Evnen til præcist at opdage neuromuskulære krydskomponenter er afgørende for at evaluere ændringer i sin arkitektur på grund af patologiske eller udviklingsmæssige processer. Her præsenterer vi en komplet beskrivelse af en enkel metode til at opnå billeder i høj kvalitet af hele monterede neuromuskulære kryds, der kan bruges til at udføre kvantitative målinger.
Det neuromuskulære kryds (NMJ) er et specialiseret kontaktpunkt mellem motornerven og skeletmusklen. Denne perifere synapse udviser høj morfologisk og funktionel plasticitet. I mange nervesystem lidelser, NMJ er en tidlig patologisk mål resulterer i neurotransmission fiasko, svaghed, atrofi, og selv i muskelfibre død. På grund af dens relevans kan muligheden for kvantitativt at vurdere visse aspekter af forholdet mellem NMJ-komponenter hjælpe med at forstå de processer, der er forbundet med dens samling / demontering. Den første hindring, når du arbejder med muskler, er at få den tekniske ekspertise til hurtigt at identificere og dissekere uden at beskadige deres fibre. Den anden udfordring er at bruge højkvalitetsdetekteringsmetoder til at opnå NMJ-billeder, der kan bruges til at udføre kvantitativ analyse. Denne artikel præsenterer en trin-for-trin protokol til dissekering extensor digitorum longus og soleus muskler fra rotter. Det forklarer også brugen af immunfluorescens til at visualisere præ- og postsynaptiske elementer af hele mount NMJs. Opnåede resultater viser, at denne teknik kan bruges til at etablere synapsisens mikroskopiske anatomi og identificere subtile ændringer i status for nogle af dens komponenter under fysiologiske eller patologiske forhold.
Pattedyret neuromuskulære krydset (NMJ) er en stor cholinrgic trepartssynapse består af den motoriske neuron nerve slutter, den postsynaptiske membran på skeletmuskel fiber, og terminalen Schwann celler1,2,3. Denne synapse udviser høj morfologisk og funktionel plasticitet4,5,6,7,8, selv i voksenalderen, når NMJs kan gennemgå dynamiske strukturelle ændringer. For eksempel har nogle forskere vist, at motornerveender løbende ændrer deres form ved mikrometerskalaen9. Det er også blevet rapporteret, at NMJ’s morfologi reagerer på funktionelle krav, ændret brug, aldring, motion eller variationer i lokomotorisk aktivitet4,10,11,12,13,14,15. Således er træning og manglende brug vigtig stimulus til at ændre nogle egenskaber ved NMJ, såsom dens størrelse, længde, spredning af synaptiske vesikler og receptorer samt nerveterminalforgrening14,16,17,18,19,20.
Desuden har det vist sig, at enhver strukturel ændring eller degeneration af dette vitale kryds kan resultere i motor neuron celledød og muskelatrofi21. Det menes også, at ændret kommunikation mellem nerver og muskler kan være ansvarlig for de fysiologiske aldersrelaterede NMJ-ændringer og muligvis for dets ødelæggelse i patologiske tilstande. Neuromuskulære krydset demontering spiller en afgørende rolle i starten af Amyotrofisk Lateral Sklerose (ALS), en neurodegenerativ sygdom, der udgør et af de bedste eksempler på nedsat muskel-nerve samspil3. På trods af de mange undersøgelser udført på motor neuron dysfunktion, er det stadig diskuteres, om forringelsen observeret i ALS opstår på grund af den direkte skade i motor neuron og derefter strækker sig til cortico-spinal fremskrivninger22; eller hvis det bør betragtes som en distal axonopati, hvor degeneration begynder i nerveender og skrider frem mod motor neuron somas23,24. I betragtning af kompleksiteten af ALS-patologi er det logisk at overveje, at der opstår en blanding af uafhængige processer. Da NMJ er den centrale aktør i det fysiopatologiske samspil mellem muskler og nerve, repræsenterer dets destabilisering et omdrejningspunkt i sygdommens oprindelse, der er relevant at analysere.
Pattedyrets neuromuskulære system er funktionelt organiseret i diskrete motorenheder, der består af en motorisk neuron og muskelfibrene, der udelukkende er innerveret af nerveterminalen. Hver motorenhed har fibre med lignende eller identiske strukturelle og funktionelle egenskaber25. Motor neuron selektiv rekruttering gør det muligt at optimere muskelrespons på funktionelle krav. Nu er det klart, at pattedyr skeletmusklerne er sammensat af fire forskellige fibertyper. Nogle muskler er navngivet i henhold til egenskaberne ved deres mest rigelige fibertype. For eksempel bærer soleus (en bageste muskel i bagbenet, der er involveret i vedligeholdelsen af kropsholdningen) et flertal af langsomme trækenheder (type 1) og anerkendes som en langsom muskel. I stedet er extensor digitorum longus (EDL) hovedsageligt sammensat af enheder med lignende hurtige rykegenskaber (type 2 fibre) og er kendt som en hurtig muskel specialiseret til gradvise bevægelser, der er nødvendige for bevægelse. Med andre ord, selvom voksne muskler er plastiske på grund af de hormonelle og neurale påvirkninger, bestemmer dens fibersammensætning evnen til at udføre forskellige aktiviteter, som det ses i soleus, der oplever kontinuerlig lavintensitetsaktivitet og EDL, der udviser et hurtigere enkelt ryk. Andre funktioner, der er variable blandt forskellige typer muskelfibre, er relateret til deres struktur (mitokondrieindhold, udvidelse af sarcoplasmic reticulum, tykkelsen af Z-linjen), myosin ATPase-indhold og myosin tung kædesammensætning26,27,28,29.
For gnaver NMJs er der betydelige forskelle mellemmusklerne 28,29. Morfometriske analyser udført i soleus og EDL fra rotter afslørede en positiv sammenhæng mellem synaptisk område og fiberdiameter (dvs. synaptisk område i soleus langsomme fibre er større end i EDL hurtige fibre), men forholdet mellem NMJ-området og fiberstørrelse er ens i begge muskler30,31. Også i forhold til nerveterminalerne var endepladens absolutte områder i type 1-fibre lavere end i type 2-fibre, mens normaliseringen af fiberdiameteren gjorde områder af nerveterminaler i type 1 fibre de største32.
Meget få undersøgelser fokuserer dog på morfometrisk analyse for at vise tegn på ændringer i nogle af NMJ-komponenterne33,34. På grund af NMJ’s relevans i organismens funktion, hvis morfologi og fysiologi ændres i forskellige patologier, er det vigtigt at optimere dissektionsprotokoller for forskellige typer muskler med kvalitet nok til at muliggøre visualisering af hele NMJ-strukturen. Det er også nødvendigt at evaluere forekomsten af præ- eller postsynaptiske ændringer i forskellige eksperimentelle situationer eller tilstande som aldring eller motion35,36,37,38. Derudover kan det være nyttigt at bevise mere subtile ændringer i NMJ-komponenter som ændret neurofilamentphoosphorylation i terminalnervenenderne som rapporteret i ALS39.
I denne artikel præsenterer vi en detaljeret protokol for dissektion af to rotte skeletmuskler (en langsom-twitch og den anden hurtige ryk), fiber muskelisolering og immunfluorescens påvisning af præ- og postsynaptiske markører for kvantitativt at vurdere NMJ-ændringer samt samling / demonteringsprocesser. Denne form for protokol kan være nyttig i gnavermodeller41,42 til evaluering af NMJ under fysiologiske eller patologiske processer som eksemplificeret he…
The authors have nothing to disclose.
Mange tak til CSIC og PEDECIBA for den finansielle støtte til dette arbejde. til Natalia Rosano for hendes manuskript rettelser; til Marcelo Casacuberta, der gør videoen og til Nicolás Bolatto for udlån hans stemme for det.
Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 – AiryScan | |
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Glycine | Amresco | 167 | |
BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
Tris | Amresco | 497 | |
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |