगी), URA3 चयन मार्कर (हल्के नीले) के साथ टैग शामिल एक परिवर्तन कैसेट, और PDR5 डाउनस्ट्रीम क्षेत्र (नीला) का एक टुकड़ा अभिव्यक्ति मेजबान एस को बदलने के लिए प्रयोग किया जाता है .cer जीनोमिक पीडीआर5 लोकस में एकीकरण द्वारा evisiae AD लाभ-कार्य उत्परिवर्ती ट्रांसक्रिप्शन कारक Pdr1-3 प्लाज्मा झिल्ली में Cdr1 (लाल अष्टकोण) के संविलियन अतिउत्पी का कारण बनता है (नीचे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि देखें)। (ख)प्लाज्मिड pABC3-XLmGFPHis, जिसका उपयोग पारंपरिक क्लोनिंग रणनीति में या पीसीआर टेम्पलेट के रूप में परिवर्तन कैसेट उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है । pABC3-GFP14 पर प्लाज्मिड pABC3-XLmGFPHis के सुधार प्लाज्मिड नक्शे के नीचे सूचीबद्ध हैं । (ग)एडीजेके के जीनोमिक पीडीआर5 लोकस में परिवर्तन कैसेट को एकीकृत करने के लिए एक वैकल्पिक अधिक कुशल वन-स्टेप क्लोनिंग रणनीति। एक ओआरएफ (लाल) को प्राइमर (तीर) का उपयोग करके पीसीआर परिलक्षित किया जा सकता है जो बाएं हाथ (नीला) के साथ ओवरलैप बनाता है; PDR5 प्रमोटर) और दाहिने हाथ (हरा; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 डाउनस्ट्रीम) टुकड़े । म्यूटेशन (काली रेखाएं) यदि आवश्यक हो तो प्राइमर डिजाइन द्वारा ओआरएफ में पेश किया जा सकता है। पीडीआर5 लोकस में सही एकीकरण को निर्देशित करने वाली मुताबिक़ पुनर्संयोजन घटनाओं को पार की गई धराशायी रेखाओं द्वारा इंगित किया जाता है। (घ)पूरे सेल परख है कि कवक मल्टीड्रग efflux पंपों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: CDR1के साथ ADΤ के परिवर्तन -mGFPHis परिवर्तन कैसेट और खूबसूरत ADΤΤ-CDR1-mGFPHis transformants के उन्मूलन। यूरासिल प्रोटोट्रोफ ट्रांसफॉर्मेंट को 3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सीएसएम-उरा प्लेटों पर परिवर्तित एडीके कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग करके चुना गया था। (A)निगेटिव कंट्रोल (डीएनए नहीं)। (ख)सकारात्मक नियंत्रण (pYES2 के 10 एनजी) । (C) CDR1-mGFPHis transformants (डीएनए के 1 माइक्रोन) । (घ)वाईपीजी एगर प्लेटों पर एक खूबसूरत फेनोटाइप के लिए ADΤ-CDR1-mGFPHis ट्रांसफॉर्मेंट का परीक्षण । खराब माइटोकॉन्ड्रिया के कारण वाईपीजी एगर प्लेटों पर विकसित नहीं हो सके खूबसूरत ट्रांसफॉर्मेंट पीले रंग में घेर लिए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीएफपी फ्लोरेसेंस Cdr1 अभिव्यक्ति के स्तर के लिए एक विश्वसनीय उपाय है क्योंकि Cdr1-mGFPHis (चरण 3.3.9) और इन-जेल फ्लोरेसेंस संकेतों(चित्रा 3 ए)की मात्रा के बीच एक रैखिक संबंध था। इस परियोजना में, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले छोटे पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली की तैयारी के तेजी से उत्पादन के लिए एक प्रजनन योग्य अनुकूलित कार्यप्रवाह विकसित किया गया था। उच्चतम Cdr1 ATPase गतिविधि (400 nmol/min/mg) दिखा लगभग 0.5 मिलीग्राम प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन(चित्रा 3C;बाएं ग्राफ) उत्पन्न करना संभव था; चित्रा 3C; सही ग्राफ) जब लॉगरिथम चरण के 40 ODU(1-3 के OD 600nm) कोशिकाओं (एचबी के 0.5 एमएल में पुनः निलंबित) एक ही मात्रा के साथ (यानी, 0.5 मिलीएल) सिलिका मोती और अधिकतम मिलाते हुए तीव्रता पर 1 मिनट के लिए भंवर के 6 चक्र बर्फ पर 3 मिनट ठंडा अवधि के बाद। टूटना चक्र की संख्या में और वृद्धि (चरण ३.३.३) अलग प्लाज्मा झिल्ली तैयारी की गुणवत्ता कम (Cdr1 ATPase गतिविधि १७० nmol/min/mg से ~६० nmol/min/mg; डेटा नहीं दिखाया गया है) । हालांकि वहां केवल एसडीएस में मामूली अंतर थे प्लाज्मा झिल्ली टूटे चक्र की उच्च संख्या के साथ टूटी हुई कोशिकाओं से अलग नमूनों के पृष्ठ प्रोटीन पैटर्न (डेटा नहीं दिखाया गया), यह संभावना है कि लगभग 3 गुना कम Cdr1 ATPase गतिविधियों के बाद 10 या अधिक टूटना चक्र या तो कारण था: मैं) ऊंचा तापमान के संपर्क के कारण Cdr1 के आंशिक विकृति; ii) पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन जैसे फॉस्फोरिलेशन या डीफोस्फोरिलेशन; या iii द्वारा) अन्य ऑर्गेनेल्स के झिल्ली अंशों के साथ अलग-अलग प्लाज्मा झिल्ली वेसिकल्स के क्रॉस-संदूषण में वृद्धि हुई। एचबी के 0.5 एमएल में कोशिकाओं के 40 ODU को तोड़कर प्लाज्मा झिल्ली की उच्चतम गुणवत्ता (यानी, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के प्रति 10 माइक्रोग्राम सबसे कमांडर 1) का परिणाम मिला; चित्रा 3B) उच्चतम Cdr1 ATPase गतिविधि के साथ(चित्रा 3C,सही ग्राफ) । उच्च (एचबी के 40 ODU/0.5 एमएल >) या कम (एचबी के 20 ODU/0.5 एमएल) सेल घनत्व ने अलग-थलग प्लाज्मा झिल्ली(चित्रा 3C, दाएंग्राफ) की एटीपीई गतिविधि को कम कर दिया, हालांकि, उनकी उपज बढ़ती कोशिका घनत्व(चित्रा 3C, बाएंग्राफ) के अनुपात में बढ़ी है। इस प्रकार, एचबी का 40 ओडू/05 एमएल प्लाज्मा झिल्ली की उच्चतम गुणवत्ता के अलगाव के लिए इष्टतम कोशिका घनत्व था। इसलिए, प्लाज्मा झिल्ली की तैयारी के छोटे पैमाने पर अलगाव के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करने से 2-3 गुना अधिक कमांडर 1 विशिष्ट एटीपेस गतिविधियां (~ 300 एनएमओएल/मिन/मिलीग्राम; चित्रा 3C; सही ग्राफ) Cdr1 विशिष्ट ATPase गतिविधियों है कि शुरू में प्राप्त किया गया (~ १०० nmol/min/mg; डेटा नहीं दिखाया गया) की तुलना में । ये ATPase गतिविधियां भी पहले से सूचित Cdr1 ATPase गतिविधियों (100-200 nmol/min/mg) कीतुलना में काफी अधिक थीं जो अधिक श्रम-गहन और समय लेने वाली बड़े पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली तैयारी प्रोटोकॉल14,41,60के साथ प्राप्त की गई थीं।

जैविक झिल्ली से झिल्ली प्रोटीन निकालने के लिए सबसे आम विधि डिटर्जेंट के साथ घुलनशीलता है। हालांकि, चुनौती एक उपयुक्त डिटर्जेंट खोजने के लिए है जिसका प्रोटीन स्थिरता और/या तह विशेषताओं पर सबसे कम हानिकारक प्रभाव पड़ता है । एमजीएफपी के साथ प्रोटीन लेबलिंग प्रोटीन निष्कर्षण के लिए सबसे अच्छा डिटर्जेंट (ओं) का चयन करने के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा है । कुल मिलाकर, विभिन्न गुणों के साथ सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध 31 डिटर्जेंट का परीक्षण एस सेरेविसिया एड-सीडीआर1-एमजीएफपीहिस कोशिकाओं के कच्चे प्लाज्मा झिल्ली से Cdr1 को घुलनशील करने की उनकी क्षमता के लिए किया गया था। 16 परीक्षण डिटर्जेंट (ए-क्यू) के प्रतिनिधि सेट के परिणाम चित्रा 3 डीमें दिखाए गए हैं। लेन टी, पी, और एस में डिटर्जेंट घुलनशीलता (चरण 6.2) और डिटर्जेंट अघुलनशील गोली (पी) के तुरंत बाद कुल (टी) प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के 10 माइक्रोन एलिकोट्स होते हैं; GTED-20 के 0.5 एमएल में घुलनशील o/n, 2% SDS; चरण 6.5) और डिटर्जेंट घुलनशील सुपरनेंट (एस; चरण 6.4) अंश 141,000 x ग्रामपर अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन द्वारा अलग होने के बाद। वांछित डिटर्जेंट को अपनी संरचना और/या कार्य में फेरबदल किए बिना यथासंभव Cdr1-mGFPHis के रूप में घुलनशील करना चाहिए । क्रूड प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन (5 मिलीग्राम/एमएल) 1% (w/v) डिटर्जेंट (टी) और घुलनशील (एस) और अघुलनशील (पी) अंशों के साथ 2 घंटे के लिए घुलनशील थे एसडीएस-पेज(चित्रा 3डी)और बाद में फ्लोरेसेंस-डिटेक्शन साइज-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (FSEC)५८ (चित्रा 4)द्वारा विश्लेषण किया गया । हमने निर्धारित किया है कि Cdr1 के कुशल घुलनशीलता के लिए 2:1 (w/w) के प्रोटीन अनुपात के लिए एक न्यूनतम डिटर्जेंट की आवश्यकता थी । वास्तव में, Cdr1-mGFPHis के घुलनशीलता के लिए आवश्यक इष्टतम डिटर्जेंट (डीडीएम) एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, डिटर्जेंट (एक्स सीएमसी) और डिटर्जेंट/झिल्ली प्रोटीन अनुपात (डब्ल्यू/डब्ल्यू) की महत्वपूर्ण मिकेल एकाग्रता की जांच की गई । डीडीएम के 10x या 80x सीएमसी की निश्चित सांद्रता का उपयोग करते समय Cdr1-mGFPHis की घुलनशीलता क्षमता में बड़े अंतर देखे गए। विभिन्न घुलनशीलता प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले कच्चे प्लाज्मा झिल्ली की मात्रा के आधार पर घुलनशीलता क्षमता 40% और 80% या 60% और 90% के बीच भिन्न होती है। हालांकि, ≥2 (w/w) के प्रोटीन अनुपात में डिटर्जेंट का चयन करने से cdr1-mGFPHis के >८५% के साथ पुन: आवश्यक रूप से अच्छे परिणाम दिए गए, चाहे प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की मात्रा का उपयोग किया जाए । तो, यदि सीडीआर1-एमजीएफपीहिस जैसे झिल्ली प्रोटीन के घुलनशीलीकरण के लिए केवल 1% या 2% (w/v) डिटर्जेंट चुनने के अधिक सामान्य दृष्टिकोण का उपयोग करना, डिटर्जेंट को 2 (w/w) से ऊपर प्रोटीन अनुपात में रखना महत्वपूर्ण है [यानी, प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन एकाग्रता को 5 मिलीग्राम/एमएल से नीचे रखें जब 1% (यानी, 10 मिलीग्राम/एमएल] डिटर्जेंट] का उपयोग करते समय ।

Figure 3
