Summary
Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.
Abstract
De neuromusculaire verbinding (NMJ) is een gespecialiseerd contactpunt tussen de motorische zenuw en de skeletspier. Deze perifere synaps vertoont een hoge morfologische en functionele plasticiteit. Bij tal van aandoeningen van het zenuwstelsel is NMJ een vroeg pathologisch doelwit dat resulteert in neurotransmissiefalen, zwakte, atrofie en zelfs in spiervezeldood. Vanwege de relevantie ervan kan de mogelijkheid om bepaalde aspecten van de relatie tussen NMJ-componenten kwantitatief te beoordelen, helpen om de processen in verband met de assemblage / demontage ervan te begrijpen. Het eerste obstakel bij het werken met spieren is om de technische expertise op te doen om snel te identificeren en te ontleden zonder hun vezels te beschadigen. De tweede uitdaging is om hoogwaardige detectiemethoden te gebruiken om NMJ-beelden te verkrijgen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve analyses uit te voeren. Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol voor het ontleden van extensor digitorum longus en soleus spieren van ratten. Het verklaart ook het gebruik van immunofluorescentie om pre- en postsynaptische elementen van nmj's met hele montering te visualiseren. Verkregen resultaten tonen aan dat deze techniek kan worden gebruikt om de microscopische anatomie van de synapsis vast te stellen en subtiele veranderingen in de status van sommige van zijn componenten onder fysiologische of pathologische omstandigheden te identificeren.
Introduction
De zoogdier neuromusculaire verbinding (NMJ) is een grote cholinerge tripartiete synaps bestaande uit de motor neuron zenuw einde, de postsynaptische membraan op de skelet spiervezel, en de terminale Schwann cellen1,2,3. Deze synaps vertoont een hoge morfologische en functionele plasticiteit4,5,6,7,8,zelfs tijdens de volwassenheid wanneer NMJ's dynamische structurele wijzigingen kunnen ondergaan. Sommige onderzoekers hebben bijvoorbeeld aangetoond dat motorische zenuwuiteinden voortdurend van vorm veranderen op de micrometerschaal9. Er is ook gemeld dat de morfologie van de NMJ reageert op functionele vereisten, gewijzigd gebruik, veroudering, oefening of variaties in motorische activiteit4,10,11,12,13,14,15. Training en gebrek aan gebruik vertegenwoordigen dus essentiële stimulansen om bepaalde kenmerken van de NMJ te wijzigen, zoals de grootte, lengte, dispersie van synaptische blaasjes en receptoren, evenals zenuwterminalvertakking14,16,17,18,19,20.
Bovendien is aangetoond dat elke structurele verandering of degeneratie van deze vitale verbinding kan leiden tot motorneuronceldood en spieratrofie21. Er wordt ook gedacht dat veranderde communicatie tussen zenuwen en spieren verantwoordelijk kan zijn voor de fysiologische leeftijdsgebonden NMJ-veranderingen en mogelijk voor de vernietiging ervan in pathologische toestanden. Neuromusculaire junction ontmanteling speelt een cruciale rol bij het begin van Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS), een neurodegeneratieve ziekte die een van de beste voorbeelden is van verminderd spier-zenuwspel3. Ondanks de talrijke studies uitgevoerd op motorneurondisfunctie, wordt nog steeds gediscussieerd of de verslechtering waargenomen in ALS optreedt als gevolg van de directe schade in het motorneuron en zich vervolgens uitstrekt tot de cortico-spinale projecties22; of als het moet worden beschouwd als een distale axonoopathie waarbij degeneratie begint in de zenuwuiteinden en vordert naar het motorneuron somas23,24. Gezien de complexiteit van ALS-pathologie is het logisch om te overwegen dat er een mix van onafhankelijke processen plaatsvindt. Aangezien NMJ de centrale speler is van het fysiopathologische samenspel tussen spier en zenuw, vertegenwoordigt de destabilisatie ervan een cruciaal punt in de oorsprong van de ziekte dat relevant is om te worden geanalyseerd.
Het neuromusculaire systeem van zoogdieren is functioneel georganiseerd in discrete motorische eenheden, bestaande uit een motorneuron en de spiervezels die uitsluitend door de zenuwterminal worden geinvat. Elke motorunit heeft vezels met vergelijkbare of identieke structurele en functionele eigenschappen25. Motorneuron selectieve rekrutering maakt het mogelijk om de spierrespons op functionele eisen te optimaliseren. Nu is het duidelijk dat skeletspieren van zoogdieren uit vier verschillende vezeltypen bestaan. Sommige spieren worden genoemd volgens de kenmerken van hun meest voorkomende vezeltype. Bijvoorbeeld, de soleus (een achterste spier van de achterste ledemaat betrokken bij het behoud van de lichaamshouding) draagt een meerderheid van slow-twitch eenheden (type 1) en wordt herkend als een langzame spier. In plaats daarvan bestaat extensor digitorum longus (EDL) in wezen uit eenheden met vergelijkbare fast-twitch-eigenschappen (type 2-vezels) en staat bekend als een snelle spier die gespecialiseerd is in phasische bewegingen die nodig zijn voor voortbeweging. Met andere woorden, hoewel volwassen spieren plastic van aard zijn vanwege de hormonale en neurale invloeden, bepaalt de vezelsamenstelling het vermogen om verschillende activiteiten uit te voeren, zoals te zien is in soleus dat continue activiteit met lage intensiteit ervaart en EDL die een snellere enkele twitch vertoont. Andere kenmerken die variabel zijn tussen verschillende soorten spiervezels zijn gerelateerd aan hun structuur (mitochondriale inhoud, uitbreiding van sarcoplasmatisch reticulum, dikte van de Z-lijn), myosine ATPase-gehalte en myosine zware kettingsamenstelling26,27,28,29.
Voor knaagdier NMJ's zijn er significante verschillen tussen spieren28,29. Morfometrische analyses uitgevoerd in soleus en EDL van ratten toonden een positieve correlatie aan tussen het synaptische gebied en de vezeldiameter (d.w.z. het synaptische gebied in soleus langzame vezels is groter dan in EDL snelle vezels), maar de verhouding tussen NMJ-gebied en vezelgrootte is vergelijkbaar in beide spieren30,31. Ook, met betrekking tot de zenuwterminals, waren de eindplaat absolute gebieden in type 1 vezels lager dan in type 2 vezels, terwijl de normalisatie door vezeldiameter gebieden van zenuwterminals in type 1 vezels de grootste32maakte.
Er zijn echter maar weinig studies gericht op morfometrische analyse om het bewijs van veranderingen in sommige NMJ-componenten33,34 aante tonen . Vanwege de relevantie van de NMJ in de functie van het organisme, waarvan de morfologie en fysiologie in verschillende pathologieën worden gewijzigd, is het dus belangrijk om dissectieprotocollen van verschillende soorten spieren te optimaliseren met voldoende kwaliteit om de visualisatie van de hele NMJ-structuur mogelijk te maken. Het is ook noodzakelijk het optreden van pre - of postsynaptische veranderingen in verschillende experimentele situaties of omstandigheden zoals veroudering of oefening35,36,37,38te evalueren . Bovendien kan het nuttig zijn om subtielere veranderingen in NMJ-componenten te bewijzen, zoals veranderde neurofilamentfosforylatie in de terminale zenuwuiteinden zoals gerapporteerd in ALS39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de nationale wet nr. 18611 voor de verzorging van dieren die voor experimentele doeleinden worden gebruikt. Het protocol werd goedgekeurd door het Institutioneel Ethisch Comité (CEUA IIBCE, Protocolnummer 004/09/2015).
1. Spierdissectie (Dag 1)
OPMERKING: Maak voor aanvang 40 ml 0,5% paraformaldehyde (PFA), pH 7,4 in dulbecco's fosfaatoplossing (DPBS). Maak optioneel 20 ml van 4% PFA. Bereid 5 ml aliquots en vries in bij -20 °C. Ontdooi op de dag van dissectie een aliquot van 4% en voeg 35 ml DPBS toe om 40 ml 0,5% PFA te verkrijgen.
-
Isolatie van EDL (fast-twitch spier)
- Euthanaseer een rat. Plaats het dier met de buik naar boven gericht. Maak een eerste incisie met behulp van een chirurgisch mes tussen de tenen naar de achterpoot.
OPMERKING: In dit geval werd een intraperitoneale injectie van 90:10 mg/Kg ketamine:xylazine gegeven om de rat te euthanaseren, maar andere anesthesiemogelijkheden zijn ook toegestaan. - Pel de huid af en trek deze naar boven totdat de rattenknie wordt blootgesteld.
- Om de EDL te vinden, volgt u de voetpezen tot aan het ringvormige ligament. Dit ligament omcirkelt twee pezen. Knip het ligament tussen de twee pezen met eenbandige schaar (of iets dergelijks). Identificeer de EDL-pees door beide op te tillen en kies degene die de tenen naar boven laat bewegen.
- Snijd de pees met een uniband schaar. Begin vervolgens, terwijl u de pees vasthoudt met een fijn biologisch pincet, langzaam de EDL-spier te scheiden van de tibialis-anterieure, de peroneus brevis en peroneus longus40 (zie figuur 1A).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de spier zonder schade wordt gescheiden. Doe dit door de rest van de laterale spieren door te snijden om een pad tussen hen te openen (de EDL heeft geen oppervlakkige locatie) terwijl u de EDL-spier vasthoudt en optilt. - Om de spier volledig te isoleren, snijdt u de pees die aan de rattenknie is bevestigd met eenbandschaar.
- Dompel de ontlede spier onder in 5 ml 0,5% PFA en laat 24 uur bij 4 °C staan. Niet eventueel de spier in een stuk karton en draai deze met de spier naar beneden. Dompel het vervolgens volledig onder in 8 ml van de fixatieve oplossing. Deze stap helpt bij het behouden van de spier langwerpig tijdens het fixatieproces.
- Euthanaseer een rat. Plaats het dier met de buik naar boven gericht. Maak een eerste incisie met behulp van een chirurgisch mes tussen de tenen naar de achterpoot.
-
Isolatie van soleus (slow-twitch spier)
- Draai het dier om (de buik is nu naar beneden gericht). Snijd door de huid de calcaneale pees met behulp van een chirurgisch mes.
- Met behulp van het biologische pincet en de unibandschaar scheidt u de gastrocnemiusspier van de botten, waardoor een "gespierd deksel" ontstaat. De soleus zal zich aan de binnenkant van het spierdeksel zijn. Het kan worden geïdentificeerd omdat het rood van kleur is en een platte morfologie heeft.
- Bereik en til met een biologisch pincet de soleuspees die boven de gastrocnemius ligt (zie figuur 1B).
- Snijd de pees met een uniband schaar. Til de hele spier op terwijl u enkele van de zwakke aanhechtingspunten (d.w.z. neurovasculaire elementen) snijdt. Ten slotte, om de soleusspier volledig te bevrijden, snijdt u de soleus fascicle die de calcaneale pees vormt met een uniband schaar.
- Herhaal stap 1.1.6 om ontlede soleusspier te repareren.
2. Geplaagde vezelbereiding (Dag 2)
- Spoel na 24 uur fixatie de spieren met 6 ml DPBS-oplossing 3x gedurende elk 10 minuten voordat u de spiervezels isoleert.
- Om de vezels te isoleren, zet je een spier op een microscoopschuif. Houd met behulp van een stereomicroscoop voorzichtig een van de pezen vast met één biologisch pincet. Begin vervolgens met het andere biologische pincet de pees langzaam te knijpen om de spiervezels te scheiden. Trek daarna het geknepen weefsel langzaam omhoog naar de tegenoverliggende spierpees. Het zal nodig zijn om deze actie meerdere keren te herhalen totdat meerdere kleine, geïsoleerde bundels worden verkregen.
- Plaats ze voorzichtig op een voorbehandelde glijbaan (verzand). Het is noodzakelijk om alle vezels op orde te houden, zodat ze elkaar niet overlappen. Op dit punt, lucht-droog de vezels voor 24 uur.
3. Immunofluorescentie
-
Primaire antilichaam incubatie (Dag 3)
OPMERKING: Alle stappen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. De meest efficiënte manier om de verschillende oplossingen te verwijderen zonder vezels van de dia los te maken, is door een insulinespuit te gebruiken.- Om het immunostainingproces te starten, omringt u de gedroogde geïsoleerde spiervezels met een pappen om een waterdichte barrière te creëren.
- Om de spiervezels te hydrateren, voegt u 200 μL gedestilleerd water toe gedurende 5 minuten en verandert u het water vervolgens in 200 μL DPBS voor de volgende incubatie van 5 minuten. Begin op dit punt met het labelen van immunofluorescentie.
- Incubeer vezels met 300 μL van een blokkeerbuffer (BB) met 50 mM glycine, 1% BSA en 1% Triton X-100 gedurende 30 minuten.
- Vervang BB door het primaire antilichaam in een door de fabrikant voorgestelde concentratie. Gebruik de BB om het antilichaam te verdunnen. Dit experiment gebruikte 400 μL SMI 32 of SMI 31 die niet-gefosforyleerde (Nf) of gefosforyleerde (Fos-Nf) neurofilament H bij 1/800 verdunning herkenden om de NMJ presynaptische component te detecteren.
OPMERKING: Wanneer u besluit het hele presynaptische element te herkennen in plaats van neurofilamentfosforylatie te evalueren, kiest u antilichamen tegen synapsine, synaptofysine of SV2a die eerder met succes werden gebruikt. - Incubeer de vezels met de primaire antilichaamverdunning bij 4 °C 's nachts (optioneel kan incubatie worden uitgevoerd bij 37 °C gedurende 1 uur). In beide gevallen is het belangrijk om de incubatie uit te voeren met behulp van een vochtige kamer.
-
Immunofluorescentie: Secundaire antilichaam incubatie (Dag 4)
- Verwijder het primaire antilichaam en spoel de vezels 3x gedurende 10 minuten elk met 500 μL DPBS en de laatste keer met BB.
- Verwijder deze laatste wasbeurt en voeg het fluorescerend gelabelde secundaire antilichaam verdund in BB toe. Voor dit experiment werd 500 μL geitenantimuis Alexa Fluor 488 gebruikt bij 1/1000 verdunning in BB. Om het postsynaptische element van de NMJ's te bekijken, werd 1:300 α-Bungarotoxine (Btx) biotine-XX geconjugeerd toegevoegd aan de secundaire antilichaamverdunning.
OPMERKING: De toevoeging van Btx-biotine XX maakt betere signaal-ruisbeelden mogelijk zodra deze zijn gedetecteerd met streptavidine die het signaal versterkt. Bovendien verhoogde streptavidinevervoeging met verschillende fluoroforen kleurcombinaties in co-labeling-assays. Als alternatief maakt btx met fluorescerend label het verkrijgen van afbeeldingen van vergelijkbare kwaliteit mogelijk. - Incubeer het secundaire antilichaam en de Btx gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 1 uur bij 37 °C beschermd tegen licht.
- Verwijder het secundaire antilichaam en de Btx. Was 3x gedurende 10 minuten elk met 500 μL DPBS en de laatste spoeling met BB.
- Incubeer met 500 μL Streptavidin Alexa Fluor 555 bij 1/1000 verdunning met BB gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voeg op dit punt, indien gewenst, een sonde toe om de kernen tegen te gaan, zoals diaminophenylindole bij een uiteindelijke concentratie van 1 μg/ml.
- Verwijder de incubatieoplossing en was vezels 3x gedurende 10 minuten elk met 500 μL DPBS. Monteer vervolgens de vezels.
-
Montage
- Plaats 4 stippen transparante nagellak op de microscoopschuif alsof het de hoekpunten van een vierkant zijn. Laat ze 1-2 min drogen. Dit zijn de punten waar de coverslips zullen rusten, waardoor weefselverplettering wordt voorkomen.
- Verwijder de laatste DPBS-was en voeg voldoende montagemedia (~ 200 μL) toe om de vezels te bedekken; vermijd uitdroging.
OPMERKING: Gebruik Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glycerol in een 4:1 (v:v) om 10 ml van de montagemediamix te bereiden. - Gebruik een pipetpunt van 200 μL om de montagemedia voorzichtig over de vezels te verspreiden om een volledige onderdompeling van alle vezels te garanderen. Verwijder luchtbellen voordat u het afdekglas plaatst.
- Plaats de afdeklip op de monsters om het ontstaan van luchtbellen te voorkomen. Deze beweging kan worden gedaan met behulp van een tang.
4. Microscopie en morfometrische analyse
- Beeld de geplaagde vezelpreparaten met behulp van laser confocale microscopie.
- Neem een reeks optische secties (30 μm Z-stapels) over de hele synaps met behulp van een interval van één micrometer. Gebruik het Btx-signaal om de stapel in te stellen. Afbeelding ten minste 15-20 NMJ's voor elke spieraandoening met een resolutie van 2048 px x 2048 px. Deze methode is gekozen om beelden te verkrijgen met voldoende optische kwaliteit en resolutie voor de morfometrische analyse.
- Gebruik de projectiebeelden van stapels met analysesoftware om de metingen uit te voeren.
OPMERKING: Hoewel de uitgelegde morfometrische analyse handmatig werd uitgevoerd, zijn er twee recent ontwikkelde image J-gebaseerde tools voor het bestuderen van veel verschillende aspecten van pre- en postsynaptische NMJ-morfologie33,34. - Als u de totale NMJ-gebiedswaarden wilt verkrijgen, selecteert u de buitenrand (buitencontour van het bevlekte gebied, zie figuur 2)van de eindplaat met behulp van het gereedschap Photoshop Magnetic lasso en bepaalt u het aantal geselecteerde pixels in het histogramvenster. Vervolgens kunnen de pixelgebieden worden geconverteerd naar vierkante micrometers met behulp van de schaal die is opgegeven door de confocale software.
- Selecteer met hetzelfde lassogereedschap de binnenrand (contouren van het bevlekte gebied binnen de eindplaat, zie figuur 2)en bepaal het niet-bevlekte gebied in de hele structuur (of leeg gebied) zoals hierboven beschreven (stap 4.4.). De waarden van het postsynaptische gebied worden verkregen nadat het totale oppervlak is afgetrokken van het lege gebied van elke NMJ.
- Verkrijg het Presynaptische gebied, dat wordt gedefinieerd als het gebied met anti-neurofilament immunofluorescentie, op een vergelijkbare manier als het totale NMJ-gebied.
OPMERKING: Al deze parameters zijn gebruikt om de Post-Synaptic Density index (Postsynaptic Area/Total Area) en de NMJ Coverage (Presynaptic Area/Postsynaptic Area) te bepalen. Een hogere Postsynaptische dichtheidsindex impliceert een dichtere - of compactere - eindplaat, terwijl een kleinere NMJ-dekking een veel slechtere interactie tussen zenuwterminal en eindplaat weerspiegelt (beide compatibel met een denervatieproces). In het hier getoonde geval werden, aangezien gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde vormen van neurofilamenten werden gedetecteerd op zenuwterminalniveau, de fosforylated/non-phosphorylated presynaptic signal ratio en de phosphorylated/non-phosphorylated coverage ratio berekend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol biedt een eenvoudige methode om spiervezels van twee verschillende soorten spieren te isoleren en te immunostaineren (snelle en langzame spieren, zie figuur 1). Met behulp van de juiste markers en / of sondes kunnen NMJ-componenten worden gedetecteerd en geëvalueerd vanuit een kwantitatief oogpunt om enkele van de morfologische veranderingen te beoordelen die kunnen optreden als gevolg van ziekteprogressie of een specifieke medicamenteuze behandeling. In deze studie werden presynaptische en postsynaptische componenten van de NMJ fluorescerend gelabeld met respectievelijk anti-Nf- of anti-Fos-Nf-antilichamen en Btx(figuur 2, bovenste panelen). Elk confocale beeld met hoge resolutie van een NMJ dat na de immunostaining werd verkregen , werd gebruikt om de in de protocolsectie (tabel 1) gespecificeerde morfometrische metingen en indexen te bepalen , waarbij de parameters werden toegepast die in de onderste panelen van figuur 2zijn beschreven .
Om aan te tonen dat dit nmj-preparaat met de hele montering perfect de synapsarchitectuur behield, waardoor het effect met een progressieve ziekte van het zenuwstelsel kon worden gevisialiseerd, werden geplaagde vezels van transgene ratten die het menselijk gen SOD1G93A (een ALS-model) uitdrukken, geïmmuntaineerd met behulp van het protocol (Figuur 3). De samenvoegende beelden van pre- en postsynaptische signalen met de kernen bevlekt met DAPI toonden aan dat verschillen tussen de NMJ's tussen transgene en niet-transgene leeftijdsgematchte dieren duidelijk zichtbaar en verenigbaar zijn met de resultaten die door de literatuur worden verwacht.
Bovendien maakte de kwaliteit van de beelden het mogelijk om de veranderingen te kwantificeren die werden waargenomen door de morfometrische analyse uit te voeren. Figuur 4 toont bijvoorbeeld aan dat het postsynaptische signaal bij transgene dieren compacter lijkt te zijn (ongeveer 20%), voornamelijk als gevolg van de vermindering van de totale NMJ-oppervlakte.
Figuur 5 laat daarentegen zien dat ook het presynaptische gebied van de NMJ's bij transgene dieren wordt verminderd. De kwaliteit van dit nmj-preparaat met hele montering werd aangetoond door de omvang van de zenuwterminalterugtrekking te analyseren en door veranderingen met betrekking tot neurofilamentfosforylatietoestanden te detecteren. Dit feit zal belangrijk zijn om een diepgaand inzicht te krijgen in het NMJ-demontageproces met betrekking tot ALS-ziekte in het gebruikte model. Het kleinste presynaptische gebied dat werd gedetecteerd, was het gebied met antifosforylatieneurofilament(figuur 5B, E, C, F).
Het gebruik van de dekkingsindex (figuur 6) maakte het mogelijk vast te stellen dat de transgene NMJ's gedeeltelijk waren gedenerveerd. Het zou ook kunnen bepalen dat de dekkingsindexen van het gefosforyleerde neurofilament lager zijn dan die verkregen met niet-gefosforyleerd neurofilament. Deze resultaten tonen de status van nmj met hele montering en dat het nuttig kan zijn om de studie van neurofilamentfosforylatietoestand (een belangrijke determinant van filamentplasticiteit en stabiliteit) te introduceren met behulp van dit nmj-preparaat met hele vaten.
Ten slotte bieden de in dit werk gepresenteerde methoden de grootste NMJ-kwaliteit om zelfs subtiele veranderingen in NMJ als geheel of in een van de componenten ervan te identificeren, te beoordelen en te evalueren.
Figuur 1: Anatomische oriëntatiepunten EDL en soleus. Afbeeldingsmarkering (A) EDL en (B) soleuslocatie tussen de andere spieren van de onderste achterpoot van de rat. Insets tonen schema's van de achterpotenspieren in de buurt van EDL (rood) en soleus (groene) spieren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Whole-mount neuromusculaire verbinding van EDL spiervezels. (A) Postsynaptische component van NMJ gedetecteerd met behulp van alfa-bungarotoxine (Btx, magenta), een sonde die zich specifiek bindt aan de acetylcholine receptoren (AChR). (B) Motor terminal gedetecteerd met behulp van anti-neurofilamenten (anti-Nf, groen). (C,D) Synaptische componenten worden geschematiseerd om de parameters (buiten- en binnengrenzen) te illustreren die de metingen (Total Area, Presynaptic en Postsynaptic Area) definieerden die worden gebruikt voor de morfometrische analyse die in het protocol wordt beschreven. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Pre- en postsynaptische veranderingen waargenomen in NMJ's van een ALS-model. Representatieve confocale beelden verkregen van nmj's die zijn verkregen in preparaten van EDL-spiervezels die zijn gekleurd om neurofilamenten (groen), AChR (magenta) en kern (blauw) van niet-transgene (-/-) of transgene (hSOD1G93A/-) ratten te detecteren. (A,C) Niet-transgene ratten hebben een normale NMJ-morfologie (pretzelvorm) zowel wanneer het motorische uiteinde wordt gevisualiseerd met behulp van anti-Fos-Nf (A) of anti-Nf (C). (B,D) Transgene ratten presenteren een compacter postsynaptisch gebied en kleinere presynaptische terminals met een vermindering van het neurofilamentfosforylatiesignaal. Schaalbalk = 50 μm.
Figuur 4: Morfometrische evaluatie van het NMJ postsynaptische element in EDL spieren van 180 dagen oude mannelijke hSOD1G93A ratten. Representatieve confocale afbeeldingen van postsynaptische componenten bij (A,D) niet-transgene en (B,E) transgene dieren. Evaluatie van (C) postsynaptisch gebied en (F) postsynaptische dichtheidsindex bij NMJ's van niet-transgene (vaste kolommen) en transgene (gestreepte kolommen) dieren. Hoewel het postsynaptische gebied bij transgene dieren enigszins werd verminderd, steeg de postsynaptische index in grotere mate, wat wijst op de mate van NMJ-verdichting, zoals aangegeven door een verminderd totaaloppervlak bij transgene dieren, zoals weergegeven in tabel 1. Schaalbalk = 50 μm. De weergegeven gegevens zijn respectievelijk ± SEM. (*) en (***) aangeduid met p<0,05 en p<0,001. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Morfometrische evaluatie van het NMJ presynaptische element in EDL spieren van 180 dagen oude mannelijke hSOD1G93A ratten. Gezien het belang van NMJ-demontage bij ALS-ziekte, werd de kwaliteit van het preparaat geëvalueerd door niet alleen de omvang van de zenuwterminalterugtrekking te analyseren, maar ook de mogelijkheid om veranderingen in de fosforylering van het NMJ-presynaptische element te detecteren. Representatieve confocale beelden van de presynaptische component in (A,D) niet-transgene en (B,E) transgene dieren gedetecteerd met behulp van (A,B) anti-Fos-Nf of (D,E) anti-Nf antilichamen. Evaluatie van presynaptisch gebied begrensd door (C) gefosforyleerde en (F) niet-gefosforyleerde neurofilamenten bij NMJ's van niet-transgene (vaste kolommen) en transgene (gestreepte kolommen) dieren. Merk op dat deze gebieden sterk lijken op niet-transgene dieren, terwijl ze een significante vermindering van de NMJ's van transgene dieren vertonen. Schaalbalk = 50 μm. De weergegeven gegevens zijn de gemiddelde ± SEM. (****) aangegeven p<0.0001. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Evaluatie van de innervatiestatus bij whole-mount NMJ's van EDL hSOD1G93A vezels. De dekkingsindex wordt veel gebruikt om de staat van innervatie te evalueren. Er wordt van uitgegaan dat "volledig geïntensineerde" NMJ's een dekkingsindex 
van 50% presenteren, terwijl die "gedeeltelijk geïntensvateerd" dekkingen hebben tussen ≥20% en ≤50% en die vacant worden beschouwd als "gedenervateerd". Representatieve confocale beelden van (A,D) niet-transgene en (B,E) transgene NMJ's met presynaptische en postsynaptische elementen gedetecteerd met behulp van (A,B) anti-Fos-Nf of (D,E) anti-Nf antilichamen om de motor terminal te observeren. Evaluatie van de dekking met behulp van (C) gefosforyleerde en (F) niet-gefosforyleerde neurofilamenten bij NMJ's van niet-transgene (vaste kolommen) en transgene (gestreepte kolommen) dieren. De afbeeldingen en afbeeldingen tonen bewijs dat NMJ's van transgene dieren een lagere dekkingsindex hebben dan niet-transgene dieren. Bovendien zijn bij transgene dieren de dekkingsindexen van gefosforyleerde neurofilamenten lager ( 18%) dan die verkregen wanneer de niet-gefosforyleerde vorm ( 25%) wordt gedetecteerd. Dit feit wordt bevestigd door de relatie tussen beide indexen , zoals weergegeven in tabel 1. Merk op dat de kwaliteit van de preparaten het mogelijk maakt om 50% van de dekkingsindex te verkrijgen die is voorgeschreven voor de NMJ's die worden verwacht als "volledig innervated". Schaalbalk = 50 μm. De weergegeven gegevens zijn respectievelijk ± SEM. (***) en (****) aangeduid met p<0.001 en p<0.0001. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Tabel 1. Morfometrische parameters en verhoudingen verkregen uit whole-mount NMJ's van niet-transgene en transgene EDL vezels. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor de dissectie van twee skeletspieren van ratten (een langzame twitch en de andere fast-twitch), vezelspierisolatie en immunofluorescentiedetectie van pre- en postsynaptische markers om NMJ-veranderingen en assemblage- / demontageprocessen kwantitatief te beoordelen. Dit soort protocol kan nuttig zijn in knaagdiermodellen41,42 om NMJ te evalueren tijdens fysiologische of pathologische processen zoals hier geïllustreerd in een model van motorneurondegeneratie zoals gevonden in de ALS hSOD1G93A ratten.
Om succes en gunstige resultaten te verkrijgen, is het noodzakelijk om enkele tips in gedachten te houden. Het beschreven protocol maakt bijvoorbeeld onmiddellijk gebruik van ontlede spieren mogelijk. Echter, wanneer nodig om de spier langer te behouden, maakt het gebruik van DPBS met 0,05% natrium azide plus 4 °C opslag het mogelijk om uitstekende spierbehoud tot 4 weken te verlengen. Bij het gebruik van deze optie moeten uitgebreide wasbeurten met DPBS worden gedaan (elk 5x, 10 minuten) voordat het kleuringsproces wordt gestart. Een andere nuttige optie om beelden van goede kwaliteit te verkrijgen, is het verlagen van de PFA-concentratie met 0,5% omdat het de spierautofluorescentie verminderde. Dit moet gepaard gaan met een langere fixatie tot 24 uur bij 4 °C.
Met betrekking tot vezelisolatie produceren kleinere groepen vezels betere immunodetectionkwaliteiten. De vezels gedroogd op verzilte dia's moeten binnen 2 tot 3 dagen worden gebruikt. Na deze tijd zijn de immunodetecties niet van goede kwaliteit.
Een alternatief voor gedroogde vezels op verzande dia's is het genereren van een set gedeeltelijk geïsoleerde vezels die door het peesweefsel in een van de uiteinden van de vezels bij elkaar worden gehouden (een "pluk" van spiervezels) en incubaties uitvoeren in microcentrifugebuizen volgens de "vrij zwevende" methode. Het gebruik van deze optie is noodzakelijk om de incubatietijd van antilichamen met enkele uren (24-48 uur) te verlengen, evenals het aantal wasbeurten (elk ten minste 6 van 10 minuten).
Met betrekking tot vezelisolatie zonder schade, is het noodzakelijk om de "plaag" uit te voeren door de uiteinden te verwijderen waar de pees voorzichtig in tegenovergestelde richtingen wordt trek om vezelscheiding te bereiken.
Een andere cruciale stap om immunodetection te verbeteren is de toevoeging van 1% Triton X-100 en 50 mM glycine in de BB. Dit is belangrijk om preparaten te verkrijgen met homogene kleuring en een beetje achtergrond. Het is ook vermeldenswaard dat het hebben van een beetje achtergrond nuttig kan zijn wanneer niet-aangetaste vezels in beeld moeten worden gebracht. De vezeldiameter is goed te meten ver van het NMJ-veld, omdat wordt beschreven dat deze op dit niveau kan worden verhoogd. Bepaal daarom de vezeldiameter op een afstand die gelijk is aan de waarde van een NMJ-profiel.
Met behulp van de gepresenteerde procedure is het mogelijk nmj-componenten onder fysiologische omstandigheden te identificeren en te kwantificeren. Het maakt het ook mogelijk om vroege belangrijke pathologische gebeurtenissen te bestuderen als NMJ-ontmanteling24 en verlies van gefosforyleerd neurofilament in terminale eindes39 zoals beschreven in ALS pathogenese. Om deze reden biedt het beschreven protocol een alternatieve en eenvoudige aanpak om een beter begrip te krijgen van de NMJ-remodellering, wat suggereert dat gevisualiseerde morfologische kenmerken nuttige hulpmiddelen kunnen zijn om de ontaardende toestand van NMJ's te diagnosticeren of om verschillende therapeutische benaderingen te beoordelen. Het is ook van toepassing op andere ziektemodellen zoals die van Charcot-Marie-Tooth41 en spinale musculaire atrofie42 die NMJ-verstoring vertonen.
Bovendien kunnen benaderingen die in dit werk worden beschreven, worden gebruikt om de Schwann-cellen te identificeren die deze tripartiete synaps integreren en uiteindelijk om enkele van zijn rollen te beoordelen tijdens nmj-remodellering43. Studies kunnen worden gedaan bij pasgeborenen tot volwassenen, onder fysiologische omstandigheden of als reactie op verschillende behandelingen die van invloed zijn op het neuromusculaire systeem.
Ten slotte, ondanks de uitstekende behandeling die nodig is om monsters te ontleden en te labelen, samen met de tijd die wordt verbruikt om handmatige metingen uit te voeren, maakt de hier gepresenteerde methodologie een optimale etikettering van de verschillende NMJ-componenten mogelijk vanwege de vergemakkelijkte penetratie van antilichamen en sondes. Hoewel een betere penetratie kan worden verkregen in gesectiede spierpreparaten, behoudt plagen de 3D-morfologische integriteit van alle synaptische componenten die verloren kunnen gaan in spiersecties. Het vermijdt ook alle voorbereiding die nodig is om secties te maken, zoals de opname van het spierstuk en het verder ophalen van antigeen om haalbare herkenning te verkrijgen. Bovendien, in vergelijking met hele mount preparaten die de volledige innervatiepatronen behouden, maakt plagen de studie van geïsoleerde vezels mogelijk. Dit kan een aanzienlijk voordeel zijn wanneer dat nodig is om de vezel heterogeniteit gerapporteerd in pathologische omstandigheden te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Veel dank aan CSIC en PEDECIBA voor de financiële steun die aan dit werk is verleend; aan Natalia Rosano voor haar manuscriptcorrecties; aan Marcelo Casacuberta die de video maakt en aan Nicolás Bolatto voor het lenen van zijn stem ervoor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
