Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hurtig In Vivo Fiksering og isolering af translationelle komplekser fra eukaryote celler

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62639
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,3, 1
1Division of Genome Sciences and Cancer, The John Curtin School of Medical Research, The Australian National University, 2Centre for Advanced Microscopy, The Australian National University, 3Victor Chang Cardiac Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en teknik til hurtigt at stabilisere translationelle (proteinbiosyntese) komplekser med formaldehyd crosslinking i levende gær og pattedyr celler. Tilgangen muliggør dissekering af forbigående mellemprodukter og dynamiske RNA:proteininteraktioner. De krydslinkede komplekser kan bruges i flere downstream-applikationer, såsom i dybe sekventeringsbaserede profileringsmetoder, mikroskopi og massespektrometri.

Abstract

Hurtige reaktioner, der indebærer hurtig omfordeling af messenger(m)RNA og ændringer af mRNA-oversættelse, er relevante for løbende homøostatiske justeringer af cellerne. Disse justeringer er afgørende for eukaryote celle overlevelsesevne og 'skade kontrol' under svingende næringsstof og saltholdighed niveauer, temperatur, og forskellige kemiske og stråling understreger. På grund af den meget dynamiske karakter af RNA-niveau svar, og ustabiliteten i mange af RNA: RNA og RNA: protein mellemprodukter, opnå et meningsfuldt øjebliksbillede af den cytoplasmatiske RNA tilstand er kun muligt med et begrænset antal metoder. Transcriptome-dækkende, RNA-seq-baserede ribosom profilering-type eksperimenter er blandt de mest informative datakilder til kontrol af oversættelse. Men, fravær af en ensartet RNA og RNA:protein mellemliggende stabilisering kan føre til forskellige fordomme, især i de hurtige cellulære respons veje. I denne artikel leverer vi en detaljeret protokol med hurtig fiksering, der gælder for eukaryote celler af forskellig permeabilitet, for at hjælpe i RNA og RNA: protein mellemliggende stabilisering. Vi giver endvidere eksempler på isolering af de stabiliserede RNA:proteinkomplekser baseret på deres co-sedimentering med ribosomale og poly (ribo)somale fraktioner. Det adskilte stabiliserede materiale kan efterfølgende bruges som en del af ribosom profileringslignende eksperimenter, f.eks. Alsidigheden af TCP-seq-stil metoder er nu blevet demonstreret af applikationerne i en række organismer og celletyper. De stabiliserede komplekser kan også desuden affinitetsrenses og afbildes ved hjælp af elektronmikroskopi, adskilt i forskellige poly (ribo)somale fraktioner og udsat for RNA-sekventering på grund af den lette krydslink-vending. Derfor kan metoder baseret på snap-chilling og formaldehydfiksering, efterfulgt af den sedimenteringsbaserede eller anden type RNA:proteinkompleks berigelse, være af særlig interesse i at undersøge finere detaljer om hurtig RNA:protein kompleks dynamik i levende celler.

Introduction

Levende organismer er underlagt dynamiske intra- og ekstracellulære ændringer i hele deres levetid, hvilket kræver hurtige reaktioner for at opretholde homøostase og sikre overlevelse. For at muliggøre miljøtilpasning justerer eukaryote celler deres stofskifte via genekspressionskontrol. Genekspressionskontrol kan udøves under transskription og/eller oversættelse; med translationelle svar generelt forekommer hurtigere1,2,3,4. For eksempel opstår der typisk translationelle ændringer inden for 1-30 min fra stressdebuten, mens ændringer på transskriptionsniveau følger timer efter stresseksponering3,4,5. Ændringer i oversættelsesoutput opnås hurtigere på grund af den vedvarende tilgængelighed af messenger (m)RNA-molekyler i cytoplasmaet. Omvendt skal nye mRNA-molekyler syntetiseres på transskriptionsniveau, og i eukaryoter skal forarbejdes og eksporteres fra kernen, hvilket giver omfattende forsinkelser i responstiden2,4,6,7,8.

Akut translationel reaktion på stress er generelt karakteriseret ved et generelt fald i oversættelsesproduktionen, med selektiv upregulation af proteiner, der er nødvendige for celleoverlevelse1,3,4,9. Reduktion af proteinproduktionsproduktionen menes at være afgørende på grund af processens høje energiomkostninger3,7. For at lette den selektive hæmning og upregulation betjenes translationelle reaktioner af en række komplekse reguleringsmekanismer. Regulering kan udøves på tværs af alle faser af oversættelsen: indledning, forlængelse, afslutning af polypeptidbiosyntese og ribosomal genanvendelse10,11,12,13, men udstilles mest i indledningsfasen5,7,9,10,13. Under indledningen binder den lille ribosomale underenhed (SSU), bistået af eukaryote indledningsfaktorer (eIF'er), sig til og scanner 5' uoversatte regioner (UTR) i mRNA, indtil en start codon er anerkendt2,5,6,8,11,12,13. Reguleringsmekanismer er ofte rettet mod eIF'er, der påvirker vedhæftede filer, scanninger og start af codongenkendelse. F.eks. er indledningsfaktoren eIF2, en væsentlig oversættelsesfaktor, der hjælper med ansættelsen af en initiativtager Met-tRNAiMet til SSU, er ofte målrettet i eukaryoter under stress betingelser4,6,11. I gær kan fosforylering af denne faktor induceres under næringsstofmangel og osmotisk stress1,4,11,14,15og i pattedyrceller kan aminosyre sult, endoplasmisk reticulum (ER) stress, UV-stress, virusinfektion og ændrede iltniveauer udløse dette svar8,9,11. Hurtig opregulering af specifik mRNA-oversættelse er tydelig i pattedyrcellens reaktion på hypoxi, som udviser en global hurtig oversættelseshæmning og selektiv upregulering af hypoxiinukible faktorer (HIF'er) biosyntese. HIF'er er transskriptionsfaktorer, som derefter fremkalder langsigtet cellulær omprogrammering på DNA-transskriptionsniveau8,9,16. Lignende reaktioner er blevet observeret i gær under varme stress, med hurtig translationel udtryk for Heat Shock Proteins (HSP'er) efterfulgt af forsinkede transskription-niveau svar17,18. Ud over næringsstofmangel og varmechok er translationelle reaktioner i gær blevet undersøgt under varierende ilt8,19salinitet5, fosfat, svovl20,21 og kvælstof22,23 Niveauer. Denne forskning har vidtrækkende konsekvenser for den industrielle anvendelse af gær, såsom bagning og gæring24,25. Translationelle reaktioner kan også være medvirkende til at fremme forståelsen af sygdomme som neurodegenerative lidelser og hjertesygdomme, der er karakteriseret ved intracellulære belastninger som oxidativ stress. Samlet set er translationelle reaktioner en integreret del af genekspressionskontrol og letter hurtig tilpasning til en bred vifte af stressforhold i eukaryote organismer.

For at studere translationelle svar er der brug for metoder, der giver minimalt forvrængede snapshots af oversættelseslandskabet. Polysome profilering er en klassisk tilgang, der anvendes i studiet af oversættelse på tværs af mRNA, der involverer adskillelse af poly (ribo)somale fraktioner af mRNA via ultracentrifugering gennem saccharose gradienter26,27. Metoden kan anvendes til at undersøge oversættelsesniveauer for individuelle mRNA'er (med detektionsmetoder som omvendt transskription og polymerasekædereaktion, RT-PCR26) eller globalt i forbindelse med teknikker med høj kapacitet (mikroarray eller RNA-seq28,29). En mere udviklet tilgang er ribosom profilering, der gør det muligt at studere positioner af aflange ribosomer langs et mRNA-molekyle i genom-dækkende skala, samt konklusionen af effektiviteten af oversættelse på tværs af transskriptom og udnyttelse af de vigtigste og alternative startsteder30,31. Ribosom profilering indebærer isolering og sekventering af mRNA fragmenter beskyttet af ribosomal tilstedeværelse over dem. Ribosom profilering har givet betydelig indsigt i oversættelse dynamik på tværs af en række betingelser, herunder hypoxisk stress, varmechok og oxidativ stress31,32. Teknikken er blevet tilpasset flere kildematerialetyper, herunder gær- og pattedyrceller.

Mens polysome og ribosom profilering har været grundlæggende i at udvide mulighederne for forskning i oversættelse, processen med oversættelse omfatter forskellige translationelle mellemprodukter og komplekser, der er vanskelige at fange med disse metoder11,13. En yderligere begrænsning skyldes den manglende evne til at studere hurtige reaktionstyper, da translationelle komplekser enten stabiliseres in vivo ved tilsætning af specifikke oversættelseshæmmere (antibiotika), hvilket fører til visse ribosomfordelingsartefakter eller ex vivo på cellelyseis specifikt (antibiotika) eller uspecifikt (højt salt eller magnesiumioner), hvilket fører til afsavn af de korterelivede eller mindre stabile mellemprodukter33, 34,35.

Formaldehyd er meget udbredt til at krydslinke nukleinsyrer og proteiner, såsom i kromatin immunprecipitation (ChIP) og crosslinking immunoprecipitation (CLIP) undersøgelser. Dens lille størrelse og fremragende celle permeabilitet giver mulighed for en hurtig in vivo handling36. Baseret på den hurtige formaldehyd crosslinking er ribosom profileringsmetoden blevet udvidet med TCP-seq (Translation Complex Profile Sekventering)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, der først blev udviklet i gær, gør det muligt at hente alle mellemprodukter til oversættelse, herunder scanning eller SSU-komplekser efter opsigelsen og flere ribosomale konfigurationer37,38,41,42. Metoden er blevet anvendt i flere undersøgelser10,38,39,41,42, hvoraf nogle bruger en kombinationstilgang af både oversættelseshæmmere og formaldehyd crosslinking at lette anholdelsen af oversættelse. En anden modificeret version af teknikken, selektiv TCP-seq39, er for nylig blevet anvendt til at omfatte immunpurification af de krydslinkede komplekser, der udvider omfanget af TCP-seq-applikationerne. Den formelledehydkrydsning har en hurtig, effektiv og reversibel karakter, der gør disse tilgange velegnede til at studere forbigående mRNA:oversættelseskomplekse interaktioner, især i forbindelse med meget dynamiske responsveje på oversættelsesniveau.

Her beskriver vi processerne for in vivo formaldehyd crosslinking med henblik på omfattende oversættelse kompleks stabilisering og isolation. Vi leverer separate protokoller nuanceret for gær og pattedyr celler (Figur 1). Vi skitserer endvidere eksempler på den efterfølgende anvendelse af det krydslinkstabilerede materiale (figur 1), f.eks. IP) og berigelse af translationelle komplekser, der indeholder specifikke interessefaktorer, elektronmikroskopi og RNA-sekventering.

