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Biology

यूकेरियोटिक कोशिकाओं से ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के वीवो फिक्सेशन और अलगाव में तेजी

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62639
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,3, 1
1Division of Genome Sciences and Cancer, The John Curtin School of Medical Research, The Australian National University, 2Centre for Advanced Microscopy, The Australian National University, 3Victor Chang Cardiac Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

हम लाइव खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग के साथ ट्रांसलेशनल (प्रोटीन बायोसिंथेसिस) परिसरों को तेजी से स्थिर करने के लिए एक तकनीक पेश करते हैं। यह दृष्टिकोण क्षणिक मध्यवर्ती और गतिशील आरएनए: प्रोटीन इंटरैक्शन को विच्छेदन करने में सक्षम बनाता है। क्रॉसलिंक किए गए परिसरों का उपयोग कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में किया जा सकता है जैसे कि गहरे अनुक्रमण-आधारित प्रोफाइलिंग विधियों, माइक्रोस्कोपी और मास-स्पेक्ट्रोमेट्री में।

Abstract

मैसेंजर (एम) आरएनए के तेजी से पुनर्वितरण और एमआरएनए अनुवाद के परिवर्तनों से जुड़ी त्वरित प्रतिक्रियाएं कोशिकाओं के चल रहे होम्योस्टिटिक समायोजन के लिए प्रासंगिक हैं। ये समायोजन यूकेरियोटिक सेल सर्वाइविटी और 'क्षति नियंत्रण' के लिए महत्वपूर्ण हैं, जो पोषक तत्वों और लवणता के स्तर, तापमान और विभिन्न रासायनिक और विकिरण तनावों में उतार-चढ़ाव के दौरान होते हैं। आरएनए स्तर की प्रतिक्रियाओं की अत्यधिक गतिशील प्रकृति के कारण, और आरएनए के कई की अस्थिरता: आरएनए और आरएनए: प्रोटीन मध्यवर्ती, साइटोप्लाज्मिक आरएनए राज्य का एक सार्थक स्नैपशॉट प्राप्त करना केवल सीमित संख्या में तरीकों के साथ संभव है। ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड, आरएनए-सेक-आधारित राइबोसोम प्रोफाइलिंग-प्रकार के प्रयोग अनुवाद के नियंत्रण के लिए डेटा के सबसे सूचनात्मक स्रोतों में से हैं। हालांकि, एक समान आरएनए और आरएनए की अनुपस्थिति: प्रोटीन मध्यवर्ती स्थिरीकरण विशेष रूप से तेज गति वाले सेलुलर प्रतिक्रिया मार्गों में विभिन्न पूर्वाग्रहों का कारण बन सकता है। इस लेख में, हम आरएनए और आरएनए: प्रोटीन मध्यवर्ती स्थिरीकरण में सहायता करने के लिए, विभिन्न पारमशीलता की यूकेरियोटिक कोशिकाओं पर लागू तेजी से निर्धारण का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम स्थिर आरएनए के अलगाव के उदाहरण प्रदान करते हैं: राइबोसोमल और पॉली (रिबो) सोमल अंशों के साथ उनके सह-तलछट के आधार पर प्रोटीन परिसर। अलग स्थिर सामग्री का उपयोग बाद में राइबोसोम प्रोफाइलिंग-प्रकार के प्रयोगों के हिस्से के रूप में किया जा सकता है, जैसे अनुवाद जटिल प्रोफाइल अनुक्रमण (टीसीपी-एसईक्यू) दृष्टिकोण और इसके डेरिवेटिव में। टीसीपी-सेक्यू-शैली विधियों की बहुमुखी प्रतिभा अब विभिन्न प्रकार के जीवों और कोशिका प्रकारों में अनुप्रयोगों द्वारा प्रदर्शित की गई है। क्रॉसलिंक उत्क्रमण की आसानी के कारण स्थिर परिसरों को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके अतिरिक्त रूप से आत्मीयता-शुद्ध और चित्रित किया जा सकता है, जो विभिन्न पॉली (रिबो) सोमल अंशों में अलग हो जाते हैं और आरएनए अनुक्रमण के अधीन होते हैं। इसलिए, स्नैप-चिलिंग और फॉर्मलडिहाइड निर्धारण के आधार पर विधियां, इसके बाद तलछट-आधारित या अन्य प्रकार के आरएनए: प्रोटीन जटिल संवर्धन, तेजी से आरएनए के बेहतर विवरणों की जांच करने में विशेष रुचि हो सकती है: लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन जटिल गतिशीलता।

Introduction

जीवित जीव अपने जीवनकाल में गतिशील अंतर-और बाहेत्रक परिवर्तनों के अधीन हैं, जिन्हें होमोसेस्टेसिस बनाए रखने और अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए तेजी से प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता होती है। पर्यावरण अनुकूलन की अनुमति देने के लिए, यूकेरियोटिक कोशिकाएं जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के माध्यम से अपने चयापचय को समायोजित करती हैं। जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण प्रतिलेखन और/या अनुवाद के दौरान लगाया जा सकता है; अनुवादात्मक प्रतिक्रियाओं के साथ आम तौर पर अधिक तेजी से होने वाली1,2,3,4. उदाहरण के लिए, अनुवादात्मक परिवर्तन आमतौर पर तनाव की शुरुआत के 1-30 मिनट के भीतर उत्पन्न होते हैं, जबकि ट्रांसक्रिप्शन-स्तर परिवर्तनतनाव जोखिम3,4,5के घंटों बाद पालन करते हैं। साइटोप्लाज्म में मैसेंजर (एम) आरएनए अणुओं की लगातार उपलब्धता के कारण अनुवाद उत्पादन में परिवर्तन अधिक तेजी से प्राप्त होते हैं। इसके विपरीत, प्रतिलेखन स्तर पर, नए एमआरएनए अणुओं का संश्लेषण किया जाना चाहिए, और यूकेरियोट्स में, नाभिक से संसाधित और निर्यात किया जाना चाहिए, जिससेप्रतिक्रिया समय2, 4,6,7,8में व्यापक विलंब होता है।

तनाव के लिए तीव्र अनुवाद प्रतिक्रिया आम तौर पर अनुवाद उत्पादन में एक समग्र कमी की विशेषता है, सेल अस्तित्व के लिए आवश्यक प्रोटीन के चयनात्मक अप्रेगुलेशन के साथ1,3,4,9. प्रोटीन उत्पादन उत्पादन को कम करने की प्रक्रिया के उच्च ऊर्जा खर्च के कारण महत्वपूर्ण माना जाता है3,7. चयनात्मक अवरोध और अपरेगुलेशन को सुविधाजनक बनाने के लिए, अनुवादात्मक प्रतिक्रियाओं को जटिल नियामक तंत्रों की एक श्रृंखला द्वारा परोसा जाता है। विनियमन अनुवाद के सभी चरणों में लगाया जा सकता है: दीक्षा, विस्तार, पॉलीपेप्टाइड बायोसिंथेसिस और रिबोसोमल रीसाइक्लिंग की समाप्ति10,11,12,13, लेकिन दीक्षा चरण में सबसे दृढ़ता से प्रदर्शित किया जाता है5,7,9,10,13. दीक्षा के दौरान, यूकेरियोटिक दीक्षा कारकों (ईआईएफ) द्वारा सहायता प्राप्त छोटे रिबोसोमल सबयूनिट (एसएसयू) को बांधता है, और एक स्टार्ट कॉडन को मान्यता मिलने तक एमआरएनए के 5 ' अनट्रालेटेड क्षेत्र (यूटीआर) को स्कैन करता है2,5,6,8,11,12,13. नियामक तंत्र अक्सर अटैचमेंट, स्कैनिंग को प्रभावित करने वाले ईआईएफ को लक्षित करते हैं, और कोडन मान्यता शुरू करते हैं। उदाहरण के लिए, दीक्षा कारक eIF2, एक आवश्यक अनुवाद कारक है कि एक सर्जक मिले-tRNA की भर्ती में एड्सiMet एसएसयू के लिए, अक्सर तनाव की स्थिति में यूकेरियोट्स में लक्षित किया जाता है4,6,11. खमीर में, इस कारक के फॉस्फोरिलेशन पोषक तत्वों के अभाव और ऑस्मोटिक तनाव के तहत प्रेरित किया जा सकता है1,4,11,14,15, और स्तनधारी कोशिकाओं में, अमीनो एसिड भुखमरी, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव, यूवी तनाव, वायरल संक्रमण, और बदल ऑक्सीजन का स्तर इस प्रतिक्रिया को ट्रिगर कर सकता है8,9,11. विशिष्ट एमआरएनए अनुवाद का तेजी से अपरेगुलेशन हाइपोक्सिया के लिए स्तनधारी सेल प्रतिक्रिया में स्पष्ट है, जो एक वैश्विक तेजी से अनुवाद अवरोध और हाइपोक्सिया-अक्षकीय कारकों (एचआईएफ) बायोसिंथेसिस के चयनात्मक अप्रेड्यूलेशन को प्रदर्शित करता है। HIFs प्रतिलेखन कारक हैं, जो तब डीएनए प्रतिलेखन स्तर पर लंबी अवधि के सेलुलर पुनर्प्रोग्रामिंग प्रकाश में लाना8,9,16. इसी तरह की प्रतिक्रियाओं गर्मी तनाव के तहत खमीर में देखा गया है, हीट शॉक प्रोटीन (HSPs) की तेजी से अनुवाद अभिव्यक्ति के साथ देरी प्रतिलेखन स्तर प्रतिक्रियाओं के बाद17,18. पोषक तत्वों के अभाव और गर्मी सदमे के अलावा, खमीर में अनुवाद प्रतिक्रियाओं अलग ऑक्सीजन के तहत अध्ययन किया गया है8,19लवणता5, फॉस्फेट, सल्फर20,21 और नाइट्रोजन22,23 स्तर। इस शोध में खमीर के औद्योगिक उपयोगों के लिए व्यापक निहितार्थ हैं, जैसे कि बेकिंग और किण्वन24,25. ट्रांसलेशनल प्रतिक्रियाएं न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों और हृदय रोग जैसे रोगों की समझ को आगे बढ़ाने में भी महत्वपूर्ण भूमिका हो सकती हैं, जो ऑक्सीडेटिव तनाव जैसे इंट्रासेलुलर तनावों की विशेषता हैं। कुल मिलाकर, अनुवादात्मक प्रतिक्रियाएं जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण का अभिन्न अंग हैं और यूकेरियोटिक जीवों में तनाव की स्थिति की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए तेजी से अनुकूलन की सुविधा प्रदान करते हैं।

अनुवादात्मक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, तरीकों की आवश्यकता होती है जो अनुवाद परिदृश्य के न्यूनतम विकृत स्नैपशॉट प्रदान करते हैं। पॉलीसोम प्रोफाइलिंग एक शास्त्रीय दृष्टिकोण है जिसका उपयोग एमआरएनए में अनुवाद के अध्ययन में किया जाता है, जिसमें सुक्रोज ग्रेडिएंट्स26, 27के माध्यम से अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन के माध्यम से एमआरएनए के पॉली (राइबो) सोमल अंशों को शामिल कियाजाताहै। इस दृष्टिकोण का उपयोग व्यक्तिगत एमआरएएनए के लिए अनुवाद के स्तर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पॉलीमरेज चेन रिएक्शन, आरटी-पीसीआर26जैसे डिटेक्शन विधियों के साथ, या विश्व स्तर पर उच्च थ्रूपुट तकनीकों (माइक्रोएरे या आरएनए-एसईक्यू28,29)के साथ मिलकर। एक अधिक विकसित दृष्टिकोण राइबोसोम प्रोफाइलिंग है, जो जीनोम-व्यापी पैमाने पर एक एमआरएनए अणु के साथ राइबोसोम्स को बढ़ाने की स्थिति के अध्ययन के साथ-साथ ट्रांसक्रिप्टोम में अनुवाद की दक्षता का अनुमान और मुख्य और वैकल्पिक स्टार्ट साइटों30, 31के उपयोग की अनुमति देता है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग में उन पर राइबोसोमल उपस्थिति द्वारा संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों का अलगाव और अनुक्रमण शामिल है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग ने हाइपोक्सिक तनाव, हीट शॉक और ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस31, 32सहित कई स्थितियों में अनुवाद गतिशीलता में काफी अंतर्दृष्टि प्रदान की है। तकनीक को खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं सहित कई स्रोत सामग्री प्रकारों के लिए अनुकूलित किया गया है।

जबकि अनुवाद में अनुसंधान की क्षमताओं का विस्तार करने में पॉलीसोम और राइबोसोम प्रोफाइलिंग मौलिक रही है, अनुवाद की प्रक्रिया में विभिन्न अनुवादात्मक मध्यवर्ती और जटिल शामिल हैं जिन्हें इन तरीकों के साथ पकड़ना मुश्किल है11,13। एक अतिरिक्त सीमा तेजी से प्रतिक्रिया प्रकारों का अध्ययन करने की क्षमता की कमी से उपजी है, क्योंकि ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स या तो विशिष्ट अनुवाद अवरोधकों (एंटीबायोटिक दवाओं) के अलावा वीवो में स्थिर होते हैं, जिससे कुछ राइबोसोम वितरण कलाकृतियों, या सेल लाइसिस पर पूर्व वीवो विशेष रूप से (एंटीबायोटिक्स) या अनिर्दिष्ट (उच्च नमक या मैग्नीशियम आयन), जिससे कम रहते थे या कम स्थिर मध्यवर्ती मध्यवर्ती33, 34,35.