चित्रा 3:Cdr1-mGFP his अभिव्यक्ति के स्तर का मात्राकरण, एक छोटे पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली अलगाव प्रोटोकॉल और Cdr1-mGFPHis के लिए डिटर्जेंट स्क्रीन का अनुकूलन।(ए)Cdr1-mGFPHis के इन-जेल फ्लोरेसेंस के साथ क्वांटिफिकेशन; एक ही 0.7% पॉलीएक्रीलामाइड जेल की कूमासी दाग और इन-जेल फ्लोरेसेंस एसडीएस-पेज छवियां बाईं ओर दिखाई जाती हैं। लेन 1 से 6 0.75, 1.5, 3, 6, 12, और 24 μg AD.CDR1-mGFPHis प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के साथ भरी हुई थी। Cdr1-mGFPHis एक लाल तीर के साथ संकेत दिया है। एम = सटीक प्लस प्रोटीन मार्कर। एमजीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता (दाईं ओर दिखाया गया) पूरे एकाग्रता सीमा पर रैखिक थे और न्यूनतम पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस था। (ख)इक्का-दुक्का प्लाज्मा झिल्ली की गुणवत्ता पर टूटना पर कोशिका घनत्व का प्रभाव। कूमासी दाग पॉलीएक्रीलैमाइड जेल (7%) प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन नमूनों (10 माइक्रोग्राम) और Coomassie धुंधला से पहले एक ही जेल के Cdr1-mGFPHis के हरे फ्लोरेसेंस संकेतों । एम = सटीक प्लस प्रोटीन मार्कर। लेन 1, 3, 5, और 7 ADΤ के प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन हैं और 2, 4, 6, और 8 क्रमशः 20, 40, 60, और कोशिकाओं के 80 ODU से अलग ADΤ-CDR1-mGFPHis के प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन हैं। Cdr1-mGFPHis एक लाल तीर के साथ संकेत दिया है। हरे फ्लोरोसेंट संकेतों के सापेक्ष प्रतिशत नीचे सूचीबद्ध हैं। (ग)इक्का-दुक्का प्लाज्मा झिल्ली की उपज पर टूट-फूट पर कोशिका घनत्व का प्रभाव और Cdr1-mGFPHis की एटीपीई गतिविधि । बाईं ओर, एडीके और एडीके-सीडीआर1-एमजीएफपीहिस (सीडीआर1) कोशिकाओं से अलग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन की मात्रा पर सेल घनत्व (ODU/0.5 एमएल एचबी) का प्रभाव। दाईं ओर, AD.CDR1-mGFPHis कोशिकाओं से अलग प्लाज्मा झिल्ली की CDr1 ATPase गतिविधि पर कोशिका घनत्व का प्रभाव। (घ)घुलनशीलता मिश्रण (टी; 0.5 एमएल), घुलनीयकरण के बाद गोली के 10 μL aliquots के अनुकरणीय एसडीएस-पेज; 0.5 एमएल), और एक ही जेल (नीचे) के Coomassie दाग से पहले DDΤ-CDR1-mGFPHis (ऊपर) और Cdr1-mGFPHis के इन-जेल फ्लोरेसेंस के डिटर्जेंट घुलनशील कच्चे प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के घुलनशील (सुपरनेट) अंश (एस; 0.5 एमएल) । एम = ब्रॉड मेगावाट पूर्व दाग प्रोटीन सीढ़ी (२४५, १८०, १३५, १००, ७५, ६३, और ४८ केडीए बैंड; १८० केडीए और ७५ केडीए बैंड क्रमशः लाल और हरे तीर के साथ संकेत दिया जाता है । लेन ए से एल और एन टू क्यू टी, एस हैं, और डीएम (ए), β-डीडीएम (बी), α-डीडीएम (सी), टीडीएम (डी), एलएमएनजी (ई), ओजीएन (एफ), ओजी (जी), एलडीएओ (एच), हेगा के लिए पी अंश (I), मेगा (जे), ट्राइटन-X100 (K), चैप्स (एल), एनएम (एन), Tween80 (O), Fos-choline-13 (P) और एसडीएस (क्यू), क्रमशः । संक्षिप्त रूपों को सामग्री की तालिकामें परिभाषित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

