Summary
Die Fähigkeit, neuromuskuläre Verbindungskomponenten genau zu erkennen, ist entscheidend für die Bewertung von Modifikationen in ihrer Architektur aufgrund pathologischer oder Entwicklungsprozesse. Hier präsentieren wir eine vollständige Beschreibung einer einfachen Methode, um qualitativ hochwertige Bilder von neuromuskulären Verbindungen ganzer Mounts zu erhalten, die für quantitative Messungen verwendet werden können.
Abstract
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist ein spezialisierter Kontaktpunkt zwischen dem motorischen Nerv und der Skelettmuskulatur. Diese periphere Synapse weist eine hohe morphologische und funktionelle Plastizität auf. Bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems ist NMJ ein frühes pathologisches Ziel, das zu Neurotransmissionsversagen, Schwäche, Atrophie und sogar zum Muskelfasertod führt. Aufgrund seiner Relevanz kann die Möglichkeit, bestimmte Aspekte der Beziehung zwischen NMJ-Komponenten quantitativ zu bewerten, dazu beitragen, die mit ihrer Montage / Demontage verbundenen Prozesse zu verstehen. Das erste Hindernis bei der Arbeit mit Muskeln besteht darin, das technische Know-how zu erwerben, um ihre Fasern schnell zu identifizieren und zu sezieren, ohne sie zu beschädigen. Die zweite Herausforderung besteht darin, qualitativ hochwertige Nachweismethoden zu verwenden, um NMJ-Bilder zu erhalten, die für quantitative Analysen verwendet werden können. Dieser Artikel stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zum Sezieren von Extensor digitorum longus und Soleusmuskeln von Ratten vor. Es erklärt auch die Verwendung von Immunfluoreszenz zur Visualisierung prä- und postsynaptischer Elemente von Ganz-Mount-NMJs. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass diese Technik verwendet werden kann, um die mikroskopische Anatomie der Synapse zu bestimmen und subtile Veränderungen im Status einiger ihrer Komponenten unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen zu identifizieren.
Introduction
Die neuromuskuläre Säugetierverbindung (NMJ) ist eine große cholinerge dreigliedrige Synapse, die aus dem Nervenende des Motoneurons, der postsynaptischen Membran auf der Skelettmuskelfaser und den terminalen Schwannzellen1,2,3besteht. Diese Synapse weist eine hohe morphologische und funktionellePlastizität auf 4,5,6,7,8, auch im Erwachsenenalter, wenn NMJs dynamische strukturelle Veränderungen erfahren können. So haben einige Forscher gezeigt, dass motorische Nervenenden im Mikrometermaßstab9kontinuierlich ihre Form verändern. Es wurde auch berichtet, dass die Morphologie des NMJ auf funktionelle Anforderungen, veränderte Verwendung, Alterung, Bewegung oder Variationen der Bewegungsaktivität reagiert4,10,11,12,13,14,15. So stellen Training und mangelnde Verwendung einen wesentlichen Anreiz dar, um einige Eigenschaften des NMJ zu modifizieren, wie seine Größe, Länge, Dispersion von synaptischen Vesikeln und Rezeptoren sowie Nerventerminalverzweigungen14,16,17,18,19,20.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass jede strukturelle Veränderung oder Degeneration dieser lebenswichtigen Verbindung zum Tod von Motoneuronzellen und Muskelatrophie führen kann21. Es wird auch angenommen, dass eine veränderte Kommunikation zwischen Nerven und Muskeln für die physiologischen altersbedingten NMJ-Veränderungen und möglicherweise für ihre Zerstörung in pathologischen Zuständen verantwortlich sein könnte. Der Abbau neuromuskulärer Verbindungen spielt eine entscheidende Rolle beim Auftreten der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS), einer neurodegenerativen Erkrankung, die eines der besten Beispiele für ein gestörtes Muskel-Nerven-Zusammenspiel darstellt3. Trotz der zahlreichen Studien, die zur Dysfunktion von Motoneuronen durchgeführt wurden, wird immer noch diskutiert, ob die bei ALS beobachtete Verschlechterung aufgrund der direkten Schädigung des Motoneurons auftritt und sich dann auf die kortiko-spinalen Projektionen erstreckt22; oder wenn es als distale Axonopathie betrachtet werden sollte, bei der die Degeneration in den Nervenenden beginnt und in Richtung des Motoneurons Somas23,24fortschreitet. Angesichts der Komplexität der ALS-Pathologie ist es logisch zu berücksichtigen, dass eine Mischung unabhängiger Prozesse auftritt. Da NMJ der zentrale Akteur des physiopathologischen Zusammenspiels zwischen Muskel und Nerv ist, stellt seine Destabilisierung einen dreh- und angelpunktlichen Entstehungspunkt der zu analysierenden Erkrankung dar.
Das neuromuskuläre System von Säugetieren ist funktionell in diskrete motorische Einheiten organisiert, die aus einem Motoneuron und den Muskelfasern bestehen, die ausschließlich von seinem Nerventerminal innerviert werden. Jede Motoreinheit hat Fasern mit ähnlichen oder identischen strukturellen und funktionalen Eigenschaften25. Die selektive Rekrutierung von Motoneuronen ermöglicht die Optimierung der Muskelreaktion auf funktionelle Anforderungen. Jetzt ist klar, dass die Skelettmuskulatur von Säugetieren aus vier verschiedenen Fasertypen besteht. Einige Muskeln werden nach den Eigenschaften ihres häufigsten Fasertyps benannt. Zum Beispiel trägt der Soleus (ein hinterer Muskel der Hintergliedmaße, der an der Aufrechterhaltung der Körperhaltung beteiligt ist) einen Großteil der langsam zuckenden Einheiten (Typ 1) und wird als langsamer Muskel erkannt. Stattdessen besteht Extensor digitorum longus (EDL) im Wesentlichen aus Einheiten mit ähnlichen schnell zuckenden Eigenschaften (Typ 2-Fasern) und ist als schneller Muskel bekannt, der auf phasische Bewegungen spezialisiert ist, die für die Fortbewegung benötigt werden. Mit anderen Worten, obwohl erwachsene Muskeln aufgrund der hormonellen und neuronalen Einflüsse plastischer Natur sind, bestimmt ihre Faserzusammensetzung die Fähigkeit, verschiedene Aktivitäten auszuführen, wie bei Soleus, der kontinuierliche Aktivität mit geringer Intensität erfährt, und EDL, die ein schnelleres einzelnes Zucken aufweist. Andere Merkmale, die zwischen verschiedenen Arten von Muskelfasern variabel sind, hängen mit ihrer Struktur zusammen (mitochondrialer Gehalt, Erweiterung des sarkoplasmatischen Retikulums, Dicke der Z-Linie), Myosin-ATPase-Gehalt und Myosin-Schwerkettenzusammensetzung26,27,28,29.
Bei Nagetier-NMJs gibt es signifikante Unterschiede zwischen den Muskeln28,29. Morphometrische Analysen, die an Soleus und EDL von Ratten durchgeführt wurden, zeigten eine positive Korrelation zwischen der synaptischen Fläche und dem Faserdurchmesser (dh der synaptische Bereich in soleus langsamen Fasern ist größer als in EDL schnellen Fasern), aber das Verhältnis zwischen NMJ-Fläche und Fasergröße ist in beiden Muskeln ähnlich30,31. Auch in Bezug auf die Nerventerminals waren die absoluten Endplattenbereiche in Typ-1-Fasern niedriger als in Typ-2-Fasern, während die Normalisierung durch Faserdurchmesser Bereiche von Nerventerminals in Typ-1-Fasern zu den größten32machte.
Nur sehr wenige Studien konzentrieren sich jedoch auf morphometrische Analysen, um den Nachweis von Veränderungen in einigen der NMJ-Komponenten33,34zu zeigen. Aufgrund der Relevanz des NMJ für die Funktion des Organismus, dessen Morphologie und Physiologie in verschiedenen Pathologien verändert sind, ist es daher wichtig, die Dissektionsprotokolle verschiedener Muskeltypen mit ausreichender Qualität zu optimieren, um die Visualisierung der gesamten NMJ-Struktur zu ermöglichen. Es ist auch notwendig, das Auftreten von prä- oder postsynaptischen Veränderungen in verschiedenen experimentellen Situationen oder Bedingungen wie Alterung oder Übung zu bewerten35,36,37,38. Darüber hinaus kann es hilfreich sein, subtilere Veränderungen in NMJ-Komponenten wie eine veränderte Neurofilament-Phosphorylierung in den terminalen Nervenenden nachzuweisen, wie in ALS39berichtet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des nationalen Gesetzes Nr. 18611 für die Pflege von Tieren, die für Versuchszwecke verwendet werden, durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutionellen Ethikkommission genehmigt (CEUA IIBCE, Protokollnummer 004/09/2015).
1. Muskeldissektion (Tag 1)
HINWEIS: Bevor Sie beginnen, machen Sie 40 ml 0,5% Paraformaldehyd (PFA), pH 7,4 in Dulbeccos Phosphatsalzlösung (DPBS). Optional machen Sie 20 ml 4% PFA. 5 ml Aliquoten zubereiten und bei -20 °C einfrieren. Am Tag der Dissektion ein Aliquot von 4% auftauen und 35 ml DPBS hinzufügen, um 40 ml 0,5% PFA zu erhalten.
-
Isolierung von EDL (Schnellzuckenmuskel)
- Euthanasie eine Ratte. Legen Sie das Tier mit dem Bauch nach oben. Machen Sie einen ersten Schnitt mit einer chirurgischen Klinge zwischen den Zehen in Richtung der Hintergliedmaße.
HINWEIS: In diesem Fall wurde eine intraperitoneale Injektion von 90:10 mg/Kg Ketamin:Xylazin verabreicht, um die Ratte einzuschläfern, aber auch andere Anästhesieoptionen sind erlaubt. - Ziehen Sie die Haut ab und ziehen Sie sie nach oben, bis das Rattenknie freigelegt ist.
- Um die EDL zu finden, folgen Sie den Fußsehnen bis zum Ringband. Dieses Band umkreist zwei Sehnen. Schneiden Sie das Band zwischen den beiden Sehnen mit einer Unibandschere (oder ähnlichem) ab. Identifizieren Sie die EDL-Sehne, indem Sie beide anheben und wählen Sie diejenige, die die Zehen nach oben bewegt.
- Schneiden Sie die Sehne mit einer Uniband-Schere ab. Dann, während Sie die Sehne mit einer feinen biologischen Pinzette halten, beginnen Sie, den EDL-Muskel langsam vom Tibialis anterior, dem Peroneus brevis und dem Peroneus longus40 zu trennen (siehe Abbildung 1A).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Muskel ohne Schäden getrennt ist. Tun Sie dies, indem Sie den Rest der seitlichen Muskeln schneiden, um einen Weg zwischen ihnen zu öffnen (die EDL hat keine oberflächliche Position), während Sie den EDL-Muskel halten und anheben. - Um den Muskel vollständig zu isolieren, schneiden Sie die am Rattenknie befestigte Sehne mit einer Uniband-Schere ab.
- Tauchen Sie den sezierten Muskel in 5 ml 0,5% PFA und lassen Sie ihn 24 h bei 4 °C ein. Optional heften Sie den Muskel in ein Stück Pappe und drehen ihn mit dem Muskel nach unten. Dann tauchen Sie es vollständig in 8 ml der fixativen Lösung. Dieser Schritt hilft, den Muskel während des Fixierungsprozesses zu dehnung zu erhalten.
- Euthanasie eine Ratte. Legen Sie das Tier mit dem Bauch nach oben. Machen Sie einen ersten Schnitt mit einer chirurgischen Klinge zwischen den Zehen in Richtung der Hintergliedmaße.
-
Isolierung des Soleus (langsam zuckender Muskel)
- Drehen Sie das Tier um (der Bauch ist jetzt nach unten gerichtet). Schneiden Sie durch die Haut die Kalkanealsehne mit einer chirurgischen Klinge.
- Mit Hilfe der biologischen Pinzette und der Unibandschere trennen Sie den Musculus gastrocnemius von den Knochen und erzeugen einen "muskelösen Deckel". Der Soleus befindet sich auf der Innenseite des muskulösen Lids. Es kann identifiziert werden, weil es rot ist und eine flache Morphologie hat.
- Mit einer biologischen Pinzette erreichen und heben Sie die Soleussehne an, die über dem Gastrocnemius liegt (siehe Abbildung 1B).
- Schneiden Sie die Sehne mit einer Uniband-Schere ab. Heben Sie den gesamten Muskel an, während Sie einige der schwachen Befestigungspunkte (z. B. neurovaskuläre Elemente) schneiden. Um den Soleusmuskel vollständig zu befreien, schneiden Sie schließlich den Soleusfaszikel, der die Kalkanealsehne bildet, mit einer Unibandschere ab.
- Wiederholen Sie Schritt 1.1.6, um den sezierten Soleusmuskel zu reparieren.
2. Teefaserzubereitung (Tag 2)
- Nach 24 h Fixierung spülen Sie die Muskeln mit 6 ml DPBS-Lösung 3x für jeweils 10 minuten, bevor Sie die Muskelfasern isolieren.
- Um die Fasern zu isolieren, legen Sie einen Muskel auf einen Objektträger. Halten Sie mit einem Stereomikroskop eine der Sehnen vorsichtig mit einer biologischen Pinzette. Dann, mit der anderen biologischen Pinzette, beginnen Sie, die Sehne langsam zu kneifen, um die Muskelfasern zu trennen. Danach ziehen Sie das eingeklemmte Gewebe langsam nach oben in Richtung der gegenüberliegenden Muskelsehne. Es ist notwendig, diese Aktion mehrmals zu wiederholen, bis mehrere kleine, isolierte Bündel erhalten werden.
- Legen Sie sie vorsichtig auf einen vorbehandelten Objektträger (silanisiert). Es ist notwendig, alle Fasern in Ordnung zu halten, damit sie sich nicht überlappen. An dieser Stelle trocknen Sie die Fasern 24 Stunden an der Luft.
3. Immunfluoreszenz
-
Primäre Antikörperinkubation (Tag 3)
HINWEIS: Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Der effizienteste Weg, die verschiedenen Lösungen zu entfernen, ohne Fasern vom Objektträger zu lösen, ist die Verwendung einer Insulinspritze.- Um den Immunfärbungsprozess zu starten, umschließen Sie die getrockneten isolierten Muskelfasern mit einem Pap-Pen, um eine wasserdichte Barriere zu schaffen.
- Um die Muskelfasern zu hydratisieren, fügen Sie 200 μL destilliertes Wasser für 5 minuten hinzu und ändern Sie dann das Wasser auf 200 μL DPBS für die nächste 5-minütige Inkubation. Beginnen Sie an dieser Stelle mit der Immunfluoreszenzmarkierung.
- Inkubieren Sie Fasern mit 300 μL eines Blockierpuffers (BB), der 50 mM Glycin, 1% BSA und 1% Triton X-100 enthält, für 30 min.
- Ersetzen Sie BB durch den primären Antikörper in einer vom Hersteller empfohlenen Konzentration. Verwenden Sie das BB, um den Antikörper zu verdünnen. Dieses Experiment verwendete 400 μL SMI 32 oder SMI 31, die nicht phosphoryliertes (Nf) oder phosphoryliertes (Phos-Nf) Neurofilament H bei 1/800 Verdünnung erkannten, um die präsynaptische NMJ-Komponente nachzuweisen.
HINWEIS: Wenn Sie sich entscheiden, das gesamte präsynaptische Element zu erkennen, anstatt die Neurofilament-Phosphorylierung zu bewerten, wählen Sie Antikörper gegen Synapsin, Synaptophysin oder SV2a, die zuvor erfolgreich eingesetzt wurden. - Inkubieren Sie die Fasern mit der primären Antikörperverdünnung bei 4 °C über Nacht (optional kann die Inkubation bei 37 °C für 1 h durchgeführt werden). In beiden Fällen ist es wichtig, die Inkubation mit einer feuchten Kammer durchzuführen.
-
Immunfluoreszenz: Sekundäre Antikörperinkubation (Tag 4)
- Entfernen Sie den primären Antikörper und spülen Sie die Fasern 3x für jeweils 10 min mit 500 μL DPBS und das letzte Mal mit BB.
- Entfernen Sie diese letzte Wäsche und fügen Sie den fluoreszierend markierten sekundären Antikörper hinzu, der in BB verdünnt ist. Für dieses Experiment wurden 500 μL Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 488 bei 1/1000 Verdünnung in BB verwendet. Um das postsynaptische Element der NMJs zu sehen, wurde der sekundären Antikörperverdünnung 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) Biotin-XX-Konjugat zugesetzt.
HINWEIS: Die Zugabe von Btx-Biotin XX ermöglicht bessere Signal-Rausch-Bilder, sobald sie mit Streptavidin erkannt wurden, das das Signal verstärkt. Darüber hinaus erhöhte die Streptavidin-Konjugation mit verschiedenen Fluorophoren die Farbkombinationen in Co-Labeling-Assays. Alternativ ermöglicht fluoreszierend markiertes Btx die Gewinnung von Bildern ähnlicher Qualität. - Inkubieren Sie den sekundären Antikörper und das Btx für 2 h bei Raumtemperatur oder 1 h bei 37 °C lichtgeschützt.
- Entfernen Sie den sekundären Antikörper und das Btx. Waschen Sie 3x für jeweils 10 min mit 500 μL DPBS und spülen Sie das letzte Mal mit BB.
- Mit 500 μL Streptavidin Alexa Fluor 555 bei 1/1000 Verdünnung mit BB für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. An dieser Stelle fügen Sie, falls gewünscht, eine Sonde hinzu, um die Kerne wie Diaminophenylindol in einer Endkonzentration von 1 μg / ml zu verunreinigt.
- Entfernen Sie die Inkubationslösung und waschen Sie die Fasern 3x für jeweils 10 min mit 500 μL DPBS. Montieren Sie dann die Fasern.
-
Montage
- Legen Sie 4 Punkte transparenten Nagellacks auf den Objektträger, als wären sie die Eckpunkte eines Quadrats. 1-2 min trocknen lassen. Dies sind die Punkte, an denen die Coverlips ruhen und helfen, Gewebezerkleinerung zu vermeiden.
- Entfernen Sie die letzte DPBS-Wäsche und fügen Sie genügend Montagemedien (~ 200 μL) hinzu, um die Fasern abzudecken. Vermeiden Sie das Trocknen.
HINWEIS: Um 10 ml des Montagemedienmixes vorzubereiten, verwenden Sie Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: Glycerin in einem 4:1 (v:v). - Verwenden Sie eine 200 μL Pipettenspitze, um die Montagemedien vorsichtig über die Fasern zu verteilen, um ein vollständiges Eintauchen aller Fasern zu gewährleisten. Bevor Sie das Deckglas einsetzen, entfernen Sie luftblasen.
- Legen Sie den Abdeckel auf die Proben, um die Erzeugung von Luftblasen zu verhindern. Diese Bewegung kann mit Hilfe einer Zette erfolgen.
4. Mikroskopie und morphometrische Analyse
- Stellen Sie sich die gehänselten Faserpräparate mit der konfokalen Lasermikroskopie ab.
- Nehmen Sie eine Reihe von optischen Abschnitten (30 μm Z-Stacks) über die gesamte Synapse in einem Intervall von einem Mikrometer. Um den Stack einzustellen, verwenden Sie das Btx-Signal. Stellen Sie mindestens 15-20 NMJs für jede Muskelerkrankung mit einer Auflösung von 2048 px x 2048 px ab. Diese Methode wurde gewählt, um Bilder mit ausreichender optischer Qualität und Auflösung für die morphometrische Analyse zu erhalten.
- Um die Messungen durchzuführen, verwenden Sie die Projektionsbilder von Stapeln mit einer beliebigen Analysesoftware.
HINWEIS: Obwohl die erläuterte morphometrische Analyse manuell durchgeführt wurde, gibt es zwei kürzlich entwickelte Image J-basierte Werkzeuge zur Untersuchung vieler verschiedener Aspekte der prä- und postsynaptischen NMJ-Morphologie33,34. - Um die NMJ-Gesamtbereichswerte zu erhalten, wählen Sie mit dem Photoshop-Magnet-Lasso-Werkzeug den außene Rahmen (externer Umriss des gefärbten Bereichs, siehe Abbildung 2)der Endplatte aus und bestimmen Sie die Anzahl der ausgewählten Pixel im Histogrammfenster. Anschließend können die Pixelflächen mit der von der konfokalen Software vorgegebenen Skala in Quadratmikrometer umgewandelt werden.
- Wählen Sie mit demselben Lasso-Werkzeug den innenliegenden Rahmen aus (Umrisse des gefärbten Bereichs innerhalb der Endplatte, siehe Abbildung 2) und bestimmen Sie den nicht gefärbten Bereich in der gesamten Struktur (oder leeren Bereich) wie oben beschrieben (Schritt 4.4.). Die werte für die postsynaptische Fläche erhalten Sie, nachdem die Gesamtfläche von der leeren Fläche jedes NMJ subtrahiert wurde.
- Erhalten Sie den präsynaptischen Bereich, der als der Bereich mit Anti-Neurofilament-Immunfluoreszenz definiert ist, auf ähnliche Weise wie den Gesamten NMJ-Bereich.
HINWEIS: Alle diese Parameter wurden verwendet, um den Postsynaptischen Dichteindex (Postsynaptic Area/Total Area) und die NMJ Coverage (Presynaptic Area/Postsynaptic Area) zu bestimmen. Ein höherer postsynaptischer Dichteindex impliziert eine dichtere oder kompaktere Endplatte, während eine kleinere NMJ-Abdeckung eine viel schlechtere Interaktion zwischen Nerventerminal und Endplatte widerspiegelt (beide kompatibel mit einem Denervierungsprozess). Im hier gezeigten Fall wurden, da phosphorylierte und nicht phosphorylierte Formen von Neurofilamenten auf Nerventerminalebene nachgewiesen wurden, das phosphorylierte/nicht phosphorylierte präsynaptische Signalverhältnis und das phosphorylierte/nicht phosphorylierte Deckungsverhältnis berechnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, um Muskelfasern aus zwei verschiedenen Arten von Muskeln (schnell und langsam zuckende Muskeln, siehe Abbildung 1)zu isolieren und zu immunanimieren. Mit den richtigen Markern und / oder Sonden können NMJ-Komponenten aus quantitativer Sicht detektiert und bewertet werden, um einige der morphologischen Veränderungen zu beurteilen, die als Folge eines Krankheitsverlaufs oder einer spezifischen medikamentösen Behandlung auftreten können. In der vorliegenden Studie wurden präsynaptische und postsynaptische Komponenten des NMJ fluoreszierend mit Anti-Nf- bzw. Anti-Phos-Nf-Antikörpern bzw. Btx markiert(Abbildung 2,obere Panels). Jedes hochauflösende konfokale Bild eines NMJ, das nach der Immunfärbung erhalten wurde, wurde verwendet, um die im Abschnitt Protokoll (Tabelle 1) angegebenen morphometrischen Messungen und Indizes unter Anwendung der in den unteren Tafeln der Abbildung 2beschriebenen Parameter zu bestimmen.
Um zu zeigen, dass dieses NMJ-Präparat auf ganzer Montierung die Synapsenarchitektur perfekt beibehielt und die Visualisierung der Wirkung ermöglichte, die eine fortschreitende Erkrankung des Nervensystems auf sich hat, wurden gehänste Fasern transgener Ratten, die das menschliche Gen SOD1G93A exprimierten (ein ALS-Modell), mit dem Protokoll immungefärbt (Abbildung 3). Die Verschmelzung von Bildern prä- und postsynaptischer Signale mit den mit DAPI gefärbten Kernen zeigte, dass Unterschiede zwischen den NMJs zwischen transgenen und nicht-transgenen altersangepassten Tieren deutlich sichtbar und mit den von der Literatur erwarteten Ergebnissen kompatibel sind.
Darüber hinaus ermöglichte die Qualität der Bilder die Quantifizierung der beobachteten Veränderungen durch die Durchführung der morphometrischen Analyse. Beispielsweise zeigt Abbildung 4 Hinweise darauf, dass das postsynaptische Signal bei transgenen Tieren kompakter zu sein scheint (ca. 20%), hauptsächlich aufgrund der Verringerung der NMJ-Gesamtfläche.
Andererseits zeigt Abbildung 5, dass die präsynaptische Fläche der NMJs bei transgenen Tieren ebenfalls reduziert ist. Die Qualität dieses NMJ-Präparats wurde durch die Analyse des Ausmaßes der Nerventerminalrücknahme und durch die Erkennung von Veränderungen in Bezug auf Neurofilament-Phosphorylierungszustände nachgewiesen. Diese Tatsache wird wichtig sein, um einen tiefen Einblick in den NMJ-Demontageprozess im Zusammenhang mit der ALS-Krankheit im verwendeten Modell zu erhalten. Der kleinste entdeckte präsynaptische Bereich war derjenige, der mit antiphosphoryliertem Neurofilament markiert war (Abbildung 5B, E, C, F).
Die Verwendung des Erfassungsindex (Abbildung 6) ermöglichte den Nachweis, dass die transgenen NMJs teilweise denervated waren. Außerdem könnte festgestellt werden, dass die Abdeckungsindizes des phosphorylierten Neurofilaments niedriger sind als die mit nicht phosphoryliertem Neurofilament. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich dies auf den Status von NMJ mit ganzer Montierung bezieht und dass es nützlich sein könnte, die Untersuchung des Neurofilament-Phosphorylierungszustands (eine wichtige Determinante der Filamentplastizität und -stabilität) mit diesem NMJ-Präparat einzuführen.
Schließlich bieten die in dieser Arbeit vorgestellten Methoden die höchste NMJ-Qualität, um selbst subtile Veränderungen in NMJ als Ganzes oder in einer seiner Komponenten zu identifizieren, zu bewerten und zu bewerten.
Abbildung 1: EDL und soleus anatomische Landmarken. Bild-Highlight (A) EDL und (B) Soleus-Position zwischen den anderen Muskeln der unteren Hintergliedmaße der Ratte. Insets zeigen Schemata der Hintergliedmaßenmuskeln in der Nähe von EDL (rot) und Soleus (grün)Muskeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Neuromuskuläre Verbindung von EDL-Muskelfasern auf ganzer Montierung. (A) Postsynaptische Komponente von NMJ, nachgewiesen mit Alpha-Bungarotoxin (Btx, Magenta), einer Sonde, die spezifisch an die Acetylcholinrezeptoren (AChR) bindet. (B) Motorterminal mit Anti-Neurofilamenten (Anti-Nf, grün) detektiert. (C,D) Synaptische Komponenten werden schematisiert, um die Parameter (Außen- und Innengrenzen) zu veranschaulichen, die die Messungen (Gesamtfläche, präsynaptische und postsynaptische Fläche) definiert haben, die für die im Protokoll beschriebene morphometrische Analyse verwendet wurden. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Prä- und postsynaptische Veränderungen, die in NMJs eines ALS-Modells beobachtet wurden. Repräsentative konfokale Bilder von Ganz-Mount-NMJs, die in Präparaten von EDL-Muskelfasern erhalten wurden, die zum Nachweis von Neurofilamenten (grün), AChR (magenta) und Kern (blau) von nicht-transgenen (-/-) oder transgenen (hSOD1G93A/-) Ratten gefärbt wurden. (A,C) Nicht-transgene Ratten haben eine normale NMJ-Morphologie (Brezelform), sowohl wenn das motorische Ende mit Anti-Phos-Nf (A) oder Anti-Nf (C) visualisiert wird. (B,D) Transgene Ratten zeigen einen kompakteren postsynaptischen Bereich und kleinere präsynaptische Terminals mit einer Verringerung des Neurofilament-Phosphorylierungssignals. Maßstabsleiste = 50 μm.
Abbildung 4: Morphometrische Auswertung des postsynaptischen NMJ-Elements in EDL-Muskeln von 180 Tage alten männlichen hSOD1G93A-Ratten. Repräsentative konfokale Bilder von postsynaptischen Komponenten in (A,D)nicht-transgenen und (B,E) transgenen Tieren. Bewertung des postsynaptischen Bereichs (C) und des postsynaptischen Dichteindex (F) in NMJs von nicht-transgenen (festen Säulen) und transgenen (gestreiften Säulen) Tieren. Während die postsynaptische Fläche bei transgenen Tieren leicht reduziert war, stieg der postsynaptische Index stärker an, was den Grad der NMJ-Verdichtung hervorhob, wie durch eine reduzierte Gesamtfläche bei transgenen Tieren angezeigt, wie in Tabelle 1gezeigt. Maßstabsleiste = 50 μm. Die dargestellten Daten sind mittelwert ± SEM. (*) und (***) angegeben p<0,05 bzw. p<0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Morphometrische Auswertung des präsynaptischen NMJ-Elements in EDL-Muskeln von 180 Tage alten männlichen hSOD1G93A-Ratten. Angesichts der Bedeutung der NMJ-Demontage bei ALS-Erkrankungen wurde die Qualität des Präparats bewertet, indem nicht nur das Ausmaß der Nerventerminalrückziehung, sondern auch die Möglichkeit, Veränderungen in der Phosphorylierung des präsynaptischen NMJ-Elements zu erkennen, analysiert wurden. Repräsentative konfokale Bilder der präsynaptischen Komponente in (A, D) nicht-transgenen und (B, E) transgenen Tieren, die mit (A, B) Anti-Phos-Nf oder (D, E) Anti-Nf-Antikörpern nachgewiesen wurden. Bewertung der präsynaptischen Fläche, begrenzt durch (C) phosphorylierte und (F) nicht phosphorylierte Neurofilamente in NMJs von nicht-transgenen (festen Säulen) und transgenen (gestreiften Säulen) Tieren. Beachten Sie, dass diese Bereiche bei nicht-transgenen Tieren sehr ähnlich sind, während sie eine signifikante Verringerung der NMJs transgener Tiere aufweisen. Maßstabsleiste = 50 μm. Die dargestellten Daten sind mittelwert ± SEM. (****) angegeben p<0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Auswertung des Innervationsstatus an ganz montierten NMJs von EDL hSOD1G93A-Fasern. Der Coverage-Index wird häufig verwendet, um den Zustand der Innervation zu bewerten. Es wird davon ausgegangen, dass "vollständig innervierte" NMJs einen 
Abdeckungsindex von 50% aufweisen, während diejenigen, die "teilweise innerviert" sind, Abdeckungen zwischen ≥20% und ≤50% aufweisen und diejenigen, die vakant sind, als "denervated" gelten. Repräsentative konfokale Bilder von (A,D)nicht-transgenen und (B,E) transgenen NMJs, die präsynaptische und postsynaptische Elemente zeigen, die mit (A, B) Anti-Phos-Nf oder (D, E) Anti-Nf-Antikörpern nachgewiesen wurden, um das motorische Terminal zu beobachten. Bewertung der Abdeckung mit (C) phosphorylierten und (F) nicht phosphorylierten Neurofilamenten in NMJs von nicht-transgenen (festen Säulen) und transgenen (gestreiften Säulen) Tieren. Die Bilder und Grafiken zeigen Hinweise darauf, dass NMJs von transgenen Tieren einen niedrigeren Abdeckungsindex aufweisen als nicht-transgene. Darüber hinaus ist bei transgenen Tieren der Abdeckungsindex von phosphorylierten Neurofilamenten niedriger ( 18%) als bei dem Nachweis der nicht phosphorylierten Form ( 25%). Diese Tatsache wird durch die Beziehung zwischen beiden Indizes bestätigt, wie in Tabelle 1 dargestellt. Beachten Sie, dass die Qualität der Vorbereitungen es ermöglicht, 50% des Abdeckungsindex zu erhalten, der für die NMJs als "vollständig innerviert" erwartet wird. Maßstabsleiste = 50 μm. Die dargestellten Daten sind mittelwert ± SEM. (***) und (****) angegeben p<0,001 bzw. p<0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1. Morphometrische Parameter und Verhältnisse, die aus ganz montierten NMJs von nicht-transgenen und transgenen EDL-Fasern erhalten werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Dissektion von zwei Rattenskeletten (eine langsame Zuckung und die andere schnell zucken), die Fasermuskelisolation und die Immunfluoreszenzdetektion von prä- und postsynaptischen Markern vor, um NMJ-Veränderungen sowie Montage- / Demontageprozesse quantitativ zu bewerten. Diese Art von Protokoll kann in den Nagetiermodellen41,42 nützlichsein,um NMJ während physiologischer oder pathologischer Prozesse zu bewerten, wie hier in einem Modell der Motoneurondegeneration wie bei den ALS hSOD1G93A-Ratten veranschaulicht.
Um Erfolg und vorteilhafte Ergebnisse zu erzielen, ist es notwendig, einige Tipps zu beachten. Zum Beispiel ermöglicht das beschriebene Protokoll die sofortige Verwendung von sezierten Muskeln. Wenn es jedoch notwendig ist, um den Muskel länger zu erhalten, ermöglicht die Verwendung von DPBS mit 0,05% Natriumazid plus 4 ° C Lagerung eine Verlängerung des ausgezeichneten Muskelerhalts bis zu 4 Wochen. Bei Verwendung dieser Option müssen vor Beginn des Färbevorgangs umfangreiche Wäschen mit DPBS durchgeführt werden (jeweils 5x, 10 min). Eine weitere hilfreiche Option, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, ist die Senkung der PFA-Konzentration auf 0,5%, da dies die Autofluoreszenz des Muskels reduziert. Dies muss mit einer längeren Fixierung bis zu 24 h bei 4 °C einhergehen.
In Bezug auf die Faserisolierung erzeugen kleinere Gruppen von Fasern bessere Immundetektionseigenschaften. Die auf silanisierten Objektträgern getrockneten Fasern müssen innerhalb von 2 bis 3 Tagen verwendet werden. Nach dieser Zeit sind die Immundetektionen nicht von guter Qualität.
Eine Alternative zu getrockneten Fasern auf silanisierten Objektträgern besteht darin, einen Satz teilweise isolierter Fasern zu erzeugen, die vom Sehnengewebe in einem der Faserenden zusammengehalten werden (ein "Büschel" von Muskelfasern) und Inkubationen in Mikrozentrifugenröhrchen nach der "frei schwebenden" Methode durchzuführen. Die Verwendung dieser Option ist notwendig, um die Inkubationszeiten der Antikörper um mehrere Stunden (24-48 h) sowie die Anzahl der Wäschen (mindestens 6 von jeweils 10 minuten) zu erhöhen.
In Bezug auf die Faserisolierung ohne Beschädigung ist es notwendig, die "Neckerei" durchzuführen, indem die Enden entfernt werden, an denen die Sehne sanft in entgegengesetzte Richtungen gezogen wird, um eine Fasertrennung zu erreichen.
Ein weiterer kritischer Schritt zur Verbesserung der Immundetektion ist die Zugabe von 1% Triton X-100 und 50 mM Glycin im BB. Dies ist wichtig, um Präparate zu erhalten, die eine homogene Färbung und einen kleinen Hintergrund haben. Es ist auch erwähnenswert, dass ein kleiner Hintergrund von Vorteil sein kann, wenn unbefleckte Fasern abgebildet werden müssen. Der Faserdurchmesser ist gut zu messen weit weg vom NMJ-Feld, da beschrieben wird, dass er auf diesem Niveau erhöht werden kann. Bestimmen Sie daher den Faserdurchmesser in einem Abstand, der dem Wert eines NMJ-Profils entspricht.
Mit dem vorgestellten Verfahren ist es möglich, NMJ-Komponenten unter physiologischen Bedingungen zu identifizieren und zu quantifizieren. Es ermöglicht auch die Untersuchung früher pathologischer Schlüsselereignisse wie NMJ-Abbau24 und Verlust von phosphoryliertem Neurofilament in terminalen Enden39, wie in DER ALS-Pathogenese beschrieben. Aus diesem Grund bietet das beschriebene Protokoll einen alternativen und einfachen Ansatz, um ein besseres Verständnis des NMJ-Umbaus zu erhalten, was darauf hindeutet, dass morphologische Merkmale visualisierte Merkmale nützliche Werkzeuge sein können, um den degenerierenden Zustand von NMJs zu diagnostizieren oder verschiedene therapeutische Ansätze zu bewerten. Es ist auch auf andere Krankheitsmodelle wie die von Charcot-Marie-Tooth41 und spinaler Muskelatrophie42 anwendbar, die eine NMJ-Störung aufweisen.
Darüber hinaus können die in dieser Arbeit beschriebenen Ansätze verwendet werden, um die Schwann-Zellen zu identifizieren, die diese dreigliedrige Synapse integrieren, und schließlich einige ihrer Rollen während des NMJ-Umbaus zu bewerten43. Studien können an Neugeborenen bis zu Erwachsenen, unter physiologischen Bedingungen oder als Reaktion auf verschiedene Behandlungen, die sich auf das neuromuskuläre System auswirken, durchgeführt werden.
Trotz der hervorragenden Handhabung, die erforderlich ist, um Proben zusammen mit dem Zeitaufwand für manuelle Messungen zu sezieren und zu etikettieren, ermöglicht die hier vorgestellte Methodik eine optimale Markierung der verschiedenen NMJ-Komponenten aufgrund der erleichterten Penetration von Antikörpern und Sonden. Obwohl in abschnittsweisen Muskelpräparaten eine bessere Penetration erreicht werden kann, bewahrt das Necken die morphologische 3D-Integrität aller synaptischen Komponenten, die in Muskelabschnitten verloren gehen können. Es vermeidet auch die gesamte Vorbereitung, die erforderlich ist, um Abschnitte wie die Einbeziehung des Muskelstücks und die weitere Antigenentnahme durchzuführen, um eine praktikable Erkennung zu erhalten. Darüber hinaus ermöglicht das Necken im Vergleich zu ganzen Mount-Präparaten, die die vollständigen Innervationsmuster bewahren, die Untersuchung isolierter Fasern. Dies kann ein wesentlicher Vorteil sein, wenn dies zur Beurteilung der Faserheterogenität unter pathologischen Bedingungen erforderlich ist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Vielen Dank an CSIC und PEDECIBA für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit; an Natalia Rosano für ihre Manuskriptkorrekturen; an Marcelo Casacuberta, der das Video macht, und an Nicolás Bolatto, der ihm seine Stimme ge lieh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