Figure 1
Figur 1: Skematisk, der viser en oversigt over den typiske eksperimentelle opsætning. De vigtigste trin i in vivo formaldehydstabilisering af translationelle komplekser fremstilles som et rutediagram suppleret med oplysninger om de vigtigste nødvendige instrumenter. Potentielle downstream-anvendelser af det krydslinkede materiale er skitseret, herunder eksempler, der med succes er blevet anvendt, men ikke direkte dækket i denne protokol, såsom SPRI perlerensning af RNA, RNA-sekventering og massespektrometri. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Gær celle protokol

  1. Gær celle kultur og fiksering
    BEMÆRK: Cellefiksering og høst er tilpasset fra10,38med modifikationer.
    1. Opsætning af 1 L gærcellekultur (vildtype (WT) BY4741 er givet som eksempel) i en orbital shaker med den begyndende optiske tæthed på højst 0,05 AU ved 600 nm (OD600) i egnede medier (1% w/v gærekstrakt, 2% w/v peptone, 2% w/v dextrose (glukose), 40 mg/L af adeninsulfat (YPD), der anvendes som eksempel) under de ønskede betingelser (30 °C, der anvendes i denne eksperiment).
    2. Opret en præparativ centrifuge med kompatible rotor- og centrifugeflasker til peltering af gærcellernes flydende suspensionskultur. For glukose sult eksperimenter, pellet cellerne, når den optiske tæthed på 0,6-0,8 AU ved 600 nm (OD600)er nået, ved hjælp af en kort centrifugering ved 30 °C, 5.000 x g i 1 min.
      BEMÆRK: Hold styr på OD af de voksende celler og lad cellerne vokse, indtil OD600 når 0,6-0,8 AU, hvis den eksponentielle vækstfase er af interesse.
    3. YP-medier, der ikke indeholder eller lav (0,25% w/v), tilsættes glukose og inkuberes straks i yderligere 10 min ved 30 °C i en orbital shaker-inkubator.
      BEMÆRK: Mediesammensætning kan påvirke efterfølgende krydslinkeffektivitet. Denne protokol blev kun testet ved hjælp af YPD. Når du udfører sult eksperimenter, overholde timingen og minimere forsinkelser mellem procedurer er kritisk.
    4. Når cellerne er klar, skal du sætte en isboks op inde i røghætten med et bægerglas, der indeholder 250 g ren knust vandis. Sørg for, at 25 mL stripetter og nyindkøbte methanolstabili stabiliserede 37% w/v formaldehydopløsning er tilgængelige inde i emhætten. Hæld 1 L-kulturen i bægerglasset, der indeholder 25% w /v af knust vandis.
      BEMÆRK: Hold cellerne på is under alle efterfølgende operationer, indtil cellerne er frosne, medmindre andet er angivet.
    5. Tilsæt 75 mL 37% w/v formaldehydopløsning til en endelig koncentration på 2,2% w/v og rør blandingen intenst, indtil isen smelter.
    6. Når isen er smeltet, skal du oprette en timer i 10 minutter.
      BEMÆRK: Hold dig til de anbefalede tidspunkter og temperaturregime for at opnå reproducerbare fikseringsresultater.
    7. Efter inkubation i 10 min overføres kulturen til de forkølede centrifugeflasker og pellet cellerne ved centrifugering ved 4 °C, 5.000 x g i 5 min. Mens dette spin er tændt, forkøl et 50 mL rør og hold frisklavet buffer A (indeholdende glycin for at neutralisere eventuelle resterende formaldehyd) på is.
      BEMÆRK: Se den medfølgende tabel for de nøjagtige buffersammensætninger.
    8. Efter centrifugering placeres centrifugerørene på isen med pelletsiden i kontakt med isen. Bring rørene ind i røghætten og kassér supernatanten i en formaldehydaffaldsbeholder.
    9. Resuspend celle pellet fra alle rør i 20 mL buffer A ved hjælp af en 25 mL stripette og overføre til en 50 mL rør.
      BEMÆRK: Denne vask er afgørende for at undgå ufravindelig krydslinking, og buffertilsætningen må ikke overstige 20 min tid fra cellernes høst.
    10. Volumen op til 40 mL med buffer A og opsamles de vaskede celler ved centrifugering ved 4 °C, 5.000 x g i 5 min.
    11. Kassér supernatanten og genbrug cellepillen i 40 mL buffer A1, som er buffer A, der ikke indeholder glycin, for at fjerne enhver glycinforurening.
    12. Pelletceller igen ved centrifugering ved 4 °C, 5.000 x g i 5 min.
    13. Gentag vaskerne med buffer A1 en gang til. Kassér supernatanten, og læg cellepillen på is. Afvej røret med pellet (våd cellemasse skal være ~ 1 g pr 1 L i cellekulturen).
  2. Gær celle forstyrrelser og cytosol indsamling
    1. Fyld en polystyren skumkasse foret med aluminiumsfolie med flydende nitrogen til en dybde på ca. 3 cm. Placer et 50 mL rør oprejst i kassen.
    2. Brug pelleten (~1 g våd cellemasse) igen i 550 μL buffer A2 ved pipettering og hvirvlende i 10 s. Der tilsættes 10 μL på 40 U/μL RNase-hæmmer og vortex igen i 10 s.
      FORSIGTIG: Brug passende værnemidler, såsom termisk isolerede handsker, ved håndtering af flydende nitrogen. Sørg for, at enhver beholder, der anvendes til at holde flydende nitrogen ikke lækker, og at rør rack inde vil ikke flyde op eller falde på sin side. Arbejd i et godt ventileret område for at undgå iltsvind.
    3. Dryp celleaffjedringen i det 50 mL-rør, der indeholder det flydende nitrogen, ved hjælp af en 1 mL-pipette.
      BEMÆRK: Dryp skal udføres langsomt og omhyggeligt for at undgå sammenlægning af dråberne. Sørg for, at dråberne fryser, før du introducerer nye dråber.
    4. Overfør 50 mL-røret med de frosne celleaffjedringsdråber til stuetemperatur og vent, indtil det flydende nitrogen fordamper helt. Forsegl røret med hætten, og opbevar cellepillerne ved -80 °C, eller gå straks videre.
      FORSIGTIG: Sørg for, at det flydende nitrogen er helt fordampet, før røret forsegles. Overskydende flydende nitrogen i et forseglet rør kan forårsage en farlig trykopbygning.
    5. For at forberede det næste skridt, precool 1,5 mL nuclease-fri rør og 10 mL rustfrit stål slibning krukker på tøris.
    6. Overfør de frosne celleaffjedringsdråber i krukkerne ved hjælp af en ren, steril spatel.
      FORSIGTIG: Sørg for, at slibeglassene er tætforseglet.
    7. Dyk slibeglassene ned i det flydende nitrogen i 1 minut, så væskefasen forbliver under krydset. Opret en kryo mixer mølle på 27 Hz for agitation i 1 min.
      BEMÆRK: Afvej altid slibebeholderen med en anden af samme model, selvom prøven kun kræver én beholder til forarbejdning.
    8. Omrør de forseglede slibeglas ved 27 Hz i 1 min i mixermøllen.
    9. Slibning af slibeglassene i flydende nitrogen som før og ryst ved 27 Hz i 1 minut yderligere i røremøllen.
    10. Krukkerne overføres til iskassen, der indeholder tøris, sammen med de 1,5 mL nukleasefrie rør. Ved hjælp af en lille stålspatel overføres den resulterende pulverprøve til rørene i ~ 100 mg aliquots, og rørene opbevares ved -80 °C.
      BEMÆRK: Det anbefales at anvende ~600 mg af prøven pr. eksperiment, der omfatter analyse af polysome sedimenteringsprofil, adskillelse af cytosolen i oversatte og ikke-oversatte fraktioner og yderligere adskillelse af den oversatte fraktion til SSU-, ribosom- og disomefraktioner ved RNase-fordøjelsen.
  3. Adskillelse af de faste (poly)ribosomale komplekser fra de ikke-oversatte fraktioner af cytosolen
    BEMÆRK: Den procedure, der blev indført tidligere10,38følges generelt for at berige oversat RNA baseret på dets co-sedimentering med (poly)ribosomer. En mere raffineret tilgang til adskillelse af de oversatte og ikke-oversatte cytosolfraktioner introduceres her, hvilket eliminerer behovet for at fremskynde og efterfølgende opløse materialet igen.
    1. Forbered 2,5 mL lineær 10%-20% w/v saccharose gradienter med buffer B ved hjælp af fryse-optø metode43 i tynd væg ultracentrifuge rør (5 mL, 13 x 51 mm).
      BEMÆRK: Fryse-optøningsmetoden udføres ved sekventiel tilsætning og frysning af bufferede saccharoselag med lineært regresserende koncentrationer oven på hinanden. Se supplerende tabel 1 for nærmere oplysninger.
    2. For at skabe en diskontinuerlig 50% w /v saccharose pude, på de lineære gradienter optø og stabilisere, langsomt dispensere 0,5 mL af 50% saccharose i buffer B direkte på bunden af rørene ved hjælp af en 1 mL sprøjte knyttet til 19 G x 1,5 "nål eller et glas kapillær af lignende / passende dimensioner. Før dispensering, forsigtigt og langsomt køre spidsen af nålen eller kapillær fra toppen til bunden af de præ-dannede saccharose gradienter, undgå enhver forstyrrelse, indtil den når rørbunden.
      BEMÆRK: Se supplerende tabel 1 for vejledning i udarbejdelse af buffer B.
    3. Afvej forsigtigt stigningerne ved at fjerne de øverste dele eller lægge mere 10 w/v saccharose i buffer B og holde dem iskolde eller ved 4 °C.