डिटर्जेंट स्क्रीनिंग परिणामों(चित्रा 3 डी),डीडीएम (बी और सी) और फॉस-कोलीन-13 (पी) के आधार पर Cdr1-mGFPHis के घुलनशीलता के लिए सबसे अच्छा डिटर्जेंट दिखाई दिया । हालांकि, फोस-कोलीन-13 के उपयोग से Cdr1-mGFPHis (चित्रा 3 डीमें पी) के आंशिक प्रोटेओलिसिस का कारण लग रहा था। LMNG (ई), पीसीसी-α एम (नहीं दिखाया गया) और संभवतः भी डीएम (ए) अगले सबसे अच्छा डिटर्जेंट थे । डिटर्जेंट स्क्रीन से यह भी पता चला है कि ग्लूकोस्ड्स ओजीएनजीएन (एफ) और ओग (जी), चैप्स (एल), एनएम (एन), और एंजर्जेंट (नहीं दिखाए गए) Cdr1-mGFPHis के घुलनशीलता के लिए खराब विकल्प थे क्योंकि प्रोटीन की महत्वपूर्ण मात्रा अघुलनशील पेले अंशों(चित्रा 3 डी)में पाई गई थी। एसडीएस डेन्चर Cdr1-XLmGFPHis, यही वजह है कि क्यू लेन(चित्रा 3 डी)में कोई ग्रीन फ्लोरेसेंस सिग्नल दिखाई नहीं दे रहे हैं ।

ठीक से मुड़ा हुआ देशी Cdr1-mGFPHis कणों के घुलनशीलता के लिए एक डिटर्जेंट की उपयुक्तता भी डिटर्जेंट घुलनशील प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन (चरण 6.4 सुपरनैंट) के FSEC द्वारा मूल्यांकन किया गया था। एडीडब्ल्यू-सीडीआर1-एमजीएफपीहिस (2 मिलीग्राम/एमएल) से 100 माइक्रोन क्रूड प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के लिए प्राप्त क्रोमेटोग्राम के उदाहरण चित्रा 4में दिखाए गए हैं। 9 एमएल एल्यूशन वॉल्यूम पर चोटी ज्यादातर एकत्रित Cdr1-mGFPHis का प्रतिनिधित्व करती है जो शून्य मात्रा में है, जबकि ठीक से घुलनशील और सही ढंग से मुड़ा हुआ सीडीआर 1-mGFPHis कणों का प्रतिनिधित्व गॉसियन के आकार के शिखर द्वारा 15.5 एमएल एल्यूशन वॉल्यूम पर किया जाता है। 12 और 14 एमएल एल्यूशन वॉल्यूम के बीच व्यापक कंधे में संभवतः कम अच्छी तरह से परिभाषित Cdr1-mGFPHis micelle कणों और/या आंशिक गलत वर्ल्डिंग या प्रोटीन समुच्चय का संकेत मिलता है । माल्टोसाइड्स और एलएमएनजी निकाले गए प्रोटीन के क्रोमाटोग्राम ने 15.5 एमएल पर एक अच्छी तरह से आकार के गॉसियन चोटी के रूप में सीडीआर 1-mGFPHis eluting के अधिकांश दिखाया, जिसमें एक छोटे से कंधे 14 मिलीएल(चित्रा 4A)पर थोड़ा पहले eluting । इन नमूनों में शून्य मात्रा में कोई cdr1-mGFPHis eluting था । ब्लैंक सैंपल बफर प्लस डीडीएम कंट्रोल है जिसने कोई एमजीएफपी सिग्नल नहीं दिया । चित्रा 4बी में क्रोमेटोग्राम डिटर्जेंट घुलनशील कमांडर 1-mGFPHis कणों की गुणवत्ता के लिए चीनी हेडग्रुप के प्रकार के महत्व को उजागर करते हैं । डिटर्जेंट युक्त ग्लूकोज (ओग, एनजी, ओजीएन) डिटर्जेंट (डीडीएस) युक्त सुक्रोज से भी बदतर प्रदर्शन किया, जो बदले में डिटर्जेंट (एनएम, डीएमएनजी, डीडीएम) युक्त माल्टोज से भी बदतर प्रदर्शन करता है। Cdr1-mGFPHis एक एकत्रित (ओग) या व्यापक एकत्रित चोटी (एनजी, OGNG) के रूप में eluted डिटर्जेंट युक्त ग्लूकोज के साथ घुलनशील, जो Cdr1 के बड़े अनुपात से उंमीद की जानी थी-mGFPHis OGNG (एफ) और ओजी (जी) के लिए गोली अंश में उपजी चित्रित 3Dमें मनाया । हालांकि डीएमएनजी क्रोमटोग्राम (हरा; चित्रा 4B) गुणात्मक रूप से डीडीएम क्रोमाटोग्राम (नीला; चित्रा 4B),डीडीएम के लिए उच्च चोटियों से संकेत मिलता है कि DMNG घुलनशील Cdr1-mGFPHis का एक बड़ा हिस्सा वास्तव में विकृत किया जा सकता है । चित्रा 4C zwitterionic