Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Småskala plasmamembranpreparat for analyse av Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Published: June 13, 2021 doi: 10.3791/62592
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1
1Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, 3School of Biological Sciences, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen presenterer en liten plasmamembranisolasjonsprotokoll for karakterisering av Candida albicans ABC (ATP-bindende kassett) protein Cdr1, overekspressert i Saccharomyces cerevisiae. En protease-cleavable C-terminal mGFPHis dobbel tag med en 16-resters linker mellom Cdr1 og taggen ble designet for å lette rensing og vaskemiddel-screening av Cdr1.

Abstract

Den vellykkede biokjemiske og biofysiske karakteriseringen av ABC-transportører avhenger sterkt av valget av det heterografiske uttrykkssystemet. I løpet av de siste to tiårene har vi utviklet en gjærmembranproteinuttrykksplattform som har blitt brukt til å studere mange viktige soppmembranproteiner. Uttrykksverten Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ slettes i syv store endogene ABC-transportører, og den inneholder transkripsjonsfaktoren Pdr1-3 med en gain-of-function mutasjon som muliggjør konstituerende overekspresjon av heterografiske membranproteingener stabilt integrert som enkeltkopier ved det genomiske PDR5-locus. Opprettelsen av allsidige plasmidvektorer og optimalisering av ett-trinns kloningsstrategier muliggjør rask og nøyaktig kloning, mutagenese og uttrykk for heterografiske ABC-transportører. Her beskriver vi utviklingen og bruken av et nytt protease-cleavable mGFPHis dobbel tag (dvs. den monomeriske gjæren forbedret grønt fluorescerende protein yEGFP3 smeltet sammen til en seks-histidin affinitet renselse tag) som ble designet for å unngå mulig interferens av taggen med proteinet av interesse og for å øke bindingseffektiviteten til Hans tag til nikkel-affinitets harpikser. Sammensmeltingen av mGFPHis til membranproteinet ORF (åpen leseramme) muliggjør enkel kvantifisering av proteinet ved inspeksjon av polyakrylamidgeler og påvisning av nedbrytningsprodukter som beholder mGFPHis-taggen. Vi demonstrerer hvordan denne funksjonen letter vaskemiddelscreening for membranprotein-solubilisering. En protokoll for effektiv, rask og pålitelig isolasjon av småskala plasmamembranpreparater av C-terminalt merket Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overekspressert i S. cerevisiae ADΔΔ, presenteres. Denne småskala plasmamembranisolasjonsprotokollen genererer plasmamembraner av høy kvalitet i løpet av en enkelt arbeidsdag. Plasmamembranpreparatene kan brukes til å bestemme enzymaktivitetene til Cdr1- og Cdr1 mutantvarianter.

Introduction

Utvinningen av integrerte membranproteiner fra deres opprinnelige lipidmiljø kan dramatisk påvirke deres struktur og funksjon1,2,3,4. Den komplekse lipidsammensetningen av biologiske membraner5 sikrer at kritisk viktige protein-lipidinteraksjoner kan forekomme6. Lipider opprettholder den strukturelle integriteten til membranproteiner, slik at de kan fungere riktig i membranrommets destinasjon (er)7,8. Derfor er et kritisk første skritt i membranproteinrensingen utvinningen av proteinet fra sitt opprinnelige miljø uten å påvirke strukturen og / eller funksjonen.

Det er mange hindringer for å karakterisere strukturen av membranproteiner, hvorav de fleste er relatert til deres hydrofobe natur, og vanskelighetene med å uttrykke riktig brettede og funksjonelle membranproteiner i mengdene som kreves for røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM)9,10,11,12. Det finnes tre typer membranproteinuttrykkssystemer: homolog9, heterolog13,14,15og in vitro expression-systemer16,17. De ofte lave uttrykksnivåene, eller de uoverkommelige kostnadene, for mange uttrykkssystemer etterlater bare noen få verter som det foretrukne alternativet for å produsere membranproteiner. De inkluderer bakteriell vert, Escherichia coli, gjærene S. cerevisiae og Pichia pastoris, og høyere eukaryoter som Sf9 insektceller eller pattedyrcellelinjer18. Alle membranproteinuttrykksteknologier har fordeler og ulemper; S. cerevisiae er imidlertid kanskje den best studerte eukaryote modellorganismen som er egnet for membranproteinproduksjon. Det er svært allsidig med anvendelser innen genteknologi, legemiddeloppdagelse, syntetisk biologi og uttrykk for eukaryote membranproteiner14,19,20,21.

I denne studien ble en patentert S. cerevisiae membranproteinuttrykksteknologi21 brukt, med S. cerevisiae ADΔ14 og ADΔΔ22 som foretrukne verter (Figur 1A), for å overekspressere og studere den store C. albicans multidrug efflux pumpe Cdr1. Både S. cerevisiae-stammene er derivater av AD1-8u- 23 som enten har ura3 (ADΔ) eller både ura3- og his1 (ADΔΔ)-genene slettet for å eliminere falske positive uracil- eller histidinprototrotransformanter som oppstår gjennom uønsket integrasjon ved URA3 eller HIS1 genomisk loci. Slettingen av de 7 store multidrug efflux-pumpene23, angitt i figur 1A, gjør ADΔΔ utsøkt følsom for de fleste xenobiotika. Mutanttranskripsjonsfaktoren Pdr1-3 medfører konstituerende overekspressering av heteroologe membranproteiner som Cdr1 (røde oktagoner i figur 1A) etter integrering av den heterologe-ORF-inneholdende transformasjonskassett (figur 1A) ved genomisk PDR5-locus (blått rektangel i figur 1A) via to homologe rekombinasjonshendelser. Riktig plasmamembran lokalisering av C-terminalt mGFPHis taggede proteiner kan bekreftes ved konfektmikroskopi (figur 1A), og Hans-koden kan brukes til nikkel-affinitetsrensing av det taggede proteinet. Kloning av noen sopp ABC transportører (f.eks. Candida krusei ABC1) i pABC3-avledede plasmider var imidlertid ikke mulig fordi de ikke kunne forplantes i Escherichia coli på grunn av celletoksisitet. Dette førte til utviklingen av ett-trinns kloning av membranproteiner14,24 merket på enten deres N- eller C-terminus med ulike affinitets-, epitop- eller reporterkoder direkte inn i S. cerevisiae ADΔΔ (Figur 1C). S. cerevisiae ADΔΔ-stammer som overtrykker ulike CDR1-mutanter, kan også opprettes effektivt på denne måten ved å bruke opptil fem individuelle PCR-fragmenter som overlapper med 25 bp (Figur 1C). Ved å bruke denne protokollen kan mange ORF-er av interesse klones, uttrykkes og karakteriseres til lave kostnader og ved høy effektivitet innen svært kort tid. Transformasjonseffektiviteten reduserer bare ~ 2 ganger med hvert ekstra PCR-fragment.

Hvis ønskelig, kan uttrykksnivåer også enkelt manipuleres av primer-design for å justere uttrykksnivåene forutsigbart ned til hvor som helst mellom 0,1% -50% av de vanligvis høye, konstitutive uttrykksnivåene25. Den optimaliserte, multifunksjonelle, pABC314 derivat kloning vektor, pABC3-XLmGFPHis26 (Figur 1B) inneholder en HRV-3C protease spalting området (X; LEVLFQ| gp), en protease som yter bedre ved 4 °C enn det ofte brukte tobakksetsypet (TEV) protease27. L er en fem aminosyre (GSGGS) linker, mGFP er en monomerisk mutant (A206K)28,29 versjon av gjær forbedret grønn-fluorescens protein variant yEGFP330, og Hans er en tre aminosyre linker (GGS) etterfulgt av seks-histidin (HHHHHH) nikkel-affinitet protein rensing tag.

Denne uttrykksteknologien har blitt brukt med hell i legemiddeloppdagelse og studiet av membranproteiner. Den første strukturen for et soppazol narkotika mål, S. cerevisiae Erg1131, ble løst ved hjelp av denne teknologien. Det aktiverte også detaljert karakterisering av C. albicans Cdr132,33,34 og opprettelsen av et cystein-mangelfull Cdr1-molekyl35 egnet for cystein-crosslinking-studier for å verifisere enhver fremtidig høyoppløselig struktur. Mange andre ABC-transportører fra store menneskelige sopppatogener (dvs. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei og Fusarium solani arts complex) har også blitt studert i detalj ved hjelp av denne uttrykksplattformen24,36,37,38,39. Dette har gjort det mulig for genereringen av et panel av S. cerevisiae stammer overekspresserende effluxpumper som har blitt brukt i skjermer med høy gjennomstrømning for å oppdage det nye fluorescerende effluxpumpeunderlaget Nilen rød40 og spesifikke41 og bredspektret14,33,42,43,44 efflux pumpehemmere. Bruken av dette systemet gjorde det også mulig å oppdage clorgyline som den første av sitt slag bredspektret sopp multidrug efflux pumpehemmer42.

Fullstendig solubilisering av membranproteiner og opprettelsen av en homogen membranprotein-micellepreparat blottet for endogene lipider, krever høye vaskemiddelkonsentrasjoner45. Men dessverre inaktiverer dette også ofte membranproteinet5,8,45,46. Egenskapene til vaskemiddelmonomerer og deres aggregering i løsning påvirkes av de fysiske egenskapene til den hydrofobe halen, lengden og forgreningen av alkylkjeden, tilstedeværelsen av en aromatisk kjerne eller fluoroalkyl sidekjede, eller antall polyoksyetylenenheter. Dermed er rengjøringsmiddelscreening et viktig første skritt for å bestemme det mest passende vaskemiddelet for membranprotein-solubilisering og rensing.

C. albicans er et stort menneskelig sopppatogen av immunkompromitterte individer som kan forårsake alvorlige, livstruende invasive infeksjoner47, og det kan bli motstandsdyktig mot azole antifungale legemidler48,49. En av hovedmekanismene for C. albicans multidrug motstand er overekspression av Cdr150, som er en type II ATP-bindende kassett (ABC) transportør51 av ABCG-underfamilien som ligger i plasmamembranen. Abcg-transportører i full størrelse (bestående av to nukleotidbindingsdomener [NBDs] og to transmembrane domener [TMDs]) er mer kjent som pleiotrope legemiddelresistens (PDR) transportører og er preget av deres unike inverterte domenetopologi [NBD-TMD]2. PDR transportører finnes bare i planter52,53 og sopp54. Til tross for deres betydning er det ingen strukturer for PDR-transportører, selv om strukturer for menneskelige halvstørrelse ABCG-transportører nylig har blitt løst som bidro til å skape den første tentative modellen for Cdr133. Våre nylige eksperimentelle bevis tyder imidlertid på at denne modellen er feil muligens fordi sopp PDR-transportører har karakteristiske asymmetriske NBD-er, noe som resulterer ganske muligens i en unik transportmekanisme. En høyoppløselig struktur av Cdr1 er derfor nødvendig for både den rasjonelle utformingen av nye effluxpumpehemmere som kan bidra til å overvinne efluxmediert legemiddelresistens, og for å gi innsikt i virkningsmekanismen til denne viktige ABC-transportørfamilien.

Målet med denne studien var å utvikle pålitelige protokoller for uttrykket, solubilisering og rensing av Cdr1 i den genetisk modifiserte S. cerevisiae uttrykksverten, med det endelige målet å oppnå en høyoppløselig struktur for Cdr1. Som en del av denne prosessen ble en protease-cleavable mGFPHis dobbel tag (Figur 1B) designet med en 16-resters linker som skiller taggen fra C-terminus av Cdr1, som forbedret bindingen av den vedlagte 6x Hans affinitetsmerke til nikkel-affinitetharpiksen og aktivert overvåking av Cdr1-uttrykksnivåer i levende celler og under hele renseprosessen. En reproduserbar protokoll for småskala gjærplasma proteinpreparater som inneholder ca 10% C. albicans Cdr1 (som estimert av Coomassie farging etter SDS-PAGE) ble også utviklet, som kunne brukes til biokjemisk karakterisering av Cdr1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tilberedning av friske eller frosne lagre av transformasjons kompetente ADΔ- og ADΔΔ-celler

  1. Inokuler 25 ml 2x YPCD [dvs. 2x YPD; 2% (w / v) gjærekstrakt, 2% (w / v) peptone, 4% (w / v) dextrose), 0,079 % (w / v) CSM (komplett tilskuddsblanding)]35 medium med en enkelt gjærkoloni og inkuberer over natten (o / n) i 16 timer ved 30 °C med risting ved 200 omdreininger per minutt (rpm).
  2. Inokkuler 225 ml 2x YPCD medium med 25 ml o/n-kulturen og kontroller celleoptisk tetthet ved 600 nm (OD600); OD600 er vanligvis ~0,5-1,0.
    MERK: På dette stadiet må du sørge for at alle materialer som kreves for følgende transformasjonseksperiment, er lett tilgjengelige.
  3. Vokse kulturen ved 30 °C i ytterligere ~ 6-8 timer med risting ved 200 o/min til celletettheten når en OD600 på ~ 6-8.
    MERK: Følgende trinn utføres ved romtemperatur (RT) med mindre annet er oppgitt.
  4. Høst disse logaritmiske fasecellene ved sentrifugering ved 3000 x g i 3 min.
  5. Resuspend cellene og vask dem to ganger med sterilt dobbeltdestillert vann (ddH2O; dvs. 200 ml og deretter 20 ml).
  6. Høst cellene på 3000 x g i 3 min.
  7. Sakte (dvs. tilsett 30 like aliquots av frossen kompetent celle (FCC) løsning hvert minutt i 30 min) resuspend cellepellet i X ml av FCC [5% (w / v) glyserol, 10% (v/v) dimetylsulfoksid (DMSO)] på is (hvor X = OD600; f.eks. hvis OD600 = 6 resuspend i 6 ml, eller hvis OD600 = 3 resuspend i 3 ml).
    MERK: Riktig FCC-sammensetning er avgjørende for at transformasjonen skal lykkes.
  8. Hold celler på is i 2 timer før transformasjon eller oppbevar aliquots ved -80 °C til det er nødvendig.
    MERK: ADΔ- og ADΔΔ-cellene er svært følsomme for frysing. Dermed må cellene avkjøles sakte til -80 °C: Plasser iskalde mikrosenterrør som inneholder 50-600 μL celle aliquots i en plastlagringsboks (RT). Plasser esken i en større polystyrenbeholder (RT) og lukk beholderen med et passende polystyrenlokk. Sett deretter beholderen i -80 °C fryseren.
    FORSIKTIG: Langsom frysing er avgjørende for celleoverlevelse.

2. Transformasjon av ADΔ og ADΔΔ med CaCDR1-XLmGFPHis og bekreftelse av korrekte transformanter ved koloni PCR og DNA-sekvensering

MERK: Plasmid pABC3-CDR1-mGFPHis ble opprettet ved hjelp av konvensjonelle kloningsstrategier beskrevet i detalj i Lamping et al., 201055 og er illustrert i figur 1B. Wild-type C. albicans CDR1 ble isolert som et PacI /NotI fragment fra plasmid pABC3-CaCDR1A-GFP14 og klonet i pABC3-XLmGFPHis26.

  1. PCR forsterker hele CDR1-transformasjonskassett med en dna-polymerase med høy kvalitet og primerpar PDR5-pro/PDR5-ter35 ved hjelp av 1-10 ng pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis som DNA-mal eller, Alternativt kan du fordøye 2 μg pABC3-CaCDR1-XLmGFPHis til ferdigstillelse med 10 U-begrensningsenzym AscI ved 37 °C (Figur 1A, B).
    MERK: CDR1-transformasjonskassett (figur 1A) består av PDR5-promotoren - CaCDR1-mGFPHis - PGK1 terminator - URA3 utvalgsmarkør - PDR5 nedstrøms region.
  2. Utfør agarose gel elektroforese og gel ekstrakt ~8 kb transformasjon kassetten.
    MERK: Gelrensing av ~8 kb CaCDR1-transformasjonskassett fjerner alle mulige ufordøyde plasmid-DNA, noe som kan føre til feil transformanter som har hele plasmidet, i stedet for den lineære transformasjonskassett, integrert ved den genomiske PDR5-locus.
  3. Denature den nødvendige mengden laks sperm carrier DNA (2 mg / ml; 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7,5) i 10 min i et kokende vannbad og hold på is. Bruk skrue kappede rør for kokende laks sperm DNA for å unngå åpning av lokket.
  4. Bland 50 μL denaturert laksesperm-DNA med 14 μL av transformasjonskassett (500-2000 ng) og hold 64 μL DNA-blanding på is inntil videre bruk.
    MERK: Bruk 10 ng av en E. coli-gjærfergeplasmid (f.eks. pYES2) som en positiv transformasjonskontroll (figur 2B).
  5. Resuspend friske eller frosne kompetente celler raskt tint i 5 min i et 30 °C vannbad og del dem i 50 μL aliquots i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  6. Høst celler ved sentrifugering i 1 min i en mikrofunksjon med maksimal hastighet (18 000 x g).
  7. Fjern supernatanten og hold cellepelleten på RT.
  8. For hver transformasjon blander du 296 μL kombinasjoner (RT) på 260 μL 50% (w/v) polyetylenglykol (PEG 3350) og 36 μL 1 M litiumacetat (LiAc), ved gjentatt pipettering, med passende 64 μL iskalde DNA-blandinger.
  9. Tilsett riktig blanding umiddelbart til en 50 μL kompetent cellepellet aliquot.
  10. Resuspend cellepellet i 360 μL PEG-LiAc-DNA-blanding ved grundig virveling i ca 30 s.
  11. Inkuber celleblandingen i et 30 °C vannbad i 1 time.
    MERK: ADΔ- og ADΔΔ-cellene forvandles bedre ved 30 °C enn ved 42 °C35.
  12. Høst cellene på 18.000 x g i 10 s. Kast supernatanten og resuspend cellepellet i 80 μL ddH2O.
  13. Spred cellene på en CSM-URA agarplate35 [dvs. 0,67% (w / v) gjær nitrogenbase uten aminosyrer, 0,077% (w / v) CSM minus uracil, 2% (w / v) glukose og 2% (w / v) agar].
  14. Inkuber platene i 2-3 dager ved 30 °C til uracil prototrophtransformasjonsmidler er godt synlige.
    MERK: Forvent ~100 transformanter per μg av den lineære ~8 kb CaCDR1 transformasjonskassett og ~4 x 104 transformanter per μg pYES2.
  15. Velg fem uavhengige transformanter og spre dem på en frisk CSM-URA-plate for å skille uracil prototroph transformanter fra rester av ikke-transformerte vertsceller.
  16. Fjern eventuelle petite mutanter ved å dyrke transformantene på YPG-agarplater [1% (w / v) gjærekstrakt, 2% (w / v) peptone, 2% (v / v) glyserol og 2% (w / v) agar] (Figur 2D).
    MERK: Petite mutanter har defekte mitokondrier og kan derfor ikke vokse på ikke-gjærbare karbonkilder. De er ganske vanlige i S. cerevisiae56. S. cerevisiae ADΔ og ADΔΔ er spesielt tilbøyelige til å skaffe seg petite fenotype.
  17. Utfør gjærkolonien PCR og bekreft at minst tre uavhengige transformanter er riktig integrert i den genomiske PDR5-locusen (figur 1C) ved å forsterke hele ~8 kb CaCDR1-transformasjonskassett med en spesifikk DNA-polymerase som er optimalisert for å forsterke PCR-produkter fra urene DNA-malkilder. Bruk et sett med primere som binder seg like utenfor integrasjonsstedet og 1 μL aliquots av cellesuspensjoner (i ddH2O) avledet fra enkeltkolonier som DNA-maler.
    MERK: Denne spesielle DNA-polymerasen forsterker pålitelig ~ 8 kb PCR-fragmenter fra intakte gjærceller. For pålitelig forsterkning er det imidlertid nødvendig med 45 PCR-sykluser, og gjærcellene må resuspenderes ved OD600 1-10 i ddH2O.
  18. Bekreft riktig ~8 kb PCR-forsterkningsprodukt ved DNA-agarose gelelektroforese av en 1 μL del av PCR-reaksjonen.
  19. Fjern overflødige forsterkningsprimere fra en 10 μL del av PCR-reaksjonen med en enzymblanding av en enkeltstrengs DNA-eksonuklease og en fosfatase i henhold til produsentens instruksjoner før du sekvenserer hele ORF ved hjelp av deler av den behandlede DNA-prøven med passende primere.

