Dissektion af enkelt skeletmuskelfibre til immunfluorescerende og morfometriske analyser af hele mount neuromuskulære vejkryds
Summary
Evnen til præcist at opdage neuromuskulære krydskomponenter er afgørende for at evaluere ændringer i sin arkitektur på grund af patologiske eller udviklingsmæssige processer. Her præsenterer vi en komplet beskrivelse af en enkel metode til at opnå billeder i høj kvalitet af hele monterede neuromuskulære kryds, der kan bruges til at udføre kvantitative målinger.
Abstract
Det neuromuskulære kryds (NMJ) er et specialiseret kontaktpunkt mellem motornerven og skeletmusklen. Denne perifere synapse udviser høj morfologisk og funktionel plasticitet. I mange nervesystem lidelser, NMJ er en tidlig patologisk mål resulterer i neurotransmission fiasko, svaghed, atrofi, og selv i muskelfibre død. På grund af dens relevans kan muligheden for kvantitativt at vurdere visse aspekter af forholdet mellem NMJ-komponenter hjælpe med at forstå de processer, der er forbundet med dens samling / demontering. Den første hindring, når du arbejder med muskler, er at få den tekniske ekspertise til hurtigt at identificere og dissekere uden at beskadige deres fibre. Den anden udfordring er at bruge højkvalitetsdetekteringsmetoder til at opnå NMJ-billeder, der kan bruges til at udføre kvantitativ analyse. Denne artikel præsenterer en trin-for-trin protokol til dissekering extensor digitorum longus og soleus muskler fra rotter. Det forklarer også brugen af immunfluorescens til at visualisere præ- og postsynaptiske elementer af hele mount NMJs. Opnåede resultater viser, at denne teknik kan bruges til at etablere synapsisens mikroskopiske anatomi og identificere subtile ændringer i status for nogle af dens komponenter under fysiologiske eller patologiske forhold.
Introduction
Pattedyret neuromuskulære krydset (NMJ) er en stor cholinrgic trepartssynapse består af den motoriske neuron nerve slutter, den postsynaptiske membran på skeletmuskel fiber, og terminalen Schwann celler1,2,3. Denne synapse udviser høj morfologisk og funktionel plasticitet4,5,6,7,8, selv i voksenalderen, når NMJs kan gennemgå dynamiske strukturelle ændringer. For eksempel har nogle forskere vist, at motornerveender løbende ændrer deres form ved mikrometerskalaen9. Det er også blevet rapporteret, at NMJ’s morfologi reagerer på funktionelle krav, ændret brug, aldring, motion eller variationer i lokomotorisk aktivitet4,10,11,12,13,14,15. Således er træning og manglende brug vigtig stimulus til at ændre nogle egenskaber ved NMJ, såsom dens størrelse, længde, spredning af synaptiske vesikler og receptorer samt nerveterminalforgrening14,16,17,18,19,20.
Desuden har det vist sig, at enhver strukturel ændring eller degeneration af dette vitale kryds kan resultere i motor neuron celledød og muskelatrofi21. Det menes også, at ændret kommunikation mellem nerver og muskler kan være ansvarlig for de fysiologiske aldersrelaterede NMJ-ændringer og muligvis for dets ødelæggelse i patologiske tilstande. Neuromuskulære krydset demontering spiller en afgørende rolle i starten af Amyotrofisk Lateral Sklerose (ALS), en neurodegenerativ sygdom, der udgør et af de bedste eksempler på nedsat muskel-nerve samspil3. På trods af de mange undersøgelser udført på motor neuron dysfunktion, er det stadig diskuteres, om forringelsen observeret i ALS opstår på grund af den direkte skade i motor neuron og derefter strækker sig til cortico-spinal fremskrivninger22; eller hvis det bør betragtes som en distal axonopati, hvor degeneration begynder i nerveender og skrider frem mod motor neuron somas23,24. I betragtning af kompleksiteten af ALS-patologi er det logisk at overveje, at der opstår en blanding af uafhængige processer. Da NMJ er den centrale aktør i det fysiopatologiske samspil mellem muskler og nerve, repræsenterer dets destabilisering et omdrejningspunkt i sygdommens oprindelse, der er relevant at analysere.
Pattedyrets neuromuskulære system er funktionelt organiseret i diskrete motorenheder, der består af en motorisk neuron og muskelfibrene, der udelukkende er innerveret af nerveterminalen. Hver motorenhed har fibre med lignende eller identiske strukturelle og funktionelle egenskaber25. Motor neuron selektiv rekruttering gør det muligt at optimere muskelrespons på funktionelle krav. Nu er det klart, at pattedyr skeletmusklerne er sammensat af fire forskellige fibertyper. Nogle muskler er navngivet i henhold til egenskaberne ved deres mest rigelige fibertype. For eksempel bærer soleus (en bageste muskel i bagbenet, der er involveret i vedligeholdelsen af kropsholdningen) et flertal af langsomme trækenheder (type 1) og anerkendes som en langsom muskel. I stedet er extensor digitorum longus (EDL) hovedsageligt sammensat af enheder med lignende hurtige rykegenskaber (type 2 fibre) og er kendt som en hurtig muskel specialiseret til gradvise bevægelser, der er nødvendige for bevægelse. Med andre ord, selvom voksne muskler er plastiske på grund af de hormonelle og neurale påvirkninger, bestemmer dens fibersammensætning evnen til at udføre forskellige aktiviteter, som det ses i soleus, der oplever kontinuerlig lavintensitetsaktivitet og EDL, der udviser et hurtigere enkelt ryk. Andre funktioner, der er variable blandt forskellige typer muskelfibre, er relateret til deres struktur (mitokondrieindhold, udvidelse af sarcoplasmic reticulum, tykkelsen af Z-linjen), myosin ATPase-indhold og myosin tung kædesammensætning26,27,28,29.
For gnaver NMJs er der betydelige forskelle mellemmusklerne 28,29. Morfometriske analyser udført i soleus og EDL fra rotter afslørede en positiv sammenhæng mellem synaptisk område og fiberdiameter (dvs. synaptisk område i soleus langsomme fibre er større end i EDL hurtige fibre), men forholdet mellem NMJ-området og fiberstørrelse er ens i begge muskler30,31. Også i forhold til nerveterminalerne var endepladens absolutte områder i type 1-fibre lavere end i type 2-fibre, mens normaliseringen af fiberdiameteren gjorde områder af nerveterminaler i type 1 fibre de største32.
Meget få undersøgelser fokuserer dog på morfometrisk analyse for at vise tegn på ændringer i nogle af NMJ-komponenterne33,34. På grund af NMJ’s relevans i organismens funktion, hvis morfologi og fysiologi ændres i forskellige patologier, er det vigtigt at optimere dissektionsprotokoller for forskellige typer muskler med kvalitet nok til at muliggøre visualisering af hele NMJ-strukturen. Det er også nødvendigt at evaluere forekomsten af præ- eller postsynaptiske ændringer i forskellige eksperimentelle situationer eller tilstande som aldring eller motion35,36,37,38. Derudover kan det være nyttigt at bevise mere subtile ændringer i NMJ-komponenter som ændret neurofilamentphoosphorylation i terminalnervenenderne som rapporteret i ALS39.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel præsenterer vi en detaljeret protokol for dissektion af to rotte skeletmuskler (en langsom-twitch og den anden hurtige ryk), fiber muskelisolering og immunfluorescens påvisning af præ- og postsynaptiske markører for kvantitativt at vurdere NMJ-ændringer samt samling / demonteringsprocesser. Denne form for protokol kan være nyttig i gnavermodeller41,42 til evaluering af NMJ under fysiologiske eller patologiske processer som eksemplificeret he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mange tak til CSIC og PEDECIBA for den finansielle støtte til dette arbejde. til Natalia Rosano for hendes manuskript rettelser; til Marcelo Casacuberta, der gør videoen og til Nicolás Bolatto for udlån hans stemme for det.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 – AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -. S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