      BEMÆRK: Den diskontinuerlige gradient med det nederste 50% saccharoselag er nødvendig for at indsamle materiale med højere sedimenteringshastighed uden at udfælde det på rørvæggen.
    4. Optø ~ 100 mg af den frosne celle pulveriseret prøve ved stuetemperatur og straks placere på is. Bland i 150 μL buffer A2 ved pipettering, tilsæt RNase-hæmmer til 1 U/μL og blandes ved hvirvlen (undgå overdreven skumdannelse og blanding med gasfasen) i 10 s.
      BEMÆRK: Fortsæt alle operationer, mens materialet opbevares på is, medmindre andet er angivet.
    5. Pellet celleaffaldet ved at centrifugere rørene ved 4 °C, 13.000 x g i 5 min og genvinde det afklarede supernatant (~150 μL) i et nyt bindingsrør med 1,5 mL lavt proteinindhold.
    6. Den resulterende afklarede blanding på de diskontinurosegradientrør fra trin 1.3.3 og afvej dem omhyggeligt.
    7. Ultracentrifugere rørene i en medium volumen swing-bucket rotor ved 4 °C, med gennemsnitlig g-kraft 287.980 x g (k-faktor 49) i 1 h 30 min.
      BEMÆRK: Disse betingelser er foroptimeret (ved hjælp af UV-absorbansanalyse efter ultracentrifugeringsgrad) for at bevare den frie (ikke-(poly)ribosomale) SSU'er og LSU'er (stor ribosomale underenhed) i den øverste (10%-20% saccharose) del af gradienten, mens den (poly)ribosomale fraktion i bunden (50%) saccharosepuden koncentreres uden peltering af materialet.
    8. Brug en ny steril 1 mL sprøjte udstyret med en 19 G x 1,5 "nål til at indsamle den oversatte cytosol fraktion. Placer 5 mL gradient på en stabil rack sikre bunden af røret er synlig.
    9. Fra toppen af røret skal du holde nålen lige ind i bunden af gradienten (uden at punktere røret) og træk forsigtigt nøjagtigt 0,5 mL af den nederste opløsning, der indeholder den oversatte RNA-pool, uden at skabe bobler.
      BEMÆRK: Sørg for, at dette trin udføres i et koldt rum, og at røret holdes fast. Det anbefales at trække hele 0,5 mL i en enkelt upstroke bevægelse for at undgå forstyrrelse af gradienten.
    10. Bekræft (poly)ribosomale tilstedeværelse og udtømning af SSU, LSU og lettere fraktioner i den resulterende blanding ved absorbans udlæsning af saccharose gradient ved ultracentrifugering køre.
    11. Koncentrer den indsamlede oversatte RNA-pulje fra forrige trin til 100 μL ved hjælp af ultrafiltration i en mikrokoncentrationsanordning med 10 kDa afskåret regenereret cellulosemembran.
      BEMÆRK: Forvask mikrokoncentrationsanordningens membran med 0,5 mL buffer 1 (se figur 2a) og brug spinbetingelser (g), som fabrikanten anbefaler.
    12. Yderligere fortyndes materialet fra det foregående trin fem gange (tilsættes 400 μL) med buffer 1 og koncentrere sig tilbage til 200 μL, for at give mulighed for et mindre volumen samt delvis fjernelse af saccharose.
      BEMÆRK: Det anbefales at opbevare de resulterende blandinger ved -80 °C i op til 6 måneder og bruge som inputmateriale til den samlede oversatte RNA'-RNA-seq-bibliotekskonstruktion eller RNase-fordøjelsestrinnet i TCP-seq-bibliotekskonstruktionen. Den »ikke-oversatte« cytosolfraktion kan genvindes fra toppen af gradienten ved hjælp af en lignende procedure og opbevares ved -80 °C.
  4. RNase fordøjelsen af de faste (poly)ribosomale komplekser og adskillelse af fordøjet materiale i små ribosomale subunit (SSU), monoribosomaal (ribosomer, RS), og diribosomaal (disomes, DS) fraktioner
    BEMÆRK: Proceduren følger generelt en tilgang, der tidligere er beskrevet10,38men en modificeret gradient type, separation tid, acceleration og RNase fordøjelse betingelser anvendes, for at opnå den bedste opløsning på tværs af alle tre isolerede fraktioner.
    1. Forbered omhyggeligt afbalancerede 12,5 mL lineære 10%-40% w/v saccharose gradienter lavet med buffer 1 i 13 mL tynd væg polypropylenrør, 14 x 89 mm, ved hjælp af fryse-optø metode43 som beskrevet i trin 1.3.1 og bemærk deri.
    2. Tø op ved stuetemperatur, og fjern straks prøverne på isen, eller tag den koncentrerede og saccharoseudtømte oversatte cytosolfraktion fra trin 1.3.12.
      BEMÆRK: Fortsæt alle procedurer på is, medmindre andet er angivet.
    3. Fordøje den oversatte cytosolfraktion ved blanding i 4,5 U af E. coli RNase I pr. 1 OD260 enhed af fraktionen i 30 min ved 23 °C. Tilsætning og bland straks ved pipettering af RNase-hæmmeren, der er i stand til at inaktivere RNase I til 0,25 U/μL til blandingen, for at inaktivere RNase I.
      BEMÆRK: Brug RNase-hæmmer, der er i stand til at hæmme RNase I. Derive AU260 ved hjælp af AU260 = (Absorbans ved 260 nm standardiseret til optiske densitetsenheder svarende til 1 cm optisk sti x volumen af lysatet i μL) / 1.000.
    4. Overfør straks prøverne til is.
      FORSIGTIG: Det er vigtigt at overholde de anbefalede betingelser for fordøjelse og omhyggeligt måle mængden af den tilsatte RNase I. Den her omhandlede RNase I-enhed defineres som den mængde af enzymet, der kræves for at producere 1 μg syreopløseligt materiale fra muselever-RNA i 30 min. ved 37 °C. RNase I-partier kan have udokumenterede aktivitetsvariationer og kan kræve forsøg for at opnå optimale fordøjelsesforhold. Hvis enzymbestanden er for koncentreret, anbefales det at fortynde den med buffer 1 for at undgå at pipettere meget små mængder af opløsningen.
    5. Reaktionsblandingerne indlæsses på 10%-40% w/v saccharosegradienterne fra trin 1.4.1.
      BEMÆRK: Brug de endelige volumener i intervallet 150-300 μL pr. gradient. Hver rensning kræver minimalt to gradienter. Brug forskellige inputmængder af materialet (nedre AU260, 10-11 AU260, til DS og forholdsvis højere AU260, 13-14 AU260, for SSU eller RS) for at opnå optimal adskillelse.
    6. Ultracentrifugere rørene i en medium volumen swing-bucket rotor ved 4 °C med gennemsnitlig g-kraft 178.305 x g (k-faktor 143,9) i 3 h 30 min.
      FORSIGTIG: Hvis der er behov for ekstra balancerør, udlignes deres masse- og massefordeling med de prøveholdige rør. Der anvendes ekstra saccharosegradienter, der er overlejret med en mængde buffer svarende til prøveoverlejringens, og ikke rør med ensartet saccharosekoncentration.
    7. Konfigurer en gradientfraktionatorenhed mindst 30 min før ultracentrifugeringsspin færdiggørelsen, herunder påfyldning af den 0,2 μm filtrerede tunge jagtopløsning (f.eks. 60% saccharose i deioniseret vand som brugt her) i fortrængningspumpen.
      BEMÆRK: Det anbefales at de-forurene linjerne og slangerne af fraktionatoren ved hjælp af deioniseret vand, efterfulgt af 1%-2% SDS-opløsning i deioniseret vand, deioniseret vand og endelig 80% ethanol i deioniseret vandopløsning før og efter løbene.
    8. Juster absorbansaflæsningsbasislinjen ved først at fylde systemet med deioniseret vand og nulstille optik i henhold til fabrikantens anbefalinger og derefter kompensere basisskiftet ved hjælp af en reserveaflæst 14 x 89 mm saccharosegradient lavet med en buffer, der er identisk med prøverørene (f.eks. buffer 1).
      BEMÆRK: Brug samme forskydningshastighed til at foretage justeringerne som for prøveudlæsningen, f.eks.
    9. Mål forskydningssystemets døde volumen ved nøjagtigt at tælle tid mellem den opløsning, der først kom ind i detektorens optiske sti, og først vises ved brøkens opsamleroutput.
      BEMÆRK: Med den anbefalede hastighed på 1,5 mL/min kan fraktioneringen udføres ved stuetemperatur. Det anbefales straks at overføre de indsamlede fraktioner på is.
    10. Udfør fraktionering ved hjælp af levende absorberelsesudlæsning ved 254 nm, 1,5 mL/min forskydningshastighed og registrering af in-line fraction baseret på prøvernes forventede sedimenteringsposition og absorbansprofil. Brug opsamlingsrørsskift med en tidsforsinkelse svarende til den døde volumen målt før.
    11. Isoler fraktioner svarende til SSU-, RS- og DS-kompleksernes positioner og mobilitet, og saml dem i nye lavproteinbindingsrør på 1,5 mL mikrocentrifuge. straks overføre de isolerede fraktioner på is og fryse, hvis de ikke behandles yderligere med det samme.
      BEMÆRK: Det anbefales straks at flashfryse de indsamlede fraktioner i tøris eller flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C eller derunder i op til 6 måneder.
  5. De-crosslinking af ribosomale komplekser og isolering af RNA til at konstruere RNA-seq biblioteker