Fos-cholines के लिए FSEC क्रोमेटोग्राम से पता चलता है (Fos-choline-8, फोस-कोलीन-10, फोस-कोलीन-13) और दो गैर-आयनिक डिटर्जेंट (डिजियोनिन, ट्राइटन-X100), और चित्रा 4डी से पता चलता है कि कैसे लोड िंग दो बार (२०० माइक्रोन) डिटर्जेंट घुलनशील प्रोटीन का फोस-कोलीन-8,-10, और-13 और डीडीएम के लिए क्रोमाटोग्राम की गुणवत्ता पर कोई ध्यान देने योग्य प्रभाव नहीं पड़ा । केवल डिजिऑनिन (नारंगी; चित्रा 4C) डीडीएम को एक समान क्रोमेटोग्राम दिया (नीला; चित्रा 4C) और, हालांकि फोस-कोलीन-13 ने एक सममित तेज आकार की चोटी दी, लेकिन यह डीडीएम (15.5 एमएल) की तुलना में काफी कम एल्यूशन वॉल्यूम (14 एमएल) के साथ फिर से कम हो गया। कुल मिलाकर, 12 या 13 कार्बन अवशेषों की लंबी एलिफेटिक साइड-चेन के साथ डिटर्जेंट द्वारा बेहतर घुलनशीलता की स्पष्ट प्रवृत्ति थी; उदाहरण के लिए, डीएम > एनएम > डीडीएम (12, 10, या 9 कार्बन), फो-कोलीन-13 > 10 > 8 (13, 10, या 8 कार्बन), और एलएमएनजी > डीएमएनजी > ओजीएनजी (12, 10, या 8 कार्बन), क्रमशः। इस प्रकार, 12 से कम कार्बन की हाइड्रोफोबिक पूंछ वाले डिटर्जेंट 12 या 13 कार्बन की लंबी हाइड्रोफोबिक पूंछ वाले डिटर्जेंट की तुलना में Cdr1-mGFPHis के घुलनशीलीकरण के लिए बहुत कम उपयुक्त डिटर्जेंट थे, और गैर-आयनिक डिटर्जेंट (डीडीएम, एलएमएनजी) आम तौर पर zwitterionic डिटर्जेंट(चित्रा 3 डी, चित्रा 4)की तुलना में Cdr1-mGFPHis के घुलनशीलीकरण के लिए अधिक उपयुक्त लग रहा था ।

Figure 4
चित्रा 4:FSEC का उपयोग कर Cdr1-mGFPHis घुलनशीलता के लिए डिटर्जेंट स्क्रीनिंग । 100 माइक्रोन के क्रोमाटोग्राम घुलनशील एडी-सीडीआर1-एमजीएफपीहिस क्रूड प्लाज्मा झिल्ली (2 मिलीग्राम/एमएल) के साथ 1% डिटर्जेंट का संकेत दिया और एक सुपरोस 6-वृद्धि 10/300 जीएल आकार बहिष्कार कॉलम का उपयोग करके अलग किया गया। क्रोमेटोग्राम एकत्र एल्यूशन बफर के एक कॉलम वॉल्यूम (सीवी; 25 एमएल) के सापेक्ष एमजीएफपी फ्लोरेसेंस इकाइयों (फू) को दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक विश्लेषण में हाल ही में प्रगति के बावजूद, Cdr1, या किसी अन्य पीडीआर ट्रांसपोर्टर के लिए कोई 3 डी संरचना वर्तमान में उपलब्ध है। इसलिए, Cdr1 संरचना और इसकी जैव रासायनिक सुविधाओं का ज्ञान प्राप्त करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह न केवल एफ्लक्स-मध्यस्थता दवा प्रतिरोध को दूर करने के लिए उपन्यास दवाओं के तर्कसंगत डिजाइन में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा, बल्कि एबीसी प्रोटीन के एक महत्वपूर्ण उपपरिवार के कार्य के तंत्र में भी होगा।

झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए मुख्य आवश्यकताओं में से एक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या क्रायो-ईएम के लिए आवश्यक मात्रा में सही ढंग से मुड़ा हुआ और बरकरार झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति है। अभिव्यक्ति प्रणाली का चयन करते समय महत्वपूर्ण मानदंड उपयोग में आसानी, विकास दर और लागत, और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के साथ प्रोटीन व्यक्त करने की क्षमता भी है जो प्रोटीन61, 62के कार्य और/यास्थिरताके लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं।