फॉर्मलडिहाइड का व्यापक रूप से उपयोग न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन को क्रॉसलिंक करने के लिए किया जाता है, जैसे क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन (सीआईपी) और क्रॉसलिंकिंग इम्यूनोप्रिपिटेशन (क्लिप) अध्ययन। इसका छोटा आकार और उत्कृष्ट कोशिका पारमशीलता वीवो एक्शन36में तेजी से अनुमति देती है । रैपिड फॉर्मेल्डिहाइड क्रॉसलिंकिंग के आधार पर, ट्रांसलेशन कॉम्प्लेक्स प्रोफाइल सीक्वेंसिंग (टीसीपी-एसईक्यू)10,36, 37, 38,39,40के साथ राइबोसोम प्रोफाइलिंग दृष्टिकोण बढ़ाया गया है। टीसीपी-एसईक्यू, जो पहले खमीर में विकसित किया गया था, स्कैनिंग या पोस्ट-टर्मिनेशन एसएसयू कॉम्प्लेक्स और कई रिबोसोमल कॉन्फ़िगरेशन37,38,41, 42सहित सभी अनुवाद मध्यवर्ती को पकड़ने की अनुमतिदेताहै। इस विधि काउपयोग कईअध्ययनों 10,38, 39,41, 42में किया गया है, जिनमें से कुछ अनुवाद अवरोधकों और फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग दोनों के संयोजन दृष्टिकोण का उपयोग करते हैं ताकि अनुवाद की गिरफ्तारी को सुगम बनाया जा सके। तकनीक का एक और संशोधित संस्करण, चयनात्मक टीसीपी-एसईक्यू39,हाल ही में क्रॉसलिंक किए गए परिसरों के इम्यूनोपुरिफिकेशन को शामिल करने, टीसीपी-सेक्यू अनुप्रयोगों के दायरे को व्यापक बनाने के लिए नियोजित किया गया है। फॉर्मेल्डिहाइड क्रॉसलिंकिंग की तेजी से, कुशल और प्रतिवर्ती प्रकृति इन दृष्टिकोणों को क्षणिक एमआरएनए का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त बनाती है: अनुवाद जटिल बातचीत, विशेष रूप से अत्यधिक गतिशील अनुवाद-स्तर प्रतिक्रिया मार्गों के संदर्भ में।

यहां हम व्यापक अनुवाद जटिल स्थिरीकरण और अलगाव के उद्देश्य से वीवो फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग की प्रक्रियाओं का विस्तार करते हैं। हम खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं(चित्रा 1)के लिए अलग प्रोटोकॉल सूक्ष्म प्रदान करते हैं । हम क्रॉसलिंक-स्थिर सामग्री(चित्रा 1)के बाद के उपयोग के उदाहरणों को रेखांकित करते हैं, जैसे इम्यूनोब्लोटिंग (पश्चिमी-ब्लॉटिंग), इम्यूनो-असिस्टेड शुद्धि (या 'इम्यूनोप्रिपिटेशन' का उपयोग करके सह-शुद्ध प्रोटीन कारक का पता लगाने के लिए; आईपी) और ब्याज, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और आरएनए अनुक्रमण के विशिष्ट कारकों वाले अनुवादात्मक परिसरों का संवर्धन।

Figure 1
चित्रा 1:योजनाबद्ध विशिष्ट प्रयोगात्मक सेटअप के अवलोकन का चित्रण। ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के वीवो फॉर्मेल्डिहाइड स्टेबिलाइजेशन में मुख्य चरणों को एक फ्लोचार्ट के रूप में चित्रित किया गया है, जो प्रमुख आवश्यक उपकरणों के बारे में जानकारी द्वारा पूरक है। क्रॉसलिंक्ड सामग्री के संभावित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को रेखांकित किया गया है, जिनमें ऐसे उदाहरण शामिल हैं जिन्हें सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है लेकिन सीधे इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं किया गया है, जैसे कि आरएनए की स्प्री मनका शुद्धि, आरएनए अनुक्रमण, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Protocol

1. खमीर सेल प्रोटोकॉल

  1. खमीर सेल संस्कृति और निर्धारण
    नोट: सेल निर्धारण और कटाई संशोधनों के साथ10,38से अनुकूलित कर रहे हैं।
    1. स्थापित 1 एल खमीर सेल संस्कृति (जंगली प्रकार (WT) BY4741 एक उदाहरण के रूप में दिया जाता है) उपयुक्त मीडिया में ६०० एनएम (OD६००)में ०.०५ AU से अधिक की शुरुआत ऑप्टिकल घनत्व के साथ एक कक्षीय शेखर में (1% w/v खमीर निकालने के, पेप्टोन का 2% w/v, डेक्सट्रोस (ग्लूकोज) का 2% w/v, वांछित परिस्थितियों में 40 मिलीग्राम/एल ऑफ एडेनिन सल्फेट (वाईपीडी) एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है) (इसमें उपयोग किया जाने वाला 30 डिग्री सेल्सियस प्रयोग) ।
    2. खमीर कोशिकाओं की तरल निलंबन संस्कृति को पेलेट करने के लिए संगत रोटर और अपकेंद्रित्र की बोतलों के साथ एक तैयारीकेंद्री अपकेंद्रित्र की स्थापना करें। ग्लूकोज भुखमरी प्रयोगों के लिए, 600 एनएम (ओडी 600) पर 0.6-0.8 AU के ऑप्टिकल घनत्व के बाद कोशिकाओं को गोली दें,30डिग्री सेल्सियस पर एक संक्षिप्त अपकेंद्रित्र का उपयोग करके, 1 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम।
      नोट: बढ़ती कोशिकाओं के आयुध डिपो का रिकॉर्ड रखें और कोशिकाओं को बढ़ने दें जब तक कि ओडी६०० 0.6-0.8 AU तक नहीं पहुंच जाता, यदि घातीय विकास चरण ब्याज का है ।
    3. गोली को तुरंत गर्म (30 डिग्री सेल्सियस) वाईपी मीडिया में फिर से खर्च करें जिसमें कोई या कम (0.25% w/v) होता है, ग्लूकोज जोड़ा जाता है और एक कक्षीय शेकर-इनक्यूबेटर में 30 डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करता है।
      नोट: मीडिया संरचना बाद में क्रॉसलिंकिंग दक्षता को प्रभावित कर सकती है। केवल वाईपीडी का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था। भुखमरी प्रयोग करते समय, समय का पालन करना और प्रक्रियाओं के बीच देरी को कम करना महत्वपूर्ण है।
    4. एक बार कोशिकाओं के लिए तैयार हो जाते हैं, एक बीकर साफ कुचल पानी बर्फ के २५० ग्राम युक्त के साथ धुएं हुड के अंदर एक बर्फ बॉक्स की स्थापना की । सुनिश्चित करें कि 25 एमएल स्ट्रिपेट्स और हौसले से खरीदे गए मेथनॉल-स्थिर 37% w/v फॉर्मलडिहाइड समाधान हुड के अंदर सुलभ हैं। कुचल पानी बर्फ के 25% w/v युक्त बीकर में 1 एल संस्कृति डालो ।
      नोट: कोशिकाओं को बर्फ पर सभी बाद के आपरेशनों में रखें जब तक कोशिकाओं को जमे हुए हैं, जब तक अंयथा संकेत दिया ।
    5. 2.2% w/v की अंतिम एकाग्रता के लिए फॉर्मलडिहाइड समाधान के 37% w/v के 75 एमएल जोड़ें और बर्फ पिघलने तक मिश्रण को तीव्रता से हिलाएं।
    6. एक बार बर्फ पिघल जाने के बाद, 10 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें।
      नोट: प्रजनन योग्य निर्धारण परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुशंसित समय और तापमान आहार का पालन करें।
    7. 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग के बाद, संस्कृति को प्रीकूल्ड सेंट्रलाइज बोतलों में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र द्वारा गोली मारें, 5,000 एक्स ग्राम 5 मिनट के लिए। जबकि इस स्पिन पर है, एक ५० एमएल ट्यूब precool और ताजा तैयार बफर एक (ग्लाइसिन युक्त किसी भी शेष formaldehyde बेअसर) बर्फ पर रखें ।
      नोट: सटीक बफर रचनाओं के लिए आपूर्ति की गई तालिका को देखें।
    8. अपकेंद्रित्र के बाद, बर्फ के संपर्क में पैलेट साइड के साथ बर्फ पर अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें। ट्यूबों को धूम हुड में लाएं और सुपरनैंट को फॉर्मलडिहाइड अपशिष्ट कंटेनर में फेंक दें।
    9. 25 एमएल स्ट्रिपेट का उपयोग करके और 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए बफर ए के 20 एमएल में सभी ट्यूबों से सेल पेलेट को फिर से र्इंसाल करें।
      नोट: यह धोने अपरिवर्तनीय क्रॉसलिंकिंग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है और बफर इसके अलावा कोशिकाओं की फसल से 20 मिनट से अधिक समय नहीं होना चाहिए ।
    10. बफर ए के साथ 40 एमएल तक वॉल्यूम बनाएं और 4 डिग्री सेल्सियस, 5,000 एक्स ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा धोई गई कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
    11. सुपरनैंट को त्यागें और किसी भी ग्लाइसिन संदूषण को हटाने के लिए बफर ए1 के 40 एमएल में सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें, जो कि बफर ए में ग्लाइसिन युक्त नहीं है।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र द्वारा फिर से गोली कोशिकाओं, 5 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम।
    13. एक और बार बफर A1 के साथ धोता दोहराएं। सुपरनेट को त्यागें और सेल पेलेट को बर्फ पर रखें। गोली के साथ ट्यूब का वजन करें (गीला सेल द्रव्यमान सेल संस्कृति के प्रति 1 एल ~ 1 ग्राम होना चाहिए)।
  2. खमीर सेल व्यवधान और साइटोसोल संग्रह
    1. लगभग 3 सेमी की गहराई तक तरल नाइट्रोजन के साथ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लाइन में खड़ा एक पॉलीस्टीरिन फोम बॉक्स भरें। बॉक्स में 50 एमएल ट्यूब को सीधा रखें।
    2. 10 एस के लिए पाइपिंग और भंवर द्वारा बफर A2 के 550 माइक्रोल में गोली (~ 1 ग्राम गीले सेल द्रव्यमान) को फिर से रीसुस्ल करें। 10 एस के लिए फिर से RNase अवरोधक और भंवर के ४० U/μL के 10 μL जोड़ें ।
      सावधानी: तरल नाइट्रोजन को संभालते समय थर्मल रूप से अछूता दस्ताने जैसे उपयुक्त सुरक्षात्मक उपकरण पहनें। सुनिश्चित करें कि तरल नाइट्रोजन पकड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले किसी भी कंटेनर में रिसाव नहीं होता है, और अंदर ट्यूब रैक अपने पक्ष में नहीं तैरेगा या गिरेगा। ऑक्सीजन की कमी से बचने के लिए एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में काम करें।
    3. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, कोशिका निलंबन को तरल नाइट्रोजन युक्त 50 एमएल ट्यूब में ड्रिप करें।
      नोट: बूंदों के एकत्रीकरण से बचने के लिए टपकता धीरे-धीरे और सावधानी से किया जाना चाहिए। नई बूंदों को शुरू करने से पहले बूंदों को फ्रीज करना सुनिश्चित करें।
    4. जमे हुए सेल निलंबन बूंदों के साथ 50 एमएल ट्यूब को कमरे के तापमान में स्थानांतरित करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि तरल नाइट्रोजन पूरी तरह से वाष्पित न हो जाए। ट्यूब को अपनी टोपी के साथ सील करें और सेल छर्रों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या तुरंत आगे बढ़ें।
      सावधानी: सुनिश्चित करें कि ट्यूब को सील करने से पहले तरल नाइट्रोजन पूरी तरह से सुखाया जाता है। एक सील ट्यूब में बचे हुए तरल नाइट्रोजन एक खतरनाक दबाव निर्माण का कारण बन सकता है।
    5. अगले चरण के लिए तैयार करने के लिए, प्रीकूल 1.5 एमएल न्यूक्लियज़-फ्री ट्यूब और सूखी बर्फ पर 10 एमएल स्टेनलेस स्टील पीस जार।
    6. एक साफ, बाँझ स्पैटुला का उपयोग करके जमे हुए सेल निलंबन बूंदों को जार में स्थानांतरित करें।
      सावधानी: सुनिश्चित करें कि पीसने वाले जार कसकर सील किए गए हैं।
    7. तरल चरण को सुनिश्चित करने के लिए तरल नाइट्रोजन में पीस जार को जलमग्न करें जंक्शन से नीचे रहता है। 1 मिनट के लिए आंदोलन के लिए 27 हर्ट्ज पर क्रायो मिक्सर मिल स्थापित करें।
      नोट: हमेशा एक ही मॉडल के एक और एक के साथ पीसने कनस्तर संतुलन भले ही नमूना प्रसंस्करण के लिए केवल एक कनस्तर की आवश्यकता है ।
    8. मिक्सर मिल में 1 मिनट के लिए 27 हर्ट्ज पर सील पीस जार उत्तेजित करें।
    9. पहले की तरह तरल नाइट्रोजन में पीसने वाले जार को फिर से ठंडा करें और मिक्सर मिल में 1 मिनट के लिए 27 हर्ट्ज पर हिलाएं।
    10. जार को 1.5 एमएल न्यूक्लियीज-फ्री ट्यूब के साथ सूखी बर्फ वाले बर्फ बॉक्स में स्थानांतरित करें। एक छोटे स्टील स्पैटुला का उपयोग करके, परिणामी पाउडर नमूने को ~ 100 मिलीग्राम एलिककोट में ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रति प्रयोग ~ 600 मिलीग्राम नमूने का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जिसमें पॉलीसोम तलछट प्रोफ़ाइल विश्लेषण, साइटोसोल को अनुवादित और गैर-अनुवादित अंशों में अलग करना, और अनुवादित अंश को एसएसयू, राइबोसोम और RNase पाचन पर डाइसम अंशों में आगे अलग करना शामिल है।
  3. साइटोसोल के गैर-अनुवादित अंशों से निश्चित (पॉली) रिबोसोमल परिसरों का पृथक्करण
    नोट: पहले स्थापित प्रक्रिया10,38आम तौर पर (पॉली) राइबोसोम्स के साथ अपने सह-तलछट के आधार पर अनुवादित आरएनए को समृद्ध करने के लिए पालन किया जाता है। अनुवादित और गैर-अनुवादित साइटोसोल अंशों को अलग करने के लिए एक अधिक परिष्कृत दृष्टिकोण यहां पेश किया गया है, जो सामग्री को फिर से बनाने और बाद में फिर से घुलनशील करने की आवश्यकता को नष्ट करता है।
    1. पतली दीवार अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब (5 एमएल, 13 x 51 मिमी) में फ्रीज-गल विधि43 का उपयोग करके बफर बी के साथ 2.5 एमएल रैखिक 10%-20% डब्ल्यू/वी सुक्रोज ग्रेडिएंट्स तैयार करें।
      नोट: फ्रीज-गल विधि अनुक्रमिक इसके अलावा और एक दूसरे के शीर्ष पर रैकरली प्रतिगामी सांद्रता के साथ बफर सुक्रोज परतों की ठंड से किया जाता है। विवरण के लिए अनुपूरक तालिका 1 देखें।
    2. एक असतत 50% w/v सुक्रोज तकिया बनाने के लिए, रैखिक ढाल पर विगलन और स्थिर, धीरे-धीरे बफर बी में 50% सुक्रोज के 0.5 एमएल को सीधे ट्यूबों के नीचे 1 9 जी x 1.5 "सुई या समान/उपयुक्त आयामों के एक ग्लास कैपिलरी से जुड़ी 1 मिली सी सिरिंज का उपयोग करके सीधे वितरित करें। वितरण से पहले, ध्यान से और धीरे-धीरे सुई या केशिका की नोक को पूर्व-गठित सुक्रोज ग्रेडिएंट के ऊपर से नीचे तक चलाएं, किसी भी गड़बड़ी से बचें, जब तक कि यह ट्यूब के नीचे तक न पहुंच जाए।
      नोट: बफर बी की तैयारी के निर्देशों के लिए अनुपूरक तालिका 1 देखें।
    3. ऊपरी हिस्सों को हटाकर या बफर बी में सुक्रोज के अधिक 10 डब्ल्यू/v लेयर करके ग्रेडिएंट्स को सावधानी से संतुलित करें और उन्हें बर्फ-ठंडा या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
      नोट: नीचे 50% सुक्रोज परत के साथ असतत ढाल को ट्यूब वॉल पर इसे उपजी बिना उच्च तलछट दर के साथ सामग्री एकत्र करने की आवश्यकता होती है।
    4. गल ~ 100 मिलीग्राम जमे हुए सेल कमरे के तापमान पर नमूना पाउडर और तुरंत बर्फ पर जगह है। पाइपिंग द्वारा बफर A2 के 150 माइक्रोन में मिलाएं, 1 U/μL में RNase अवरोधक जोड़ें और 10 एस के लिए भंवर (अत्यधिक फोमिंग और गैसीय चरण के साथ मिश्रण से बचें) द्वारा मिलाएं।
      नोट: बर्फ पर सामग्री रखते हुए सभी अभियानों को जारी रखें, जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र द्वारा सेल मलबे गोली और एक नया 1.5 एमएल कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूब में स्पष्ट supernatant (~ 150 μL) ठीक हो।
    6. परिणामी स्पष्ट मिश्रण को चरण 1.3.3 से असतत सुक्रोज ढाल ट्यूबों पर लोड करें और सावधानीपूर्वक उन्हें संतुलित करें।
    7. अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम मात्रा में स्विंग-बकेट रोटर में, औसत जी-बल 287,980 x ग्राम (k-factor 49) के साथ 1 घंटे 30 मिनट के लिए।
      नोट: इन स्थितियों को पूर्व-अनुकूलित किया गया है (पोस्ट-अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन रेडिएंट यूवी अवशोषण ट्रेस विश्लेषण का उपयोग करके) मुफ्त (गैर-(पॉली) रिबोसोमल) एसएसयू और एलएसयू (बड़े रिबोसोमल उप) को बनाए रखने के लिए शीर्ष में यूनिट (10%-20% सुक्रोज) ढाल के हिस्से में, जबकि सामग्री को गोली मारने के बिना नीचे (50%) सुक्रोज कुशन में (पॉली) रिबोसोमल अंश को ध्यान में रखते हुए।
    8. अनुवादित साइटोसोल अंश को इकट्ठा करने के लिए 19 जी x 1.5 "सुई से लैस एक नई बाँझ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। ट्यूब के नीचे सुनिश्चित करने के लिए एक स्थिर रैक पर 5 एमएल ढाल रखें।
    9. ट्यूब के ऊपर से, सुई को सीधे ढाल के नीचे (ट्यूब पंचर किए बिना) में चिपकाएं और धीरे-धीरे, किसी भी बुलबुले को बनाए बिना, अनुवादित आरएनए पूल वाले नीचे के समाधान का ठीक 0.5 एमएल आकर्षित करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि यह कदम ठंडे कमरे में किया जाता है और ट्यूब को मजबूती से आयोजित किया जाता है। ढाल की अशांति से बचने के लिए एक ही अपस्ट्रोक गति में पूरे 0.5 एमएल को आकर्षित करने की सिफारिश की जाती है।
    10. अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन रन पर सुक्रोज रेडिएंट के अवशोषण रीडआउट द्वारा परिणामी मिश्रण में एसएसयू, एलएसयू और हल्के अंशों की (पॉली) रिबोसोसोमल उपस्थिति और गिरावट की पुष्टि करें।
    11. 10 केडीए कट-ऑफ पुनर्जीवित सेल्यूलोज झिल्ली के साथ माइक्रो-एकाग्रता डिवाइस में अल्ट्राफिल्ट्रेशन का उपयोग करके पिछले चरण से एकत्र किए गए अनुवादित आरएनए पूल को 100 माइक्रोल तक केंद्रित करें।
      नोट: बफर 1 के 0.5 एमएल के साथ माइक्रो-एकाग्रता डिवाइस की झिल्ली को प्री-वॉश करें (चित्रा 2aदेखें) और निर्माता द्वारा अनुशंसित स्पिन स्थितियों(जी)का उपयोग करें।
    12. इसके अलावा पिछले चरण से सामग्री को पांच बार पतला करें (बफर 1 के साथ 400 माइक्रोन जोड़ें) और 200 माइक्रोन पर वापस ध्यान केंद्रित करें, ताकि छोटी मात्रा के साथ-साथ सुक्रोज को आंशिक रूप से हटाने की अनुमति दी जा सके।
      नोट: परिणामी मिश्रण को 6 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने और 'कुल अनुवादित आरएनए' आरएनए-सेक्यू लाइब्रेरी निर्माण, या टीसीपी-सेक्यू लाइब्रेरी निर्माण के आरएननैस पाचन कदम के लिए इनपुट सामग्री के रूप में उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। 'गैर-अनुवादित' साइटोसोल अंश को इसी तरह की प्रक्रिया का उपयोग करके ढाल के शीर्ष से बरामद किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. फिक्स्ड (पॉली) रिबोसोमल कॉम्प्लेक्स का आरनैस पाचन और पचाने वाली सामग्री को छोटे रिबोसोमल सबयूनिट (एसएसयू), मोनोरिबोसोमल (राइबोसोम्स, आरएस) और डिरिबोसोमल (डायसोम्स, डीएस) अंशों में अलग करना
    नोट: प्रक्रिया आम तौर पर पहले वर्णित दृष्टिकोण का पालन करती है10,38लेकिन सभी तीन अलग-थलग अंशों में सर्वश्रेष्ठ संकल्प प्राप्त करने के लिए एक संशोधित ढाल प्रकार, पृथक्करण समय, त्वरण और आरएनएएस पाचन की स्थिति नियोजित की जाती है।
    1. 13 एमएल पतली दीवार पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब, 14 x 89 मिमी में बफर 1 के साथ बने सावधानी से संतुलित 12.5 एमएल रैखिक 10%-40% डब्ल्यू/वी सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करें, फ्रीज-गल विधि43 का उपयोग करके चरण 1.3.1 में वर्णित है और उसमें नोट करें।
    2. कमरे के तापमान पर गल और तुरंत बर्फ पर नमूने हस्तांतरण या कदम 1.3.12 से केंद्रित और सुक्रोज समाप्त cytosol अंश ले।
      नोट: बर्फ पर सभी प्रक्रियाओं को जारी रखें जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।
    3. ई. कोलाई RNase I प्रति 1 OD260 इकाई में 30 मिनट के लिए अंश के प्रति 23 डिग्री सेल्सियस के 4.5 यू में मिश्रण द्वारा अनुवादित साइटोसोल अंश को पचा लें। तुरंत जोड़ें और RNase अवरोधक में मिश्रण करने के लिए 0.25 U/μL को निष्क्रिय करने में सक्षम RNase अवरोधक को जोड़ते हुए, RNase I को निष्क्रिय करने के लिए।
      नोट: आरएनईएसई I. एयू260 का उपयोग करके एयू260 प्राप्त करने में सक्षम आरएनएसई अवरोधक का उपयोग करें = (260 एनएम पर अवशोषण 1 सेमी ऑप्टिकल पथ एक्स वॉल्यूम के बराबर ऑप्टिकल घनत्व इकाइयों के बराबर 1 सेमी ऑप्टिकल पाथ एक्स वॉल्यूम इन μL) /
    4. तुरंत नमूनों को बर्फ में स्थानांतरित करें।
      सावधानी: पाचन की अनुशंसित स्थितियों का पालन करना और अतिरिक्त आरएनएसई I की मात्रा को सावधानीपूर्वक मापना महत्वपूर्ण है। यहां उल्थित आरएनएनई आई इकाई को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट में माउस लिवर आरएनए से एसिड-घुलनशील सामग्री के 1 माइक्रोन का उत्पादन करने के लिए आवश्यक एंजाइम की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया है । RNase मैं बैचों गतिविधि में अप्रलेखित बदलाव हो सकता है और पाचन की स्थिति को प्राप्त करने के लिए प्रयोग की आवश्यकता हो सकती है । यदि एंजाइम स्टॉक बहुत केंद्रित है, तो समाधान की बहुत छोटी मात्रा से बचने के लिए इसे बफर 1 के साथ पतला करने की सिफारिश की जाती है।
    5. 10%-40% w/v सुक्रोज ढाल पर प्रतिक्रिया मिश्रण कदम 1.4.1 से लोड करें।
      नोट: ग्रेडिएंट प्रति 150-300 माइक्रोन की सीमा में अंतिम मात्रा का उपयोग करें। प्रत्येक शुद्धि के लिए न्यूनतम दो ढाल की आवश्यकता होती है। इष्टतम पृथक्करण प्राप्त करने के लिए डीएस और तुलनात्मक रूप से उच्च एयू260,13-14 एयू 260, एसएसयू या आरएस के लिए सामग्री (लोअर एयू260,10-11 एयू260)के विभिन्न इनपुट वॉल्यूम का उपयोग करें।
    6. अल्ट्रासेंट्रफ्यूज 3 घंटे 30 मिनट के लिए औसत जी-बल 178,305 x ग्राम (k-factor 143.9) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर एक मध्यम मात्रा स्विंग-बाल्टी रोटर में ट्यूबों को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज करें।
      सावधानी: यदि अतिरिक्त संतुलन ट्यूबों की आवश्यकता है, तो नमूना युक्त ट्यूबों के साथ उनके द्रव्यमान और बड़े पैमाने पर वितरण को बराबर करें। नमूना ओवरले के बराबर बफर की मात्रा के साथ मढ़ा अतिरिक्त सुक्रोज ढाल का उपयोग करें और एक समान सुक्रोज एकाग्रता के साथ ट्यूब नहीं।
    7. अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन स्पिन पूरा होने से कम से कम 30 मिनट पहले एक ढाल आंशिक उपकरण सेट करें, जिसमें विस्थापन पंप में 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर किए गए भारी चेस समाधान (उदाहरण के लिए, डिओनाइज्ड पानी में 60% सुक्रोज शामिल है)।
      नोट: डिशनाइज्ड पानी का उपयोग करके आंशिक की लाइनों और ट्यूबिंग को डी-दूषित करने की सिफारिश की जाती है, इसके बाद डिएकाइज्ड पानी, डिसोनाइज्ड पानी में 1%-2% एसडीएस समाधान, और अंत में रन से पहले और बाद में डिएकॉनाइज्ड पानी समाधान में 80% इथेनॉल।
    8. पहले डिओनाइज्ड वॉटर से सिस्टम को भरकर और निर्माता की सिफारिशों के अनुसार ऑप्टिक्स को शून्य करके अवशोषित रीडआउट बेसलाइन को समायोजित करें, और फिर नमूना ट्यूबों (जैसे, बफर 1) के समान बफर के साथ बने स्पेयर अनलोड 14 x 89 मिमी सुक्रोज ढाल का उपयोग करके बेसलाइन बदलाव की भरपाई करें।
      नोट: एक ही विस्थापन गति का उपयोग करने के लिए इस तरह के १.५ mL/min के रूप में नमूना readout के लिए के रूप में समायोजन करते हैं ।
    9. समाधान के बीच सही गिनती समय पहले डिटेक्टर के ऑप्टिकल पथ में प्रवेश करने और पहले अंश कलेक्टर उत्पादन में प्रदर्शित होने से विस्थापन प्रणाली मृत मात्रा को मापने ।
      नोट: 1.5 एमएल/मिनट की अनुशंसित गति के साथ, अंश कमरे के तापमान पर किया जा सकता है। बर्फ पर एकत्र अंशों को तुरंत स्थानांतरित करने की सिफारिश की जाती है।
    10. नमूनों की अपेक्षित तलछट स्थिति और अवशोषण प्रोफ़ाइल के आधार पर 254 एनएम, 1.5 एमएल/न्यूनतम विस्थापन गति, और इन-लाइन अंश का पता लगाने पर लाइव अवशोषण रीडआउट का उपयोग करके अंश का उपयोग करें। पहले मापा गया मृत मात्रा के अनुरूप समय में देरी के साथ कलेक्टर ट्यूब स्विचिंग का उपयोग करें।
    11. एसएसयू, आरएस और डीएस परिसरों की स्थितियों और गतिशीलता के अनुरूप अंशों को अलग करें और उन्हें नए कम प्रोटीन बाइंडिंग 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में एकत्र करें; तुरंत बर्फ पर अलग अंश स्थानांतरित करें और फ्रीज करें यदि तुरंत संसाधित नहीं किया जाता है।
      नोट: सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन में एकत्र अंशों को तुरंत फ्लैश-फ्रीज करने और 6 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे स्टोर करने की सिफारिश की जाती है।
  5. राइबोसोमल परिसरों को डी-लिंकिंग और आरएनए-सेक्यू पुस्तकालयों के निर्माण के लिए आरएनए का अलगाव
    1. क्रॉसलिंक को डी-ब्लॉक/रिवर्स करने और आरएनए को संबंधित प्रोटीन से दूर करने के लिए, पूरे सुक्रोज ग्रेडिएंट अंशों में से लगभग आधे को नए कम न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग न्यूक्लियक-फ्री पॉलीप्रोपाइलीन १.५ एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब (३५० माइक्रोसेंटाइल प्रति ट्यूब) में ढक्कन सुरक्षा/लॉकिंग उपकरणों के साथ स्थानांतरित करें ।
    2. 100% स्टॉप सॉल्यूशन (10% एसडी डब्ल्यू/वी और 100 एमएम ईडीटीए), 1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 2 के 4 माइक्रोन के साथ मिश्रण को 2 पर पूरक करें 5 डिग्री सेल्सियस (10 m M करने के लिए), 2.5 एम ग्लाइसिन (10 mm) के 1.6 माइक्रोन और 400 माइक्रोन की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए नाभिक मुक्त पानी।
    3. ट्यूबों की सामग्री को पाइपिंग करके और ट्यूबों को कमरे के तापमान पर स्थानांतरित करके मिलाएं।
    4. अम्लीय फिनॉल की बराबर मात्रा जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: आइसोअमिल अल्कोहल 125:24:1 (पीएच 4.0-5.0) मिश्रण प्रत्येक ट्यूब में। अधिकतम गति के लिए सेट किए गए भंवर मिक्सर का उपयोग करके मिश्रण को 2 मिनट तक तेजी से हिलाएं।
      सावधानी: फिनोल और क्लोरोफॉर्म संक्षारक और जहरीले होते हैं। तरल पदार्थ के साथ शारीरिक संपर्क से बचें और एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में या एक धुएं हुड के नीचे काम करते हैं। फिनॉल या क्लोरोफॉर्म के साथ काम करते समय हमेशा दस्ताने, लैब कोट और सुरक्षात्मक चश्मे या चेहरे की ढाल का उपयोग करें।
    5. ट्यूबों को थर्मोशेकर में रखें और लगातार 65 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 1,400 आरपीएम पर हिलाएं।
    6. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर मिश्रण अपकेंद्रित्र द्वारा चरण एकत्रीकरण की सुविधा।
    7. ऊपरी जलीय चरणों को इकट्ठा करें और उन्हें ताजा कम न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए, जलीय चरणों को पूरी तरह से ठीक करने का प्रयास न करें। एक उचित वसूली की मात्रा 300-350 μL है।
    8. 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5 25 डिग्री सेल्सियस), ग्लाइकोजन के 20 माइक्रोग्राम (5 μg/μL स्टॉक का उपयोग करके) और पूर्ण इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम के साथ एकत्र जलीय चरणों को पूरक करें। 1 मिनट के लिए ट्यूबों को भंवर से जोड़कर समाधान को सावधानी से मिलाएं।
    9. कम से कम 2 घंटे (रात भर अनुशंसित) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेटिंग करके आरएनए को तेज करें।
    10. ट्यूबों को कमरे के तापमान पर गर्म करें और भंवर से मिलाएं।
      नोट: ट्यूबों के पूर्व वार्मिंग और कमरे के तापमान पर बाद में अपकेंद्रित्र (मजबूर हल्का बिना) नमक और फिनॉल सह वर्षा और कैरीओवर को कम करने में मदद करते हैं । इन स्थितियों के परिणामस्वरूप भौतिक हानि या आरएनए संग्रह की अक्षमता नहीं होनी चाहिए यदि वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया जाता है और पर्याप्त रूप से शुद्ध इथेनॉल का उपयोग किया जाता है।
    11. गोली आरएनए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए १२,० x ग्राम पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र द्वारा उपजी ।
    12. सुपरनेट को त्यागें और 80% v/v इथेनॉल के साथ दो बार गोली धोएं, इसे हर बार कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा इकट्ठा करें।
    13. ट्यूब के ढक्कन खोलकर आरएनए छर्रों को सुखाएं और खोले गए ट्यूबों को ड्राई-ब्लॉक हीटर सेट में 10 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस तक रख दें। परिणामी सूखे गोली को 1x HE बफर के 20 माइक्रोन में भंग करें।
    14. यूवी अवशोषण स्पेक्ट्रम माप का उपयोग कर परिणामी आरएनए एकाग्रता का अनुमान लगाएं।
      नोट: आरएनए टुकड़ा लंबाई और कुल राशि को आगे जेल-इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है, जैसे कि स्वचालित फ्लोरेसेंस-आधारित केशिका जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण में।
  6. एसएससी और चयनात्मक एसएसयू संवर्धन के पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा एसएसयू का चयनात्मक सह-इम्यूनोपुरिफिकेशन
    नोट: चुंबकीय आईजीजी मोतियों का उपयोग करके आत्मीयता शुद्धि करने के लिए चरण 1.4.11 से पचाने और तलछट-अलग एसएसयू अंश के ~ 15 AU (260 एनएम) का उपयोग करें। इनपुट नियंत्रण (इनपुट अंश, I) के रूप में एसएसयू अंश का ~ 5% बचाएं। eIF4A-टैग (TIF1-TAP; टैंडेम एफ़िनिटी शुद्धिकरण टैग) खमीर तनाव का उपयोग किया गया था जो एंटी-टैप एंटीबॉडी का उपयोग करके टैप-टैग की जांच करके eIF4A का पता लगाना भी संभव बनाता है।
    1. चुंबकीय आईजीजी मोतियों के निलंबन के 100 माइक्रोन को स्थानांतरित करें (1 मिलीग्राम मोतियों का उपयोग प्रत्येक 15 एयू (260 एनएम) के लिए किया जाता था, जो 1.5 एमएल ट्यूब को एक नए कम प्रोटीन में बाध्यकारी करता है; चुंबकीय रैक का उपयोग कर मोतियों को इकट्ठा करें और उन्हें एस्पिरेट करें।
    2. चुंबकीय रैक का उपयोग करके पाइपिंग और संग्रह द्वारा अनुक्रमिक पुनपचारण का उपयोग करके बफर 1 के 1 एमएल के साथ चुंबकीय मोतियों को दो बार धोएं।
    3. धोने के बाद, मोतियों को इकट्ठा करें और उन्हें चुंबकीय रैक पर रखते हुए डिकेंट करें।
    4. धोए गए मोतियों में एसएसयू अंश जोड़ें और ~ 20 आरपीएम पर सेट साइक्लोमिक्सर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ मिश्रण को 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर चुंबकीय रैक का उपयोग कर मोतियों को इकट्ठा करें और सुपरनैंट (फ्लो-थ् माध्यम से अंश, एफटी) को बचाएं।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर मोतियों को दो बार धोएं बफर 1 के साथ पूरक 4 mM DTT के साथ, हर बार साइक्लोमिक्सर में 10 मिनट के लिए घूर्णन और चुंबकीय रैक पर मोतियों को इकट्ठा और डिकंटिंग करें। वॉश (W1 और W2 अंश) को बचाएं।
    7. पश्चिमी ब्लॉटिंग जैसे विश्लेषणात्मक अनुप्रयोग के लिए, एलडीएस (लिथियम डॉडेकाइल सल्फेट) पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) नमूना बफर को पीएच 8.5 से 1x और डीटीटी को 2 एमएम में जोड़कर बाउंड सामग्री को कम करने के लिए बाध्य सामग्री को स्पष्ट करें।
    8. एल्यूशन को अंतिम रूप देने के लिए थर्मल ब्लॉक में 5 मिनट के लिए मिश्रण को 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    9. चुंबकीय रैक का उपयोग कर मोती ले लीजिए और एक ताजा कम प्रोटीन बाध्यकारी 1.5 मिली एमएलएसयूटीरफ्यूज ट्यूब में विकृत eluate (ई अंश) ठीक हो।
    10. पिछले चरण से ई अंश का उपयोग करें एक denaturing सोडियम द्वादक सल्फेट (एसडीएस) पृष्ठ तुरंत चलाने के लिए, या -20 डिग्री सेल्सियस पर ई अंश स्टोर ।
      नोट: किसी भी बाद के आवेदन के लिए टैप-टैग-समृद्ध ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के एक तैयारीात्मक संग्रह के लिए, तंबाकू एची वायरस (टीईवी) प्रोटीज़ को नियोजित करने वाले वैकल्पिक एल्यूशन दृष्टिकोण का उपयोग करें। अधिक जानकारी के लिए अनुपूरक तालिका 1 का उल्लेख करें।
    11. तनु एफटी, W1 और W2 अंशों को केंद्रित करने के लिए, बर्फ-ठंडे एसीटोन के 3x वॉल्यूम जोड़कर अपनी सामग्री को उपजी करें। 3 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना-एसीटोन मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्री करके तेज हो जाना।
    13. सुपरनेट को त्यागें और हवा 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खुली ट्यूबों में गोली को सुखा दें।
    14. 2 एमएम डीटीटी के साथ सप्लीमेंट 1x एलडीएस लोडिंग बफर के 7 माइक्रोन में गोली को भंग करें। एक थर्मल ब्लॉक में नमूनों को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    15. सभी मैं, एफटी, W1, W2, और ई नमूनों को एक्रिलैमाइड ढाल, बीआईएस-ट्रिस पॉलीएक्रेलामाइड डेनटुरिंग जेल के 4%-12% w/v पर लोड करें। 1x एमईएस एसडीएस (2-[एन-मोफोलिनो] एथेलसुल्फोनिक एसिड, सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट) 80 वी पर बफर चलाने का उपयोग करके जेल चलाएं, जब तक कि प्रोटीन मार्कर (10-250 केडीए) अच्छी तरह से हल नहीं हो जाता और लीड डाई जेल के नीचे तक पहुंच जाती है।
      नोट: नियंत्रण के रूप में जेल पर डब्ल्यूसीएल (पूरे सेल lysate) (2-10 μg) के धारावाहिक कमजोर करने की सिफारिश की जाती है। अंश सामग्री में जेल की तुलनीय लोडिंग प्राप्त करने के लिए कई प्रयास लग सकते हैं।
    16. पश्चिमी-ब्लॉटिंग उपकरण निर्माता द्वारा अनुशंसित ठंडे कमरे में 1 घंटे के लिए गीले हस्तांतरण विधि द्वारा गीले हस्तांतरण विधि द्वारा जेल की प्रोटीन सामग्री को पॉलीविनाइलाइडन डिफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली पर स्थानांतरित करें।
    17. लगातार झटकों के तहत 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक उपयुक्त अवरुद्ध बफर (फॉस्फेट बफर नमकीन आधारित) का उपयोग करके झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    18. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, एक ठंडे कमरे में एक साइक्लाइजर में ब्लॉकिंग बफर (पीबीएस)- पतला एंटीबॉडी (1:1,000 कमजोर) के साथ झिल्ली के रात भर के इनक्यूबेशन तक टैग किए गए eIF4A प्रोटीन, एंटी-पाब 4 पी एंटीबॉडी या एंटी-β-ऐक्टिन एंटीबॉडी (या किसी अन्य वांछनीय लक्ष्य) का पता लगाने के लिए एंटी-टैप-एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की जांच करें।
      नोट: 1:1,000 एंटीबॉडी कमजोर पड़ने एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है।
    19. झिल्ली को 1x फॉस्फेट बफर खारा, 0.2% v/v ट्वीन 20 (पीबीएसटी) के साथ 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    20. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक साइक्लोमिक्सर में इनक्यूबेटिंग करके निर्माता के निर्देशों के बाद फ्लोरोसेंटली लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की जांच करें।
      नोट: 1:20,000 एंटीबॉडी कमजोर पड़ने एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है।
    21. झिल्ली को 10 मिनट के लिए 1x पीबीएएसटी के साथ तीन बार धोएं। संक्षेप में झिल्ली को डिएकीकृत पानी के साथ कुल्लाएं, और फिर पूर्ण मेथनॉल के साथ। निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम में झिल्ली को सूखा और कल्पना करें।
      नोट: विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों (जैसे eIF4A-TAP बनाम) से मेल खाती रंगों के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके अन्य प्रोटीन के लिए धुंधला हासिल किया जा सकता है। β-ऐक्टिन जोड़ी यहां उपयोग की जाती है), अनुक्रमिक धुंधला या स्ट्रिपिंग और एक ही झिल्ली को धुंधला करके या अंशों के दोहराने वाले पैटर्न से भरे जेल से झिल्ली को काटने और संबंधित एंटीबॉडी के साथ प्रत्येक टुकड़े की अलग से जांच करके (जैसा कि यहां उपयोग किया जाता है Pab1p उदाहरण में)।

2. स्तनधारी सेल प्रोटोकॉल

  1. स्तनधारी सेल संस्कृति और निर्धारण
    1. 2 टी-175 फ्लैक्स में, दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम में 60%-70% संगम और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% v/v कार्बन डाइऑक्साइड पर 10% v/v भ्रूण गोजातीय सीरम में HEK293 कोशिकाओं को 60%-70% संगम तक बढ़ाएं।
      नोट: पूरा मीडिया वाणिज्यिक एफबीएस के 55 एमएल को उच्च ग्लूकोज के साथ व्यावसायिक रूप से खरीदे गए डीएमईएम के 500 एमएल में जोड़कर बनाया गया है, जिसमें एल-ग्लूटामाइन, फिनोल लाल और सोडियम बाइकार्बोनेट शामिल हैं, लेकिन कोई एचईपी या सोडियम पायरुवेट नहीं है। 70% संगम पर प्रति टी-175 फ्लास्क सेल मायने रखता है 1.7-2.0 x 107की सीमा में होना चाहिए।
    2. वांछित निर्धारण समय से कम से कम 3 घंटे पहले, टी-175 फ्लास्क के मीडिया को पूर्व-गर्म पूर्ण मीडिया के ठीक 30 एमएल के साथ बदलें और एक सेल इनक्यूबेटर में फ्लास्क को बदलें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि ताजा मीडिया सेल टुकड़ी से बचने के लिए सेल मोनोलेयर को फ्लास्क के विपरीत दिशा में पिपेट किया गया है। जितनी जल्दी हो सके मीडिया एक्सचेंज का संचालन करने का प्रयास करें, न्यूनतम गैस और तापमान संतुलन अशांति का परिचय दें।
    3. एक बार सेल मीडिया को बदल दिया गया है, फिक्सेशन के लिए आवश्यक बफ़र्स और रसायनों को तैयार करें। दुल्बेको के फॉस्फेट बफर्ड-लवाइन (डीपीबीएस) को 50 एमएम ग्लाइसिन के साथ 2.5 एम ग्लाइसिन स्टॉक के 10.2 एमएल जोड़कर डीपीबीएस और मिक्सिंग की 500 एमएल बोतल में तैयार करें।
    4. गैर-बाँझ स्थितियों में उपयोग किए जाने वाले चरण 2.1.1 में 10% एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम की एक बोतल तैयार करें और 0.25% ट्रिप्पसिन-ईडीटीए के 100 एमएल एलिकोट का उपयोग किया जा सके। स्रोत वाणिज्यिक डीपीबीएस की एक अतिरिक्त बोतल कैल्शियम क्लोराइड (सीएसीएल2)और मैग्नीशियम क्लोराइड (एमजीसीएल2)के साथ पूर्व-तैयार की गई है।
      नोट: समाधान 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. कुचल पानी बर्फ के साथ किनारा करने के लिए एक बर्फ बॉक्स तैयार इस तरह कि एक टी-१७५ फ्लास्क शीर्ष पर समान रूप से फिट और तैयार बफ़र्स के साथ धुएं हुड में रख सकते हैं, बर्फ पर भी ।
      नोट: किसी भी पर्यावरण परिवर्तन के लिए अनुवाद की तेजी से प्रतिक्रियाओं के कारण, इनक्यूबेटर से सेल फ्लास्क को हटाने और फॉर्मलडिहाइड समाधान के अलावा के बीच सभी समय को कम किया जाना चाहिए।
    6. कोशिकाओं को ठंडा करने के लिए, इनक्यूबेटर से टी-175 फ्लास्क को हटा दें और इसे अधिकतम सतह संपर्क सुनिश्चित करने वाली बर्फ के खिलाफ दृढ़ता से दबाएं। रासायनिक धुएं हुड के अंदर, फ्लास्क को अपनी तरफ झुकाएं ताकि मीडिया कोशिकाओं के विपरीत पक्ष में एकत्र हो। पिपेट 168 μL के 37% w/v फॉर्मलडिहाइड सीधे पूल्ड मीडिया में (0.2% w/v की अंतिम एकाग्रता के लिए)। तुरंत धीरे से आगे और पीछे फ्लास्क कमाल से मिश्रण, बंद करो और बर्फ पर फ्लास्क फिर से स्थान, यह सुनिश्चित करने क्षैतिज है और कोशिकाओं को समान रूप से कवर कर रहे हैं ।
      सावधानी: फॉर्मलडिहाइड संभावित दीर्घकालिक प्रतिकूल प्रभावों के साथ एक हानिकारक पदार्थ है और श्वसन प्रणाली और त्वचा दोनों के लिए एक अड़चन भी है। इसे केवल एक उपयुक्त रासायनिक धुएं हुड में संभाला जाना चाहिए। फ़ेल्डिहाइड के कंटेनरों को हमेशा तब सील किया जाना चाहिए जब धुएं हुड के बाहर।
      नोट: सुनिश्चित करें कि फॉर्मलडिहाइड सीधे सेल मीडिया में जोड़ा गया है न कि फ्लास्क दीवार में। चरण 2.1.6 1 मिनट से कम लेना चाहिए।
    7. एक और 10 मिनट के लिए बर्फ पर फ्लास्क इनक्यूबेट। कोशिकाओं के विपरीत फ्लास्क साइड के माध्यम से एक उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में मीडिया को बंद करें।
    8. एक स्ट्रिपेट का उपयोग करना, दुलबेक्को के फॉस्फेट बफर खारा के 30 एमएल में कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों के बिना और इसके अतिरिक्त 50 m M ग्लाइसिन युक्त, धीरे से कोशिकाओं के विपरीत पक्ष पर। फ्लास्क कमाल से मिलाएं; क्षैतिज स्थिति के लिए फ्लास्क वापस और बर्फ पर 10 मिनट अधिक के लिए इनक्यूबेट ।
    9. कोशिकाओं के विपरीत फ्लास्क साइड के माध्यम से समाधान बंद करें और धीरे-धीरे कोशिकाओं को अलग करने और पुनर्व्यवसाण करने के लिए मानक 0.25% w/v ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 7 एमएल जोड़ें। 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें।
      नोट: सुनिश्चित करें ट्रिप्सिन-EDTA समाधान सभी कोशिकाओं को समान रूप से कवर करता है। सेल टुकड़ी को बढ़ावा देने के लिए आवधिक कोमल झुकाव और कमाल का उपयोग करें।
    10. फ्लास्क को खड़ी स्थानांतरित करें और एक स्ट्रिपेट का उपयोग करके फ्लास्क दीवारों से किसी भी शेष कोशिकाओं को धीरे-धीरे धोकर अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करें। निलंबन को बर्फ पर 50 एमएल ट्यूब सेट में स्थानांतरित करें।
      नोट: फिक्स्ड कोशिकाएं अधिक नाजुक हो सकती हैं; फ्लास्क दीवार से कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक से तीव्रता या अधिक से अधिक पिपेट न करें।
    11. तुरंत पूर्ण मीडिया के 20 एमएल (10% एफबीएस के साथ गैर-बाँझ बर्फ-ठंडे मीडिया) के साथ एकत्र सेल निलंबन को पूरक करें और धीरे-धीरे ट्यूब को फ्लिप करके मिलाएं।
      नोट: पूर्ण सेल संस्कृति मीडिया (10% एफबीएस सहित) ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए जोड़ा जाता है, जिससे कोशिका झिल्ली और कोशिका विघटन को और अधिक नुकसान होता है।
    12. 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 100 x ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मार। सेल पेलेट स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए।
    13. मीडिया से दूर डालो और धीरे से बर्फ के 10 मिलीएल में सेल गोली फिर से खर्च-Ca2 +,एमजी2 + केसाथ, और ग्लाइसिन के बिना ठंडे डीपीबीएस ।
    14. दोहराएं चरण 2.1.12।
    15. वॉश बफर को बंद करें और बर्फ पर सीए2 +,एमजी 2+के साथ बर्फ-ठंडे डीपीबीएस के 800 माइक्रोन में सेल पेलेट को धीरे से फिर से ढिंढा करें। पुनर्नक्षित कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को एक नए कम प्रोटीन में स्थानांतरित करें।
    16. 3 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 100 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें। 1 एमएल पिपेटर का उपयोग करके सुपरनेट को सावधानी से त्यागें। इस स्तर पर, सेल पेलेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जा सकता है या सेल लाइसिस चरण में आगे बढ़ सकता है।
      नोट: फ्रोजन सेल छर्रों को 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। हमने पाया कि सेल पेलेट फ्रीजिंग बाद में लाइसिस की सुविधा प्रदान करता है और लंबी अवधि के भंडारण की योजना नहीं होने पर भी ठंड की सलाह देता है।
  2. स्तनधारी सेल व्यवधान और साइटोसोल संग्रह
    1. एक जैवसेफ्टी कैबिनेट में, नॉनओनिक, नॉनडेनाचरिंग डिटर्जेंट और 40 यू/μL RNase अवरोधक के 7 माइक्रोन के आधार पर लाइसिस बफर के 300 माइक्रोन जोड़ें। 1 एमएल टिप का उपयोग करके पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    2. ध्यान से एक 1-3 मिलील सिरिंज के लिए एक 25 जी सुई देते हैं और तेजी से मिश्रण पिपेट, कम से कम सात धीमी गति से ऊपर की ओर सेवन और तेजी से नीचे निकास स्ट्रोक का उपयोग कर।
    3. सिरिंज और सुई को शार्प्स बिन में छोड़ें और 31 जी सुई से लैस 0.3 एमएल सिरिंज का उपयोग करके प्रक्रिया दोहराएं।
    4. सिरिंज और सुई को शार्प्स बिन में फेंकें। 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, 5 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम सेल मलबे गोली के लिए।
    5. सुपरनेट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को एक नए कम प्रोटीन बाइंडिंग में स्थानांतरित करें। दोनों को स्टोर करें, सेल मलबे (नियंत्रण उद्देश्यों के लिए) और परिणामी स्पष्ट सेल -80 डिग्री सेल्सियस पर lysate।
      नोट: lysate की ऑप्टिकल घनत्व 25-30 AU260 के बीच पर्वतमाला जब दो टी-175 फ्लास्क संयुक्त हैं और अनुशंसित मात्रा का पालन किया जाता है। lysates और सेल मलबे -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 साल तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. साइटोसोल के गैर-अनुवादित अंशों से निश्चित (पॉली) रिबोसोमल परिसरों का पृथक्करण
    1. 13 एमएल पतली दीवार पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब, 14 x 89 मिमी में रैखिक 15%-45% डब्ल्यू/वी सुक्रोज ग्रेडिएंट तैयार करें, फ्रीज-गल विधि का उपयोग करके आम तौर पर खमीर प्रोटोकॉल के चरण 1.3.1 में वर्णित है, लेकिन बफर 2(चित्रा 2a)का उपयोग कर रहा है।
      नोट: विडियंट्स को रात भर ठंडे कमरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर गल जाता है।
    2. सेल के 150-250 (अधिकतम 300) माइक्रोन को संतुलित ढाल पर पिछले चरण 2.2.5 से लोड करें। शेष lysate -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और नियंत्रण उद्देश्यों के लिए उपयोग करें।
      नोट: यहां पॉलीसोमल, रिबोसोमल और 'फ्री' एसएसयू अंशों में तलछट-आधारित अलगाव का एक उदाहरण प्रदान किया गया है। वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए प्रदान की गई अनुपूरक तालिका 1 का उल्लेख करें ।
    3. अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम मात्रा में स्विंग-बाल्टी रोटर, औसत जी-बल 178,305 x ग्राम (k-factor 143.9) में 1 घंटे 45 मिनट के लिए।
    4. स्पिन पूरा होने से 30 मिनट पहले, स्थापित करें और ढाल आंशिक को बेसलाइन करें, जैसा कि खमीर प्रोटोकॉल चरण 1.4.7-1.4.9 में वर्णित है।
    5. आम तौर पर खमीर प्रोटोकॉल चरण 1.4.10-1.4.11 में वर्णित ढाल को फिर से करें।
      नोट: यह कदम पॉलीसोमल, रिबोसोमल और 'फ्री' एसएसयू अंशों को अलग करेगा। पॉलीसोमल अंशों का उपयोग पॉलीसोम प्रोफाइलिंग प्रयोगों में किया जा सकता है।
    6. तुरंत एकत्र किए गए अंशों को बर्फ पर स्थानांतरित करें और यदि आगे संसाधित नहीं किया जाता है, तो 6 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यदि अंश कलेक्टर ट्यूब परिवर्तन पर लाइन अंश पहचान और अलगाव के साथ तुल्यकालन है, हम ८०० μL अंश (१.५ ml/min पर ३२ एस प्रति अंश के संग्रह समय) का उपयोग करने की सलाह देते हैं । यदि इन-लाइन अवशोषण रीडआउट का उपयोग किए बिना अंश किया जाता है, तो 250-500μl अंशों (1.5 मिलीएल/मिनट पर 10-20 एस प्रति अंश) का उपयोग करके इसकी सिफारिश की जाती है। पृथक्करण के बाद, अंशों का उपयोग इम्यूनोपुरिफिकेशन, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, डेन्चरिंग पेज और पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए सीधे किया जा सकता है, या बाद के आरएनए और/या प्रोटेओमिक्स विश्लेषणों के लिए क्रॉसलिंक रिवर्सल के अधीन किया जा सकता है ।

Representative Results

ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स बफ़र्स की आयनिक संरचना के प्रति संवेदनशील होते हैं, जो अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है जहां तलछट गुणों का आकलन किया जाता है। इस प्रकार हमने जमीन के गैर-निश्चित खमीर सामग्री से निकाले गए स्पष्ट लाइसेट का उपयोग करके कई तलछट बफ़र्स का परीक्षण किया, ताकि ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स और अलग राइबोसोमल सबयूनिट (एसएसयू, एलएसयू), मोनोसोम्स (आरएस) और ढाल में पॉलीसोम्स को हल करने के लिए सबसे उपयुक्त स्थितियों का चयन किया जा सके। सभी बफर 25 एमएम एचईपीई-कोह पीएच 7.6 और 2 एमएम डीटीटी युक्त कोर संरचना पर आधारित थे। केसीएल, एमजीसीएल2,सीएसीएल2और ईडीटीए की सांद्रता को बफ़र्स(चित्रा 2ए)में और संशोधित किया गया था, और इन घटकों को ढाल लोडिंग से पहले लिसेट्स में जोड़ा गया था और ढाल कास्टिंग से पहले सुक्रोज रेडिएंट बफ़र्स में, तदनुसार।

बफ़र्स में 1 और 2 अच्छी तरह से हल किए गए अनुवाद परिसर प्राप्त किए गए थे। बफर 1 के परिणामस्वरूप छोटे रिबोसोमल सबयूनिट (एसएसयू)(चित्रा 2ए)का कुछ बेहतर पृथक्करण हुआ। एमजीसीएल2 का लोप और ईडीटीए (बफ़र्स 3,4) के अलावा अधिकांश पॉलीसोम्स के लिए उच्च तलछट गुणों का नुकसान हुआ और उनके आंशिक विघटन(चित्रा 2 ए)की संभावना है। जबकि 2.5 m CaCl2 के अलावा कुछ अधिक सजातीय पॉलीसोमल चोटियों के परिणामस्वरूप, सुधार सीमांत था और पॉलीसोमल सामग्री की कुल राशि बफ़र्स 1 और 2 की तुलना में इस मामले(चित्रा 2a)में कमी आई। इस प्रकार हमने बफर 1 को पसंद के कामकाजी बफर के रूप में चुना।

Figure 2
चित्र 2:अनुवाद जटिल निष्कर्षण और निर्धारण के स्थिर प्रभाव के आकलन के लिए बफर शर्तें। दिखाया गया है यूवी अवशोषण प्रोफाइल कुल खमीर सेल के लिए २६० एनएम पर एकत्र 10%-40% w/v सुक्रोज ढाल में अलग । (क)गैर-निश्चित खमीर कोशिकाओं से निकाली गई सामग्री के तलछट पर मोनो और डिवेलेंट लवण और मैग्नीशियम आयन ज़ब्ती का प्रभाव। लाल और भूरे रंग की रेखाएं एक विशिष्ट दोहराने का प्रतिनिधित्व करते हैं। (b,c) फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड यीस्ट कोशिकाओं के गैर-फिक्स्ड (ग्रे लाइन), 2.2% (ब्लैक लाइन) और 4.4% (ब्लैक डॉटेड लाइन) डब्ल्यू/वी से प्राप्त लिडेट्स की तुलना। (घ)एचईके 293T कोशिकाओं के फॉर्मेल्डिहाइड निर्धारण (ब्लैक डैश्ड एंड डॉटेड लाइन) के अनुकूलित 02% डब्ल्यू/वी द्वारा पॉलीसोम्स का स्थिरीकरण, एक ही गैर-फिक्स्ड कोशिकाओं (ग्रे लाइन) से सामग्री की तुलना में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हमने अगले विभिन्न फॉर्मलडिहाइड सांद्रता के साथ निर्धारण द्वारा पॉलीसोमल स्थिरीकरण के प्रभाव की जांच की। अन्यथा एक ही सेल सामग्री, बफ़र्स, सेल हैंडलिंग और समय दृष्टिकोण का उपयोग करके, हमने गैर-निश्चित कोशिकाओं और कोशिकाओं से निकाली गई सामग्री की तुलना 2.2% और फॉर्मलडिहाइड(चित्रा 2b,सी)के 4% डब्ल्यू/वी के साथ तय की गई। हमने पाया कि फॉर्मलडिहाइड का 2.2% डब्ल्यू/वी निर्धारण के लिए बेहतर अनुकूल था, जबकि यह पॉलीसोम्स को उत्कृष्ट रूप से संरक्षित करता है जैसा कि पॉलीसोम-टू-मोनोसोम अनुपात(चित्रा 2 बी)द्वारा आंका जा सकता है, इसने फॉर्मलडिहाइड के 4% डब्ल्यू/वी की तुलना में रिबोसोमल सामग्री की समग्र उपज को कम नहीं किया, जिसने ओवर-फिक्सेशन(चित्रा 2c)के स्पष्ट संकेत प्रदर्शित किए।

स्तनधारी कोशिकाओं से प्राप्त सामग्री के लिए, डिटर्जेंट आधारित निष्कर्षण के लिए आवश्यक बड़े लाइसिस बफर-टू-सेल वॉल्यूम अनुपात के कारण, बफर 2(चित्रा 2ए)का उपयोग किया गया था। इससे सुक्रोज ग्रेडिएंट्स(चित्रा 2डी)में तलछट पर अच्छी तरह से हल किए गए अनुवादात्मक परिसरों का उत्पादन हुआ। विशेष रूप से, 0.2% w/v के फॉर्मेल्डिहाइड की बहुत कम एकाग्रता का उपयोग किया गया था, क्योंकि उच्च सांद्रता के परिणामस्वरूप पर्याप्त पॉलीसोमल और रिबोसोमल सामग्री हानि हुई (डेटा नहीं दिखाया गया)। खमीर कोशिकाओं के साथ प्राप्त परिणामों के लिए समानता में, क्रॉसलिंक-स्थिर सामग्री ने पॉलीसोम और उच्च पॉलीसोम-टू-मोनोसोम अनुपात(चित्रा 2डी)के बेहतर संरक्षण का प्रदर्शन किया।

हमने अगले परीक्षण किया कि क्या चयनित फॉर्मलडिहाइड निर्धारण की स्थिति क्रॉसलिंकिंग के परिणामस्वरूप पॉलीसोमल अंशों के भीतर सक्रिय रूप से अनुवादित एमआरएनए को स्थिर करने के लिए पर्याप्त कुशल है, और बेहतर पॉलीसोमल यील्ड एंजाइम फ़ंक्शन और अनुवाद विस्तार प्रगति को बाधित करने का परिणाम नहीं है। हमने पॉलीसोम्स और राइबोसोम्स को अस्थिर करने के लिए EDTA और हाई मोनोवेलेंट सॉल्ट (केसीएल) का इस्तेमाल किया। इन अभिकर्णों को स्पष्ट खमीर सेल लिसेट्स में जोड़ा गया था, और बफर 1 संरचना के शीर्ष पर क्रमशः सभी बाद के बफ़र्स और सुक्रोज ग्रेडिएंट्स में शामिल किया गया था।

दरअसल, 15 एमएम ईडीटीए ने फिक्स्ड सेल्स(चित्रा 3ए)से प्राप्त पॉलीसोमल अंशों पर कम अस्थिरता प्रभाव का प्रदर्शन किया, जो इस बात की पुष्टि करता है कि क्रॉसलिंक्ड कॉम्प्लेक्स अधिक मजबूत हैं। EDTA के अस्थिर प्रभावों को फॉर्मेल्डिहाइड की एकाग्रता बढ़ाकर कुछ हद तक दूर किया जा सकता है, क्योंकि फॉर्मेल्डिहाइड-फिक्स्ड कोशिकाओं के 4% w/v से सामग्री बेहतर खुलासा करने का विरोध करती है(चित्रा 3a)। हालांकि, 50 m M करने के लिए EDTA एकाग्रता बढ़ाने के परिणामस्वरूप दोनों निश्चित और गैर-निश्चित शर्तों के तहत अधिकांश ट्रांसलेशनल परिसरों को अस्थिर किया गया, जैसा कि सामग्री की धीमी तलछट और अच्छी तरह से आकार की चोटियों(चित्रा 3 बी)की अनुपस्थिति से कम किया जा सकता है। यह एमआरएनए से पॉलीसोमल घटकों के पूर्ण वियोजन के बजाय संरचनाओं के आंशिक खुलासा और कॉम्पैक्टनेस के समग्र नुकसान से समझाया जा सकता है। यहां तक कि इस मामले में, क्रॉसलिंक्ड सामग्री ने तेजी से तलछट(चित्रा 3बी) काप्रदर्शन किया है।

Figure 3
चित्रा 3:पॉलीसोम्स की स्थिरता पर वीवो यीस्ट फॉर्मलडिहाइड निर्धारण में प्रभाव। बफर 1 (देखें टेक्स्ट और फिगर 2ए)का इस्तेमाल सभी प्रयोगों में किया गया था। डेटा प्रकार और प्लॉटिंग के रूप में चित्रा 2 किंवदंती में वर्णित है । }फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड सेल्स के 2.2% (ब्लैक लाइन) और 4% (ब्लैक डॉटेड लाइन) डब्ल्यू/वी से प्राप्त पॉलीसोम्स की स्थिरता पर सेल लाइसेट्स और उसके बाद के बफ़र्स में 15 एमएम ईडीए के अलावा की तुलना । (ख)समान(ए)के रूप में, लेकिन 50 mM EDTA के अलावा और फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड कोशिकाओं के 4% w/v को छोड़कर। (ग)500 mm KCl के अलावा और फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड सेल के 2.2% डब्ल्यू/वी को छोड़कर) के समान है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

EDTA प्रभाव के समान, 500 mM KCl पर, हमने फॉर्मलडिहाइड निर्धारण(चित्रा 3c)के 4% w/v के साथ स्थिरता में बड़ा सुधार पाया। इस मामले में कॉम्पैक्टनेस की स्पष्ट हानि को आरएनए से उनके पूर्ण वियोजन के बजाय रिबोसोमल परिसरों के घटकों की आंशिक टुकड़ी द्वारा भी समझाया जा सकता है। कुल मिलाकर, फॉर्मेल्डिहाइड-फिक्स्ड कोशिकाओं से प्राप्त पॉलीसोम्स ने इन परिसरों के भीतर अतिरिक्त सहसंयोजक बांड बनाने के अनुरूप खुलासा और संरचनात्मक अस्थिरता के लिए उच्च प्रतिरोध का प्रदर्शन किया।

उत्तेजक विकास की स्थिति के दौरान, mRNAs तेजी से शुरू किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप एक ही mRNA अणुओं पर कई राइबोसोम का संचय होता है, जो पॉलीरिबोसोम, या पॉलीसोम के रूप में जाना जाता संरचनाओं के रूप में जाना जाता है । पॉलीसोम्स को सुक्रोज ग्रेडिएंट्स में अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन द्वारा अलग किया जा सकता है, जहां वे अपने आदेश (एमआरएनए पर समवर्ती संलग्न राइबोसोम्स की संख्या) के आधार पर तलछट करते हैं। जब अनुवाद दबा दिया जाता है, तो राइबोसोम जल्द ही अनुवाद के एक और दौर में शामिल होने में विफल हो जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप पॉलीसोम्स का (आंशिक) 'अलग' होता है, जिसे कम क्रम के पॉलीसोम्स की ओर एक मोडल बदलाव औरमोनोसोम्स 4,26के संचय के रूप में प्रदर्शित किया जाता है।

ट्रांसलेशनल रिस्पांस का एक मॉडल जिसे पॉलीसोम ऑर्डर डिस्ट्रीब्यूशन लेवल पर कल्पना की जा सकती है, ग्लूकोज भुखमरी द्वारा प्रदान की जा सकती है। ग्लूकोज की कमी खमीर पर सबसे नाटकीय और तेजी से अनुवादात्मक अवरोधक प्रभावों में से एक है1,3,40. पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि ग्लूकोज की कमी के 1 मिनट के भीतर, पॉलीसोम्स की हानि, मोनोसोम का संचय और अनुवाद दीक्षा का अवरोध4हो सकता है। ग्लूकोज के 5 मिनट के भीतर पुनः पूरक,पॉलीसोम्स 3, 4में स्पष्ट वृद्धि के साथ अनुवाद जल्दी से बहाल होजाताहै। यह भी देखा गया कि अनुवाद तब बाधित हुआ जब कोशिकाओं को ०.५% (w/v) या उससे कम ग्लूकोज युक्त मीडिया के संपर्क में किया गया और ग्लूकोज के स्तर में ०.६% (w/v) या उससे अधिक का कोई प्रभाव नहीं देखा गया ।

इस प्रकार हम यह निर्धारित करना चाहते थे कि क्या हमारी निर्धारण स्थितियां ग्लूकोज तनाव प्रतिक्रिया की गतिशीलता के भीतर ट्रांसलेशनल मतभेदों के संरक्षण के लिए उपयुक्त हैं, जैसा कि पॉलीसोम-टू-मोनोसोम अनुपात द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। हम उच्च ग्लूकोज पर मध्य घातीय चरण में उगाया कोशिकाओं से सामग्री की तुलना (२.००% w/v जोड़ा) कोई या कम जोड़ा (०.००% या ०.२५% w/v, क्रमशः) ग्लूकोज के साथ मीडिया में 10 मिनट के लिए स्थानांतरित उन लोगों के साथ । निर्धारण नियंत्रण में समानांतर में formaldehyde के २.२% w/v का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है (गैर भूखे; एक ही मानक 2% w/v जोड़ा ग्लूकोज युक्त मीडिया के साथ रैपिड मीडिया प्रतिस्थापन, 10 मिनट और निर्धारण के लिए इनक्यूबेशन के बाद) और 10 मिनट भूखे (एक ही मीडिया के साथ तेजी से मीडिया प्रतिस्थापन लेकिन कम ०.२५ w/v या कोई जोड़ा ग्लूकोज, 10 मिनट और निर्धारण) कोशिकाओं के लिए इनक्यूबेशन के बाद।

पहले के निष्कर्षों के अनुरूप, हमने देखा कि खमीर कोशिकाओं को भारी ग्लूकोज भुखमरी तनाव(चित्रा 4a)पर अनुवाद को दबाने । दोनों, कोई जोड़ा और कम ग्लूकोज की स्थिति पॉलीसोम disassembly प्रेरित, थोड़ा लेकिन जाहिर है और अधिक पॉलीसोम कम जोड़ा ग्लूकोज के मामले में बनाए रखा के साथ । इस प्रकार, खमीर ग्लूकोज हटाने प्रतिक्रिया एक सब पर या सभी प्रकार के नहीं हो सकता है और धीरे-धीरे देखते हैं। फॉर्मेल्डिहाइड क्रॉसलिंकिंग की स्थिर कार्रवाई के लिए उम्मीदों की पुष्टि करते हुए, निश्चित कोशिकाओं से पॉलीसोमल सामग्री ने भूखे और गैर-भूखे कोशिकाओं के बीच एक उच्च अंतर का प्रदर्शन किया है, यकीनन प्रतिक्रिया की एक उच्च गतिशील रेंज(चित्रा 4b)को संरक्षित किया है। दिलचस्प बात यह है कि निश्चित कोशिकाओं से सामग्री के मामले में, कम अतिरिक्त ग्लूकोज एकाग्रता के परिणामस्वरूप विशिष्ट पॉलीसोमल बहुतायत हुई जो गैर-निश्चित कोशिकाओं(चित्रा 4 ए)की तुलना में कोई अतिरिक्त ग्लूकोज की स्थिति से बेहतर अंतर है। यह अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं के संतुलन में अपेक्षाकृत मिनट और क्षणिक मतभेदों को संरक्षित और कैप्चर करने में फॉर्मलडिहाइड निर्धारण दृष्टिकोण की उपयुक्तता का एक मजबूत संकेत है, जैसे कि अनुवादात्मक प्रतिक्रियाओं के दौरान।

Figure 4
चित्रा 4:ग्लूकोज भुखमरी पर खमीर अनुवाद में तेजी से परिवर्तन पर कब्जा। बफर 1 (देखें टेक्स्ट और फिगर 2ए)का इस्तेमाल सभी प्रयोगों में किया गया था। डेटा प्रकार और प्लॉटिंग के रूप में चित्रा 2 किंवदंती में वर्णित है । (क)गैर-भूखे (ग्रे लाइन) से प्राप्त सेल लिट्स, प्रतिबंधित ग्लूकोज-भूखे (025% डब्ल्यू/वी जोड़ा ग्लूकोज 10 मिनट के लिए; ब्राउन लाइन) और ग्लूकोज-समाप्त (10 मिनट के लिए कोई अतिरिक्त ग्लूकोज; लाल रेखा) गैर-निश्चित खमीर कोशिकाएं । (ख)समान(ए)के रूप में, लेकिन 2.2% w/v फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड कोशिकाओं के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

सुक्रोज ग्रेडिएंट तलछट ('पॉलीसोम प्रोफाइलिंग') का उपयोग करके एमआरएनए का सक्रिय रूप से अनुवाद करने से जुड़े राइबोसोम्स द्वारा अनुवादात्मक स्थिति की निगरानी करना एक व्यापक रूप से लागू तकनीक26,27,28है। मात्रात्मक माइक्रोएरे विश्लेषण के संयोजन में और हाल ही में उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण28,44के साथ, पॉलीसोम प्रोफाइलिंग राइबोसोम से जुड़े RNAs ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड के बारे में जानकारी प्रदान करता है। कई मान्यताओं के साथ, प्रोटीन बायोसिंथेसिस अनुसंधान के क्षेत्र में पारंपरिक रूप से यह तर्क दिया गया है कि पॉलीसोमल उपस्थिति संबंधित एमएचआरए के अनुवाद में सक्रिय भागीदारी का संकेत है। एक और निष्कर्ष अक्सर उचित होता है (लेकिन हमेशा नहीं) उचित होता है, कि दिए गए लंबाई (पॉलीसोम्स का उच्च क्रम) के एमआरएनए पर अधिक राइबोसोम मौजूद होते हैं, और अधिक सक्रिय रूप से एमआरएनए अनुवाद में शामिल होता है। इस प्रकार, बाकी सामग्री से पॉलीसोमल अंश को अलग करना सक्रिय रूप से अनुवादित आरएनए को अलग करने के दृष्टिकोण से उपयोगी हो सकता है। पदचिह्न प्रोफाइलिंग दृष्टिकोणों के भीतर, और विशेष रूप से टीसीपी-एसईक्यू10,38,39 जो स्कैनिंग से प्राप्त मुक्त एसएसयू की एक अलग आबादी उत्पन्न करता है, शुरू करें और कोडन परिसरों को रोकते हैं, यह अतिरिक्त रूप से राइबोसोमल सबयूनिट को हटाने के लिए व्यावहारिक हो सकता है जो पूर्ण मोनोसोम या पॉलीसोम्स के साथ सह-तलछट नहीं करते हैं।

इस प्रकार हमने एमआरएएनए के 'सक्रिय रूप से अनुवादित' पूल से दूर मुफ्त एसएसयू (एमआरएनए को बिना संलग्न एमआरएनए के एकल एसएसयू या एसएसयू से बंधे) जैसे 'गैर-अनुवादित' एमआरएनपी के पृथक्करण को नियोजित किया है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, हमने माना कि या तो एक (मोनो-) या कई राइबोसोम (पॉलीसोम) के साथ बातचीत में शामिल mRNAs का सक्रिय रूप से अनुवाद किया जा सकता है। इस तरह के परिसरों को उनके उच्च तलछट गुणांक द्वारा दूसरों से अलग किया जा सकता है। हमने यह भी सुझाव दिया कि ट्यूब वॉल पर सामग्री को सीधे पेलेट करने के बजाय mRNAs के 'सक्रिय रूप से अनुवादित' पूल को एक सुक्रोज कुशन (50% डब्ल्यू/वी ऑफ सुक्रोज) में अलग करें। तकिया में तेजी से तलछट परिसरों के अपकेंद्रित्र हमें अवशोषण प्रोफ़ाइल readout का उपयोग कर जुदाई की निगरानी करने के लिए और घुलनशील, गैर एकत्रित और गैर-विकृत सामग्री के एक उच्च उत्पादन को प्राप्त करने के लिए, गोली और फिर से घुलनशीलीकरण10,३८की तुलना में अनुमति दी ।

कुल मिलाकर, व्यक्तिगत एसएसयू, राइबोसोम्स, डाइसोम्स और संभावित रूप से पैक किए गए पॉलीसोम्स को उच्च क्रम के शुद्ध करने के लिए, निश्चित स्पष्ट रूप से स्पष्ट रूप से दो चरण की अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन प्रक्रिया(चित्रा 5)के अधीन थे। पहले सुक्रोज ढाल में, अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन के परिणामस्वरूप ग्रेडिएंट(चित्रा 5a) के शीर्ष (10%-20% w/v ऑफ सुक्रोज) भाग में अलग मुक्त एसएसयू और एलसus के परिणामस्वरूप, जबकि पॉलीसोम और एक पूर्ण राइबोसोम से जुड़े पॉलीसोम और rnAs सहित क्रॉसलिंक्ड अनुवादित पूल नीचे केंद्रित थे (50% w/v sucrose के) ). अनुवादित एमआरएनए पूल युक्त सुक्रोज परत का निचला 50% डब्ल्यू/वी तब केंद्रित था और इसके आरएनए को आरएनएस प्रथम के साथ पचाया गया था, जिसके बाद अलग एसएसयू, एलएसयू, आरएस, आरएनएसई प्रतिरोधी डिसोम्स (डीएस) और उच्च-आदेश नाभिक-प्रतिरोधी पॉलीसोम्स(चित्रा 5b)के मामूली अंश प्राप्त करने के लिए एक दूसरे सुक्रोज ढाल अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन के बाद। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ यूरेनाइल एसीटेट और इमेजिंग के साथ नकारात्मक धुंधला प्रत्येक तलछट चरण(चित्र 5)में अलग परिसरों की पहचान की पुष्टि की ।

Figure 5
चित्रा 5:कुल अनुवादित आरएनए अंशों का अलगाव अअनुवादित आरएनए से दूर है। (a,c)योजनाबद्ध (बाएं) और संबंधित प्रतिनिधि परिणाम (दाएं; डेटा प्रकार और प्लॉटिंग के रूप में चित्रा 2 किंवदंती में वर्णित)(क)मुक्त SSUs और अनुवादित mRNA पूल सहित गैर अनुवादित साइटोसोल अंशों के पहले असतत सुक्रोज ढाल जुदाई रिबोसोम्स और पॉलीसोम्स के साथ सह-तलछट द्वारा पहचाने गए, और(ग)अनुवादित एमआरएन पूल से मुक्त व्यक्तिगत रिबोसोमल परिसरों को नियंत्रित आरएनएई पाचन और अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन द्वारा एसएसयू, एलएसयू, रिबोसोमल (आरएस) में दूसरे रैखिक सुक्रोज ढाल के माध्यम से अलग करना, और नाभिक प्रतिरोधी विघटन (डीएस) अंश। उच्च (15 AU260)और कम (8 AU260)गैर भूखे पचा सामग्री की मात्रा को शामिल किया गया था ताकि मामूली अंशों की रुचि होने पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन लोड बढ़ाने की संभावना प्रदर्शित की जा सके। उच्च क्रम नाभिक प्रतिरोधी पॉलीसोम्स की भी पहचान की जा सकती है (उदाहरण के लिए, प्रदान किए गए उदाहरणों में ट्राइसोम्स)। (b,d) यूरेनिल एसीटेट-विषम अंशों की प्रतिनिधि TEM छवियां क्रमशः(ए, सी)से लेबल के रूप में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

क्षणिक राइबोसोम से जुड़े प्रोटीन (विशेष रूप से, eIFs) को बनाए रखने के लिए निर्धारण आहार की उपयुक्तता की जांच करने के लिए, हमने eIF4A के सह-तलछट के लिए परीक्षण किया, जो एक लैबिल ईआईएफ गतिशील रूप से राइबोसोम से बंधे हैं, रिबोसोमल अंशों में। हम eIF4A टैंडेम आत्मीयता शुद्धि (नल) टैग खमीर तनाव (TIF1-TAP) का लाभ उठाया और विरोधी नल एंटीबॉडी का उपयोग करके तय बनाम गैर तय कोशिकाओं से प्राप्त सामग्री में eIF4A उपस्थिति की जांच की, एक अतिरिक्त आरएनए बाध्यकारी नियंत्रण के रूप में Pab1p की बहुतायत की तुलना में, SDS-पश्चिमी ब्लॉटिंग(चित्रा 6)के बाद पृष्ठ का उपयोग कर ।

Figure 6
चित्र 6: वीवो फॉर्मलडिहाइड निर्धारण में ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स में क्षणिक प्रोटीन का स्थिरीकरण। (ए, बी)(शीर्ष भूखंड)पूरे सेल लिसेट (डब्ल्यूसीएल)(ए)गैर-फिक्स्ड और(बी)2.2% फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड ईआईएफ 4ए-टैप यीस्ट कोशिकाओं को अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन द्वारा अलग किया गया और चित्रा 2 किंवदंती में वर्णित दृश्यमान । (नीचे भूखंड) संबंधित ढाल (शीर्ष भूखंडों) में विश्लेषण सामग्री के पृथक्करण पर संबंधित सुक्रोज ढाल अंशों की पश्चिमी-दाग इमेजिंग, और डब्ल्यूसीएल एक नियंत्रण के रूप में। (ग)फिक्स्ड और नॉन-फिक्स्ड सामग्री के अंशों में eIF4A या Pab1p बहुतायत के बीच औसत अनुपात । सापेक्ष अनुपात (eIF4A (काले सलाखों) और Pab1p (ग्रे सलाखों) के सभी 2-7 अंशों के संकेत को सामान्यीकृत 2,3 (एसएसयू, एलएसयू), 4,5 (रुपये, हल्के पॉलीसोम्स), और 6,7 (भारी पॉलीसोम) के डेटा से (ए, बी) (नीचे भूखंडों) और उनके तय अनुपात में गैर-तय अनुपात में गणना की गई। त्रुटि सलाखों के पूल्ड अंशों (बिंदीदार बक्से) प्रतिकृति के रूप में इलाज के साथ मतलब से अनुपात के मानक विचलन का संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कोशिकाओं में उनकी उच्च बहुतायत के अनुरूप, हमने पूरे सेल lysate (WCL) में प्रोटीन के दोनों से संकेत की एक उच्च तीव्रता और गैर-निश्चित कोशिकाओं(चित्रा 6a, नीचेपैनल) से प्राप्त धीमी-तलछट अंशों को देखा। हमने निश्चित कोशिकाओं से प्राप्त डब्ल्यूसीएल में इन प्रोटीनों की पर्याप्त मात्रा का भी पता लगाया है और क्रॉसलिंक्ड सामग्री निष्कर्षण की दक्षता और अप्रत्याशित नुकसान(चित्रा 6b, नीचेपैनल) की अनुपस्थिति को आश्वस्त किया है। हालांकि, गैर-निश्चित कोशिकाओं के विपरीत, निश्चित कोशिकाओं से सामग्री ने Pab1p(चित्रा 6c)की तुलना में तेजी से तलछट रिबोसोमल अंशों में eIF4A की ऊंचा सापेक्ष उपस्थिति का प्रदर्शन किया। इस परिणाम से पता चलता है कि eIF4A फॉर्मलडिहाइड-क्रॉसलिंक्ड सामग्री में पॉलीसोम्स के साथ अधिक दृढ़ता से जुड़ा हुआ है।

राइबोसोमल अंशों में eIF4A उपस्थिति पर क्रॉसलिंकिंग के सकारात्मक और विशिष्ट स्थिरीकरण प्रभाव की पुष्टि करने के बाद, हमने चुंबकीय आईजीजी मोतियों के साथ आत्मीयता शुद्धि द्वारा eIF4A-युक्त परिसरों को पकड़ने और समृद्ध करने के लिए eIF4A-टैग (TIF1-TAP) खमीर तनाव से निश्चित सामग्री का उपयोग किया। हमारे पास आत्मीयता से समृद्ध डब्ल्यूसीएल है, मुफ्त एसएसयू और पॉलीसोमल (अनुवादित एमआरएनए पूल) सुक्रोज ग्रेडिएंट (जैसे, खमीर प्रोटोकॉल की धारा 1.3) के माध्यम से पहली तलछट के बाद अंश, साथ ही एसएसयू, एलएसयू और आरएस अंश अनुवादित पूल के विघटन पर दूसरे तलछट से RNase I (जैसे, खमीर प्रोटोकॉल की धारा 1.4)(चित्रा 7 ). सभी मामलों में, LSU अंश को छोड़कर, हम शुद्ध अंशों (eluate, ई) में eIF4A के चयनात्मक संवर्धन का पालन करने में सक्षम थे, स्रोत सामग्री में β-actin की उपस्थिति की तुलना में (इनपुट, मैं)(चित्रा 7)।

Figure 7
चित्र 7:क्षणिक रूप से जुड़े eIF4A द्वारा वीवो फॉर्मलडिहाइड-स्थिर ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स में चयनात्मक इम्यूनोपुरिफिकेशन। योजनाबद्ध विभिन्न ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स और eIF4A एपिटोप के स्रोत को दिखाता है, जिसमें eIF4A-TAP खमीर कोशिकाओं के गैर-आंशिक स्पष्ट डब्ल्यूसीएल शामिल हैं; पहले अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन में अलग-अलग एसएसयू और अनुवादित आरएनए पूल (पॉलीसोम्स) को अलग किया गया; SSU, LSU और आरएस अंश RNase मैं पाचन द्वारा अनुवादित आरएनए से मुक्त और दूसरे अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन का उपयोग कर अलग (पाठ देखें) । पश्चिमी दाग छवि समवर्ती दाग β-actin नियंत्रण की बहुतायत की तुलना में अंशों में eIF4A बहुतायत का एक दृश्य प्रदान करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

फॉर्मेल्डिहाइड फिक्सेशन बायोमॉलिक्यूल्स10,36, 46 , 46 ,47,48के वीवो क्रॉसलिंकिंग में तेजी से प्राप्त करने की एक सुविधाजनक और लोकप्रिय विधि है। अन्य संभावित बायोमॉल्यूल लक्ष्यों की तुलना में, ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के सफल कैप्चर को कोशिकाओं या अन्य सामग्री की तस्वीर द्रुतशीतन के दौरान तत्काल निर्धारण की आवश्यकता होती है। बिना किसी कमी स्थिरीकरण के बिना, विभिन्न अनुवाद से संबंधित प्रक्रियाओं को जारी रखने की क्षमता है, जटिल वितरण को वीवो राज्य49में बेफिक्र से दूर स्थानांतरित कर रहा है। अनुवादात्मक गिरफ्तारी और रिबोसोमल जटिल स्थिरीकरण के अन्य तरीकों की तुलना में, कोशिका झिल्ली में फॉर्मलडिहाइड कार्रवाई की तेज़ी और क्रॉसलिंक की अंधाधुंध प्रकृति अनुवाद परिसर की अधिकतम विविधता के संरक्षण का वादा करतीहै।

यहां प्रस्तुत दृष्टिकोण को खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं दोनों में स्थापित और अनुकूलित किया गया है, और अब अन्य समूहों द्वारा अधिक विविध जैविक सामग्री में उपयोग के लिए तरीके प्राप्त किए गए हैं, जैसे कि पूरे कशेरुकी (जैसे, जेब्राफिश भ्रूण)10,38,39,49,51,52 . यद्यपि ये काम सामूहिक रूप से दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा और व्यापक प्रयोज्यता को आश्वस्त करते हैं, लेकिन अनुकूलन और समायोजन की आवश्यकता के कारण ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के तेजी से फॉर्मलडिहाइड क्रॉसलिंकिंग को नए प्रकार की जैविक सामग्री में स्थानांतरित करना कुछ हद तक मुश्किल माना जा सकता है।

विधि की सफलता के लिए एक सबसे महत्वपूर्ण आवश्यकता फॉर्मेल्डिहाइड और सेल संग्रह और व्यवधान तकनीक की एकाग्रता का पुनः अनुकूलन है। कम पारगम्य, छोटे और गोल खमीर कोशिकाओं को बहुत अधिक (कम से कम, 10 गुना) फॉर्मलडिहाइड एकाग्रता और निश्चित कोशिकाओं के शारीरिक व्यवधान की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, संस्कृति में बड़े और चपटे अनुयायी स्तनधारी कोशिकाओं को आसानी से अधिक तय किया जा सकता है और निर्धारण पर कोमल हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, जबकि निश्चित परिसरों की निकासी को डिटर्जेंट का उपयोग करके झिल्ली व्यवधान के साथ रासायनिक रूप से किया जा सकता है। अंडर-क्रॉसलिंकिंग कम स्थिर या अधिक अल्पकालिक मध्यवर्ती को बाद की स्थिति में अलग या रिसाव करने की अनुमति दे सकता है। ओवर-क्रॉसलिंकिंग राइबोसोमल अंशों को अलग करने और अध्ययन करने की क्षमता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है और भारी परिसरों की गहरी कमी जैसे चयनात्मक पूर्वाग्रह पैदा कर सकता है। हमारे अवलोकन में, यहां तक कि मामूली परिवर्तन, जैसे कि उपयोग की जाने वाली अनुयायी मानव कोशिकाओं के प्रकार, बरामद क्रॉसलिंक्ड परिसरों की उपज को प्रभावित कर सकते हैं और क्रॉसलिंकिंग रेजिमेन के पुनः अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। हम यह भी आशा कर सकते हैं कि पौधों की कोशिकाओं जैसे काफी अलग पारमीयता गुणों वाली कोशिकाओं को निर्धारण शर्तों52के अतिरिक्त व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता होगी। फिर भी, एक प्रकार की जैविक सामग्री की कल्पना करना मुश्किल है जो दृष्टिकोण के साथ पूरी तरह से असंगत होगा।

स्तनधारी निर्धारण प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक एक विचार घनत्व और इनपुट के रूप में उपयोग की जाने वाली सेल सामग्री की मात्रा है। सेलुलर अनुवाद गतिशीलता पर बाहरी प्रभावों से बचने के लिए कम से कम 2 दिनों के लिए कोशिकाओं को फिर से बोने या अन्य क्षोभ के बिना लगातार बढ़ने की सिफारिश की जाती है। अधिकांश सेल प्रकारों के लिए लागू है, लेकिन अधिकांश अनुयायी कोशिकाओं के लिए लगातार 70% से अधिक के संगम स्तर प्राप्त करने से प्रमुख संपर्क अवरोध प्रभावों की अनुपस्थिति सुनिश्चित होगी जो अनुवाद दरों को नकारात्मक और अप्रत्याशित रूप से प्रभावित कर सकते हैं।

एक और दिलचस्प, और संभावित रूप से विशिष्ट सुविधाजनक, इसकी अंधाधुंध प्रतिक्रियाशीलता से उपजी फॉर्मलडिहाइड फिक्सेशन की विशेषता मिश्रित वर्गीकरण की प्रणालियों में ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स पर स्थिरीकरण प्रभाव है। बैक्टीरियल, और माइटोकॉन्ड्रिया, क्लोरोप्लास्ट और विभिन्न इंट्रासेलर परजीवी के और भी अधिक अनुवादात्मक परिसरों, विशिष्ट अनुवाद अवरोधकों के साथ लक्षित करना बेहद मुश्किल रहा है। इसके विपरीत, टीसीपी-एसईक्यू डेटा में, माइटोट्रान्रिप्टोम के पैरों के निशान38,39,50के आंकड़ों में आसानी से नमूदार हैं। एक दिलचस्प बाद में विकास इस तरह के मिट्टी, पानी या आंत के नमूनों में, जहां विश्वसनीय तेजी से अनुवाद गिरफ्तारी और किसी भी अंय साधनों के साथ जटिल स्थिरीकरण के रूप में पूरे microcommunities में अनुवाद की जांच करने के लिए दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है समस्याग्रस्त होगा ।

यह भी उल्लेख किया जाना चाहिए कि सबसे जटिल सामग्री (जैसे कठिन और/या भारी ऊतकों) के लिए, कुछ भी कोशिका व्यवधान और सामग्री समरूपता पर तुरंत फॉर्मलडिहाइड स्थिरीकरण के उपयोग को रोकता है । विशिष्ट छोटे अणु अवरोधक33 , 53, 54,55के साथ ट्रांसलेशनल परिसरों को स्थिर करते समय सेल प्रवेश में देरी को दूर करने के लिए यह दृष्टिकोण पहले से ही अक्सर नियोजित कियाजाताहै । यह देखते हुए कि फॉर्मलडिहाइड निर्धारण पारंपरिक रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी४५, ५६, ५७,५८जैसे अनुप्रयोगों में पूर्व वीवो/इन विट्रो नमूना स्थिरीकरण के लिए उत्कृष्ट परिणामों के साथ इस्तेमाल किया गया है, हम इस मामले में और भी कम नकारात्मक प्रभाव की उम्मीद कर सकते हैं, विशेष रूप से पूरी तरह से तय कोशिकाओं से ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के खराब निष्कर्षण से जुड़े लोग ।

हमारे निष्कर्ष अत्यधिक क्षणिक परिसरों को स्थिर करने के लिए तेजी से फॉर्मलडिहाइड निर्धारण की उपयोगिता की पुष्टि करते हैं, जैसे कि उनमें eIF4A शामिल हैं। यह उल्लेखनीय है कि स्तनधारियों के विपरीत, खमीर eIF4A कैप बाध्यकारी जटिल eIF4F के साथ बहुत अधिक कमजोर रूप से जुड़ा हुआ है और नतीजतन, सामान्य रूप से अनुवादात्मक परिसर। खमीर29,59, 60 , 62 , 62,63में राइबोसोमल सामग्री के किसी भी व्यापक शुद्धिकरणके दौरानआमतौर पर eIF4A खोजाताहै। फिर भी, वीवो-फिक्स्ड यीस्ट सामग्री में,ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के सभी अंशों में eIF4A के विश्वसनीय संवर्धन को प्राप्त करना संभव है जहां इसकी उपस्थिति का अनुमान लगाया जाएगा। पहले प्रकाशित सेल-टीसीपी-एसईक्यू डेटा ने eIF2 और eIF3 के संवर्धन का प्रदर्शन किया है जो राइबोसोम्स के साथ अधिक दृढ़ता से संबद्ध है (लेकिन यह भी पता चला कि क्षणिक रूप से होने वाले सह-ट्रांसलेशनल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स असेंबली)39। इस प्रकार, विधि ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के मजबूत और कमजोर संलग्न दोनों घटकों का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।

संक्षेप में, हमने मुख्य रूप से अनुवाद के दीक्षा चरण में होने वाले परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए उपयोगी दृष्टिकोण प्रस्तुत किया है और जब एमआरएनए पर न्यूनतम रूप से बेफिक्र रिबोसोमल वितरण की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह दृष्टिकोण ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के अपेक्षाकृत लैबिल और गतिशील घटकों जैसे eIF4A के स्थिरीकरण के लिए उपयुक्त है, और इसका उपयोग मोटे तौर पर आवश्यक अनुकूलन के अधीन किया जा सकता है। हमने अनुवाद के तेजी से गतिशील परिवर्तन के परिदृश्यों में फॉर्मलडिहाइड निर्धारण की उपयोगिता के सबूत भी प्रदान किए हैं, जो पर्यावरणीय परिवर्तनों या तनाव की स्थिति के लिए तेजी से पुस्तक सेलुलर प्रतिक्रियाओं जैसे जांच के क्षेत्रों को खोल रहे हैं ।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल डिस्कवरी प्रोजेक्ट ग्रांट (DP1801001111 से टी.पी. और एनईएस), नेशनल हेल्थ एंड मेडिकल रिसर्च काउंसिल इन्वेस्ट्रकेशन ग्रांट (GNT1175388 से N.E.S.) और रिसर्च फैलोशिप (एपी1135928 से टीपी) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक सेंटर फॉर एडवांस्ड माइक्रोस्कोपी, ऑस्ट्रेलियन नेशनल यूनिवर्सिटी में माइक्रोस्कोपी ऑस्ट्रेलिया की सुविधाओं को स्वीकार करते हैं, एक ऐसी सुविधा जो विश्वविद्यालय और संघीय सरकार द्वारा वित्तपोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Merck, Sigma-Aldrich 70161
Peptone Merck, Sigma-Aldrich 70178
D-Glucose (Dextrose) Merck, Sigma-Aldrich 49139
Adenine sulphate Amresco 0607-50G
Formaldehyde solution Merck Sigma-Aldrich F11635-500ML ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific 10777019
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail COEDTAF-RO Roche by Merck 11873580001
Magnesium chloride solution (Merck/Sigma-Aldrich) M1028
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (Merck/Sigma-Aldrich) E7889
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL Ambion AM2294
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL) Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific AM2694
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0) (Merck/Sigma-Aldrich) P1944-100ML
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) 11033
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) AM9740
Glycogen (5 mg/ml) Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) AM9510
Ethyl alcohol, Pure Merck; Sigma Aldrich E7023
Amersham™ Hybond® P Western blotting membranes, PVDF Merck GE10600023 PVDF membrane for western blotting
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific NW04120BOX Protein gel
4X Bolt™ LDS Sample Buffer Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific B0007  LDS sample loading buffer
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards BioRad 1610375 Protein ladder
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer ThermoFischer Scientific B0002 PAGE runninjg buffer
Intercept® (PBS) Blocking Buffer LI-COR 927-70001 Odyssey Blcoking buffer (PBS)
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 92632210
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 92632211
TAP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific CAB1001
Anti-beta Actin antibody Abcam ab8227
Sucrose (Merck/Sigma-Aldrich) 84097 BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC)
DL-Dithiothreitol solution (Merck/Sigma-Aldrich) 43816 BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O
Terumo Syringe 1CC/mL Terumo Syringe 878499
Potassium chloride (Merck/Sigma-Aldrich) 60128
HEPES (Merck/Sigma-Aldrich) H3375
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich 12003C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium Sigma-Aldrich D8662
Glycine Sigma-Aldrich G7126
Tris hydrochloride Merck/Sigma-Aldrich 10812846001
Sodium dodecyl sulfate Merck/Sigma-Aldrich 436143
IGEPAL CA-630 Merck/Sigma-Aldrich I3021
Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111
Stainless steel grinding jar Retsch 02.462.0059
MM400 mixer mill Retsch 20.745.0001
Gradient Fractionator Brandel BRN-BR-188
Thermomixer R Eppendorf Z605271
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices Eppendorf Safe-Lock 30121023
Mini Gel Tank (Thermo Fisher Scientific) A25977 PAGE running tank
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm Beckman-Coulter 344057
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk Beckman-Coulter 331372
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices Merck UFC5030 Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge Cambridge Scientific 15566
Beckman Coulter Optima L-90K GMI 8043-30-1191
Nunc EasYFlask 175cm2 Thermofisher Scientific 159910
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermofisher Scientific 14-432-22
25 mL Serological Pipette Sigma-Aldrich SIAL1250
10 mL Serological Pipette Sigma-Aldrich SIAL1100
DNA lobind tubes Eppendorf 30108051
Cold Centrifuge 5810 R Eppendorf EP022628188 for 50 mL tubes
Orbital Shaking Incubator Ratek OM11
Frezco 17 Microcentrifuge Thermofisher Scientific 75002402
Eppendorf DNA lo-bind tubes Merck/Sigma-Aldrich EP0030108051
Eppendorf® Protein LoBind tubes Merck/Sigma-Aldrich EP0030108116
SW 41 Ti Swinging bucket rotor Beckman-Coulter 331362
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L Thermofisher Scientific 51026282
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe BD Medical 328822
3 mL syringe with Luer Lok tip BD Medical 302113
25 G x 16 mm Hypodermic Needle Terumo TUAN2516R1

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References

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Janapala, Y., Woodward, K., Lee, J., Rug, M., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (178), e62639, doi:10.3791/62639 (2021).

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