3. Småskala gjær plasmamembran isolasjonsprotokoll

  1. Voksende gjærceller
    1. Forkultur en enkelt gjærkoloni i 10 ml YPD ved 30 °C i ~7-8 timer med risting ved 200 o/min.
    2. Inokuler 40 ml YPD-medium med 10 ml forkultur og inkuber cellene ved 30 °C o/n (~16 h) med risting ved 200 o/min til celletettheten når en OD600 av 1-3.
  2. Høsting av gjærceller
    1. Høst 40 OD-enheter (ODU, for eksempel 1 ml ved en OD600 av 1 = 1 ODU) logaritmiske faseceller ved 4200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    2. Resuspend og vask celler to ganger med iskald steril ddH2O (dvs. 40 ml og deretter 1 ml; høst celler mellom trinnene ved sentrifugering ved 4200 x g i 5 min ved 4 °C).
    3. Resuspend pellet i 1 ml iskald steril ddH2O og overfør celleopphenget til et forhåndskjølt (på is) 1,5 ml mikrosenterrør.
    4. Høst celler ved 3300 x g i 3 min ved 4 °C.
    5. Aspirer supernatanten.
    6. Resuspend cellepellet i 0,5 ml homogeniseringsbuffer [HB; 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20% (v/v) glyserol; pH 7,5] ferskt supplert med 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF).
      MERK: Legg alltid PMSF friskt fordi PMSF aktiveres raskt ved eksponering for vann.
      FORSIKTIG: PMSF er en serin proteasehemmer, som er ekstremt korrosiv og ødeleggende for vev. Det kan forårsake irreversibel øyeskade.
    7. Oppbevar cellesuspensjonen ved -80 °C eller bruk den umiddelbart.
  3. Isolering av plasmamembraner
    1. Hvis de er frosset, tine cellene på is i ~ 1 time.
    2. Tilsett iskalde silikaperler med diameter på 0,5 ml for å nå et totalt volum på 1 ml.
    3. Bryt celler med 6 sykluser med virveling med maksimal risteintensitet i 1 min ispedd 3 min kjøleperioder på is.
    4. Lag et tynt hull på bunnen av røret med et oppvarmet skalpellblad.
    5. Samle den ødelagte cellen homogenat gjennom bunnen av røret montert i en annen iskald 1,5 ml mikrocentrifuge rør med en 10 s lav hastighet (~ 200 rpm) spinn.
      MERK: Dette sikrer at silikaperlene forblir i det originale røret.
    6. Sentrifuger cellen homogenat ved 5156 x g i 5 min ved 4 °C for å fjerne cellerester, ubrutte celler og kjerner.
    7. Overfør 450 μL supernatant til et iskaldt 1,5 ml mikrosenterrør og tilsett ytterligere 1 ml iskald HB supplert med fersk PMSF (1 mM).
      MERK: Dette fortynningstrinnet er avgjørende for proteingjenvinning av plasmamembran av høy kvalitet.
    8. Høst plasmamembraner ved 17 968 x g i 1 time ved 4 °C og resuspend plasmamembranpelleten, ved gjentatt pipettering, i 100 μL HB ferskt supplert med 1 mM PMSF. Løsne cellepellet for riktig plasmamembranhomogenisering ved å røre cellepellet med 100 μL pipettespissen før du slipper 100 μL HB og opp og ned pipettering.
    9. Mål proteinkonsentrasjonen av plasmamembranpreparatet med et proteinanalysesett som er kompatibelt med buffere som inneholder reduksjonsmiddel og vaskemiddel.
    10. Oppbevar plasmamembranene ved -80 °C eller hold dem på isen for umiddelbar bruk.

4. Natrium dodecyl sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE)

  1. Monter apparatet for tilberedning av polyakrylamidgeler.
  2. For to separerende geler (7 % polyakrylamid) blandes 2,1 ml 40 % akrylamid/bis-akrylamid, 3 ml 4x separasjonsbuffer (1,5 M Tris, 0,4 % natrium dodecylsulfat [SDS] (w/v); pH 8,8) og 6,9 ml ddH2O. Tilsett 8 μL tetrametyletylendiamin (TEMED) og 60 μL 10 % ammoniumpersulfat (APS) for å initiere polymerisering av akrylamid.
    FORSIKTIG: Akrylamid/bis-akrylamid er svært giftig. Det forårsaker hudirritasjon, perifer nevropati og er et kreftfremkallende middel. TEMED er skadelig ved svelging eller innånding. APS er skadelig ved svelging. Det forårsaker alvorlige øye- og hudirritasjoner.
  3. Hell ~ 4-5 ml av denne blandingen i det monterte gelapparatet, opptil ~ 2 cm fra toppen.
  4. Lag forsiktig ~ 1-2 ml 0,1% SDS på toppen for å lage en planar menisk.
  5. La polyakrylamidet stilles inn i ~60 min ved RT.
  6. Forbered en stablingsgelblanding for to geler ved å blande 0,5 ml 40% akrylamid / bis-akrylamid, 1 ml 4x stablingsbuffer (0,5 M Tris, 0,4 % SDS (w/v); pH 6,8) og 6,9 ml ddH2O. Tilsett 2 μL TEMED og 30 μL 10 % APS for å initiere polymerisering av akrylamid.
  7. Fjern 0,1% SDS-laget fra den polymeriserte separasjonsgelen og skyll med ddH2O for å fjerne spor av SDS.
  8. Hell stablingsgelblandingen på separasjonsgelen.
  9. Legg en kam i stablingsgelen og fjern eventuelle luftbobler fra rundt kammen.
  10. La stablingsgelen stilles inn i ~60 min ved RT.
  11. Fjern kammen og skyll gelsporene med vann. Sett gelen inn i geltanken og fyll geltanken til toppen med 1x løpebuffer (24,8 mM Tris, 190 mM glycin, 0,1% SDS).
    MERK: Klargjør 1x løpebuffer fra en bufferlager på 10x (248 mM Tris, 1,9 M glycin, 1 % SDS (w/v) i ddH2O) lagret ved RT.
  12. Bland 5-10 μL plasmamembranprøver (dvs. 10-20 μg protein) med like store mengder 2x proteinlastefargestoff [120 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20 % glyserol, 0,02 % bromofenolblå, 4 % SDS, 200 mM dithiothreitol (DTT)] og last umiddelbart inn i individuelle gelspor nedsenket i løpebufferen.
    FORSIKTIG: DTT er skadelig ved svelging. Det forårsaker alvorlige øye- og hudirritasjoner.
    MERK: Lag en 10 ml bestand av 2x proteinlastefargestoff, aliquot og oppbevar ved -20 °C. Ikke varm opp de blandede prøvene, men last dem umiddelbart inn i individuelle gelspor slik at GFP-taggen ikke denatureres, og fluorescenssignalene i gelen kan påvises.
  13. Last proteinmolekylære vektmarkører (10-245 kDa-område) i et eget spor for å muliggjøre størrelsesestimering av individuelle proteinfragmenter.
  14. Utfør gelelektroforese ved 200 V til det blå lastefargen når bunnen av gelen (vanligvis 45-55 min).
  15. Undersøk gelen for in-gel GFP-fluorescens med et gelavbildningssystem (henholdsvis eksitasjons- og utslippsbølgelengder er henholdsvis 475-485 nm og 520 nm).
  16. Etter fluorescensavbildning i gel, fest proteiner ved forsiktig agitasjon av gelen i ~ 10-20 ml Protein Gel Fixing Solution (40% etanol, 10% eddiksyre) i 15 min ved RT.
  17. Skyll gelen to ganger i 10 min med 10 ml ddH2O og visualiser proteinbånd ved å plassere gelen i 10 ml kolloidal Coomassie flekkløsning med skånsom risting i ~ 1 time ved RT.
  18. For forbedret visualisering av proteinbånd, flekk gelen en eller to ganger i ~ 20 ml ddH2O i ~ 1 time før du tar opp bilder med gelavbildningssystemet.