पिछले दो दशकों में एक एस । सेरेविसिया झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी60 को अनुकूलित किया गया है14 ब्याज की झिल्ली प्रोटीन की एक कदम क्लोनिंग की सुविधा के लिए24 या तो उनके एन या सी-टर्मिनस पर विभिन्न आत्मीयता, epitope, या रिपोर्टर टैग के साथ टैग और, यदि वांछित, उनकी अभिव्यक्ति का स्तर जाहिर है ५०% के बीच कहीं भी के रूप में अधिकतम अभिव्यक्ति स्तर25के ०.१% के रूप में कम करने के लिए । यह बहुमुखी प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति मंच शोधकर्ताओं को काफी विस्तार से फंगल efflux पंपों की विशेषता के लिए सक्षम बनाता है । पंप फ़ंक्शन के पूरे सेल परख के विकास और अनुकूलन ने सब्सट्रेट विशिष्टता24 के सफल लक्षण वर्णन और कई प्रमुख फंगल मल्टीड्रग एफ्लक्स पंपों की अवरोधक संवेदनशीलता को सक्षम किया, और उन्हें उपन्यास42, 43, 44,या मौजूदा14,33,36,व्यापक स्पेक्ट्रम एफफ्लक्स पंप अवरोधकों की पहचान करने के लिए उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीन में नियोजित किया गया था। उपन्यास efflux पंप अवरोधक Cdr141के लिए विशिष्ट .

हालांकि मौजूदा अभिव्यक्ति मंच का उपयोग सफलतापूर्वक कवक की एक सरणी से फंगल एबीसी ट्रांसपोर्टरों को व्यक्त करने के लिए किया गया है, जिसमें बसीडोमायकोटा (सी) शामिलहै। नियोफॉर्मेमेंट्स एमडीआर1), 14 फिलामेंटस कवक जैसे पी मार्नेफेई (Abc1)37 और कई सैकरोमाइकोटिना प्रजातियां (उदाहरण के लिए, एस सेरेविसिया पीडीआर 5, सी ग्लैब्रेटा कमांडर1 और कमांडर2, सी सी सीडीआर1, सी क्रुसेई एबीसी1, एबीसी11 और एबीसी12 और सी एल्बिकन सीडी 14,24,32,36,39,60,63को कम सफलता मिली है जिसमें ठीक से मुड़ा हुआ मानव एबीसी ट्रांसपोर्टरों के उच्च स्तर को व्यक्त किया गया है । प्रारंभिक परिणामों से संकेत मिलता है कि यह विशिष्ट लिपिड वातावरण के कारण है कि इन ट्रांसपोर्टरों को खमीर में उचित अभिव्यक्ति और कार्य के लिए आवश्यकता होती है। संकेत है कि यह भी संयंत्र एबीसी ट्रांसपोर्टरों के लिए सच हो सकता है, हालांकि यह अभी तक प्रयोगात्मक पुष्टि की जानी है ।

अनुकूलित छोटे पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली अलगाव प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त काफी अधिक Cdr1 ATPase विशिष्ट गतिविधियों (यानी, कम दूषित झिल्ली के साथ तैयारी) के प्रमुख कारण दो गुना हैं: i) बड़े पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली की तैयारी के लिए एक मनका-डिब्बा का उपयोग करने की तुलना में कोशिकाओं के जेंटलर मैनुअल टूटना; और ii) मध्य-लॉग चरण में कोशिकाओं की कटाई, जो माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइमों के ग्लूकोज दमन के कारण संभावित माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण को कम करती है। छह टूटने चक्रों में से प्रत्येक के बीच 3 मिनट ठंडा अवधि प्लाज्मा झिल्ली की गुणवत्ता पर किसी भी ध्यान देने योग्य प्रभाव के बिना बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, फ्रीज-गल चक्र ों को दोहराएं, इससे बचा जा सकता है क्योंकि अलग-अलग प्लाज्मा झिल्ली की Cdr1 ATPase गतिविधियों को हर अतिरिक्त फ्रीज-गल चक्र के साथ ~ 10% तक कम कर दिया जाता है। यही कारण है कि प्लाज्मा झिल्ली के नमूनों को कई फ्रीज-गल चक्रों की आवश्यकता को कम करने के लिए प्लाज्मा झिल्ली के नमूनों को छोटे aliquots में विभाजित करने की सिफारिश की जाती है। MGFPHis डबल टैग शुद्धि उपज में सुधार और कुशल एक कदम डिटर्जेंट स्क्रीनिंग की अनुमति देता है । इस निर्माण का उपयोग करके, सही स्थानीयकरण, उचित तह/तस्करी और थर्मोस्थायता का आसानी से पता लगाया जा सकता है; और डबल टैग को हटाया जा सकता है, यदि आवश्यक हो, तो वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध प्रोटीज के साथ दरार से, हालांकि ब्याज के प्रोटीन और टैग के बीच 3 अमीनो एसिड-लिंकर को टैग को कुशल हटाने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

इन प्रोटोकॉल में कई विशेषताओं का संयोजन, अर्थात्, डीएनए पॉलीमरेज का उपयोग विशेष रूप से 8 केबी परिवर्तन कैसेट के कॉलोनी पीसीआर प्रवर्धन के लिए डिज़ाइन किया गया है; अनुकूलित उच्च दक्षता खमीर परिवर्तन विधि; जमे हुए सक्षम खमीर स्टॉक बनाने की क्षमता; और अनुकूलित छोटे पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली तैयारी प्रोटोकॉल एक अनुकूलित झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति मंच के निर्माण को प्रदर्शित करता है जो फंगल एबीसी एफ्लक्स पंपों के उच्च-थ्रूपुट क्लोनिंग, अभिव्यक्ति और लक्षण वर्णन के लिए उत्तरदायी है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों कृतज्ञता से ंयूजीलैंड Marsden कोष (अनुदान UOO1305) से धन स्वीकार करते हैं, और चिकित्सा संकाय, Chulalongkorn विश्वविद्यालय, बैंकॉक, थाईलैंड (एम Niimi) से एक ब्लॉक अनुदान । वे जी मदनी को पीएचडी स्कॉलरशिप प्रदान करने के लिए ओटागो विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहते हैं । लेखक प्रोफेसर स्टीफन रौनसेर और उनके सहयोगियों, डॉ अमीर एपेलबॉम और डॉ देविनागाबाराथी विनायकम के प्रति भी आभार व्यक्त करना चाहते हैं, जो जर्मनी के डॉर्टमुंड के मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट ऑफ मॉलिक्यूलर फिजियोलॉजी (एमपीआईएमपी) में जी मदनी की 6 महीने की यात्रा के दौरान उनके समर्थन और पर्यवेक्षण के लिए हैं । लेखकों को भी एक अनुसंधान अनुदान (57381332) के साथ जी मदनी प्रदान करने के लिए MPIMP यात्रा के लिए जर्मन अकादमिक विनिमय सेवा (DAAD) का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

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जीव विज्ञान अंक 172
<em>कैंडिडा एल्बिकान</em> कमांडर 1-mGFPHis के विश्लेषण के लिए छोटे पैमाने पर प्लाज्मा झिल्ली तैयारी
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Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

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