    1. Hvis du vil afspærre/vende krydslinkene og isolere RNA'et væk fra de tilknyttede proteiner, overføres ca. halvdelen af hele saccharosegradientfraktionerne til nye lavnukleinsyrebindingskernefri polypropylen 1,5 mL mikrocentrifugerør (350 μL pr. rør) med lågsikkerheds-/låseanordninger.
    2. Blandingerne suppleres med 40 μL 100 % stopopløsning (10 % SDS m/v og 100 mM EDTA), 4 μL på 1 M Tris-HCl pH 2 ved 25 °C (til 10 mM), 1,6 μL på 2,5 M glycin (til 10 mM) og deioniseret nucleasefrit vand for at opnå det endelige volumen på 400 μL.
    3. Bland indholdet af rørene ved pipettering og overfør rørene ved stuetemperatur.
    4. Der tilsættes lige stor mængde af den sure phenol:chloroform:isoamylalkohol 125:24:1 (pH 4,0-5,0) blanding til hvert rør. Ryst kraftigt blandingerne i 2 min ved hjælp af en vortex mixer indstillet til maksimal hastighed.
      FORSIGTIG: Phenol og kloroform er ætsende og giftige. Undgå fysisk kontakt med væskerne og arbejde i et godt ventileret område eller under en røghætte. Brug altid handsker, kittel og beskyttelsesbriller eller ansigtsskærm, når du arbejder med phenol eller kloroform.
    5. Rør i en termoskal og ryst kontinuerligt ved 65 °C, 1.400 omdrejninger i 30 min.
    6. Gør det lettere at centrifugere blandingen ved 12.000 x g i 10 min ved stuetemperatur.
    7. Saml de øvre vandige faser og overfør dem til frisk lav nukleinsyre bindende 1,5 mL rør.
      BEMÆRK: For at undgå krydskontaminering må du ikke forsøge at genvinde de vandige faser fuldstændigt. En rimelig restitutionsvolumen er 300-350 μL.
    8. De opsamlede vandige faser suppleres med 0,1 volumener på 3 M natriumacetat (pH 5 ved 25 °C), 20 μg glykogen (med 5 μg/μL-lager) og 2,5 volumener absolut ethanol. Bland forsigtigt opløsningerne ved at hvirvler rørene i 1 min.
    9. Udfælde RNA ved at inkubere prøverne ved -20 °C i mindst 2 timer (anbefales natten over).
    10. Varm rørene til stuetemperatur og bland ved hvirvlende.
      BEMÆRK: Forvarmning af rørene og efterfølgende centrifugering ved stuetemperatur (uden tvungen afkøling) hjælper med at reducere salt og phenol co-nedbør og fremførsel. Disse betingelser bør ikke medføre materialetab eller ineffektivitet i RNA-indsamlingen, hvis de udføres som beskrevet og anvender tilstrækkeligt ren ethanol.
    11. Pellet RNA bundfald ved centrifugering rørene ved 12.000 x g i 30 min ved stuetemperatur.
    12. Kassér supernatanten og vask pelleten to gange med 80% v/v ethanol, og opsamle den hver gang ved centrifugering ved 12.000 x g i 10 min ved stuetemperatur.
    13. Tør RNA-pellets ved at åbne rørlåg og placere de åbnede rør i en tørblokvarmer, der er indstillet til 45 °C i 10 min. Den resulterende tørrede pellet opløses i 20 μL af 1x HE-bufferen.
    14. Estimere den resulterende RNA-koncentration ved hjælp af måling af UV-absorberende spektrum.
      BEMÆRK: RNA-fragmentlængden og den samlede mængde kan vurderes yderligere ved hjælp af denaturerende gelelektroforese, f.eks. i et automatiseret fluorescensbaseret kapillærgelelektroforeseapparat.
  6. Selektiv co-immunopurification af SSU'erne ved de mærkede eIF'er og western blot-analyse af den selektive SSU-berigelse
    BEMÆRK: Brug ~15 AU (260 nm) af den fordøjede og sedimenteringsadskilte SSU-fraktion fra trin 1.4.11 til at udføre affinitetsrensning ved hjælp af magnetiske IgG-perler. Gem ~ 5% af SSU brøken som input kontrol (Input brøk, I). eIF4A-mærket (TIF1-TAP; Tandem Affinitet Rensning tag) gær stamme blev brugt, som også gør det muligt at opdage eIF4A ved sondering for TAP-tag ved hjælp af anti-TAP antistof.
    1. Overfør 100 μL magnetisk IgG perler suspension (1 mg af perlerne blev brugt for hver 15 AU (260 nm) af lysatet eller fraktion) i et nyt lavt proteinindhold bindende 1,5 mL rør; indsamle perlerne ved hjælp af magnetisk rack og aspirere dem.
    2. Vask de magnetiske perler to gange med 1 mL buffer 1 ved hjælp af sekventiel resuspension ved pipetter og indsamling ved hjælp af det magnetiske rack.
    3. Efter vask, indsamle og dekanter perlerne, samtidig med at de på den magnetiske rack.
    4. Tilsæt SSU-fraktionen til de vaskede perler, og inkuber blandingen i 4 timer med rotation ved 4 °C i en cyklomixer, der er indstillet til ~ 20 rpm.
    5. Saml perlerne ved hjælp af magnetristen ved 4 °C, og gem supernatanten (Flow-through-fraktion, FT).
    6. Perlerne vaskes to gange ved 4 °C med buffer 1 suppleret med 4 mM DTT, hver gang de roterer i 10 min i cyklomixeren og opsamler og dekanterer perlerne på magnetristen. Gem vaskene (W1 og W2 brøker).
    7. Til en analytisk anvendelse som vestlig blotting skal det bundne materiale under denaturering og reducere betingelserne ved at tilsætte LDS (lithium dodecyl sulfat) polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) prøvebuffer med pH 8,5 til 1x og DTT til 2 mM.
    8. Blandingen opvarmes ved 95 °C i 5 min i en termisk blok for at færdiggøre fortyndingen.
    9. Saml perlerne ved hjælp af den magnetiske rack og genvinde den denaturerede eluate (E-fraktion) i en frisk lavt proteinindhold bindende 1,5 mL mikrocentrifuge rør.
    10. Brug E-brøken fra forrige trin til at køre en denaturerende natrium dodecylsulfat (SDS) PAGE med det samme, eller opbevar E-brøken ved -20 °C.
      BEMÆRK: For en foreløbig samling af TAP-tag-berigede translationelle komplekser til enhver efterfølgende anvendelse skal du bruge en alternativ elutionsmetode, der anvender Tobacco Etch Virus (TEV) protease. Yderligere oplysninger finder du i supplerende tabel 1.
    11. For at koncentrere de fortyndede FT-, W1- og W2-fraktioner skal de bundfældes deres materiale ved at tilsætte 3x volumener iskold acetone. Inkuberes prøven-acetoneblandingen ved -20 °C i 3 timer.
    12. Pellet bundfaldet ved at centrifugere rørene ved 13.000 x g i 10 min ved 4 °C.
    13. Kassér supernatanten, og lufttør pelleten i de åbne rør ved stuetemperatur i 30 min.
    14. Pellet opløses i 7 μL 1x LDS-belastningsbuffer suppleret med 2 mM DTT. Prøverne opvarmes i en termisk blok, der er indstillet til 95 °C i 5 min.
    15. Læg alle prøver af I, FT, W1, W2 og E på en 4%-12% w/v acrylamidgradient, Bis-Tris polyacrylamid denaturerende gel. Kør gelen ved hjælp af 1x MES SDS (2- [N-mopholino]ethanesulfonsyre, natrium dodecyl sulfat) kører buffer ved 80 V, indtil proteinmarkøren (10-250 kDa) løser godt og blyfarven når bunden af gelen.
      BEMÆRK: Det anbefales at indlæse seriel fortyndinger af WCL (helcellelyset) (2-10 μg) på gelen som en kontrol. Det kan tage flere forsøg på at opnå sammenlignelig belastning af gelen på tværs af fraktionsmaterialet.
    16. Proteinindholdet i gelen overføres til en polyvinyliden difluorid (PVDF) membran ved våd overførselsmetode ved 100 V i 1 time i et koldt rum som anbefalet af producenten af vestligt blottingudstyr.
    17. Bloker membranen ved hjælp af en passende blokeringsbuffer (Fosfat Buffered Saline baseret) ved stuetemperatur i 1 time under konstant rysten.
    18. Efter producentens anvisninger for antistoffortynding sonderer membranen med anti-TAP-antistof til påvisning af det mærkede eIF4A-protein, anti-Pab1p antistof eller anti-β-actin antistof (eller ethvert andet ønskeligt mål) ved nattens inkubation af membranen med blokerende buffer (PBS)-fortyndet antistof (1:1.000 fortynding) i et cyklomixer i et kølerum.
      BEMÆRK: 1:1.000 antistoffortynding er et godt udgangspunkt.
    19. Vask membranen tre gange med 1x fosfat Buffered Saltvand, 0,2% v/v Tween 20 (PBST) i 10 min hver.
    20. Sonde membranen med fluorescerende mærkede sekundære antistoffer efter producentens anvisninger ved at inkubere i en cyclomixer ved stuetemperatur i 1 time.
      BEMÆRK: 1:20.000 antistoffortynding er et godt udgangspunkt.
    21. Vask membranen tre gange med 1x PBST i 10 min hver. Skyl kortvarigt membranen med deioniseret vand, og derefter med absolut methanol. Tør og visualiser membranen i et fluorescerende billedsystem i henhold til producentens anvisninger.
      BEMÆRK: Farvning af andre proteiner kan opnås ved hjælp af sekundære antistoffer med farvestoffer, der matcher forskellige fluorescerende kanaler (f.eks. i eIF4A-TAP vs. β-actin-par, der anvendes her), ved sekventiel farvning eller stripning og farvning af membranen fra en gel fyldt med gentagende mønster af fraktioner og separat sondering hvert stykke med respektive antistoffer (som i Pab1p-eksemplet, der anvendes her).

2. Pattedyrs celleprotokol

  1. Pattedyrs cellekultur og fiksering
    1. I 2 T-175 kolber, vokse HEK293 celler til 60%-70% sammenløb i Dulbecco's Modified Eagle Medium og 10% v /v Føtalt Kvæg Serum ved 37 °C og 5% v /v kuldioxid.
      BEMÆRK: Hele mediet er lavet ved at tilføje 55 mL kommerciel FBS i en 500 mL kommercielt købt DMEM med høj glukose, der indeholder L-glutamin, phenol rød og natriumbicarbonat, men ingen HEPES eller natrium pyruvat. Celletal pr. T-175 kolbe ved 70 % sammenløb skal ligge i intervallet 1,7-2,0 x 107.
    2. Mindst 3 timer før den ønskede fikseringstid skal du udskifte T-175 kolbernes medier med nøjagtigt 30 mL forvarmede komplette medier og udskifte kolberne i en cellekuvøse.
      BEMÆRK: Sørg for, at det friske medie ledes på den modsatte side af kolben til cellemonomeren for at undgå cellefordeling. Forsøg på at gennemføre medieudvekslingen så hurtigt som muligt, og indførelsen af minimal gas- og temperaturbalanceforstyrrelser.
    3. Når cellemediet er udskiftet, skal du forberede buffere og kemikalier, der er nødvendige for fiksering. Forbered Dulbeccos fosfat Buffered-Saline (DPBS) med 50 mM glycin ved at tilsætte 10,2 mL 2,5 M glycinlager til en 500 mL flaske DPBS og blanding.
    4. Klargør en flaske DMEM suppleret med 10% FBS som i trin 2.1.1, der skal anvendes under ikke-sterile forhold og en 100 mL aliquot på 0,25% Trypsin-EDTA. Der skal fremskaffes en ekstra flaske kommerciel DPBS, der er formuleret med calciumchlorid (CaCl2) og magnesiumchlorid (MgCl2).
      BEMÆRK: Opløsningerne kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
    5. Forbered en iskasse til randen med knust vandis, så en T-175 kolbe kan passe jævnt på toppen og holde i røghætten sammen med de forberedte buffere, også på is.
      BEMÆRK: På grund af de hurtige reaktioner på oversættelsen på eventuelle miljøændringer skal alle tidspunkter mellem fjernelsen af cellekolberne fra inkubatoren og tilsætning af formaldehydopløsningen minimeres.
    6. Hvis du vil knække cellerne, skal T-175-kolben fjernes fra inkubatoren og presse den fast mod isen for at sikre maksimal overfladekontakt. Inde i den kemiske røghætte, vippe kolben på sin side, så medierne indsamler på den side modsatte af cellerne. Pipette 168 μL på 37% w/v formaldehyd direkte ind i de samlede medier (til en endelig koncentration på 0,2% w/v). Bland straks ved forsigtigt at vugge kolben frem og tilbage, lukke og flytte kolben på is, så den er vandret, og cellerne er dækket jævnt.
      FORSIGTIG: Formaldehyd er et skadeligt stof med potentielle langsigtede bivirkninger og også et irritationsmoment for både åndedrætssystemet og huden. Det bør kun håndteres i en passende kemisk røghætte. Beholdere af formaldehyd skal altid forsegles, når de er uden for røghætten.
      BEMÆRK: Sørg for, at formaldehydet tilføjes direkte i cellemediet og ikke til kolbevæggen. Trin 2.1.6 bør tage mindre end 1 minut.
    7. Inkuber kolberne på is i yderligere 10 minutter. Hæld mediet i en passende affaldsbeholder gennem kolbesiden modsat cellerne.
    8. Ved hjælp af en stripette, pipette i 30 mL af Dulbecco's Fosfat Buffered Saltvand uden calcium og magnesiumioner og desuden indeholder 50 mM glycin, forsigtigt på siden overfor cellerne. Bland ved at vugge kolben; kolben skal vende tilbage til vandret position og inkubere i 10 minutter mere på is.
    9. Hæld opløsningen gennem kolbesiden modsat cellerne, og tilsæt forsigtigt 7 mL af standardopløsningen 0,25% w/v Trypsin-EDTA for at løsne og genbruge cellerne. Inkuber kolben ved stuetemperatur i 5-10 min.
      BEMÆRK: Sørg for, at Trypsin-EDTA-opløsningen dækker alle cellerne jævnt. Brug periodisk blid vippe og vuggende til at fremme celle løsrivelse.
    10. Flyt kolben lodret og ved hjælp af en stripette indsamle de fritliggende celler ved forsigtigt at vaske eventuelle resterende celler fra kolben vægge. Affjedringen overføres til et 50 mL rør, der er sat på is.
      BEMÆRK: Faste celler kan blive mere skrøbelige; rør ikke intenst eller mere, end hvad der kræves for at løsne cellerne fra kolbevæggen.
    11. Suppler straks den indsamlede celleaffjedring med 20 mL komplette medier (de ikke-sterile iskolde medier med 10% FBS) og bland ved forsigtigt at vende røret.
      BEMÆRK: Hele cellekulturmediet (herunder 10% FBS) tilsættes for at neutralisere trypsinen, hvilket forhindrer yderligere skade på cellemembranerne og celleopløsningen.
    12. Pjecellerne ved at centrifugere røret ved 100 x g i 5 min og 4 °C. Cellepillen skal være tydeligt synlig.
    13. Hæld af medierne og forsigtigt genbruge cellepillen i 10 mL iskold DPBS med Ca2 +, Mg2 +, og uden glycin.
    14. Gentag trin 2.1.12.
    15. Hæld vaskebufferen af, og gentag forsigtigt cellepillen i 800 μL iskolde DPBS med Ca2+, Mg2+, uden glycin, på is. Overfør de ophængte celler til et nyt lavt proteinbindingsrør på 1,5 mL mikrocentrifugerør.
    16. Centrifugere røret ved 100 x g i 3 min og 4 °C. Kassér forsigtigt supernatanten ved hjælp af en 1 mL pipettor. På dette stadium kan cellepillen fryses ved -80 °C eller fortsætte til cellelyset.
      BEMÆRK: Frosne cellepiller kan opbevares ved -80 °C op til 1 år. Vi fandt ud af, at cellepillefrysning letter efterfølgende lysis og anbefaler frysning, selvom længere tids opbevaring ikke er planlagt.
  2. Pattedyr celleforstyrrelser og cytosol samling
    1. I et biosikkerhedskab tilsættes 300 μL af lysisbufferen baseret på ikkeionisk, ikke-tilættet vaskemiddel og 7 μL på 40 U/μL RNase-hæmmer. Bland godt ved pipettering ved hjælp af en 1 ML tip.
    2. Fastgør forsigtigt en 25 G nål til en 1-3 mL sprøjte og kraftigt pipette blandingen, ved hjælp af mindst syv langsom opadgående indtag og hurtige nedadgående udstødningsstrøg.
    3. Kassér sprøjten og nålen i en skarpbeholder, og gentag proceduren med en 0,3 mL sprøjte udstyret med en 31 G nål.
    4. Kassér sprøjten og nålen i en skarp skraldespand. Centrifuge rørene ved 4 °C, 12.000 x g i 5 min for at pille cellerester.
    5. Supernatanten overføres til et nyt lavt proteinbindingsrør på 1,5 mL mikrocentrifugerør. Opbevar både cellerester (til kontrolformål) og det resulterende afklarede cellelys ved -80 °C.
      BEMÆRK: Optisk tæthed af lysatområdet mellem 25-30 AU260, når to T-175 kolber kombineres, og de anbefalede mængder følges. Lysatet og cellerester kan opbevares ved -80 °C op til 1 år.
  3. Adskillelse af de faste (poly)ribosomale komplekser fra de ikke-oversatte fraktioner af cytosolen
    1. Der fremstilles lineære 15%-45% w/v saccharosegradienter i 13 mL polypropylenrør i tynd væg, 14 x 89 mm, ved hjælp af fryse-optøningsmetode generelt som beskrevet i trin 1.3.1 i gærprotokollen, men ved hjælp af buffer 2 (Figur 2a).
      BEMÆRK: Optø stigningerne natten over i et koldt rum ved 4 °C natten før fraktioneringen.
    2. 150-250 (maks. 300) μL af cellelyset fra det foregående trin 2.2.5 på de afbalancerede gradienter. Opbevar det resterende lysat ved -80 °C og brug til kontrolformål.
      BEMÆRK: Her gives et eksempel på sedimenteringsbaseret adskillelse i polysomale, ribosomale og 'frie' SSU-fraktioner. Der henvises til den supplerende tabel 1 for at få en alternativ fremgangsmåde.
    3. Ultracentrifuge rørene i en svingspandens rotor med medium volumen ved 4 °C, gennemsnitlig g-kraft 178.305 x g (k-faktor 143,9) i 1 h 45 min.
    4. 30 min før spin færdiggørelse, opsætning og baseline gradient fraktionator, som beskrevet i gær protokol trin 1.4.7-1.4.9.
    5. Fraktionere gradienter generelt som beskrevet i gær protokol trin 1.4.10-1.4.11.
      BEMÆRK: Dette trin vil adskille polysomale, ribosomale og 'gratis' SSU-fraktioner. Polysomale fraktioner kan anvendes i polysome profilering eksperimenter.
    6. Overfør straks de indsamlede fraktioner på is, og hvis de ikke behandles yderligere, opbevares de ved -80 °C op til 6 måneder.
      BEMÆRK: Hvis ændringen af brøkerrøret synkroniseres med onlinefraktionsidentifikation og -adskillelse, anbefaler vi, at du bruger op til 800 μL-fraktioner (indsamlingstid på 32 s pr. brøk ved 1,5 mL/min). Hvis fraktioneringen udføres uden brug af den in-line absorbansudlæsning, anbefales det at bruge 250-500 μL-fraktioner (10-20 s pr. brøk ved 1,5 mL/min). Efter adskillelse kan fraktioner bruges til immunfunktion, elektronmikroskopi, denaturering AF SIDE og vestlig blotting med det samme eller udsættes for krydslink-vending til efterfølgende RNA- og/eller proteomicsanalyser.

Representative Results

Translationelle komplekser er følsomme over for buffernes ioniske sammensætning, hvilket er særligt vigtigt under ultracentrifugering, hvor sedimenteringsegenskaber vurderes. Vi testede således flere sedimenteringsbuffere ved hjælp af afklaret lysat udvundet af jordfast gærmateriale for at vælge de betingelser, der er bedst egnede til at løse translationelle komplekser og separate ribosomale underenheder (SSU, LSU), monoomer (RS) og polyomer på tværs af gradienten. Alle buffere var baseret på kernesammensætningen, der indeholder 25 mM HEPES-KOH pH 7,6 og 2 mM DTT. Koncentrationerne af KCl, MgCl2, CaCl2og EDTA blev yderligere ændret på tværs af bufferne (Figur 2a), og disse komponenter blev tilføjet til lysaterne før gradientbelastning og til saccharosegradientbuffere før gradientstøbning i overensstemmelse hermed.

I buffere 1 og 2 velfor løste oversættelseskomplekser blev opnået. Buffer 1 resulterede i en noget bedre adskillelse af de små ribosomale underenheder (SSU'er) (figur 2a). Udeladelse af MgCl2 og tilsætning af EDTA (buffere 3,4) forårsagede tab af de høje sedimentationsegenskaber for de fleste polyomer og sandsynligvis deres delvise demontering (figur 2a). Mens tilsætning af 2,5 mM CaCl2 resulterede i noget mere homogene polysomale toppe, var forbedringen marginal, og den samlede mængde af det polysomale materiale faldt i dette tilfælde (figur 2a) sammenlignet med buffere 1 og 2. Vi valgte således buffer 1 som den foretrukne arbejdsbuffer.

Figure 2
Figur 2: Bufferbetingelser for translationel kompleks udvinding og vurdering af fikseringens stabiliserende virkning. Vist er UV absorbans profiler indsamlet ved 260 nm for den samlede gær celle lysat adskilt i 10%-40% w /v saccharose gradienter. (a) Virkninger af mono- og divalente salte og magnesiumionbinding på sedimenteringen af materiale udvundet fra ikke-faste gærceller. Røde og grå linjer repræsenterer en typisk replikering. (b,c) Sammenligning af lysater afledt af ikke-faste (grå linje), 2,2% (sort linje) og 4,4% (sort prikket linje) w / v af formaldehyd-faste gærceller. (d) Stabilisering af polyomer med de optimerede 0,2% w/v formaldehydfiksering (sort stiplet og stiplede linje) af HEK 293T-celler sammenlignet med materialet fra samme ikke-faste celler (grå linje). Klik her for at se en større version af dette tal.

Vi kontrollerede derefter effekten af polysomal stabilisering ved fiksering med forskellige formaldehydkoncentrationer. Ved hjælp af det ellers samme cellemateriale, buffere, cellehåndterings- og timingtilgange sammenlignede vi materiale udvundet fra ikke-faste celler og celler, der var fastgjort med 2,2% og 4% w /v formaldehyd (Figur 2b, c). Vi fandt, at 2,2% w / v formaldehyd var bedre egnet til fiksering, da mens det fremragende bevarede polysomes, som det kan bedømmes af polysome-til-monosome ratio(Figur 2b), det ikke reducere det samlede udbytte af ribosomale materiale i forhold til 4% w / v formaldehyd, som udviste klare tegn på overfiksering (Figur 2c).

For det materiale, der stammer fra pattedyrceller, blev der på grund af det større lysis buffer-til-celle volumenforhold, der kræves af den vaskemiddelbaserede ekstraktion, anvendt buffer 2 (Figur 2a). Dette resulterede i velafsatte translationelle komplekser ved sedimentering i saccharosegradienter (Figur 2d). Især blev der anvendt en meget lavere koncentration af formaldehyd på 0,2% w/v, da højere koncentrationer resulterede i betydelige polysomale og ribosomale materialetab (data ikke vist). I lighed med de opnåede resultater med gærceller viste krydskædningsstabiliseret materiale bedre bevarelse af polysomes og højere polysome-til-monosome ratio (Figur 2d).

Vi testede dernæst, om de valgte formaldehydfikseringsbetingelser er effektive nok til at stabilisere aktivt oversatte mRNA inden for de polysomale fraktioner som følge af krydskædning, og det forbedrede polysomale udbytte er ikke kun en konsekvens af hæmmende enzymfunktion og oversættelsesforlængelsesprog. Vi brugte EDTA og højt monovalent salt (KCl) til at destabilisere polyomer og ribosomer. Disse reagenser blev tilføjet til de afklarede gærcellelysater og inkluderet i alle efterfølgende buffere og saccharosegradienter oven på buffer 1-sammensætningen.

Faktisk udviste 15 mM EDTA en mindre destabiliseringseffekt på de polysomale fraktioner, der stammer fra de faste celler (Figur 3a), hvilket bekræfter, at de krydslinkede komplekser er mere robuste. De destabiliserende virkninger af EDTA kan overvindes noget ved at øge koncentrationen af formaldehyd, da materiale fra de 4% w /v af formaldehyd-faste celler modstod udfolde sig bedre (Figur 3a). En forøgelse af EDTA-koncentrationen til 50 mM resulterede imidlertid i destabilisering af de fleste af de translationelle komplekser under både faste og ikke-faste forhold, som kan udledes af den langsommere sedimentering af materialet og fravær af velformede toppe (figur 3b). Dette kan forklares ved den delvise udfoldelse af strukturer og det samlede tab af kompakthed, snarere end ved fuldstændig adskillelse af polysomale komponenter fra mRNA. Selv i dette tilfælde har det krydslinkede materiale vist hurtigere sedimentering (Figur 3b).