5. Bestemmelse av Cdr1 ATPase Aktiviteter 57

  1. Fortynn plasmamembranprøver >2,2 mg/ml til 1-2 mg/ml i HB.
  2. Likevekt på ATPase-analysecocktailen (75 mM MES-Tris, 75 mM kaliumnitrat, 0,3 mM ammoniummolybdate, 7,5 mM natriumazid; pH 7,5) og Mg-ATP (28,8 mM ATP disodiumsalt, 28,8 mM MgCl2; pH 7,0) til 30 °C i en 30 °C inkubator.
    FORSIKTIG: Natriumazid er svært giftig.
    MERK: Sørg for at alle bufferlagrer og flasker er fosfatfrie; Dvs. vask glass med 1% (vol / vol) HCl og skyll det flere ganger med ddH2O. Hold det også atskilt fra annet glass som sannsynligvis inneholder spor av fosfat som vanligvis finnes i vaskemidler som brukes til å vaske glass.
  3. Tilsett 90 μL analysecocktail med eller uten Cdr1-ATPase-hemmer (20 μM oligomycin) i individuelle brønner av en 96-brønns mikrotiterplate.
    MERK: Analysen utføres i triplikat.
  4. Tilsett 5 μL av de isolerte plasmamembranene (~5-10 μg protein) eller fosfatstandarder (0-100 nmoles Pi) i de aktuelle brønnene på mikrotiterplaten.
    MERK: Behold den første og siste kolonnen for to separate sett med fosfatstandarder.
  5. Start analysen ved å tilsette 25 μL forhåndsvarslet 28,8 mM Mg-ATP (6 mM endelig konsentrasjon) med en flerkanals pipette i individuelle brønner og inkubere ved 30 °C i 30 minutter.
  6. Stopp reaksjonen ved å tilsette 130 μL utviklingsreagens (1,6% natrium L-askorbat, 1% SDS, 12% ammoniummolybdate i 6 M svovelsyre).
    FORSIKTIG: Konsentrert svovelsyre reagerer voldsomt med vann. Det er etsende og kan forårsake hud- og lungeskader.
  7. Inkuber på RT i 10 min.
  8. Les absorbansen av mikrotiterplatens brønner på 750 nm med en mikrotiterplateleser.
    MERK: Å holde seg til 10 min inkubasjonstid for utvikling av blått fargestoff (dvs. et redusert fosfor-molybdenkompleks) er avgjørende for analysenøyaktighet fordi den blå fargestoffutviklingen fortsetter med tiden.
  9. Få den Cdr1-spesifikke ATPase-aktiviteten (dvs. den oligomycinfølsomme ATPase-aktiviteten) ved å trekke ATPase-aktiviteten i nærvær av oligomycin fra den totale ATPase-aktiviteten i fravær av oligomycin.

6. Liten skala vaskemiddel skjerm

  1. Kombiner plasmamembranpreparatene (dvs. 2,5 mg plasmamembranprotein) av celler som overekspresserer Cdr1-mGFPHis med GTED-20 buffer [10 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 20 % (w/v) glyserol; pH 7,5; fersk supplert med 1 mM PMSF] som inneholder 5 mg av testvaskemiddelet, for å nå et totalt volum på 0,5 ml supplert med 1 % (w/v) rengjøringsmiddel.
  2. Roter blandingen ved 4-8 °C i 2 timer, med en rotasjonsenhet.
  3. Sentrifuger blandingen ved 141 000 x g ved 4 °C i 1 time.
  4. Overfør supernatanten som inneholder solubilisert materiale til et friskt mikrosenterrør.
  5. Tilsett 0,5 ml GTED-20 buffer supplert med 2 % (w/v) SDS til den uoppløselige pelletsfraksjonen og inkuber ved 30 °C o/n i en ristende inkubator for å trekke ut alt vaskemiddelløselig membranprotein.
  6. Analyser og sammenlign de supernatante og solubiliserte pelletsfraksjonene med SDS-PAGE.
  7. Fotografigeler som inneholder GFP-merkede proteiner for in-gel GFP-fluorescens før Coomassie flekker og kvantifiserer uttrykksnivåer med bildesystemet.
  8. Bruk den løselige membranproteinfraksjonen for nedstrømsapplikasjoner som fluorescensstørrelse eksklusjonskromatografi (FSEC)58 for å identifisere egnede vaskemidler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En høy frekvens av transformasjon av S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformanter/μg) ble oppnådd med pYES2 (Figur 2B). Som forventet ga ikke DNA-kontrollen (dvs. bare ddH2O) noen transformanter, og 1 μg av den lineære CDR1-mGFPHis-transformasjonskassetten (figur 1A) ga ~ 50 transformanter (figur 2C) med den optimaliserte ADΔΔ-transformasjonsprotokollen. CDR1-mGFPHis transformanter ble også testet for deres evne til å vokse på en ikke-gjærbar karbonkilde for å eliminere eventuelle petite mutanter med defekte mitokondrier. Tre (gule sirkler; Figur 2D) av de 25 uracil-prototroph transformantene som ble testet, kunne ikke vokse på YPG-agarplater og ble kassert fra videre undersøkelser. Cdr1-mGFPHis uttrykt av den nyopprettede stammen ADΔΔ-CDR1-mGFPHis er riktig lokalisert i plasmamembranen (figur 1A) og ble uttrykt på tilstrekkelige nivåer for strukturell og funksjonell karakterisering av Cdr1 (figur 3). Utformingen av den optimaliserte dobbeltkoden (Figur 1B) gjør det også mulig å fjerne mGFPHis dobbel tag etter nikkel-affinitet rensing av Cdr1-mGFPHis for å forhindre mulig interferens fra taggen i nedstrøms applikasjoner. Foreløpige resultater har imidlertid vist at 3 aminosyrekoblingen mellom Cdr1 og HRV-3C protease spaltingsstedet kanskje må utvides for å oppnå raskere, mer effektiv spalting. Lignende observasjoner ble nylig rapportert for den N-terminalt merkede nukleosidetransportøren Escherichia coli NupC, som krevde en 15 i stedet for den opprinnelig designede 3 aminosyrekoblingen for effektiv spalting av vaskemiddelet (DDM) solubilisert NupC bundet til nikkel-affinitetharpiksen59. Den 5 aminosyre linker C-terminalen på HRV-3C spaltingsstedet forhindrer sterisk interferens av mGFPHis dobbel tag med det vedlagte proteinet av interesse, som vi tidligere har observert for C. bruk ABC transportør Cdr139. yEGFP3-A206K-mutasjonen ble opprettet for å forhindre kunstig GFP-dimerisering ved høye proteinkonsentrasjoner28, og den ekstra 3 aminosyrekoblingen mellom mGFP og His Nickel-affinitetstaggen sikrer riktig overflateeksponering av His-koden for å maksimere bindingseffektiviteten til det taggede proteinet til nikkel affinitetharpiksen (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: En gjærmembranproteinuttrykksplattform for effektiv kloning og uttrykk for soppplasmamembrantransportører. (A) En transformasjonskassett som består av PDR5-promotoren (blå), CDR1 (rød) C-terminalt merket med XLmGFPHis (grønn), PGK1-terminatoren (oransje), URA3-merkemarkøren (lyseblå) og en del av PDR5 nedstrømsområdet (blå) brukes til å transformere uttrykksverten S.cer evisiae ADΔΔ ved integrasjon ved genomisk PDR5 locus. Mutanttranskripsjonsfaktoren Pdr1-3 medfører konstituerende overekspresjon av Cdr1 (røde oktagoner) i plasmamembranen (se konfokalt mikroskopibilde under). (B) Plasmid pABC3-XLmGFPHis, som kan brukes i en tradisjonell kloningsstrategi eller som en PCR-mal for å generere en transformasjonskassett. Forbedringer av plasmid pABC3-XLmGFPHis over pABC3-GFP14 er oppført under plasmidkartet. (C) En alternativ mer effektiv ett-trinns kloning strategi for å integrere transformasjonskassett på genomisk PDR5 locus av ADΔΔ. En ORF (rød) kan pcr forsterkes ved hjelp av primere (piler) som skaper overlappinger med venstre arm (blå; PDR5 promotor) og høyre arm (grønn; XLmGFPHis-PGK1-URA3-PDR5 nedstrøms) fragmenter. Mutasjoner (svarte linjer) kan introduseres i ORF ved primer design om nødvendig. Homologe rekombinasjonshendelser som styrer riktig integrasjon ved PDR5-locus, indikeres av de kryssede stiplede linjene. (D) Hele celleanalyser som kan brukes til funksjonell karakterisering av sopp multidrug efflux pumper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Transformasjon av ADΔΔ med CDR1-mGFPHis-transformasjonskassett og eliminering av petite ADΔΔ-CDR1-mGFPHis transformanter. Uracil prototroph transformanter ble valgt ved å inkubere transformerte ADΔΔ-celler på CSM-URA-plater ved 30 °C i 3 dager. (A) Negativ kontroll (ingen DNA). (B) Positiv kontroll (10 ng pYES2). (C) CDR1-mGFPHis transformanter (1 μg DNA). (D) Testing ADΔΔ-CDR1-mGFPHis transformanter for en petite fenotype på YPG agarplater. Petite transformanter som ikke kunne vokse på YPG agarplater på grunn av defekte mitokondrier, er omkranset i gult. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

GFP-fluorescensen er et pålitelig mål for Cdr1-uttrykksnivåer, da det var en lineær sammenheng mellom mengden Cdr1-mGFPHis (trinn 3.3.9) og fluorescenssignaler i gel (figur 3A). I dette prosjektet ble en reproduserbar optimalisert arbeidsflyt utviklet for rask generering av høykvalitets småskala plasmamembranpreparater for biokjemisk karakterisering av plasmamembranproteiner. Det var mulig å generere nesten 0,5 mg plasmamembranprotein (Figur 3C; venstre graf) som viser den høyeste Cdr1 ATPase-aktiviteten ( ̃400 nmol / min / mg; Figur 3C; høyre graf) ved brudd på 40 ODU i logaritmisk fase (OD600nm av 1-3) celler (resuspendert i 0,5 ml HB) med samme volum (dvs. 0,5 ml) silikaperler og 6 sykluser med virveling i 1 min ved maksimal ristingsintensitet etterfulgt av 3 min kjøleperioder på is. Ytterligere økning i antall bruddsykluser (trinn 3.3.3) reduserte kvaliteten på det isolerte plasmamembranpreparatet (Cdr1 ATPase-aktiviteten falt fra 170 nmol/ min / mg til ~ 60 nmol / min / mg; data ikke vist). Selv om det bare var små forskjeller i SDS-PAGE-proteinmønstrene i plasmamembranprøvene isolert fra celler som var brutt med høyere antall bruddsykluser (data ikke vist), er det sannsynlig at den nesten 3 ganger reduserte Cdr1 ATPase-aktivitetene etter 10 eller flere bruddsykluser var forårsaket av enten: i) delvis denaturering av Cdr1 på grunn av eksponering for forhøyet temperatur; ii) post-translasjonelle modifikasjoner som fosforylering eller defosforylering; eller ved iii) økt krysskontaminering av de isolerte plasmamembran vesiklene med membranfraksjoner av andre organeller. Brudd på 40 ODU av celler i 0,5 ml HB ga den høyeste kvaliteten på plasmamembraner (dvs. den mest Cdr1 per 10 μg plasmamembranprotein; Figur 3B) med høyest Cdr1 ATPase-aktivitet (Figur 3C; høyre graf). Høyere (> 40 ODU/0,5 ml HB) eller lavere (20 ODU/0,5 ml HB) celletetthet reduserte ATPase-aktiviteten til de isolerte plasmamembranene (Figur 3C; høyre graf), men utbyttet økte i forhold til økende celletetthet (Figur 3C; venstre graf). Dermed var 40 ODU / 0,5 ml HB den optimale celletettheten for isolering av høyeste kvalitet på plasmamembraner. Så ved hjelp av den optimaliserte protokollen for småskala isolasjon av plasmamembranpreparater førte til 2-3 ganger høyere Cdr1-spesifikke ATPase-aktiviteter (~ 300 nmol / min / mg; Figur 3C; grafen) sammenlignet med Cdr1-spesifikke ATPase-aktiviteter som opprinnelig ble innhentet (~100 nmol/min/mg; data ikke vist). Disse ATPase-aktivitetene var også betydelig høyereenn noen tidligere rapporterte Cdr1 ATPase-aktiviteter (100-200 nmol/ min / mg) som hadde blitt oppnådd med en mer arbeidsintensiv og tidkrevende storskala plasmamembranforberedelsesprotokoll14,41,60.

Den vanligste metoden for å trekke ut membranproteiner fra biologiske membraner er solubilisering med vaskemiddel. Utfordringen er imidlertid å finne et egnet vaskemiddel som har minst skadelig effekt på proteinstabilitet og/eller foldeegenskaper. Merking av proteinet med mGFPHis gjør det enklere å screene for å velge de beste vaskemiddelene for proteinutvinning. Totalt ble 31 vaskemidler, oppført i materialtabellen, med ulike egenskaper testet for deres evne til å løse Cdr1 fra rå plasmamembraner av S. cerevisiae ADΔΔ-CDR1-mGFPHis celler. Resultatene for et representativt sett med 16 testvaskemidler (A-Q) er vist i figur 3D. Lanes T, P og S inneholder 10 μL aliquots av totalt (T) plasmamembranprotein umiddelbart etter løsemiddelløsning (trinn 6.2) og vaskemiddelløselig pellets (P; solubilisert o/n i 0,5 ml GTED-20, 2 % SDS; trinn 6,5) og vaskemiddelløselig supernatant (S; trinn 6,4) brøker etter separasjon ved ultracentrifugation ved 141 000 x g. Det ønskede vaskemiddelet skal løse så mye Cdr1-mGFPHis som mulig uten å endre strukturen og / eller funksjonen. De rå plasmamembranproteinene (5 mg/ml) ble solubilisert i 2 timer med 1 % (w/v) vaskemiddel (T) og aliquots av de løselige (S) og uløselige (P) fraksjonene ble analysert av SDS-PAGE (figur 3D) og senere også ved fluorescensdeteksjonsstørrelse-eksklusjonskromatografi (FSEC)58 (figur 4). Vi fant ut at et minimum vaskemiddel til proteinforhold på 2: 1 (w / w) var nødvendig for effektiv solubilisering av Cdr1. Faktisk, for å bestemme den optimale vaskemiddel (DDM) konsentrasjonen som kreves for oppløsning av Cdr1-mGFPHis, ble den kritiske micellekonsentrasjonen av vaskemiddelet (x CMC) og vaskemiddel / membranproteinforholdet (w / w) undersøkt. Store forskjeller i solubiliseringseffektiviteten til Cdr1-mGFPHis ble observert ved bruk av faste konsentrasjoner på 10x eller 80x CMC DDM. Solubiliseringseffektiviteten varierte mellom 40% og 80% eller 60% og 90% avhengig av mengdene av rå plasmamembraner som brukes i de ulike solubiliseringsforsøkene. Å velge vaskemiddel til proteinforhold på ≥2 (w/w) ga imidlertid reprodusert gode resultater med >85% av Cdr1-mGFPHis som ble solubilisert, uansett mengden plasmamembranprotein som brukes. Så hvis du bruker den vanligste tilnærmingen til å bare velge 1% eller 2% (w / v) vaskemiddel for å løse membranproteiner som Cdr1-mGFPHis, er det viktig å holde vaskemiddelet til proteinforholdet over 2 (w / w) [dvs. holde plasmamembranproteinkonsentrasjonen under 5 mg / ml når du bruker 1% (dvs. 10 mg / ml) vaskemiddel].

Figure 3
Figur 3: Kvantifisering av Cdr1-mGFPHis uttrykksnivåer, optimalisering av en liten plasmamembranisolasjonsprotokoll og vaskemiddelskjerm for Cdr1-mGFPHis. (A) Kvantifisering av Cdr1-mGFPHis med fluorescens i gel; Coomassie farget og in-gel fluorescens SDS-PAGE bilder av samme 0,7% polyakrylamid gel er vist til venstre. Baner 1 til 6 ble lastet med 0,75, 1,5, 3, 6, 12 og 24 μg ADΔΔ-CDR1-mGFPHis plasmamembranprotein. Cdr1-mGFPHis er indikert med en rød pil. M = Presisjon pluss proteinmarkør. MGFP-fluorescensintensitetene (vist til høyre) var lineære over hele konsentrasjonsområdet som ble testet, og det var minimal bakgrunnsfluorescens. (B) Effekt av celletetthet ved brudd på kvaliteten på isolerte plasmamembraner. Coomassie farget polyakrylamidgel (7%) av plasmamembranproteinprøver (10 μg) og grønne fluorescenssignaler fra Cdr1-mGFPHis av samme gel før Coomassie farging. M = Presisjon pluss proteinmarkør. Baner 1, 3, 5 og 7 er plasmamembranproteiner av ADΔΔ og baner 2, 4, 6 og 8 er plasmamembranproteiner av ADΔΔ-CDR1-mGFPHis isolert fra henholdsvis 20, 40, 60 og 80 ODU av celler. Cdr1-mGFPHis er indikert med en rød pil. De relative prosentandelene av de grønne fluorescerende signalene er oppført under. (C) Effekt av celletetthet ved brudd på utbyttet av isolerte plasmamembraner og ATPase-aktiviteten til Cdr1-mGFPHis. Til venstre, effekten av celletettheten (ODU/0,5 ml HB) på mengden plasmamembranprotein isolert fra ADΔΔ- og ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (Cdr1)-celler. Til høyre, effekten av celletettheten på Cdr1 ATPase-aktiviteten til plasmamembranene isolert fra ADΔΔ-CDR1-mGFPHis-celler. (D) Eksemplarisk SDS-PAGE på 10 μL aliquots av solubiliseringsblandingen (T; 0,5 ml), pelletsen etter solubilisering (P; 0,5 ml), og de solubiliserte (supernatante) fraksjonene (S; 0,5 ml) vaskemiddelløsedesoluserte råplasmamembranproteiner av ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (topp) og in-gel fluorescens av Cdr1-mGFPHis før Coomassie farging av samme gel (bunn). M = bred MW pre-farget protein stige (245, 180, 135, 100, 75, 63, og 48 kDa bånd; 180 kDa og 75 kDa bånd er indikert med henholdsvis røde og grønne piler). Lanes A til L og N til Q er T, S, og P-brøker for DM (A), β-DDM (B), α-DDM (C), TDM (D), LMNG (E), OGNG (F), OG (G), LDAO (H), Hega (I), Mega (J), Triton-X100 (K), CHAPS (L), NM (N), Tween80 (O), Fos-choline-13 (P) og SDS (Q). Forkortelser defineres i Materialfortegnelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Basert på resultater fra rengjøringsmiddelscreening (Figur 3D), DDM (B og C) og Fos-choline-13 (P) så ut til å være de beste vaskemidler for å løse Cdr1-mGFPHis. Imidlertid syntes bruken av Fos-choline-13 å forårsake delvis proteolyse av Cdr1-mGFPHis (P i figur 3D). LMNG (E), PCC-α-M (ikke vist) og muligens også DM (A) var de nest beste vaskemidler. Vaskemiddelskjermen viste også at glukosider OGNG (F) og OG (G), CHAPS (L), NM (N) og Anzergents (ikke vist) var dårlige valg for oppløselighet av Cdr1-mGFPHis da betydelige mengder protein ble funnet i de uoppløselige pelletsfraksjonene (Figur 3D). SDS denatures Cdr1-XLmGFPHis, som er grunnen til at ingen grønne fluorescenssignaler er synlige i Q-banene (Figur 3D).

Egnetheten til et vaskemiddel for solubilisering av riktig brettede innfødte Cdr1-mGFPHis-partikler ble også vurdert av FSEC av vaskemiddelets solubiliserte plasmamembranprotein (trinn 6.4 supernatant). Eksempler på kromatogrammer oppnådd for 100 μL råplasmamembranprotein fra ADΔΔ-CDR1-mGFPHis (2 mg/ml) solubilisert med 1% vaskemiddel er vist i figur 4. Toppen på 9 ml elutionvolum representerer for det meste aggregerte Cdr1-mGFPHis som elutes i det tomromsvolumet, mens riktig solubiliserte og riktig brettede Cdr1-mGFPHis-partikler er representert av den gaussiskformede toppen på 15,5 ml elutionvolum. Den brede skulderen mellom 12 og 14 ml elutionvolum inneholder muligens mindre veldefinerte Cdr1-mGFPHis micellepartikler og/eller indikerer delvis feilfolding eller proteinmengder. Kromatogrammer av maltosider og LMNG ekstraherte proteiner viste det meste av Cdr1-mGFPHis eluting som en pent formet gaussisk topp på 15,5 ml med en liten skulder som unngikk litt tidligere på 14 ml (Figur 4A). Disse prøvene hadde ingen Cdr1-mGFPHis som unngikk i det ugyldige volumet. Den tomme prøven er bufferen pluss DDM-kontrollen som ikke ga noe mGFP-signal. Kromatogrammene i figur 4B fremhever viktigheten av typen sukkerhodegruppe for kvaliteten på de solubiliserte Cdr1-mGFPHis-partiklene. Glukose som inneholder vaskemidler (OG, NG, OGNG) utført verre enn sukrose som inneholder vaskemidler (DDS), som igjen fungerte verre enn maltoseholdige vaskemidler (NM, DMNG, DDM). Cdr1-mGFPHis solubilized med glukose som inneholder vaskemidler eluted som en aggregert (OG) eller bred aggregert topp (NG, OGNG), som var å forvente fra den store andelen av Cdr1-mGFPHis bunnfall i pellet fraksjoner for OGNG (F) og OG (G) observert i figur 3D. Selv om DMNG-kromatogrammet (grønt; Figur 4B) var kvalitativt lik DDM-kromatogrammet (blått; Figur 4B), de høyere toppene for DDM indikerer at en stor del av DMNG solubilized Cdr1-mGFPHis faktisk kan denatureres. Figur 4C viser FSEC-kromatogrammer for de zwitterioniske Fos-cholines (Fos-choline-8, Fos-choline-10, Fos-choline-13) og to ikke-ioniske vaskemidler (digitonin, Triton-X100) og figur 4D viser hvordan lasting dobbelt så mye (200 μL) vaskemiddel solubilisert protein ikke hadde noen merkbar effekt på kvaliteten på kromatogrammet for Fos-choline-8, -10 og -13 og DDM. Bare digitonin (oransje; Figur 4C) ga et lignende kromatogram til DDM (blå; Figur 4C) og selv om Fos-choline-13 ga en symmetrisk skarpformet topp, unngikk den igjen med et betydelig lavere elutionvolum (14 ml) enn det for DDM (15,5 ml). Totalt sett var det en klar trend med bedre solubilisering av vaskemidler med lengre alifatiske sidekjeder på 12 eller 13 karbonrester; for eksempel DDM > DM > NM (12, 10 eller 9 karboner), Fos-choline-13 > 10 > 8 (13, 10 eller 8 karboner) og LMNG > DMNG > OGNG (henholdsvis 12, 10 eller 8 karboner). Dermed var vaskemidler med hydrofobe haler på mindre enn 12 karboner langt mindre egnede vaskemidler for solubilisering av Cdr1-mGFPHis enn vaskemidler med lengre hydrofobe haler på 12 eller 13 karboner, og ikke-ioniske vaskemidler (DDM, LMNG) virket generelt mer egnet for oppløselighet av Cdr1-mGFPHis enn zwitterionic vaskemidler (Figur 3D, Figur 4).

Figure 4
Figur 4: Rengjøringsmiddelscreening for Cdr1-mGFPHis-solubilisering ved hjelp av FSEC. Kromatogrammer av 100 μL solubilisert ADΔΔ-CDR1-mGFPHis rå plasmamembran (2 mg /ml) med 1% av vaskemidler indikert og separert ved hjelp av en Superose 6-økning 10/300 GL størrelse ekskluderingskolonne. Kromatogrammene skildrer de relative mGFP-fluorescensenhetene (FU) av ett kolonnevolum (CV; 25 ml) samlet elutionbuffer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til tross for nylig fremgang i strukturanalysen av membranproteiner, er ingen 3D-struktur for Cdr1, eller noen annen PDR-transportør, for tiden tilgjengelig. Så å få kunnskap om Cdr1-strukturen og dens biokjemiske egenskaper er viktig, da dette ikke bare vil gi innsikt i rasjonell design av nye stoffer for å overvinne efluxmediert legemiddelresistens, men også inn i mekanismen for funksjon av en viktig underfamilie av ABC-proteiner.

Et av hovedkravene til strukturell karakterisering av membranproteiner er uttrykket av riktig brettet og intakt membranprotein i mengder som kreves for røntgenkrystallografi eller kryo-EM. Viktige kriterier når du velger et uttrykkssystem er brukervennlighet, vekstrater og kostnader, og også evnen til å uttrykke proteiner med post-translasjonelle modifikasjoner som kan være avgjørende for funksjonen og / eller stabiliteten til et protein61,62.

I løpet av de siste to tiårene har en S. cerevisiae membranproteinuttrykksteknologi60 blitt optimalisert14 for å lette ett-trinns kloning av membranproteiner av interesse24 merket på enten deres N- eller C-terminus med forskjellige affinitets-, epitop- eller reporterkoder, og om ønskelig, deres uttrykksnivåer forutsigbart undertrykt til hvor som helst mellom 50% til så lavt som 0,1% av det maksimale uttrykksnivået25. Denne allsidige plasmamembranproteinuttrykksplattformen gjør det mulig for forskere å karakterisere sopputløpspumper i detalj. Utviklingen og optimaliseringen av hele celleanalyser av pumpefunksjon gjorde det mulig å karakterisere substratets spesifisitet24 og inhibitorfølsomheten til en rekke store sopp multidrug effluxpumper, og de ble brukt i høygjennomstrømningsskjermer for å identifisere nye42,43,44, eller bekrefte eksisterende 14 , 33 , 36 , bredspektret eluxpumpehemmere eller for å utvikle eksisterende14,33,36, bredspektret eluxpumpehemmere eller for å utvikle nye efflukspumpehemmere som er spesifikke for Cdr141.

Selv om den eksisterende uttrykksplattformen har blitt brukt med hell for å uttrykke sopp ABC transportører fra en rekke sopp, inkludert Basidomycota (C. neoformans Mdr1),14 filamentøse sopp som P. marneffei (Abc1)37 og mange Saccharomycotina arter (f.eks. S. cerevis ceiae Pdr5, C. glabrata Cdr1 og Cdr2, C. benytte Cdr1, C. krusei Abc1, Abc11 og Abc12 og C. albicans Cdr1 og Cdr2), 14,24,32,36,39,60,63 det har vært mindre suksess å uttrykke høye nivåer av riktig foldede menneskelige ABC transportører64. Foreløpige resultater indikerer at dette skyldes det spesifikke lipidmiljøet som disse transportørene krever for riktig uttrykk og funksjon i gjær. Indikasjoner er at dette også kan være sant for anlegget ABC transportører, selv om dette ennå ikke er bekreftet eksperimentelt.

Hovedårsakene til de betydelig høyere Cdr1 ATPase-spesifikke aktivitetene (dvs. preparater med mindre forurensende membraner) oppnådd med den optimaliserte småskala plasmamembranisolasjonsprotokollen er todelt: i) den mildere manuelle brudd på celler sammenlignet med å bruke en perle-beater for større plasmamembranpreparater; og ii) høsting av celler i midtloggfasen, noe som reduserer mulig mitokondrieforurensning på grunn av glukoseundertrykking av mitokondrieenzymer. De 3 min kjøleperioder mellom hver av de seks brudd syklusene kan forlenges uten merkbar effekt på kvaliteten på plasmamembranene. Gjenta fryse-tine sykluser er imidlertid å unngå fordi Cdr1 ATPase aktiviteter av isolerte plasmamembraner redusert med ~ 10% med hver ekstra fryse-tine syklus. Dette er grunnen til at det anbefales å dele plasmamembranprøvene i mindre aliquots for å redusere behovet for flere fryse-tine sykluser. mGFPHis dobbel tag forbedrer renseutbyttet og tillater effektiv ett-trinns vaskemiddelscreening. Ved å bruke denne konstruksjonen kan riktig lokalisering, riktig folding / trafficking og termo ustabilitet lett oppdages; og den doble taggen kan fjernes, om nødvendig, ved spalting med en kommersielt tilgjengelig protease, selv om 3 aminosyreforbindelsen mellom proteinet av interesse og taggen kanskje må utvides for effektiv fjerning av taggen.

Kombinasjonen av flere funksjoner i disse protokollene, nemlig bruk av en DNA-polymerase spesielt designet for kolonien PCR-forsterkning av 8 kb transformasjonskassett; den optimaliserte høyeffektive gjærtransformasjonsmetoden; evnen til å skape frosne kompetente gjærlagrer; og den optimaliserte småskala plasmamembranforberedelsesprotokollen demonstrerer opprettelsen av en optimalisert membranproteinuttrykksplattform som er egnet for høygjennomstrømningskloning, uttrykk og karakterisering av sopp ABC efflux-pumper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner takknemlig finansiering fra New Zealand Marsden Fund (Grant UOO1305), og et blokkstipend fra Det medisinske fakultet, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand (M. Niimi). De ønsker å takke Universitetet i Otago for å ha gitt G. Madani et ph.d.-stipend. Forfatterne ønsker også å uttrykke sin takknemlighet til professor Stefan Raunser og hans kolleger, Dr. Amir Apelbaum, og Dr Deivanayagabarathy Vinayagam, for deres støtte og tilsyn under et 6-måneders besøk av G. Madani ved Max Planck Institute of Molecular Physiology (MPIMP), Dortmund, Tyskland. Forfatterne takker også den tyske akademiske utvekslingstjenesten (DAAD) for å ha gitt G. Madani et forskningsstipend (57381332) for å besøke MPIMP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethane-sulphonic acid (MES) Sigma-Aldrich M3671
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris base; ultra-pure) Merck 77-86-1
2,2-Didecylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG310S LMNG
2,2-Dihexylpropane-1,3-bis-β-D-glucopyranoside Anatrace NG311S OGNG (MNG-OG)
2,2-Dioctylpropane-1,3-bis-β-D-maltopyranoside Anatrace NG322S DMNG
4-Trans-(4-trans-propylcyclohexyl)-cyclohexyl α-D-maltopyranoside Glycon Biochemicals GmbH D99019-C PCC-α-M
40% Acrylamide/Bis-acrylamide (37.5:1) Bio-Rad 1610148
Acetic acid (glacial) Merck 64-19-7
Agar Formedium  009002-18-0
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich 13106-76-8
Ammonium persulphate (APS) Bio-Rad 1610700
ATP disodium salt sigma-Aldrich A-6419
Bromophenol blue SERVA Electrophoresis GmbH 34725-61-6
CHAPS Anatrace C316S
CHAPSO Anatrace C317S
CSM Formedium DCS0019
CSM minus uracil Formedium DCS0161
Cyclohexyl-1-butyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C324S CYMAL-4
Cyclohexyl-1-heptyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C327S CYMAL-7
Cyclohexyl-methyl-β-D-maltopyranoside Anatrace C321S CYMAL-1
Digitonin Sigma-Aldrich 11024-24-1
Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics 10197785103
DMSO Merck 67-68-5
Ethanol Merck 459836
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA; Titriplex III) Merck 6381-92-6
ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent Applied Biosystems 78205 A blend of exonuclease and phosphatase
Glucose Formedium 50-99-7
Glycerol Merck 56-81-5
Glycine Merck G8898
HEPES Formedium 7365-45-9
Hydrochloric acid Merck 1003172510
KOD Fx Neo TOYOBO Co KFX-201 Use for reliable colony PCR
lithium acetate (LiAc) Sigma-Aldrich 546-89-4
Magnesium chloride hexa-hydrate sigma-Aldrich M2393
MES Formedium 145224-94-8
n-Decanoyl-N-hydroxyethyl-glucamide Anatrace H110S HEGA-10
n-Decanoyl-N-methyl-glucamide Anatrace M320S MEGA-10
n-Decyl-phosphocholine Anatrace F304S Fos-choline-10
n-Decyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D322S DM
n-Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ312S Anzergent 3-12
n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide Anatrace D360S LDAO
n-Dodecyl-α-D-maltopyranoside Anatrace D310HA α-DDM
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace D310S β-DDM
n-Nonyl-β-D-glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Nonyl-β-D-maltopyranoside Anatrace N330S NM
n-Octadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ318S Anzergent 3-18
n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulphonate Anatrace AZ308S Anzergent 3-8
n-Octyl-phosphocholine Anatrace F300S Fos-choline-8
n-Octyl-β-D-glucopyranoside Anatrace O311S OG
n-Tetradecyl-phosphocholine Anatrace F312S Fos-choline-14
n-Tetradecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T315S TDM
n-Tridecyl-phosphocholine Anatrace F310S Fos-choline-13
n-Tridecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace T323S -
n-Undecyl-β-D-maltopyranoside Anatrace U300S UM (UDM)
N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Octylphenoxypolyethoxyethanol Sigma-Aldrich 9002-93-1 TRITON X-100
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Peptone Formedium 3049-73-7
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche Diagnostics 329-98-6
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase New England Biolabs M0535S High-fidelity DNA polymerase
polyethylene glycol (PEG 3350) Sigma-Aldrich 25322-68-3
polyoxyethylenesorbitan monooleate Sigma-Aldrich 9005-65-6 TWEEN 80
Potassium nitrate Sigma-Aldrich P8394
Protein Assay Kit Bio-Rad 5000122 RC DC Protein Assay Kit II
QC Colloidal Coomassie Stain Bio-Rad 1610803
Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa) Abcam AB116028
Sodium azide Sigma-Aldrich 71289
Sodium dodecyl sulphate Sigma-Aldrich 151-21-3 SDS
Sodium L-ascorbate BioXtra Sigma-Aldrich 11140
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350S DDS
Sulphuric acid Sigma-Aldrich 339741
Yeast extract Formedium 008013-01-2
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0402
 Equipment (type)
Centrifuge  (Eppendorf 5804) Eppendorf
Centrifuge (Beckman Ultra) Beckman
Centrifuge (Sorvall RC6) Sorvall
FSEC apparatus (NGC Chromatography Medium Pressure system equipped with a fluorescence detector, an autosampler, a fractionator) Bio-Rad
Gel imaging (GelDoc EZ Imager) Bio-Rad
Microplate reader (Synergy 2 Multi-Detection) BioTek Instruments
PCR thermal cycler (C1000 Touch) Bio-Rad
Power supply (PowerPac) Bio-Rad
SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra) Bio-Rad
Shaking incubator (Multitron) Infors HT, Bottmingen
Superose 6 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences GE17-5172-01
UV/Visible spectrophotometer (Ultraspec 6300 pro) Amersham BioSciences UK Ltd

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  2. Guo, Y. Be cautious with crystal structures of membrane proteins or complexes prepared in detergents. Crystals (Basel). 10 (2), 86 (2020).
  3. Lewinson, O., Orelle, C., Seeger, M. A. Structures of ABC transporters: handle with care. FEBS Letters. 594 (23), 3799-3814 (2020).
  4. Luckey, M. Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations. , Cambridge University Press. Ch. 4 69-105 (2014).
  5. Opekarova, M., Tanner, W. Specific lipid requirements of membrane proteins--a putative bottleneck in heterologous expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1610 (1), 11-22 (2003).
  6. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  7. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids. Annual Review of Biochemistry. 66, 199-232 (1997).
  8. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1612 (1), 1-40 (2003).
  9. Ahn, J. H., Pan, J. G., Rhee, J. S. Homologous expression of the lipase and ABC transporter gene cluster, tliDEFA, enhances lipase secretion in Pseudomonas spp. Applied and Environmental Microbiology. 67 (12), 5506-5511 (2001).
  10. Newby, Z. E., et al. A general protocol for the crystallization of membrane proteins for X-ray structural investigation. Nature Protocols. 4 (5), 619-637 (2009).
  11. Parker, J. L., Newstead, S. Membrane protein crystallisation: current trends and future perspectives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 61-72 (2016).
  12. Wiener, M. C. A pedestrian guide to membrane protein crystallization. Methods. 34 (3), 364-372 (2004).
  13. Grisshammer, R. Understanding recombinant expression of membrane proteins. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 337-340 (2006).
  14. Lamping, E., et al. Characterization of three classes of membrane proteins involved in fungal azole resistance by functional hyperexpression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 6 (7), 1150-1165 (2007).
  15. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  16. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  17. Reckel, S., et al. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 607, 187-212 (2010).
  18. Pandey, A., Shin, K., Patterson, R. E., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Current strategies for protein production and purification enabling membrane protein structural biology. Biochemistry and Cell Biology. 94 (6), 507-527 (2016).
  19. Harvey, C. J. B., et al. HEx: A heterologous expression platform for the discovery of fungal natural products. Science Advances. 4 (4), (2018).
  20. Kingsman, S. M., Kingsman, A. J., Dobson, M. J., Mellor, J., Roberts, N. A. Heterologous gene expression in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 3, 377-416 (1985).
  21. Monk, B. C., et al. Yeast membrane protein expression system and its application in drug screening. US patent. , 8728797 NZ 513755, AU 2002330796, US 8728797 patent NZ 513755, AU 2002330796 (2002).
  22. Sagatova, A. A., Keniya, M. V., Wilson, R. K., Monk, B. C., Tyndall, J. D. Structural insights into binding of the antifungal drug fluconazole to Saccharomyces cerevisiae lanosterol 14alpha-demethylase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (8), 4982-4989 (2015).
  23. Decottignies, A., et al. ATPase and multidrug transport activities of the overexpressed yeast ABC protein Yor1p. The Journal of Biological Chemistry. 273 (20), 12612-12622 (1998).
  24. Lamping, E., Zhu, J. Y., Niimi, M., Cannon, R. D. Role of ectopic gene conversion in the evolution of a Candida krusei pleiotropic drug resistance transporter family. Genetics. 205 (4), 1619-1639 (2017).
  25. Lamping, E., Niimi, M., Cannon, R. D. Small, synthetic, GC-rich mRNA stem-loop modules 5' proximal to the AUG start-codon predictably tune gene expression in yeast. Microbial Cell Factories. 12, 74 (2013).
  26. James, J. E., Lamping, E., Santhanam, J., Cannon, R. D. PDR transporter ABC1 is involved in the innate azole resistance of the human fungal pathogen Fusarium keratoplasticum. Frontiers in Microbiology. , (2021).
  27. Ullah, R., et al. Activity of the human rhinovirus 3C protease studied in various buffers, additives and detergent solutions for recombinant protein production. PLoS One. 11 (4), 0153436 (2016).
  28. von Stetten, D., Noirclerc-Savoye, M., Goedhart, J., Gadella, T. W., Royant, A. Structure of a fluorescent protein from Aequorea victoria bearing the obligate-monomer mutation A206K. Acta Crystallographica Section F. Structural Biology and Crystalization Communications. 68, Pt 8 878-882 (2012).
  29. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  30. Cormack, B. P., et al. Yeast-enhanced green fluorescent protein (yEGFP): a reporter of gene expression in Candida albicans. Microbiology (Reading). 143, Pt 2 303-311 (1997).
  31. Monk, B. C., et al. Architecture of a single membrane spanning cytochrome P450 suggests constraints that orient the catalytic domain relative to a bilayer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3865-3870 (2014).
  32. Holmes, A. R., et al. ABC transporter Cdr1p contributes more than Cdr2p does to fluconazole efflux in fluconazole-resistant Candida albicans clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (11), 3851-3862 (2008).
  33. Tanabe, K., et al. FK506 resistance of Saccharomyces cerevisiae Pdr5 and Candida albicans Cdr1 involves mutations in the transmembrane domains and extracellular loops. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (1), 01146 (2019).
  34. Tanabe, K., et al. Chimeras of Candida albicans Cdr1p and Cdr2p reveal features of pleiotropic drug resistance transporter structure and function. Molecular Microbiology. 82 (2), 416-433 (2011).
  35. Madani, G., Lamping, E., Cannon, R. D. Engineering a cysteine-deficient functional Candida albicans Cdr1 molecule reveals a conserved region at the cytosolic apex of ABCG transporters important for correct folding and frafficking of Cdr1. mSphere. 6 (1), (2021).
  36. Lamping, E., et al. Abc1p is a multidrug efflux transporter that tips the balance in favor of innate azole resistance in Candida krusei. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 354-369 (2009).
  37. Panapruksachat, S., et al. Identification and functional characterization of Penicillium marneffei pleiotropic drug resistance transporters ABC1 and ABC2. Medical Mycology. 54 (5), 478-491 (2016).
  38. Wada, S., et al. Phosphorylation of Candida glabrata ATP-binding cassette transporter Cdr1p regulates drug efflux activity and ATPase stability. The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 94-103 (2005).
  39. Watanasrisin, W., et al. Identification and characterization of Candida utilis multidrug efflux transporter CuCdr1p. FEMS Yeast Research. 16 (4), (2016).
  40. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  41. Niimi, K., et al. Specific interactions between the Candida albicans ABC transporter Cdr1p ectodomain and a D-octapeptide derivative inhibitor. Molecular Microbiology. 85 (4), 747-767 (2012).
  42. Holmes, A. R., et al. The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (3), 1508-1515 (2012).
  43. Reis de Sa, L. F., et al. Synthetic organotellurium compounds sensitize drug-resistant Candida albicans clinical isolates to fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (1), 01231 (2017).
  44. Tanabe, K., et al. Inhibition of fungal ABC transporters by unnarmicin A and unnarmicin C, novel cyclic peptides from marine bacterium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 364 (4), 990-995 (2007).
  45. le Maire, M., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta. 1508 (1-2), 86-111 (2000).
  46. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  47. Pfaller, M. A. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs, and modes of transmission. Clinical Infectious Diseases. 22, Suppl 2 89-94 (1996).
  48. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clinical Microbiology Reviews. 22 (2), 291-321 (2009).
  49. Sanglard, D., et al. Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in Candida albicans isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (11), 2378-2386 (1995).
  50. Prasad, R., De Wergifosse, P., Goffeau, A., Balzi, E. Molecular cloning and characterization of a novel gene of Candida albicans, CDR1, conferring multiple resistance to drugs and antifungals. Current Genetics. 27 (4), 320-329 (1995).
  51. Lamping, E., Madani, G., Lee, H. J., Niimi, M., Cannon, R. D. Candida albicans: Cellular and Molecular Biology. Prasad, R. , Chapter 18 379-406 (2017).
  52. Crouzet, J., Trombik, T., Fraysse, A. S., Boutry, M. Organization and function of the plant pleiotropic drug resistance ABC transporter family. FEBS Letters. 580 (4), 1123-1130 (2006).
  53. Kang, J., et al. Plant ABC Transporters. Arabidopsis Book. 9, 0153 (2011).
  54. Lamping, E., et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function. Fungal Genetics and Biology. 47 (2), 127-142 (2010).
  55. Lamping, E., Cannon, R. D. Use of a yeast-based membrane protein expression technology to overexpress drug resistance efflux pumps. Methods in Molecular Biology. 666, 219-250 (2010).
  56. Day, M. Yeast petites and small colony variants: for everything there is a season. Advances in Applied Microbiology. 85, 1-41 (2013).
  57. Niimi, K., et al. Chemosensitization of fluconazole resistance in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic fungi by a D-octapeptide derivative. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (4), 1256-1271 (2004).
  58. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  59. Hao, Z., et al. A novel and fast purification method for nucleoside transporters. Frontiers in Molecular Biosciences. 3, 23 (2016).
  60. Nakamura, K., et al. Functional expression of Candida albicans drug efflux pump Cdr1p in a Saccharomyces cerevisiae strain deficient in membrane transporters. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3366-3374 (2001).
  61. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), 29191 (2011).
  62. Byrne, B. Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 32, 9-17 (2015).
  63. Holmes, A. R., et al. Heterozygosity and functional allelic variation in the Candida albicans efflux pump genes CDR1 and CDR2. Molecular Microbiology. 62 (1), 170-186 (2006).
  64. Keniya, M. V., et al. Drug resistance is conferred on the model yeast Saccharomyces cerevisiae by expression of full-length melanoma-associated human ATP-binding cassette transporter ABCB5. Molecular Pharmaceutics. 11 (10), 3452-3462 (2014).

Tags

Biologi utgave 172
Småskala plasmamembranpreparat for analyse av <em>Candida albicans</em> Cdr1-mGFPHis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., … More

Madani, G., Lamping, E., Lee, H. J., Niimi, M., Mitra, A. K., Cannon, R. D. Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis. J. Vis. Exp. (172), e62592, doi:10.3791/62592 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter