Summary

ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם

Published: August 14, 2021
doi:

Summary

היכולת לזהות במדויק רכיבי צומת נוירו-שרירית חיונית להערכת שינויים בארכיטקטורה שלה בגלל תהליכים פתולוגיים או התפתחותיים. כאן אנו מציגים תיאור מלא של שיטה פשוטה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה של צמתים neuromuscular הר כולו שניתן להשתמש בהם כדי לבצע מדידות כמותיות.

Abstract

הצומת הנוירו-שרירי (NMJ) הוא נקודת מגע מיוחדת בין עצב המנוע לשריר השלד. סינפסה היקפית זו מציגה פלסטיות מורפולוגית ותפקודית גבוהה. בהפרעות רבות במערכת העצבים, NMJ הוא יעד פתולוגי מוקדם וכתוצאה מכך כשל עצבי, חולשה, ניוון, ואפילו במוות סיבי שריר. בשל הרלוונטיות שלה, האפשרות להעריך כמותית היבטים מסוימים של היחסים בין רכיבי NMJ יכול לעזור להבין את התהליכים הקשורים ההרכבה שלה / פירוק. המכשול הראשון בעת עבודה עם השרירים הוא להשיג את המומחיות הטכנית לזהות ולנתח במהירות מבלי לפגוע בסיבים שלהם. האתגר השני הוא להשתמש בשיטות זיהוי באיכות גבוהה כדי להשיג תמונות NMJ שניתן להשתמש בהן לביצוע ניתוח כמותי. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב לנתח את שרירי הדיגיטאורום שלוונגוס וסולאוס מחולדות. זה גם מסביר את השימוש אימונופלואורסצנטיות כדי לדמיין אלמנטים pre and postsynaptic של NMJs הר שלם. התוצאות שהושגו להוכיח כי טכניקה זו יכולה לשמש כדי להקים את האנטומיה המיקרוסקופית של הסינפסיס ולזהות שינויים עדינים במצב של חלק מרכיביה בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים.

Introduction

צומת היונקים הנוירו-שריריים (NMJ) הוא סינפסה משולשת כולינרגית גדולה המורכבת מסוף עצבי הנוירון המוטורי, הממברנה הפוסט-סינפטית על סיבי שריר השלד, ותאי Schwann מסוף1,2,3. סינפסה זו מציגה פלסטיות מורפולוגית ותפקודית גבוהה4,5,6,7,8, אפילו במהלך הבגרות כאשר NMJs יכול לעבור שינויים מבניים דינמיים. לדוגמה, כמה חוקרים הראו כי קצות עצב מוטוריים משנים ללא הרף את צורתם בסולם המיקרומטר9. כמו כן דווח כי המורפולוגיה של NMJ מגיבה לדרישות פונקציונליות, שימוש שונה, הזדקנות, פעילות גופנית או וריאציות בפעילות לוקומוטור4,10,11,12,13,14,15. לכן, אימון וחוסר שימוש מייצגים גירוי חיוני כדי לשנות כמה מאפיינים של NMJ, כגון גודלו, אורכו, פיזור של שלטים וקולטנים סינפטיים, כמו גם מסוף עצבים המסתעף14,16,17,18,19,20.

יתר על כן, הוכח כי כל שינוי מבני או ניוון של צומת חיוני זה עלול לגרום למוות תא נוירון מוטורי ניוון שריר21. הוא גם חשב כי תקשורת שונה בין עצבים ושרירים יכול להיות אחראי לשינויים NMJ הקשורים לגיל הפיזיולוגי ואולי להרס שלה במצבים פתולוגיים. פירוק צומת נוירו-שרירי ממלא תפקיד מכריע בפתיחת טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS), מחלה נוירודגנרטיבית המהווה את אחת הדוגמאות הטובות ביותר ליחסי שריר-עצבלקויים 3. למרות המחקרים הרבים שנערכו על תפקוד לקוי של נוירון מוטורי, עדיין מתלבט אם ההידרדרות שנצפתה ב- ALS מתרחשת עקב הנזק הישיר לנויר העצב המוטורי ולאחר מכן משתרעת על תחזיות קורטיקו-עמוד השדרה22; או אם זה צריך להיחשב אקסונאופתיה דיסטלית שבו ניוון מתחיל בקצות העצבים ומתקדם לכיוון הנוירון המוטורי סומה23,24. בהתחשב במורכבות של פתולוגיה ALS, הגיוני לשקול כי תערובת של תהליכים עצמאיים מתרחשת. כמו NMJ הוא השחקן המרכזי של יחסי הגומלין הפיזיופתולוגיים בין שריר לעצב, חוסר היציבות שלה מייצג נקודה מרכזית במקור המחלה הרלוונטית לניתוח.

מערכת היונקים הנוירו-שרירית מאורגנת תפקודית ליחידות מוטוריות נפרדות, המורכבות מתא עצב מוטורי וסיבי השריר המופניים באופן בלעדי על ידי מסוף העצבים שלה. לכל יחידה מוטורית יש סיבים עם תכונות מבניות ופונקציונליות דומות או זהות25. גיוס סלקטיבי נוירון מוטורי מאפשר אופטימיזציה תגובת שריר לדרישות פונקציונליות. עכשיו ברור כי שרירי השלד של היונקים מורכבים מארבעה סוגי סיבים שונים. חלק מהשרירים נקראים על פי המאפיינים של סוג הסיבים הנפוץ ביותר שלהם. לדוגמה, הסוליה (שריר אחורי של הגפה האחורית המעורבת בשמירה על תנוחת הגוף) נושאת רוב של יחידות עווית איטיות (סוג 1) ומוכרת כשריר איטי. במקום זאת, extensor digitorum longus (EDL) מורכב למעשה מיחידות עם תכונות עווית מהירות דומות (סיבים מסוג 2) וידוע כשריר מהיר המתמחה בתנועות פאזיות הדרושות לתנועה. במילים אחרות, למרות שהשרירים הבוגרים הם פלסטיק בטבע בשל ההשפעות ההורמונליות והעצבים, הרכב הסיבים שלו קובע את היכולת לבצע פעילויות שונות, כפי שניתן לראות בסולאוס שחווה פעילות מתמשכת בעצימות נמוכה ו- EDL המציג עווית בודדת מהירה יותר. תכונות אחרות המשתנות בין סוגים שונים של סיבי שריר קשורות למבנה שלהם (תוכן מיטוכונדריאלי, הרחבה של רשתית סרקופלסמית, עובי קו Z), תוכן ATPase מיוסין, והרכב שרשרת כבד מיוסין26,27,28,29.

עבור NMJs מכרסמים, ישנם הבדלים משמעותיים בין השרירים28,29. ניתוחים מורפומטריים שבוצעו בסולאוס וב- EDL מחולדות חשפו מתאם חיובי בין האזור הסינפטי לקוטר הסיבים (כלומר, האזור הסינפטי בסיבים איטיים סולאוס גדול יותר מאשר בסיבים מהירים של EDL) אך היחס בין אזור NMJ וגודל הסיבים דומה בשני השרירים30,31. כמו כן, ביחס למסופי העצבים, האזורים המוחלטים של לוח הקצה בסיבים מסוג 1 היו נמוכים יותר מאשר בסיבים מסוג 2, ואילו הנורמליזציה בקוטר סיבים הפכה אזורים של מסופי עצבים בסוג 1 סיבים הגדוליםביותר 32.

עם זאת, מעט מאוד מחקרים מתמקדים בניתוח מורפומטרי כדי להראות את הראיות לשינויים בחלק מרכיבי NMJ33,34. לכן, בשל הרלוונטיות של NMJ בתפקוד של האורגניזם, אשר מורפולוגיה ופיזיולוגיה משתנים בפתולוגיות שונות, חשוב לייעל פרוטוקולי ביתור של סוגים שונים של שרירים עם איכות מספיק כדי לאפשר הדמיה של כל מבנה NMJ. כמו כן יש צורך להעריך את המופע של שינויים לפני או פוסטינפטי במצבים ניסיוניים שונים או תנאים כגון הזדקנות או פעילות גופנית35,36,37,38. בנוסף, זה יכול להיות מועיל כדי להעיד על שינויים עדינים יותר ברכיבי NMJ כגון זרחן neurofilament שונה בקצות העצבים מסוף כפי שדווח ב ALS39.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות חוק הלאום N° 18611 לטיפול בבעלי חיים המשמשים למטרות ניסיוניות. הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית (CEUA IIBCE, פרוטוקול מספר 004/09/2015). 1. ניתוח שרירים (יום 1) הערה: לפני שתתחיל, לעשות 40 מ”ל של 0.5% paraformaldehyde (PFA), pH 7.4 מלוחים פוספט ש?…

Representative Results

פרוטוקול זה מציע שיטה פשוטה לבודד ולחסן סיבי שריר משני סוגים שונים של שרירים (שרירים מהירים ואיטיים, ראו איור 1). באמצעות הסמנים הנכונים ו / או בדיקות, רכיבי NMJ ניתן לזהות ולהעריך מאז נקודת מבט כמותית כדי להעריך חלק מהשינויים המורפולוגיים שיכולים להתרחש כתוצאה מהתקדמות המחל?…

Discussion

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח של שני שרירי השלד חולדה (אחד עווית איטית והשני עווית מהירה), בידוד שריר סיבים וזיהוי immunofluorescence של סמנים טרום ופוסט-סינפטי כדי להעריך באופן כמותי שינויים NMJ, כמו גם תהליכי הרכבה / פירוק. סוג זה של פרוטוקול יכול להיות שימושי במודלים מכרסמים41…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

תודה רבה ל- CSIC ול- PEDECIBA על התמיכה הכספית שניתנה לעבודה זו; לנטליה רוזאנו על תיקוני כתב היד שלה; למרסלו קזקוברטה שעושה את הסרטון ולניקולאס בולאטו על כך שהעניק את קולו עבורו.

Materials

Stereomicroscope with cool light illumination Nikon SMZ-10A
Rocking platform Biometra (WT 16) 042-500
Cover glasses (24 x 32 mm) Deltalab D102432
Premium (Plus) microscope slides PORLAB PC-201-16
Tweezers F.S.T 11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mm E.M.S 77910-26
Disponsable surgical blades #10 Sakira Medical 1567
Disponsable sterile syringe (1 ml) Sakira Medical 1569
Super PAP pen E.M.S 71310
100 μl or 200 μl pipette Finnpipette 9400130
Confocal microscope Zeiss LSM 800 – AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats Taconic 2148-M
1X PBS (Dulbecco) Gibco 21600-010
Paraformaldehyde Sigma 158127
Triton X-100 Sigma T8787
Glycine Amresco 167
BSA Bio Basic INC. 9048-46-8
Glycerol Mallinckrodt 5092
Tris Amresco 497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody BioLegend 801601 Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody BioLegend 801701 Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) Thermo Scientific A11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate Invitrogen B1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen S32355
Diaminophenylindole (DAPI) Sigma D8417

References

  1. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
  2. Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
  3. Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
  4. Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
  5. Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
  6. Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
  7. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
  8. Arnold, A. -. S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
  9. Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
  10. Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
  11. Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
  12. Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
  13. Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
  14. Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
  15. Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
  16. Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
  17. Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
  18. Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
  19. Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
  20. Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
  21. Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
  22. Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
  23. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
  24. Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
  25. Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
  26. Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
  27. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  28. Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
  29. Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
  30. Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
  31. Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
  32. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
  33. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
  34. Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
  35. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
  36. Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
  37. Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
  38. Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
  39. Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
  40. Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
  41. Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
  42. Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
  43. Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).

Play Video

Cite This Article
Bolatto, C., Olivera-Bravo, S., Cerri, S. Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions. J. Vis. Exp. (174), e62620, doi:10.3791/62620 (2021).

View Video