Figure 3
Figur 3: Virkningerne af in vivogær formaldehydfiksering på polysomes stabilitet. Buffer 1 (se tekst og figur 2a) blev anvendt i alle eksperimenter. Datatype og plotte som beskrevet i figur 2-forklaringen. (a) Sammenligning af tilsætning af 15 mM EDTA med cellelyset og efterfølgende buffere på stabiliteten af polysomes afledt af ikke-faste (grå linje), 2,2% (sort linje) og 4% (sort prikket linje) w / v af formaldehyd-faste celler. b) samme som( a), men til tilsætning af 50 mM EDTA og eksklusive 4% w/v formaldehydfaste celler. c) samme som( a), men til tilsætning af 500 mM KCl og eksklusive 2,2% w/v formaldehydfaste celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

I lighed med EDTA-effekterne fandt vi ved 500 mM KCl en stor forbedring af stabiliteten med 4% w/v formaldehydfiksering (figur 3c). Det tilsyneladende tab af kompakthed i dette tilfælde kan også forklares ved delvis løsrivelse af bestanddelene af ribosomale komplekser, snarere end deres fuldstændige afstandtagen fra RNA. Samlet set viste polyomer afledt af formaldehydfaste celler højere modstandsdygtighed over for udfoldelse og strukturel destabilisering, i overensstemmelse med at danne yderligere kovalente bindinger inden for disse komplekser.

Under stimulerende vækstbetingelser kan mRNAs hurtigt påbegyndes, hvilket resulterer i ophobning af flere ribosomer på de samme mRNA-molekyler, som danner strukturer kendt som polyribosomer eller polyomer. Polysomes kan adskilles ved ultracentrifugering i saccharosegradienter, hvor de sedimenter baseret på deres rækkefølge (antal samtidig vedhæftede ribosomer på mRNA). Når oversættelsen undertrykkes, ribosomer undlader at engagere sig i en anden runde af oversættelse hurtigt nok, hvilket resulterer i (delvis) 'demontering' af polyomer, som er udstillet som et modalt skift mod polyomer af en lavere orden og ophobning af monoomer4,26.

En model af translationel respons, der kan visualiseres på polysome ordrefordelingsniveauet, kan leveres af glukose sult. Glukoseudtømning fremkalder en af de mest dramatiske og hurtige translationelle hæmmende virkninger på gær1,3,40. Tidligere undersøgelser har vist, at inden for 1 min glukose udtømning, tab af polyomer, ophobning af monoomer og hæmning af oversættelse indledning kan forekomme4. Inden for 5 minutter af glukose re-supplement, oversættelse er hurtigt genoprettet med tydelig stigning i polysomes3,4. Det blev også observeret, at oversættelse blev hæmmet, når celler blev udsat for medier, der indeholder glukose på 0,5% (w /v) eller lavere, og der ikke var nogen effekt set i glukoseniveauer på 0,6% (w /v) eller højere.

Vi ønskede således at afgøre, om vores fikseringsbetingelser er egnede til bevarelse af de translationelle forskelle inden for dynamikken i glukosestressrespons, som det kan vurderes af polysome-til-monosome-forholdet. Vi sammenlignede materialet fra cellerne dyrket i midten af eksponentiel fase på høj glukose (2,00% w / v tilsat) med dem, der overføres i 10 minutter i medier uden eller lav tilsat (henholdsvis 0,00% eller 0,25% w / v) glukose. Fikseringen er udført ved hjælp af 2,2% w/v formaldehyd parallelt i styringen (ikke-udsultet; hurtig medieudskiftning med samme standardmedier, der indeholder 2% w/v tilsat glukose, efterfulgt af inkubation i 10 min. og fiksering) og 10 minved (hurtig medieudskiftning med samme medier, men lav 0,25 w/v eller ingen tilsat glukose, efterfulgt af inkubation i 10 min og fiksering) celler.

I overensstemmelse med de tidligere resultater observerede vi, at gærceller i høj grad undertrykker oversættelse ved glukose sult stress (Figur 4a). Begge, ingen tilsatte og lave glukose betingelser induceret polysome demontering, med lidt, men åbenbart mere polyomer bevaret i tilfælde af lav tilsat glukose. Således kan gær glukose fjernelse svar ikke være af en all-on eller all-off type og er gradvist tunet. Bekræfter forventninger til stabiliserende virkning formaldehyd crosslinking, polysomalt materiale fra de faste celler har vist en højere sondring mellem de udsultede og ikke-udsultede celler, velsagtens bevare et højere dynamikområde af svaret (Figur 4b). Interessant, i tilfælde af materiale fra de faste celler, lav tilsat glukosekoncentration resulterede i den specifikke polysomale overflod, der er meget bedre differentieret fra den no added glukose tilstand, sammenlignet med de ikke-faste celler (Figur 4a). Dette er en stærk indikation af egnetheden af formaldehydfikseringsmetoden til at bevare og opfange relativt små og forbigående forskelle i ligevægten i meget dynamiske processer, såsom under translationelle reaktioner.

Figure 4
Figur 4: Opfange hurtige ændringer i gær oversættelse på glukose sult. Buffer 1 (se tekst og figur 2a) blev anvendt i alle eksperimenter. Datatype og plotte som beskrevet i figur 2-forklaringen. (a) Cellelyater fremstillet af ikke-udsultet (grå linje), begrænset glukose-udsultet (0,25% w/v tilsat glukose i 10 min; brun linje) og glukose-udtømt (ingen tilsat glukose i 10 min; rød linje) ikke-faste gærceller. (b) samme som (a), men for 2,2% w/v formaldehyd-faste celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Overvågning af ribosomers translationelle status i forbindelse med aktivt oversættelse af mRNA ved hjælp af saccharosegradientsimering (»polysomeprofilering«) er en anvendt teknik26,27,28. I kombination med kvantitativ mikroarray analyse og for nylig med høj gennemløb sekventering28,44, polysome profilering giver oplysninger om ribosom-associerede mRNAs transcriptome-wide. Med flere antagelser er det traditionelt blevet fremført inden for proteinbiosynteseforskning, at den polysomale tilstedeværelse er en indikation af aktiv involvering i oversættelsen af de respektive mNA'er. En yderligere konklusion er ofte (men ikke altid) berettiget, at jo flere ribosomer er til stede på et mRNA af en given længde (jo højere rækkefølgen af polysomes), jo mere aktivt, at mRNA er involveret i oversættelse. Således kan adskillelse af den polysomale fraktion fra resten af materialet være nyttigt ud fra det synspunkt at isolere det aktivt oversatte RNA. Inden for fodaftryk profilering tilgange, og især TCP-seq10,38,39, der genererer en separat population af de befriede SSU'er stammer fra scanning, start og stop codon komplekser, kan det være desuden indsigtsfulde at fjerne ribosomale underenheder, der ikke co-sediment med de komplette monoomer eller polysomes.

Vi har således anvendt adskillelse af de "ikke-oversatte" MRNP'er såsom gratis SSU'er (mRNA bundet til enkelt SSU eller SSU'er uden vedhæftet mRNA) væk fra den "aktivt oversættende" pulje af mRNAs. For at opnå dette antog vi, at mRNAs involveret i interaktioner med enten en (mono-) eller flere ribosomer (polysomes) aktivt kan oversættes. Sådanne komplekser kan adskilles fra de andre ved deres højere sedimenteringskoefficient. Vi foreslog også at adskille den 'aktivt oversatte' pulje af mRNAs i en saccharosepude (50% w / v saccharose) i stedet for direkte pelleting materialet på rørvæggen. Centrifugering af de hurtigt sedimenteringskomplekser i puden gjorde det muligt for os at overvåge adskillelsen ved hjælp af udlæsning af absorbansprofilen og opnå en højere effekt af det opløselige, ikke-aggregerede og ikke-denaturerede materiale sammenlignet med pelleting og re-solubilisering10,38.

Samlet set blev faste præciserede lysater udsat for en totrins ultracentrifugeringsproces (figur 5)for at rense de enkelte SSU'er, ribosomer, diomer og potentielt kompakt pakkede polyomer af højere orden . I den første saccharosegradient resulterede ultracentrifugationen i adskilte frie SSU'er og LSU'er i toppen (10%-20% w/v sac saccharose) del af gradienten, mens den crosslinkede oversatte pool, herunder polyomer og mRNAs forbundet med en komplet ribosom, var koncentreret i bunden (50% w/v sac saccharose) af gradienten (figur 5a ). De nederste 50 % w/v sac saccharoselag, der indeholdt den oversatte mRNA-pulje, blev derefter koncentreret, og RNA fordøjet med RNase I, efterfulgt af en anden saccharosegradient ultracentrifugering for at opnå separate SSU, LSU, RS, RNase resistente diomer (DS) og mindre brøkdel af højere orden nukleaseresistente polyomer (Figur 5b). Negativ farvning med uranylacetat og billeddannelse med transmissionselektronmikroskop bekræftede identiteten af de komplekser, der er isoleret i hvert sedimenteringsstadium (Figur 5).

Figure 5
Figur 5: Isolering af de samlede oversatte RNA-fraktioner væk fra det uoversatte RNA. (a,c) Skematisk (venstre) og de respektive repræsentative resultater (højre, datatype og plotte som beskrevet i figur 2-legenden) af (a)første seponerede saccharosegradientseparering af de ikke-oversatte cytosolfraktioner, herunder frie SSU'er og den oversatte mRNA-pulje identificeret ved co-sedimentering med ribosomer og polyomer og (c) adskillelse af de enkelte ribosomale komplekser, der frigøres fra den oversatte mRNA-pulje ved kontrolleret RNase I fordøjelse og ultracentrifugering gennem en anden lineær saccharosegradient i SSU, LSU, ribosomal (RS) og nukleaseresistente disomale (DS) fraktioner. Der blev medtaget høje (15 AU260)og lave (8 AU260)mængder af det ikke-udsultede fordøjede materiale for at påvise en mulighed for at øge ultracentrifugationsbelastningen, når mindre fraktioner er af interesse. Højere orden nuklease-resistente polyomer kan også identificeres (f.eks trisomes i de medfølgende eksempler). (b,d) Repræsentative TEM-billeder af uranylacetatkontrastfraktioner fra henholdsvis (a,c) som mærket. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at kontrollere fikseringsregimets egnethed til opbevaring af forbigående ribosom-associerede proteiner (især eIF'er) testede vi for co-sedimentering af eIF4A, en labile eIF dynamisk bundet til ribosomet, på tværs af ribosomale fraktioner. Vi benyttede os af eIF4A Tandem Affinity Purification (TAP) mærkede gær stamme (TIF1-TAP) og undersøgt eIF4A tilstedeværelse i materiale afledt af de faste vs ikke-faste celler ved hjælp af anti-TAP antistof, sammenlignet med overflod af Pab1p som en ekstra RNA-bindende kontrol, ved hjælp af SDS-PAGE efterfulgt af vestlige blotting (Figur 6).

Figure 6
Figur 6: Stabilisering af forbigående proteiner i de translationelle komplekser ved in vivo formaldehydfiksering. (a,b) (topplotter) Helcellelyst (WCL) af (a)ikke-faste og( b) 2,2% formaldehydfaste eIF4A-TAP gærceller adskilt af ultracentrifugering og visualiseret som beskrevet i figur 2-legenden. (bundplotter) Western-blot imaging af de respektive saccharose gradient fraktioner ved adskillelse af det materiale analyseret i de tilsvarende gradienter (top plots), og WCL som en kontrol. c) Gennemsnitligt forhold mellem eIF4A eller Pab1p-overfloden i fraktioner af fast og ikke-fast materiale. Relative proportioner (normaliseret til signalet fra alle 2-7 fraktioner) af eIF4A (sorte bjælker) og Pab1p (grå bjælker) blev beregnet på tværs af 2,3 (SSU, LSU), 4,5 (RS, lette polyomer) og 6,7 (tunge polyomer) fra data fra (a,b) (bundplotter) og deres faste til ikke-faste forhold taget. Fejllinjer angiver standardafvigelsen af forholdet fra gennemsnittet, hvor de grupperede brøker (stiplede bokse) behandles som replikker. Klik her for at se en større version af dette tal.

I overensstemmelse med deres høje forekomst i cellerne observerede vi en høj intensitet af signalet fra begge proteiner i hele cellelyset (WCL) og langsommere sedimenteringsfraktioner afledt af ikke-faste celler (Figur 6a, bundpanel). Vi har også opdaget betydelige mængder af disse proteiner i WCL stammer fra de faste celler og berolige effektiviteten af crosslinked materiale ekstraktion og fravær af uventede tab (Figur 6b, bundpanel). I modsætning til de ikke-faste celler viste materiale fra de faste celler imidlertid forhøjet relativ tilstedeværelse af eIF4A i de hurtigere sedimenterende ribosomale fraktioner sammenlignet med Pab1p (Figur 6c). Dette resultat tyder på, at eIF4A forbliver mere fast forbundet med polysomes i formaldehyd-crosslinked materiale.

Efter at have bekræftet den positive og specifikke stabiliseringseffekt af krydslinking på eIF4A tilstedeværelse i ribosomale fraktioner, brugte vi det faste materiale fra eIF4A-tagged (TIF1-TAP) gærstamme til at fange og berige eIF4A-holdige komplekser ved affinitetsrensning med magnetiske IgG perler. Vi har affinitetsberigede WCL-, frie SSU- og polysomale (oversatte mRNA-puljefraktioner) fraktioner efter den første sedimentering gennem saccharosegradient (f.eks. punkt 1.3 i gærprotokollen) samt SSU-, LSU- og RS-fraktioner fra den anden sedimentering ved demonteringen af den oversatte pulje i individuelle komplekser med RNase I (f.eks. afsnit 1.4 i gærprotokollen) (Figur 7 ). I alle tilfælde, bortset fra LSU-fraktionen, var vi i stand til at observere selektiv berigelse af eIF4A i de rensede fraktioner (eluate, E), sammenlignet med tilstedeværelsen af β-actin i kildematerialet (input, I) (Figur 7).

Figure 7
Figur 7: Selektiv immunpurificering af in vivo formaldehydstabiliserede oversættelseskomplekser ved forbigående tilhørende eIF4A. Skemaet illustrerer kilden til forskellige translationelle komplekser og eIF4A-epitop, herunder den ikke-fraktionerede præciserede WCL af eIF4A-TAP gærcellerne; gratis SSU'er og oversat RNA pool (polysomes) adskilt i den første ultracentrifugation; SSU,LSU og RS fraktioner befriet fra den oversatte RNA af RNase I fordøjelse og adskilt ved hjælp af anden ultracentrifugering (se tekst). Western blot billede giver en visualisering af eIF4A overflod i fraktioner i forhold til overflod af samtidig farvede β-actin kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Formaldehyd fiksering er en bekvem og populær metode til at opnå hurtig in vivo crosslinking af biomolekyler10,36,45,46,47,48. Sammenlignet med de andre potentielle biomolekylemål kræver vellykket fangst af translationelle komplekser en øjeblikkelig fiksering under snapkøling af cellerne eller andet materiale. Uden den ufordedne stabilisering er der mulighed for, at forskellige oversættelsesrelaterede processer kan fortsætte, hvilket flytter den komplekse fordeling væk fra den uforstyrrede in vivo state49. Sammenlignet med de andre metoder til translationel anholdelse og ribosomal kompleks stabilisering lover formaldehydhandlingens hurtighed på tværs af cellemembraner og crosslinks vilkårlige karakter bevarelse af den maksimale mangfoldighed af oversættelseskomplekset mellemprodukter tættere på deres oprindeligt distribuerede tilstande50.

Den tilgang, der præsenteres her, er etableret og optimeret i både gær- og pattedyrceller, og metoder er nu afledt af andre grupper til brug på tværs af mere forskelligartet biologisk materiale, såsom i hele hvirveldyr (f.eks. zebrafiskembryoner)10,38,39,49,51,52 . Selv om disse værker kollektivt berolige alsidigheden og den brede anvendelighed af tilgangen, hurtig formaldehyd crosslinking af translationelle komplekser kan betragtes som noget vanskeligt at overføre til nye typer af biologisk materiale på grund af behovet for optimeringer og justeringer.

Et fremmest krav til metodens succes er reoptimering af koncentrationen af formaldehyd og celleindsamlings- og disruptionteknikken. Mindre gennemtrængelige, små og runde gærceller kræver meget højere (mindst 10 gange) formaldehydkoncentration og fysisk forstyrrelse af de faste celler. I modsætning hertil kan store og flade klæbende pattedyrceller i kultur let overfastsættes og kræve blid håndtering ved fiksering, mens ekstraktionen af de faste komplekser kan udføres kemisk med membranforstyrrelse ved hjælp af rengøringsmidler. Under-crosslinking kan tillade mindre stabile eller mere kortvarige mellemprodukter at adskille eller lække i en senere tilstand. Over-crosslinking kan have en negativ indvirkning på evnen til at isolere og studere ribosomale fraktioner og kan skabe selektive bias såsom dybere udtømning af tunge komplekser. I vores observation kan selv mindre ændringer, såsom den type klæbende menneskelige celler, der anvendes, påvirke udbyttet af de genvundne krydslinkede komplekser og kan kræve re-optimering af crosslinking regimet. Vi kan også forudse, at celler med væsentligt forskellige permeabilitetsegenskaber, såsom planteceller, vil kræve yderligere omfattende optimering af fikseringsbetingelserne52. Men det er svært at forestille sig en type biologisk materiale, der ville være helt uforeneligt med tilgangen.

En overvejelse, der er relevant for pattedyrsfikseringsprotokollen, er tætheden og mængden af cellemateriale, der anvendes som input. Det anbefales at have cellerne kontinuerligt voksende uden re-såning eller andre forstyrrelser i mindst 2 dage for at undgå ekstern indflydelse på cellulære oversættelse dynamik. Gældende for de fleste celletyper, men for de fleste klæbende celler konsekvent opnået sammenløb niveauer på ikke mere end 70% vil sikre fravær af større kontakt hæmning virkninger, der kan have en negativ og uforudsigelig indflydelse oversættelse satser.

Et andet interessant og potentielt enestående bekvemt træk ved formaldehydfiksering, der stammer fra dens vilkårlige reaktivitet, er stabiliseringseffekten på translationelle komplekser i systemer med blandet taksonomi. Bakterielle, og endnu mere translationelle komplekser af mitokondrier, kloroplaster og forskellige intracellulære parasitter, har været notorisk vanskeligt at målrette med specifikke oversættelseshæmmere. I TCP-seq-dataene kan fodspor, der er tilknytning til mitotranscriptomet, derimod let observeres i dataene38,39,50. En interessant efterfølgende udvikling kunne være anvendelsen af metoden til at undersøge oversættelse i hele mikrosamfund, f.eks. i jord-, vand- eller tarmprøver, hvor pålidelig hurtig oversættelsesarrest og kompleks stabilisering med andre midler ville være problematisk.

Det skal også nævnes, at intet forhindrer brugen af formaldehydstabilisering umiddelbart efter celleforstyrrelser og materiale homogenisering for det mest komplicerede materiale (såsom hårdt og/eller voluminøst væv). Denne fremgangsmåde anvendes allerede ofte til at fjerne celleindtastningsforsinkelsen, når du stabiliserer translationelle komplekser med specifikke små molekylehæmmere33,53,54,55. I betragtning af at formaldehydfiksering traditionelt er blevet brugt med fremragende resultater til ex vivo / in vitro-prøvestabilisering i applikationer som elektronmikroskopi45,56,57,58, kan vi forvente endnu mindre negative virkninger i dette tilfælde, især dem, der er forbundet med den dårlige ekstraktion af de translationelle komplekser fra de grundigt faste celler.

Vores resultater bekræfter anvendeligheden af hurtig formaldehydfiksering for at stabilisere meget forbigående komplekser, såsom dem, der omfatter eIF4A. Det er bemærkelsesværdigt, at gær eIF4A i modsætning til pattedyr er meget svagere forbundet med capbindingskomplekset eIF4F og som følge heraf translationelle komplekser generelt. eIF4A går normalt tabt under enhver omfattende rensning af ribosomalt materiale i gær29,59,60,61,62,63. Men i det in vivo-fastegærmateriale er det muligt at opnå pålidelig berigelse af eIF4A i alle fraktioner af translationelle komplekser, hvor dets tilstedeværelse ville blive forventet. De tidligere offentliggjorte Sel-TCP-seq-data har vist berigelsen af eIF2 og eIF3, der i højere grad forbinder med ribosomer (men også afslørede forbigående forekommende co-translationelle proteinkompleksmontering)39. Metoden er således velegnet til påvisning af både stærkere og svagere vedhæftede bestanddele af de translationelle komplekser.

Sammenfattende har vi præsenteret en tilgang, der er nyttig til at få indsigt primært i de ændringer, der sker i oversættelsesfasen, og når der kræves minimalt ribosomal fordeling over mRNA. Det er vigtigt, at tilgangen er velegnet til stabilisering af relativt labile og dynamiske komponenter i translationelle komplekser, såsom eIF4A, og kan bruges bredt udsat for nødvendige optimeringer. Vi har også fremlagt dokumentation for nytten af formaldehydfiksering i scenarierne med hurtig dynamisk ændring af oversættelsen, der åbner undersøgelsesområder såsom hurtige cellulære reaktioner på miljøændringer eller stressforhold.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Australian Research Council Discovery Project grant (DP180100111 til T.P. og N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 til N.E.S.) og Research Fellowship (APP1135928 til T.P.). Forfatterne anerkender faciliteterne i Mikroskopi Australien på Center for Advanced Microscopy, Australian National University, en facilitet, der er finansieret af universitetet og den føderale regering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Merck, Sigma-Aldrich 70161
Peptone Merck, Sigma-Aldrich 70178
D-Glucose (Dextrose) Merck, Sigma-Aldrich 49139
Adenine sulphate Amresco 0607-50G
Formaldehyde solution Merck Sigma-Aldrich F11635-500ML ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific 10777019
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail COEDTAF-RO Roche by Merck 11873580001
Magnesium chloride solution (Merck/Sigma-Aldrich) M1028
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (Merck/Sigma-Aldrich) E7889
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL Ambion AM2294
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL) Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific AM2694
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0) (Merck/Sigma-Aldrich) P1944-100ML
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) 11033
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) AM9740
Glycogen (5 mg/ml) Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) AM9510
Ethyl alcohol, Pure Merck; Sigma Aldrich E7023
Amersham™ Hybond® P Western blotting membranes, PVDF Merck GE10600023 PVDF membrane for western blotting
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific NW04120BOX Protein gel
4X Bolt™ LDS Sample Buffer Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific B0007  LDS sample loading buffer
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards BioRad 1610375 Protein ladder
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer ThermoFischer Scientific B0002 PAGE runninjg buffer
Intercept® (PBS) Blocking Buffer LI-COR 927-70001 Odyssey Blcoking buffer (PBS)
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 92632210
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 92632211
TAP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific CAB1001
Anti-beta Actin antibody Abcam ab8227
Sucrose (Merck/Sigma-Aldrich) 84097 BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC)
DL-Dithiothreitol solution (Merck/Sigma-Aldrich) 43816 BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O
Terumo Syringe 1CC/mL Terumo Syringe 878499
Potassium chloride (Merck/Sigma-Aldrich) 60128
HEPES (Merck/Sigma-Aldrich) H3375
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich 12003C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium Sigma-Aldrich D8662
Glycine Sigma-Aldrich G7126
Tris hydrochloride Merck/Sigma-Aldrich 10812846001
Sodium dodecyl sulfate Merck/Sigma-Aldrich 436143
IGEPAL CA-630 Merck/Sigma-Aldrich I3021
Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111
Stainless steel grinding jar Retsch 02.462.0059
MM400 mixer mill Retsch 20.745.0001
Gradient Fractionator Brandel BRN-BR-188
Thermomixer R Eppendorf Z605271
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices Eppendorf Safe-Lock 30121023
Mini Gel Tank (Thermo Fisher Scientific) A25977 PAGE running tank
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm Beckman-Coulter 344057
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk Beckman-Coulter 331372
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices Merck UFC5030 Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge Cambridge Scientific 15566
Beckman Coulter Optima L-90K GMI 8043-30-1191
Nunc EasYFlask 175cm2 Thermofisher Scientific 159910
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermofisher Scientific 14-432-22
25 mL Serological Pipette Sigma-Aldrich SIAL1250
10 mL Serological Pipette Sigma-Aldrich SIAL1100
DNA lobind tubes Eppendorf 30108051
Cold Centrifuge 5810 R Eppendorf EP022628188 for 50 mL tubes
Orbital Shaking Incubator Ratek OM11
Frezco 17 Microcentrifuge Thermofisher Scientific 75002402
Eppendorf DNA lo-bind tubes Merck/Sigma-Aldrich EP0030108051
Eppendorf® Protein LoBind tubes Merck/Sigma-Aldrich EP0030108116
SW 41 Ti Swinging bucket rotor Beckman-Coulter 331362
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L Thermofisher Scientific 51026282
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe BD Medical 328822
3 mL syringe with Luer Lok tip BD Medical 302113
25 G x 16 mm Hypodermic Needle Terumo TUAN2516R1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janapala, Y., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Control of translation at the initiation phase during glucose starvation in yeast. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4043 (2019).
  2. Masvidal, L., Hulea, L., Furic, L., Topisirovic, I., Larsson, O. mTOR-sensitive translation: Cleared fog reveals more trees. RNA Biology. 14 (10), 1299-1305 (2017).
  3. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Molecular Biology of the Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  4. Crawford, R. A., Pavitt, G. D. Translational regulation in response to stress in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 36 (1), 5-21 (2019).
  5. Melamed, D., Pnueli, L., Arava, Y. Yeast translational response to high salinity: global analysis reveals regulation at multiple levels. RNA. 14 (7), 1337-1351 (2008).
  6. Hershey, J. W., Sonenberg, N., Mathews, M. B. Principles of translational control: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 011528 (2012).
  7. Mata, J., Marguerat, S., Bähler, J. Post-transcriptional control of gene expression: a genome-wide perspective. Trends in Biochemical Sciences. 30 (9), 506-514 (2005).
  8. Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational regulation of gene expression during conditions of cell stress. Molecular Cell. 40 (2), 228-237 (2010).
  9. Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 5 (3), 301-315 (2014).
  10. Archer, S. K., Shirokikh, N. E., Beilharz, T. H., Preiss, T. Dynamics of ribosome scanning and recycling revealed by translation complex profiling. Nature. 535 (7613), 570-574 (2016).
  11. Hinnebusch, A. G., Ivanov, I. P., Sonenberg, N. Translational control by 5'-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Science. 352 (6292), 1413-1416 (2016).
  12. Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (7), 013706 (2012).
  13. Shirokikh, N. E., Preiss, T. Translation initiation by cap-dependent ribosome recruitment: Recent insights and open questions. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 9 (4), 1473 (2018).
  14. Jiménez-Díaz, A., Remacha, M., Ballesta, J. P., Berlanga, J. J. Phosphorylation of initiation factor eIF2 in response to stress conditions is mediated by acidic ribosomal P1/P2 proteins in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 8 (12), 84219 (2013).
  15. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  16. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  17. Barraza, C. E., et al. The role of PKA in the translational response to heat stress in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 12 (10), 0185416 (2017).
  18. Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: Life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
  19. Jamar, N. H., Kritsiligkou, P., Grant, C. M. The non-stop decay mRNA surveillance pathway is required for oxidative stress tolerance. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6881-6893 (2017).
  20. Chen, Z., et al. The complete pathway for thiosulfate utilization in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology. 84 (22), (2018).
  21. Marzluf, G. A. Molecular genetics of sulfur assimilation in filamentous fungi and yeast. Annual Review of Microbiology. 51, 73-96 (1997).
  22. Miller, D., Brandt, N., Gresham, D. Systematic identification of factors mediating accelerated mRNA degradation in response to changes in environmental nitrogen. PLoS Genetics. 14 (5), 1007406 (2018).
  23. Zhang, W., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Regulation of sensing, transportation, and catabolism of nitrogen sources in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82 (1), (2018).
  24. Tokpohozin, S. E., Fischer, S., Becker, T. Selection of a new Saccharomyces yeast to enhance relevant sorghum beer aroma components, higher alcohols, and esters. Food Microbiology. 83, 181-186 (2019).
  25. Walker, G. M., Stewart, G. G. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages. Beverages. 2 (4), 30 (2016).
  26. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
  27. Jin, H. Y., Xiao, C. An integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
  28. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  29. Lackner, D. H., et al. A network of multiple regulatory layers shapes gene expression in fission yeast. Molecular Cell. 26 (1), 145-155 (2007).
  30. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  31. Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), (2019).
  32. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  33. Hussmann, J. A., Patchett, S., Johnson, A., Sawyer, S., Press, W. H. Understanding biases in ribosome profiling experiments reveals signatures of translation dynamics in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences Genetics. 11 (12), 1005732 (2015).
  34. Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
  35. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
  36. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  37. Kage, U., Powell, J. J., Gardiner, D. M., Kazan, K. Ribosome profiling in plants: What is not lost in translation. Journal of Experimental Botany. 71 (18), 5323-5332 (2020).
  38. Shirokikh, N. E., Archer, S. K., Beilharz, T. H., Powell, D., Preiss, T. Translation complex profile sequencing to study the in vivo dynamics of mRNA-ribosome interactions during translation initiation, elongation and termination. Nature Protocols. 12 (4), 697-731 (2017).
  39. Wagner, S., et al. Selective translation complex profiling reveals staged initiation and co-translational assembly of initiation factor complexes. Molecular Cell. 79 (4), 546-560 (2020).
  40. Zlotorynski, E. Profiling ribosome dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (9), 535-535 (2016).
  41. Sen, N. D., Gupta, N., S, K. A., Preiss, T., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Functional interplay between DEAD-box RNA helicases Ded1 and Dbp1 in preinitiation complex attachment and scanning on structured mRNAs in vivo. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8785-8806 (2019).
  42. Zhao, J., Qin, B., Nikolay, R., Spahn, C. M. T., Zhang, G. Translatomics: The global view of translation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 20010212 (2019).
  43. Luthe, D. S. A simple technique for the preparation and storage of sucrose gradients. Analytical Biochemistry. 135 (1), 230-232 (1983).
  44. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Review Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  45. Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends in Biochemical Sciences. 25 (3), 99-104 (2000).
  46. Schmiedeberg, L., Skene, P., Deaton, A., Bird, A. A Temporal Threshold for Formaldehyde Crosslinking and Fixation. PLoS One. 4 (2), 4636 (2009).
  47. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: A probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  48. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping proteinDNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  49. Bohlen, J., Fenzl, K., Kramer, G., Bukau, B., Teleman, A. A. Selective 40S footprinting reveals cap-tethered ribosome scanning in human cells. Molecular Cell. 79 (4), 561-574 (2020).
  50. Shirokikh, N. E. Translation complex stabilization on messenger RNA and footprint profiling to study the RNA responses and dynamics of protein biosynthesis in the cells. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. , (2021).
  51. Giess, A., et al. Profiling of small ribosomal subunits reveals modes and regulation of translation initiation. Cell Reports. 31 (3), 107534 (2020).
  52. Firmino, A. A. P., et al. Separation and paired proteome profiling of plant chloroplast and cytoplasmic ribosomes. Plants (Basel). 9 (7), (2020).
  53. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Research. 42 (17), 134 (2014).
  54. Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
  55. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
  56. Plénat, F., et al. Formaldehyde fixation in the third millennium. Annales De Pathologie. 21 (1), 29-47 (2001).
  57. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  58. Wang, N. S., Minassian, H. The formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues for diagnostic transmission electron microscopy: A retrospective and prospective study. Human Pathology. 18 (7), 715-727 (1987).
  59. Grifo, J. A., et al. Characterization of eukaryotic initiation factor 4A, a protein involved in ATP-dependent binding of globin mRNA. Journal of Biological Chemistry. 257 (9), 5246-5252 (1982).
  60. Li, Y. Commonly used tag combinations for tandem affinity purification. Biotechnology and Applied Biochemistry. 55 (2), 73-83 (2010).
  61. Blum, S., et al. ATP hydrolysis by initiation factor 4A is required for translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (16), 7664-7668 (1992).
  62. Merrick, W. C. eIF4F: A Retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
  63. Rogers, G. W., Komar, A. A., Merrick, W. C. eIF4A: The godfather of the DEAD box helicases. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 72, 307-331 (2002).

Tags

Biologi Udgave 178 proteinbiosyntese snapshot capture oversættelse kompleks stabilisering hurtige celleresponser cellulær stress ribosomale komplekser affinitet rensning af oversættelse mellemprodukter translationel kontrol oversættelse kompleks profil sekventering TCP-seq ribosom (oversættelse) profilering ribo-seq ribosom sedimentering ved ultracentrifugering i saccharose gradient
Hurtig <em>In Vivo</em> Fiksering og isolering af translationelle komplekser fra eukaryote celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Janapala, Y., Woodward, K., Lee, J., … More

Janapala, Y., Woodward, K., Lee, J., Rug, M., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (178), e62639, doi:10.3791/62639 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter