Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Snabb in vivo-fixering och isolering av translationella komplex från eukaryota celler

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62639
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1,3, 1
1Division of Genome Sciences and Cancer, The John Curtin School of Medical Research, The Australian National University, 2Centre for Advanced Microscopy, The Australian National University, 3Victor Chang Cardiac Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar en teknik för att snabbt stabilisera translationella (protein biosyntes) komplex med formaldehyd tvärbindning i levande jäst och däggdjursceller. Metoden gör det möjligt att dissekera transienta intermediärer och dynamiska RNA:proteininteraktioner. De tvärlänkade komplexen kan användas i flera nedströms program, till exempel i djup sekvenseringsbaserade profileringsmetoder, mikroskopi och masspektrometri.

Abstract

Snabba svar som involverar snabb omfördelning av messenger(m)RNA och ändringar av mRNA översättning är relevanta för pågående homeostatic justeringar av cellerna. Dessa justeringar är avgörande för eukaryota cellöverlivbarhet och "skadekontroll" under fluktuerande närings- och salthaltsnivåer, temperatur och olika kemiska och strålningsspänningar. Tack vare den högt dynamiska naturen av RNA-jämna svar, och instabiliteten av många av RNA:RNAEN och RNA:proteininteriärerna, erhålla en meningsfull ögonblicksbild av cytoplasmic RNAen påstår är endast möjligheten med ett inskränkt numrerar av metoder. Transkriptomomfattande, RNA-seq-baserade ribosomprofileringsexperiment är bland de mest informativa källorna till data för kontroll av översättning. Avsaknad av ett enhetligt RNA och RNA:protein mellanliggande stabilisering kan dock leda till olika fördomar, särskilt i de snabba cellulära svarsvägarna. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för snabb fixering tillämpligt på eukaryota celler av olika permeabilitet, för att hjälpa till i RNA och RNA:protein mellanliggande stabilisering. Vi ger ytterligare exempel på isolering av stabiliserade RNA: protein komplex baserat på deras co-sedimentation med ribosomal och poly (ribo)somal fraktioner. Det separerade stabiliserade materialet kan därefter användas som en del av ribosomprofileringsexperiment, till exempel i TCP-seq-metoden (Translation Complex Profile sekvensering) och dess derivat. Mångsidigheten hos TCP-seq-stilmetoderna har nu visats av applikationerna i en mängd olika organismer och celltyper. De stabiliserade komplexen kan också dessutom affinitetrenas och avbildas med hjälp av elektronmikroskopi, separeras i olika poly(ribo)somala fraktioner och utsättas för RNA-sekvensering, på grund av hur lätt tvärlänkåterföringen är. Därför kan metoder baserade på snap-kylning och formaldehydfixering, följt av sedimenteringsbaserad eller annan typ av RNA:proteinkomplex berikning, vara av särskilt intresse för att undersöka finare detaljer om snabb RNA:proteinkomplex dynamik i levande celler.

Introduction

Levande organismer är föremål för dynamiska intra- och extracellulära förändringar under hela sin livslängd, vilket kräver snabba svar för att upprätthålla homeostas och säkerställa överlevnad. För att möjliggöra miljöanpassning justerar eukaryota celler sin ämnesomsättning via genuttryckskontroll. Genuttryckskontroll kan utövas under transkription och/eller översättning; med translationella svar som i allmänhet förekommer snabbare1,2,3,4. Till exempel uppstår translationella förändringar vanligtvis inom 1-30 minuter från stressutbrottet, medan förändringar på transkriptionsnivå följer timmar efter stressexponering3,4,5. Ändringar av översättningsutmatningen uppnås snabbare på grund av den ihållande tillgången på budbärarmolekyler (m)RNA i cytoplasma. Omvänt, på transkriptionsnivå, måste nya mRNA-molekyler syntetiseras, och i eukaryoter, bearbetas och exporteras från kärnan, vilket ger omfattande förseningar i svarstiden2,4,6,7,8.

Akut translationellt svar på stress kännetecknas i allmänhet av en övergripande minskning av översättningsproduktionen, med selektiv uppreglering av proteiner som är nödvändiga för cellens överlevnad1,3,4,9. Att minska produktionen av protein anses vara avgörande på grund av de höga energikostnaderna för processen3,7. För att underlätta selektiv hämning och uppreglering betjänas translationella svar av en rad komplexa regleringsmekanismer. Reglering kan utövas i alla översättningsfaser: initiering, förlängning, upphörande av polypeptidbiosyntes och ribosomal återvinning10,11,12,13, men ställs starkast ut i inledningsfasen5,7,9,10,13. Under initieringen binder den lilla ribosomala underenheten (SSU), assisterad av eukaryota initieringsfaktorer (eIF), till och skannar 5' oöversatta regionen (UTR) av mRNA tills en startkodon känns igen2,5,6,8,11,12,13. Regleringsmekanismer riktar sig ofta mot eTI:er som påverkar bifogade filer, skanning och start av kodonigenkänning. Initieringsfaktorn eIF2, en väsentlig översättningsfaktor som bidrar till rekryteringen av en initiativtagare Met-tRNAiMet SSU, ofta är inriktad på eukaryoter under stressförhållanden4,6,11. I jäst kan fosforylering av denna faktor induceras under näringsbrist och osmotisk stress1,4,11,14,15, och i däggdjursceller, aminosyrasvält, endoplasmisk retikulum (ER), UV-stress, virusinfektion och förändrade syrenivåer kan utlösa detta svar8,9,11. Snabb uppreglering av specifika mRNA översättning är uppenbart i däggdjur cellen svar på hypoxi, som uppvisar en global snabb översättning hämning och selektiv uppreglering av hypoxi-inducible faktorer (HIFs) biosyntes. HIFs är transkriptionsfaktorer, som sedan framkallar mer långsiktig cellulär omprogrammering på DNA-transkriptionsnivå8,9,16. Liknande svar har observerats hos jäst under värmestress, med snabbt translationellt uttryck av värmechockproteiner (HSP) följt av fördröjda transkriptionssvar17,18. Förutom näringsbrist och värmechock har translationella reaktioner i jäst studerats under varierande syre8,19salinitet5, fosfat, svavel20,21 och kväve22,23 Nivåer. Denna forskning har omfattande konsekvenser för den industriella användningen av jäst, såsom bakning och jäsning24,25. Translationella svar kan också vara avgörande för att främja förståelsen av sjukdomar som neurodegenerativa sjukdomar och hjärtsjukdomar, som kännetecknas av intracellulära påfrestningar som oxidativ stress. Sammantaget är translationella svar integrerade i genuttryckskontrollen och underlättar snabb anpassning till ett brett spektrum av stressförhållanden i eukaryota organismer.

För att studera translationella svar krävs metoder som ger minimalt förvrängda ögonblicksbilder av översättningslandskapet. Polysomprofilering är ett klassiskt tillvägagångssätt som används vid studier av översättning över mRNA, som inbegriper separation av poly(ribo)somala fraktioner av mRNA via ultracentrifugation genom sackaros gradienter26,27. Metoden kan användas för att utforska översättningsnivåer för enskilda mRNAs (med detektionsmetoder som omvänd transkription och polymeraskedjereaktion, RT-PCR26), eller globalt i kombination med höggenomströmningstekniker (mikroarray eller RNA-seq28,29). Ett mer utvecklat tillvägagångssätt är ribosomprofilering, som gör det möjligt att studera positioner av långsträckta ribosomer längs en mRNA-molekyl i en genomomfattande skala, liksom slutsatsen av effektiviteten av översättning över transkriptom och användning av de viktigaste och alternativa startplatserna30,31. Ribosom profilering innebär isolering och sekvensering av mRNA fragment skyddas av ribosomal närvaro över dem. Ribosomprofilering har gett betydande inblick i översättningsdynamiken under ett antal förhållanden, inklusive hypoxisk stress, värmechock och oxidativ stress31,32. Tekniken har anpassats till flera källmaterialtyper, inklusive jäst och däggdjursceller.

Medan polysom- och ribosomprofilering har varit grundläggande för att utöka förmågan till forskning inom översättning, innehåller översättningsprocessen olika translationella intermediärer och komplex som är svåra att fånga med dessa metoder11,13. En ytterligare begränsning härrör från bristen på förmåga att studera snabbsvarstyper, eftersom translationella komplex antingen stabiliseras in vivo genom tillsats av specifika översättningshämmare (antibiotika), vilket leder till vissa ribosomfördelningsartefakter, eller ex vivo på celllys specifikt (antibiotika) eller ospecificerat (höga salt- eller magnesiumjoner), vilket leder till berövande av de kortare eller mindre stabila intermediärerna33, 34,35.

Formaldehyd används ofta för att korslänka nukleinsyror och proteiner, såsom i kromatinimmunprecipitation (ChIP) och korslänkande immunoprecipitation (CLIP) studier. Dess lilla storlek och utmärkta cellgenomsläpplighet möjliggör en snabb in vivo-åtgärd 36. Baserat på den snabba korslänkningen av formaldehyd har ribosomprofileringsmetoden utökats med translation komplex profilsekvensering (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, som först utvecklades i jäst, gör det möjligt att fånga alla översättningsmediärer, inklusive skannings- eller efterterminering av SSU-komplex och flera ribosomkonfigurationer37,38,41,42. Metoden har använts i flera studier10,38,39,41,42, varav några använder en kombinatorisk metod av både översättningshämmare och formaldehydkorslänkning för att underlätta gripandet av översättning. En ytterligare modifierad version av tekniken, selektiv TCP-seq39, har nyligen använts för att inkludera immunspurifiering av de tvärbundna komplexen, vilket breddar omfattningen av TCP-seq-applikationerna. Den snabba, effektiva och reversibla karaktären hos formaldehydkrysslänkning gör dessa metoder lämpliga för att studera transienta mRNA: översättning komplexa interaktioner, särskilt i samband med mycket dynamiska översättning-nivå svarsvägar.

Här beskriver vi processerna för in vivo formaldehyd tvärbindning i syfte att omfattande översättning komplex stabilisering och isolering. Vi tillhandahåller separata protokoll nyanserade för jäst och däggdjursceller (figur 1). Vi beskriver vidare exempel på den efterföljande användningen av det tvärlänkstabiliserade materialet (figur 1), såsom för samrenad proteinfaktordetektering med immunoblotting (western-blotting), immunassisterad rening (eller "immunoprecipitation"; IP) och anrikning av translationella komplex som innehåller specifika intressefaktorer, elektronmikroskopi och RNA-sekvensering.

Figure 1
Bild 1: Schematisk som visar en översikt över den typiska experimentella installationen. Huvudstegen för in vivo-formaldehydstabilisering av translationella komplex beskrivs som ett flödesschema, kompletterat med information om de viktigaste nödvändiga instrumenten. Potentiella nedströmsapplikationer av det tvärbundna materialet beskrivs, inklusive exempel som framgångsrikt har använts men inte direkt omfattas av detta protokoll, såsom SPRI-pärlarening av RNA, RNA-sekvensering och masspektrometri. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Protocol

1. Jästcellsprotokoll

  1. Jästcellskultur och fixering
    OBS: Cellfixering och skörd är anpassade från10,38med modifieringar.
    1. Ställ in 1 L jästcellskultur (vild typ (WT) BY4741 anges som exempel) i en orbital shaker med startoptisk densitet på högst 0,05 AU vid 600 nm (OD600)i lämpligt medium (1% w/v jästextrakt, 2% w/v pepton, 2% w/v dextrose (glukos), 40 mg/L av jästextrakt, 2% w/v pepton, 2% w/v dextros (glukos), 40 mg/L av jästextrakt, 2% v pepton, 2% w/v dextros (glukos), 40 mg/L av jästextrakt, 2% v pepton, 2% w/v av dextros (glukos), 40 mg/L av adeninsulfat (40 mg/L av adeninsulfat) experiment).
    2. Sätt upp en preparativ centrifug med kompatibla rotor- och centrifugflaskor för pelletering av jästcellernas vätskefjädringskultur. För glukossvältexperiment, pellet cellerna när den optiska densiteten på 0,6-0,8 AU vid 600 nm (OD600) uppnås, med en kort centrifugering vid 30 °C, 5 000 x g i 1 min.
      OBS: Håll register över de växande cellernas OD och låt cellerna växa tills OD600 når 0,6-0,8 AU, om den exponentiella tillväxtfasen är av intresse.
    3. Återanvänd pelleten omedelbart i varma (30 °C) YP-medier som inte innehåller någon eller låg (0,25% w/v) tillsatt glukos och inkuberar kulturen i ytterligare 10 min vid 30 °C i en orbital shaker-incubator.
      Obs: Mediesammansättning kan påverka efterföljande korslänkningseffektivitet. Det här protokollet testades endast med YPD. När du utför svältexperiment är det viktigt att hålla sig till tidpunkten och minimera förseningarna mellan procedurerna.
    4. När cellerna är klara sätter du upp en islåda inuti rökhuven med en bägare som innehåller 250 g ren krossad vattenis. Se till att 25 ml stripetter och nyinköpta metanolstabiliserade 37% w/v formaldehydlösning är tillgängliga inuti huven. Häll 1 L-kulturen i bägaren som innehåller 25% w/v krossad vattenis.
      OBS: Håll cellerna på is under alla efterföljande operationer tills cellerna är frysta, om inte annat anges.
    5. Tillsätt 75 ml 37 % w/v formaldehydlösning till en slutlig koncentration på 2,2 % v och rör intensivt om blandningen tills isen smälter.
    6. När isen har smält, sätt upp en timer i 10 min.
      OBS: Följ de rekommenderade tidpunkterna och temperaturregimen för att uppnå reproducerbara fixeringsresultat.
    7. Efter inkubation i 10 minuter överför du kulturen till de förkylda centrifugflaskorna och pellet cellerna genom centrifugering vid 4 °C, 5 000 x g i 5 min. Medan denna spinn är på, förkyl ett 50 ml rör och håll nyberedd buffert A (innehållande glycin för att neutralisera eventuell återstående formaldehyd) på is.
      OBS: Se den medföljande tabellen för de exakta buffertkompositionerna.
    8. Efter centrifugering placerar du centrifugrören på is med pelletssidan i kontakt med isen. Ta in rören i rökhuven och kasta supernatanten i en behållare för formaldehydavfall.
    9. Återanvänd cellpelleten från alla rör i 20 ml buffert A med en 25 ml stripette och överför till ett 50 ml-rör.
      OBS: Denna tvätt är avgörande för att undvika irreproduktiv tvärbindning och bufferttillskottet får inte överstiga 20 minuters tid från cellernas skörd.
    10. Gör volymen upp till 40 ml med buffert A och samla upp de tvättade cellerna genom centrifugering vid 4 °C, 5 000 x g i 5 minuter.
    11. Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i 40 ml buffert A1, som är buffert A som inte innehåller glycin, för att avlägsna eventuell glycinförorening.
    12. Pelletceller igen genom centrifugering vid 4 °C, 5 000 x g i 5 min.
    13. Upprepa tvättarna med buffert A1 en gång till. Kassera supernatanten och placera cellpelleten på is. Väg röret med pelleten (våtcellsmassan ska vara ~1 g per 1 L av cellkulturen).
  2. Störningar i jästceller och cytosolsamling
    1. Fyll en polystyrenskumlåda fodrad med aluminiumfolie med flytande kväve till ett djup av ca 3 cm. Placera ett 50 ml-rör upprätt i lådan.
    2. Återutnyttja pelleten (~1 g våtcellsmassa) i 550 μL buffert A2 genom pipettering och virvel i 10 s. Tillsätt 10 μL RNase-hämmare och virvel igen i 10 s.
      VARNING: Använd lämplig skyddsutrustning, t.ex. värmeisolerade handskar, vid hantering av flytande kväve. Se till att alla behållare som används för att hålla flytande kväve inte läcker och att rörstället inuti inte flyter upp eller faller på sidan. Arbeta i ett välventilerat område för att undvika syrebrist.
    3. Droppa cellupphängningen i 50 ml-röret som innehåller det flytande kvävet med hjälp av en 1 ml-pipett.
      OBS: Droppandet måste utföras långsamt och försiktigt för att undvika aggregering av dropparna. Se till att dropparna fryser innan nya droppar introduceras.
    4. Överför 50 ml-röret med de frusna cellfjädringsdropparna till rumstemperatur och vänta tills det flytande kvävet avdunstar helt. Försegla röret med dess lock och förvara cellpelletsen vid -80 °C eller fortsätt omedelbart vidare.
      VARNING: Se till att det flytande kvävet avdunstas helt innan du förseglar röret. Överblivet flytande kväve i ett förseglat rör kan orsaka en risk för tryckuppbyggnad.
    5. För att förbereda dig för nästa steg, förkyl 1,5 mL nukleasfria rör och 10 ml slipburkar i rostfritt stål på torris.
    6. Överför de frysta cellfjädringsdropparna i burkarna med en ren, steril spatel.
      VARNING: Se till att slipknorna är ordentligt förseglade.
    7. Doppa slipk burkarna i det flytande kvävet i 1 min och se till att vätskefasen förblir under korsningen. Sätt upp en kryoblandare på 27 Hz för omrörning i 1 min.
      OBS: Balansera alltid slipbehållaren med en annan av samma modell även om provet endast kräver en behållare för bearbetning.
    8. Omrör de förseglade slipkanorna vid 27 Hz i 1 min i blandarkvarnen.
    9. Kyl slipkanorna i flytande kväve som tidigare och skaka vid 27 Hz i 1 min längre fram i blandarbruket.
    10. Överför burkarna till islådan som innehåller torris tillsammans med de 1,5 mL nukleasfria rören. Med hjälp av en liten stålspatel överför du det resulterande pulverprovet till rören i ~100 mg alikvoter och förvara rören vid -80 °C.
      OBS: Det rekommenderas att använda ~ 600 mg av provet per experiment som omfattar polysom sedimenteringsprofilanalys, separation av cytosolen i översatta och icke-översatta fraktioner och ytterligare separation av den översatta fraktionen i SSU, ribosom och disome fraktioner på RNase matsmältning.
  3. Separation av de fasta (poly)ribosomkomplexen från de icke-översatta fraktionerna av cytosolen
    OBS: Det förfarande som fastställdes tidigare10,38följs i allmänhet för att berika översatt RNA baserat på dess samsededimentation med (poly)ribosomer. Ett mer raffinerat tillvägagångssätt för att separera de översatta och icke-översatta cytosolfraktionerna introduceras här, vilket eliminerar behovet av att fälla ut och därefter återsupna materialet.
    1. Förbered 2,5 ml linjära 10-20% w/v sackarosgradienter med buffert B med frys-tina-metoden43 i tunna vägg ultracentrifugerör (5 mL, 13 x 51 mm).
      OBS: Frys-tina-metoden utförs genom sekventiell tillsats och frysning av buffrade sackarosskikt med linjärt regresserande koncentrationer ovanpå varandra. Mer information finns i tilläggstabell 1.
    2. För att skapa en diskontinueringskudde på 50 % med sackaros, vid de linjära gradienterna som tinar och stabiliseras, doserar du långsamt 0,5 ml 50 % sackaros i buffert B direkt på botten av rören med en 1 ml-spruta fäst vid 19 G x 1,5" nål eller en kapillär av liknande/lämpliga dimensioner. Innan du doserar, kör försiktigt och långsamt spetsen på nålen eller kapillären från toppen till botten av de förformade sackarosgradienterna och undvik störningar tills den når rörbotten.
      OBS: Se kompletterande tabell 1 för instruktioner om beredning av buffert B.
    3. Balansera lutningarna noggrant genom att ta bort de övre delarna eller lägga mer 10 w/v sackaros i buffert B och hålla dem iskalla eller vid 4 °C.
      OBS: Den diskontinuerliga lutningen med det nedre 50% sackarosskiktet behövs för att samla material med högre sedimenteringshastighet utan att fälla ut det på rörväggen.
    4. Tina ~100 mg av det frysta cellpulverprovet vid rumstemperatur och lägg omedelbart på is. Blanda i 150 μL buffert A2 genom pipettering, tillsätt RNase-hämmaren till 1 U/μL och blanda genom virvel (undvik överdriven skumning och blandning med gasformfasen) i 10 s.
      OBS: Fortsätt all verksamhet samtidigt som materialet hålls på is, om inget annat anges.
    5. Pellet cellresterna genom att centrifugera rören vid 4 °C, 13 000 x g i 5 minuter och återvinn det klarnade supernatanten (~150 μL) i ett nytt 1,5 ml lågproteinbindningsrör.
    6. Ladda den resulterande klarnade blandningen på de diskontinuerade sackaros gradientrören från steg 1.3.3 och balansera dem noggrant.
    7. Ultracentrifuge rören i en medelvolym svängskopa rotor vid 4 °C, med genomsnittlig g-kraft 287,980 x g (k-faktor 49) för 1 h 30 min.
      OBS: Dessa villkor har föroptimerats (med hjälp av UV-absorbansanalys efter ultracentrifugation) för att behålla den fria (icke-(poly)ribosomala) SSUs och LSUs (stor ribosomal underenhet) i den övre (10%-20% sackaros) delen av gradienten samtidigt som (poly)ribosomal fraktionen koncentreras i botten (50%) sackaroskudde utan pelletering av materialet.
    8. Använd en ny steril 1 ml-spruta utrustad med en 19 G x 1,5" nål för att samla den översatta cytosolfraktionen. Placera 5 mL-lutningen på ett stabilt rack så att rörets botten är synlig.
    9. Från toppen av röret, stick nålen rakt in i botten av lutningen (utan att punktera röret) och försiktigt, utan att skapa några bubblor, rita exakt 0,5 ml av bottenlösningen som innehåller den översatta RNA-poolen.
      OBS: Se till att detta steg utförs i ett kallt rum och röret hålls fast. Det rekommenderas att dra hela 0,5 ml i en enda upstroke rörelse för att undvika störningar i lutningen.
    10. Bekräfta (poly)ribosomernas närvaro och utarmningen av SSU, LSU och lättare fraktioner i den resulterande blandningen genom absorbansavläsning av sackarogradienten vid ultracentrifugationskörning.
    11. Koncentrera den insamlade översatta RNA-poolen från föregående steg till 100 μL med ultrafiltrering i en mikrokoncentrationsanordning med 10 kDa cut-off regenererat cellulosamembran.
      OBS: Förtvätta mikrokoncentrationsanordningens membran med 0,5 ml buffert 1 (se figur 2a)och använd spinnförhållanden(g)som rekommenderas av tillverkaren.
    12. Späd ut materialet ytterligare från föregående steg fem gånger (tillsätt 400 μL) med buffert 1 och koncentrera tillbaka till 200 μL, för att möjliggöra en mindre volym samt delvis avlägsnande av sackaroset.
      OBS: Det rekommenderas att lagra de resulterande blandningarna vid -80 °C i upp till 6 månader och använda som inmatningsmaterial för den "totala översatta RNA" RNA-seq bibliotekskonstruktionen, eller RNase matsmältningssteget i TCP-seq-bibliotekskonstruktionen. Den "icke-översatta" cytosolfraktionen kan återvinnas från toppen av gradienten med hjälp av ett liknande förfarande och lagras vid -80 °C.
  4. RNase matsmältning av de fasta (poly)ribosomala komplexen och separation av smält material i små ribosomal underenhet (SSU), monoribosomal (ribosomer, RS) och diribosomala (disomer, DS) fraktioner
    OBS: Förfarandet följer i allmänhet ett tillvägagångssätt som beskrivits tidigare10,38men en modifierad gradienttyp, separationstid, acceleration och RNase matsmältningsförhållanden används för att uppnå bästa upplösning över alla tre isolerade fraktioner.
    1. Förbered noggrant balanserade linjära 10-40% w/v sackaros gradienter gjorda med buffert 1 på 13 ml tunna väggpolypropylenrör, 14 x 89 mm, med hjälp av frys-tina-metoden43 enligt beskrivningen i steg 1.3.1 och notera däri.
    2. Tina vid rumstemperatur och överför omedelbart proverna på is eller ta den koncentrerade och sackarosfattiga översatta cytosolfraktionen från steg 1.3.12.
      OBS: Fortsätt alla procedurer på is om inget annat anges.
    3. Smält den översatta cytosolfraktionen genom att blanda i 4,5 U E. coli RNase I per 1 OD260-enhet av fraktionen i 30 min vid 23 °C. Tillsätt och blanda omedelbart genom pipettering av RNase-hämmaren som kan inaktivera RNase I till 0,25 U/μL till blandningen, för att inaktivera RNase I.
      OBS: Använd RNase-hämmare som kan hämma RNase I. Härleda AU260 med hjälp av AU260 = (Absorbans vid 260 nm standardiserad till optisk densitetsenheter motsvarande 1 cm optisk bana x volym av lysat i μL) / 1 000.
    4. Överför omedelbart proverna till is.
      VARNING: Det är viktigt att följa de rekommenderade matsmältningsförhållandena och noggrant mäta mängden tillsatt RNase I. Den RNase I-enhet som avses här definieras som den mängd enzym som krävs för att producera 1 μg syralösligt material från muslever-RNA på 30 minuter vid 37 °C. RNase I-partier kan ha odokumenterade variationer i aktivitet och kan kräva experiment för att uppnå optimala matsmältningsförhållanden. Om enzymlagret är för koncentrerat rekommenderas att späda det med buffert 1 för att undvika pipettering av mycket små volymer av lösningen.
    5. Ladda reaktionsblandningarna på 10-40% w/v sackarosgradienterna från steg 1.4.1.
      OBS: Använd slutvolymer i intervallet 150-300 μL per lutning. Varje rening kräver minimalt två gradienter. Använd olika inmatningsvolymer av materialet (lägre AU260, 10-11 AU260, för DS och jämförelsevis högre AU260, 13-14 AU260, för SSU eller RS) för att uppnå optimal separation.
    6. Ultracentrifuge rören i en medelvolym svängskopa rotor vid 4 °C med genomsnittlig g-kraft 178,305 x g (k-faktor 143,9) för 3 h 30 min.
      VARNING: Om reservbalansrör behövs, utjämna deras massa och massfördelning med de provhaltiga rören. Använd extra sackarosgradienter överdragna med en mängd buffert som motsvarar den för provöverlägget och inte rör med enhetlig sackaroskoncentration.
    7. Sätt upp en gradientfraktionatorenhet minst 30 min innan ultracentrifugationspinn slutförs, inklusive fyllning av den 0,2 μm filtrerade tunga jaktlösningen (t.ex. 60% sackaros i avjoniserat vatten som används här) i deplacementpumpen.
      OBS: Det rekommenderas att avkontaminera fraktionatorns linjer och slangar med avjoniserat vatten, följt av 1%-2% SDS-lösning i avjoniserat vatten, avjoniserat vatten och slutligen 80% etanol i avjoniserad vattenlösning före och efter körningarna.
    8. Justera avläsningsbaslinjen för absorbans genom att först fylla systemet med avjoniserat vatten och nollställa optiken enligt tillverkarens rekommendationer och sedan kompensera baslinjeskiftet med hjälp av en extra lossad sackarosgradient på 14 x 89 mm gjord med en buffert som är identisk med provrören (t.ex. buffert 1).
      OBS: Använd samma förskjutningshastighet för att göra justeringarna som för provläsningen, till exempel 1,5 ml/min.
    9. Mät förskjutningssystemets döda volym genom att noggrant räkna tiden mellan den lösning som först kommer in i detektorns optiska bana och först visas vid fraktionens uppsamlarutgång.
      OBS: Med den rekommenderade hastigheten på 1,5 ml/min kan fraktionering utföras vid rumstemperatur. Det rekommenderas att omedelbart överföra de insamlade fraktionerna på is.
    10. Utför fraktionering med levande absorbansavläsning vid 254 nm, 1,5 ml/min deplacementhastighet och in-line fraktiondetektering baserat på provernas förväntade sedimenteringsposition och absorbansprofil. Använd samlarrörsbrytare med en tidsfördröjning som motsvarar den döda volymen mätt tidigare.
    11. Isolera fraktioner som motsvarar SSU-, RS- och DS-komplexens positioner och rörlighet och samla dem i nya lågproteinbindningsrör på 1,5 ml mikrocentrifuge. överför omedelbart de isolerade fraktionerna på is och frys om de inte bearbetas ytterligare direkt.
      OBS: Det rekommenderas att omedelbart blixtfrysa de insamlade fraktionerna i torris eller flytande kväve och lagra vid -80 °C eller lägre i upp till 6 månader.
  5. Avkryssning av ribosomala komplex och isolering av RNA för att konstruera RNA-seq-bibliotek
    1. För att avblockera/vända tvärlänkarna och isolera RNA bort från de associerade proteinerna, överför ungefär hälften av hela sackarogradientfraktionerna till nya lågnkelsyrabindningskärnorfria polypropylen 1,5 mL mikrocentrifugerör (350 μL per rör) med locksäkerhets- och låsanordningar.
    2. Komplettera blandningarna med 40 μL 100% stopplösning (10% SDS med v och 100 mM EDTA), 4 μL 1 M Tris-HCl pH 2 vid 25 °C (till 10 mM), 1,6 μL 2,5 M glycin (till 10 mM) och avjoniserat nukleasfritt vatten för att erhålla den slutliga volymen av 40 m Glycin (till 10 mM) och avjoniserat nukleasfritt vatten för att erhålla den slutliga volymen av 40 m Glycin (till 10 mM) och avjoniserat nukleasfritt vatten för att erhålla den slutliga volymen av 40 m Glycin (till 10 mM) och avjoniserat nukleasfritt vatten.
    3. Blanda innehållet i rören genom pipettering och överför rören vid rumstemperatur.
    4. Tillsätt lika stor volym av den sura fenolblandningen:kloroform:isoamylalkohol 125:24:1 (pH 4,0-5,0) till varje rör. Skaka blandningarna kraftigt i 2 minuter med en virvelblandare inställd på maximal hastighet.
      VARNING: Fenol och kloroform är frätande och giftiga. Undvik fysisk kontakt med vätskorna och arbeta i ett välventilerat område eller under en rökhuv. Använd alltid handskar, labbrock och skyddsglasögon eller ansiktsskydd när du arbetar med fenol eller kloroform.
    5. Placera rören i en termosshaker och skaka kontinuerligt vid 65 °C, 1 400 varv/min i 30 minuter.
    6. Underlätta fasaggregering genom att centrifugera blandningen vid 12 000 x g i 10 min vid rumstemperatur.
    7. Samla de övre vattenfaserna och överför dem till färska lågnartikelsyrabindning 1,5 mL rör.
      OBS: Försök inte att återställa vattenfaserna helt för att undvika korskontaminering. En rimlig återvinningsvolym är 300-350 μL.
    8. Komplettera de insamlade vattenfaserna med 0,1 volymer 3 M natriumacetat (pH 5 vid 25 °C), 20 μg glykogen (med 5 μg/μL-lager) och 2,5 volymer absolut etanol. Blanda försiktigt lösningarna genom att virvla rören i 1 min.
    9. Fäll ut RNA genom att inkubera proverna vid -20 °C i minst 2 timmar (rekommenderas över natten).
    10. Värm rören till rumstemperatur och blanda genom att virvla.
      OBS: Förvärmning av rören och efterföljande centrifugering vid rumstemperatur (utan forcerad kylning) bidrar till att minska salt- och fenolsamutfällning och överföring. Dessa villkor bör inte leda till materialförlust eller ineffektivitet i RNA-insamlingen om den utförs enligt beskrivningen och använder tillräckligt ren etanol.
    11. Pellet RNA fälls ut genom att centrifugera rören vid 12 000 x g i 30 min vid rumstemperatur.
    12. Kassera supernatanten och tvätta pelleten två gånger med 80% v/v etanol, samla den varje gång genom centrifugering vid 12 000 x g i 10 min vid rumstemperatur.
    13. Torka RNA-pelletsen genom att öppna rörlocken och placera de öppnade rören i en torrblocksvärmare inställd på 45 °C i 10 minuter. Lös upp den resulterande torkade pelleten i 20 μL 1x HE-buffert.
    14. Uppskatta den resulterande RNA-koncentrationen med hjälp av UV-absorbansspektrummätning.
      OBS: RNA-fragmentlängd och total mängd kan bedömas ytterligare med hjälp av denaturering av gelelektrofores, såsom i en automatiserad fluorescensbaserad kapillärgelelektroforesapparat.
  6. Selektiv samimmunpurifiering av SSU genom taggade eIF:er och western blot-analys av selektiv SSU-anrikning
    OBS: Använd ~15 AU (260 nm) av den smälta och sedimenteringssegregerade SSU-fraktionen från steg 1.4.11 för att utföra affinitetsrening med magnetiska IgG-pärlor. Spara ~5% av SSU-fraktionen som inmatningskontroll (Inmatningsfraktion, I). eIF4A-märkt (TIF1-TAP; Tandem Affinity Purification tag) jäststam användes vilket också gör det möjligt att detektera eIF4A genom att söka efter TAP-taggen med anti-TAP-antikropp.
    1. Överför 100 μL magnetisk IgG pärlor suspension (1 mg av pärlor användes för varje 15 AU (260 nm) av lysat eller fraktionen) till ett nytt lågt protein bindande 1,5 ml rör; samla pärlor med hjälp av magnetiskt rack och aspirera dem.
    2. Tvätta de magnetiska pärlorna två gånger med 1 ml buffert 1 genom att använda sekventiell resuspension genom pipettering och uppsamling med hjälp av magnetstället.
    3. Efter tvätt, samla och dekantera pärlorna, samtidigt som de hålls på magnetstället.
    4. Tillsätt SSU-fraktionen till de tvättade pärlorna och inkubera blandningen i 4 timmar med rotation vid 4 °C i en cyklomixer inställd på ~ 20 rpm.
    5. Samla pärlorna med magnetstället vid 4 °C och spara supernatanten (Flow-through fraction, FT).
    6. Tvätta pärlorna två gånger vid 4 °C med buffert 1 kompletterad med 4 mM DTT, rotera varje gång i 10 min i cyklomixern och samla och dekantera pärlorna på magnetstället. Spara tvättarna (W1- och W2-fraktioner).
    7. För en analytisk tillämpning som western blotting, elute det bundna materialet under denaturering och minskning av förhållanden genom att tillsätta LDS (litium dodecylsulfat) polyakrylamid gel elektrofores (PAGE) provbuffert med pH 8,5 till 1x och DTT till 2 mM.
    8. Värm blandningen vid 95 °C i 5 minuter i ett termiskt block för att slutföra elutionen.
    9. Samla pärlorna med hjälp av magnetstället och återvinn denaturerade eluat (E-fraktionen) i ett färskt lågproteinbindningsrör på 1,5 mL mikrocentrifuge.
    10. Använd E-fraktionen från föregående steg för att köra en denaturerande SDS-sida (Denaturing sodium dodecyl sulfate) eller lagra E-fraktionen vid -20 °C.
      OBS: För en preparativ samling av TAP-tag-berikade translationella komplex för alla efterföljande tillämpningar, använd en alternativ elueringsmetod som använder Tobacco Etch Virus (TEV) proteas. Mer information finns i tilläggstabell 1.
    11. För att koncentrera de utspädda FT-, W1- och W2-fraktionerna fäller du ut materialet genom att tillsätta 3x volymer iskall aceton. Inkubera prov-acetonblandningen vid -20 °C i 3 timmar.
    12. Pellet fäll ut fällningen genom att centrifugera rören vid 13 000 x g i 10 min vid 4 °C.
    13. Kassera supernatanten och lufttorka pelleten i de öppna rören vid rumstemperatur i 30 min.
    14. Lös upp pelleten i 7 μL 1x LDS-lastbuffert kompletterad med 2 mM DTT. Värm proverna i ett termiskt block inställt på 95 °C i 5 minuter.
    15. Ladda alla I-, FT-, W1-, W2- och E-prover på en 4-12% v akrylamidgradient, Bis-Tris polyakrylamid denatureringsgel. Kör gelén med 1x MES SDS (2- [N-mopholino]etanesulfonsyra, natrium dodecylsulfat) som löper buffert vid 80 V, tills proteinmarkören (10-250 kDa) löser sig väl och blyfärgämnet når gelens botten.
      OBS: Det rekommenderas att du belastar seriella utspädningar av WCL (helcellslylyst) (2-10 μg) på gelén som en kontroll. Det kan ta flera försök att uppnå jämförbar belastning av gelén över fraktionsmaterialet.
    16. Överför proteinhalten i gelén till ett polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) genom våtöverföringsmetod vid 100 V för 1 h i ett kallt rum som rekommenderas av tillverkaren av västerländsk utrustning.
    17. Blockera membranet med en lämplig blockeringsbuffert (Fosfatbuffrad saltlösning baserad) vid rumstemperatur i 1 h under konstant skakning.
    18. Efter tillverkarens anvisningar för antikroppsutspädning, sondera membranet med anti-TAP-antikropp för att detektera det taggade eIF4A-proteinet, anti-Pab1p-antikroppen eller anti-β-aktinantikropp (eller något annat önskvärt mål) genom inkubation av membranet över natten med PBS-utspädd antikropp (1:1 000 utspädning) i en cyklomixer i ett kallt rum.
      OBS: 1:1 000 antikroppsutspädnings är en bra utgångspunkt.
    19. Tvätta membranet tre gånger med 1x fosfatbuffrad saltlösning, 0,2% v/v Interpolering 20 (PBST) i 10 min vardera.
    20. Undersök membranet med fluorescerande märkta sekundära antikroppar enligt tillverkarens instruktioner genom att inkubera i en cyklomixer vid rumstemperatur i 1 h.
      OBS: 1:20 000 antikroppsutspädnings är en bra utgångspunkt.
    21. Tvätta membranet tre gånger med 1x PBST i 10 min vardera. Skölj försiktigt membranet med avjoniserat vatten och sedan med absolut metanol. Torka och visualisera membranet i ett fluorescerande bildsystem enligt tillverkarens instruktioner.
      OBS: Färgning för andra proteiner kan uppnås genom att använda sekundära antikroppar med färgämnen som matchar olika fluorescerande kanaler (t.ex. i eIF4A-TAP jämfört med β-aktinparet som används här), genom att sekventiell färgning eller strippning och färgning av samma membran eller skär membranet från en gel laddad med upprepande mönster av fraktioner och separat sondering av varje bit med respektive antikroppar (som i Pab1p-exemplet som används här).

2. Däggdjurscellprotokoll

  1. Däggdjurscellskultur och fixering
    1. I 2 T-175-flaskor odlar du HEK293-celler till 60-70% sammanflöde i Dulbeccos Modified Eagle Medium och 10% v/v Fetal Bovine Serum vid 37 °C och 5% v/v koldioxid.
      OBS: Det kompletta mediet görs genom att tillsätta 55 ml kommersiell FBS i en 500 ml kommersiellt inköpt DMEM med hög glukos, innehållande L-glutamin, fenolrött och natriumbikarbonat, men ingen HEPES eller natriumbåluvat. Cellantal per T-175-kolv vid 70 % sammanflöde bör ligga inom intervallet 1,7-2,0 x 107.
    2. Minst 3 h före önskad fixeringstid, byt ut T-175-kolvarnas media med exakt 30 ml förvärmt helmedium och byt ut kolvarna i en cellinkubator.
      OBS: Se till att det färska mediet är pipetted på motsatt sida av kolven till cellmonolagret för att undvika cellavlossning. Försök att genomföra medieutbytet så snabbt som möjligt, vilket medför minimal gas- och temperaturbalansstörning.
    3. När cellmediet har bytts ut bereder du buffertar och kemikalier som krävs för fixering. Förbered Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) med 50 mM glycin genom att tillsätta 10,2 ml 2,5 M glycinbuljong till en 500 ml flaska DPBS och blandning.
    4. Förbered en flaska DMEM kompletterad med 10% FBS enligt steg 2.1.1 som ska användas under icke-sterila förhållanden och en 100 ml alikvot på 0,25% Trypsin-EDTA. Källa en extra flaska kommersiell DPBS förformulerad med kalciumklorid (CaCl2) och magnesiumklorid (MgCl2).
      OBS: Lösningarna kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor.
    5. Förbered en islåda till brädden med krossad vattenis så att en T-175-kolv kan passa jämnt ovanpå och hålla i rökhuven tillsammans med de beredda buffertarna, även på is.
      OBS: På grund av de snabba reaktionerna vid översättning av eventuella miljöförändringar måste alla tidpunkter mellan avlägsnandet av cellkolvarna från inkubatorn och tillsatsen av formaldehydlösningen minimeras.
    6. För att kyla cellerna, ta bort T-175-kolven från inkubatorn och tryck den ordentligt mot isen för att säkerställa maximal ytkontakt. Inuti den kemiska rökhuven, luta kolven på sidan så att mediet samlas på sidan mittemot cellerna. Pipett 168 μL 37% med v formaldehyd direkt i det poolade mediet (till en slutlig koncentration på 0,2% w/v). Blanda omedelbart genom att försiktigt gunga kolven fram och tillbaka, stäng och flytta kolven på is, se till att den är horisontell och cellerna är jämnt täckta.
      VARNING: Formaldehyd är ett skadligt ämne med potentiella långsiktiga biverkningar och även irriterande för både andningsorganen och huden. Den ska endast hanteras i en lämplig kemisk rökhuv. Behållare med formaldehyd måste alltid förseglas när de är utanför rökhuven.
      OBS: Se till att formaldehyden tillsätts direkt i cellmediet och inte till kolvväggen. Steg 2.1.6 bör ta mindre än 1 min.
    7. Inkubera kolvarna på is i ytterligare 10 min. Häll av mediet i en lämplig avfallsbehållare genom kolvsidan mittemot cellerna.
    8. Använd en stripette, pipetter i 30 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning utan kalcium- och magnesiumjoner och dessutom innehållande 50 mM glycin, försiktigt på sidan mittemot cellerna. Blanda genom att gunga kolven; förkolven i horisontellt läge och inkubera i 10 minuter mer på is.
    9. Häll av lösningen genom kolvsidan mittemot cellerna och tillsätt försiktigt 7 ml av standardlösningen 0,25 % w/v Trypsin-EDTA för att lossa och återanvända cellerna. Inkubera kolven vid rumstemperatur i 5-10 min.
      OBS: Se till att Trypsin-EDTA-lösningen täcker alla celler jämnt. Använd periodisk skonsam lutning och gungning för att främja cellavlossning.
    10. Flytta kolven vertikalt och använd en stripette samla de fristående cellerna genom att försiktigt tvätta eventuella återstående celler från kolvens väggar. Överför fjädringen till ett 50 ml-rör som ligger på is.
      OBS: Fasta celler kan bli bräckligare; rör inte intensivt eller mer än vad som krävs för att lossa cellerna från kolvväggen.
    11. Komplettera omedelbart den insamlade cellfjädringen med 20 ml komplett media (det icke-sterila iskalla mediet med 10% FBS) och blanda genom att försiktigt vända röret.
      OBS: Det kompletta cellodlingsmediet (inklusive 10% FBS) läggs till för att neutralisera trypsin, vilket förhindrar ytterligare skador på cellmembranen och cellupplösning.
    12. Pellet cellerna genom att centrifugera röret vid 100 x g i 5 min och 4 °C. Cellpelleten måste vara väl synlig.
    13. Häll av mediet och återanvänd försiktigt cellpelleten i 10 ml iskall DPBS med Ca2+, Mg2+och utan glycin.
    14. Upprepa steg 2.1.12.
    15. Häll av tvättbufferten och återanvänd försiktigt cellpelleten i 800 μL iskall DPBS med Ca2+, Mg2+, utan glycin, på is. Överför de återsuspenderade cellerna till ett nytt lågproteinbindningsrör på 1,5 mL mikrocentrifuge.
    16. Centrifugera röret vid 100 x g i 3 min och 4 °C. Kassera försiktigt supernatanten med en 1 mL pipettor. I detta skede kan cellpelleten frysas vid -80 °C eller fortsätta till celllyssteget.
      OBS: Fryst cellpellets kan lagras vid -80 °C upp till 1 år. Vi fann att cellpelletfrysning underlättar efterföljande lys och rekommenderar frysning även om långtidsförvaring inte planeras.
  2. Störningar i däggdjursceller och cytosolsamling
    1. Tillsätt 300 μL av lysbufferten baserat på icke-joniskt, icke-torterande rengöringsmedel och 7 μL 40 U/μL RNase-hämmare i ett biosäkerhetsskåp baserat på icke-joniskt, icke-torterande tvättmedel och 7 μL 40 U/μL RNase-hämmare. Blanda väl genom pipettering med en 1 mL-spets.
    2. Fäst försiktigt en 25 G nål på en 1-3 ml spruta och rör försiktigt blandningen, med minst sju långsamma uppåtgående intag och snabba nedåtriktade avgasslag.
    3. Kasta sprutan och nålen i en vass behållare och upprepa proceduren med en 0,3 ml spruta utrustad med en 31 G nål.
    4. Kasta sprutan och nålen i en vass behållare. Centrifugera rören vid 4 °C, 12 000 x g i 5 minuter för att pelletera cellskrotet.
    5. Överför supernatanten till ett nytt lågproteinbindningsrör på 1,5 mL mikrocentrifuge. Förvara både cellskräpet (för kontrolländamål) och den resulterande klargjorda celllyte vid -80 °C.
      OBS: Den optiska densiteten hos lysat varierar mellan 25-30 AU260 när två T-175-flaskor kombineras och de rekommenderade volymerna följs. Lysaterna och cellresterna kan förvaras vid -80 °C upp till 1 år.
  3. Separation av de fasta (poly)ribosomkomplexen från de icke-översatta fraktionerna av cytosolen
    1. Förbered linjära 15-45% w/v sackaros gradienter i 13 mL tunna väggpolypropylenrör, 14 x 89 mm, med frys-tina-metod i allmänhet enligt beskrivningen i steg 1.3.1 i jästprotokollet, men med hjälp av buffert 2(figur 2a).
      OBS: Tina lutningarna över natten i ett kallt rum vid 4 °C natten före fraktioneringen.
    2. Ladda 150-250 (maximalt 300) μL av cell lysate från föregående steg 2.2.5 på balanserade gradienter. Förvara den återstående lysat vid -80 °C och använd den för kontrolländamål.
      OBS: Här ges ett exempel på sedimenteringsbaserad segregering i polysomala, ribosomala och "fria" SSU-fraktioner. Se den tillhandahållna tilläggstabellen 1 för ett alternativt tillvägagångssätt.
    3. Ultracentrifuge rören i en medelvolym svängskopa rotor vid 4 °C, genomsnittlig g-kraft 178,305 x g (k-faktor 143,9) för 1 h 45 min.
    4. 30 min före spinnavslutet, ställ in och baslinje gradientfraktionatorn, enligt beskrivningen i jästprotokollet steg 1.4.7-1.4.9.
    5. Fraktionera gradienterna i allmänhet enligt beskrivningen i jästprotokollet steg 1.4.10-1.4.11.
      OBS: Detta steg kommer att separera polysomala, ribosomala och "fria" SSU-fraktioner. Polysomala fraktioner kan användas i polysomprofileringsexperiment.
    6. Överför omedelbart de insamlade fraktionerna på is och om de inte bearbetas vidare, förvara vid -80 °C upp till 6 månader.
      OBS: Om fraktionens byte av samlarrör synkroniseras med identifiering och segregering på radfraktion rekommenderar vi att du använder upp till 800 μL-fraktioner (insamlingstid på 32 s per fraktion vid 1,5 ml/min). Om fraktionering utförs utan att använda in-line absorbans avläsningen, rekommenderas att använda 250-500 μL fraktioner (10-20 s per fraktion vid 1,5 ml/min). Efter separation kan fraktionerna användas för immunspurifiering, elektronmikroskopi, denaturering AV PAGE och western blotting direkt, eller utsättas för tvärlänkåterföring för efterföljande RNA- och/eller proteomiska analyser.

Representative Results

Translationella komplex är känsliga för buffertarnas joniska sammansättning, vilket är särskilt viktigt under ultracentrifugation där sedimenteringsegenskaper bedöms. Vi testade således flera sedimenteringsbuffertar med klarnad lysate extraherad från mark icke-fast jästmaterial, för att välja villkor som är bäst lämpade för att lösa translationella komplex och separata ribosomala underenheter (SSU, LSU), monosomer (RS) och polysomer över gradienten. Alla buffertar baserades på kärnan sammansättning som innehåller 25 mM HEPES-KOH pH 7,6 och 2 mM DTT. Koncentrationerna av KCl, MgCl2,CaCl2och EDTA ändrades ytterligare över buffertarna(figur 2a), och dessa komponenter lades till lysat före gradientbelastning och sackarosgradientbuffertarna före gradientgjutning, i enlighet därmed.

I buffertarna 1 och 2 erhölls väl lösta translationella komplex. Buffert 1 resulterade i något bättre separation av de små ribosomala underenheterna (SSUs) (figur 2a). Omittance av MgCl2 och tillsats av EDTA (buffertarna 3,4) orsakade förlust av de höga sedimenteringsegenskaperna för de flesta polysomer och sannolikt deras partiella demontering (figur 2a). Medan tillägg av 2,5 mM CaCl2 resulterade i något mer homogena polysomala toppar, var förbättringen marginell och den totala mängden polysomalt material minskade i detta fall (figur 2a) jämfört med buffertarna 1 och 2. Vi valde alltså buffert 1 som valfri arbetsbuffert.

Figure 2
Figur 2: Buffertvillkor för translationell komplex extraktion och bedömning av fixeringens stabiliserande effekt. Visas är UV absorbansprofiler som samlats in vid 260 nm för den totala jästcell lysate separeras i 10%-40% w/v sackaros gradienter. a) Effekter av mono- och divalenta salter och magnesiumjonbindning på sedimentering av material som extraherats från icke-fasta jästceller. Röda och grå linjer representerar en typisk replikat. b,c) Jämförelse av lysater som härrör från icke-fast (grå linje), 2,2% (svart linje) och 4,4% (svart prickad linje) med v formaldehyd-fasta jästceller. (d) Stabilisering av polysomer med optimerad 0,2% w/v formaldehydfixering (svart streckad och prickad linje) av HEK 293T-celler, jämfört med materialet från samma icke-fasta celler (grå linje). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Vi kontrollerade därefter effekten av polysomal stabilisering genom fixering med olika formaldehyd koncentrationer. Med hjälp av i övrigt samma cellmaterial, buffertar, cellhantering och timingmetoder jämförde vi material som extraherats från icke-fasta celler och celler fixerade med 2,2% och 4% w/v formaldehyd(figur 2b, c). Vi fann att 2,2% w/v formaldehyd var bättre lämpat för fixering eftersom det utmärkt bevarade polysomerna som kan bedömas av polysom-till-monosomförhållandet (figur 2b), det minskade inte det totala utbytet av ribosomalmaterialet jämfört med 4% w /v formaldehyd, som uppvisade tydliga tecken på överfixering (figur 2c).

För det material som härrör från däggdjursceller användes buffert 2 (figur 2a)på grund av det större lysbuffert-till-cell-volymförhållandet som krävs för den tvättmedelsbaserade extraktionen. Detta gav upphov till välupplösta translationella komplex vid sedimentering i sackarogradienter (figur 2d). I synnerhet användes en mycket lägre koncentration av formaldehyd på 0, 2% w/v, eftersom högre koncentrationer resulterade i betydande polysomal och ribosomal materialförlust (data som inte visades). I likhet med resultaten som erhållits med jästceller visade korslänkstabiliserat material bättre bevarande av polysomerna och högre polysom-till-monosomförhållande(figur 2d).

Vi testade därefter om de valda formaldehyd fixering villkor är tillräckligt effektiva för att stabilisera aktivt översatt mRNA inom polysomal fraktioner som ett resultat av korslänkning, och den förbättrade polysomal avkastning är inte bara en följd av hämma enzym funktion och översättning förlängning progression. Vi använde EDTA och högt monovalent salt (KCl) för att destabilisera polysomer och ribosomer. Dessa reagenser lades till de klargjorda jästcell lysates, och ingår i alla efterföljande buffertar och sackaros gradienter ovanpå buffert 1 kompositionen, respektive.

15 mM EDTA uppvisade faktiskt en mindre destabiliseringseffekt på de polysomala fraktioner som härrör från de fasta cellerna (figur 3a), vilket bekräftar att de tvärbundna komplexen är mer robusta. De destabiliserande effekterna av EDTA kan övervinnas något genom att öka koncentrationen av formaldehyd, eftersom material från 4% w/v av formaldehyd-fasta celler motstås utvecklas bättre (figur 3a). Den ökande EDTA-koncentrationen till 50 mM resulterade dock i destabilisering av de flesta translationella komplex under både fasta och icke-fasta förhållanden, vilket kan härledas från den långsammare sedimenteringen av materialet och frånvaron av välformade toppar(figur 3b). Detta kan förklaras av den partiella utvecklingen av strukturer och övergripande förlust av kompaktitet, snarare än av fullständig dissociation av polysomala komponenter från mRNA. Även i detta fall har det tvärbundna materialet visat snabbare sedimentering (figur 3b).

Figure 3
Figur 3: Effekter av formaldehydfixering av in vivo-jäst på polysomernas stabilitet. Buffert 1 (se text och figur 2a) användes i alla experiment. Datatyp och intrigning enligt beskrivningen i figure 2-förklaringen. a)Jämförelse av tillsats av 15 mM EDTA till celllyktorerna och efterföljande buffertar på stabiliteten hos de polysomer som härrör från icke-fast (grå linje), 2,2 % (svart linje) och 4 % (svart prickad linje) med formaldehyd-fasta celler. b)samma som (a), men för tillsats av 50 mM EDTA och exklusive 4 % v formaldehyd-fasta celler. c)samma som (a), men för tillsats av 500 mM KCl och exklusive 2,2 % v formaldehyd-fasta celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

I likhet med EDTA-effekterna, vid 500 mM KCl, fann vi en stor förbättring av stabiliteten med 4% w/v formaldehydfixering (figur 3c). Den uppenbara förlusten av kompaktitet i detta fall kan också förklaras av partiell avskildhet av beståndsdelarna i ribosomal komplex, snarare än deras fullständiga dissociation från RNA. Sammantaget visade polysomer som härrör från formaldehyd-fasta celler högre motståndskraft mot utveckning och strukturell destabilisering, i överensstämmelse med att bilda ytterligare kovalenta bindningar inom dessa komplex.

Under stimulerande tillväxtförhållanden kan mRNAs snabbt initieras vilket resulterar i ackumulering av flera ribosomer på samma mRNA-molekyler, som bildar strukturer som kallas polyribosomer, eller polysomer. Polysomer kan separeras med ultracentrifugation i sackarogradienter, där de sedimenterar baserat på deras ordning (antal samtidiga ribosomer på mRNA). När översättningen undertrycks misslyckas ribosomer med att delta i en ny översättningsrunda tillräckligt snart, vilket resulterar i (partiell) "demontering" av polysomer, som visas som en modal förskjutning mot polysomerna i en lägre ordning och ackumulering av monosomer4,26.

En modell av translationellt svar som kan visualiseras på polysomordningsfördelningsnivån kan tillhandahållas av glukos svält. Glukosutarmning framkallar en av de mest dramatiska och snabba translationella hämmande effekterna på jäst1,3,40. Tidigare studier visade att inom 1 min glukosutarmning kan förlust av polysomer, ackumulering av monosomer och hämning av översättningsinitiering förekomma4. Inom 5 min glukos re-supplement, översättning återställs snabbt med uppenbar ökning av polysomer3,4. Det observerades också att översättningen hämmades när celler exponerades för medier som innehöll glukos på 0, 5% (w/v) eller lägre och det inte fanns någon effekt i glukosnivåer på 0, 6% (w/v) eller högre.

Vi ville därför avgöra om våra fixering villkor är lämpliga för bevarandet av translationella skillnader inom dynamiken av glukos stress svar, som kan bedömas av polysome-till-monosome förhållandet. Vi jämförde materialet från cellerna som odlades i mitten av exponentiell fas på hög glukos (2,00% w/v tillsatt) med de som överförts i 10 min till media med ingen eller låg tillsatt (0,00% respektive 0,25% w/v) glukos. Fixeringen har utförts med 2,2% w/v formaldehyd parallellt i kontrollen (icke-svält, snabb mediaersättning med samma standardmedium som innehåller 2% w/v tillsatt glukos, följt av inkubation i 10 min och fixering) och 10 min svält (snabb medieersättning med samma media men låg 0,25 w/v eller ingen tillsatt glukos, följt av inkubation i 10 min och fixering) celler.

I överensstämmelse med de tidigare resultaten observerade vi att jästceller kraftigt undertrycker översättning vid glukossvältstress (figur 4a). Både, inga tillsatta och låga glukosförhållanden inducerad polysom demontering, med något men uppenbarligen mer polysomer kvar vid låg tillsatt glukos. Således kan jästglukosborttagningssvaret inte vara av en all-on eller all-off typ och är gradvis inställd. Polysomalt material från de fasta cellerna har visat en högre skillnad mellan de svältande och icke-svältande cellerna, vilket förmodligen bevarar ett högre dynamiskt intervall för svaret (figur 4b). Intressant, när det gäller material från de fasta cellerna, resulterade låg tillsatt glukoskoncentration i det specifika polysomala överflöd som är mycket bättre differentierat från det icke-tillsatta glukostillståndet jämfört med de icke-fasta cellerna (figur 4a). Detta är en stark indikation på lämpligheten av formaldehyd fixering strategi för att bevara och fånga relativt minut och övergående skillnader i jämvikten i mycket dynamiska processer, såsom under translationella svar.

Figure 4
Figur 4: Fånga snabba förändringar i jästöversättningen vid glukossvält. Buffert 1 (se text och figur 2a) användes i alla experiment. Datatyp och intrigning enligt beskrivningen i figure 2-förklaringen. a) Cell lysates erhållna från icke-svältande (grå linje), begränsad glukos-svält (0,25% w/v tillsatt glukos i 10 min; brun linje) och glukos-utarmat (ingen tillsatt glukos för 10 min; röd linje) icke-fasta jästceller. b)samma som (a), men för 2,2 % w/v formaldehyd-fasta celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Övervakning av translationell status med ribosomer i samband med att aktivt översätta mRNA med sackarogradientedimentation (polysomprofilering) är en allmänt tillämpad teknik26,27,28. I kombination med kvantitativ mikroarrayanalys och mer nyligen med höggenomströmningssekvensering 28,44, ger polysomprofilering information om ribosomassocierade mRNAs transcriptome-wide. Med flera antaganden har det traditionellt hävdats inom området protein biosyntes forskning att polysomal närvaro är en indikation på aktivt engagemang i översättning av respektive mRNAs. En mer ytterligare avslutning är ofta (men inte alltid) befogad, att ju mer ribosomer är närvarande på en mRNA av en given längd (ju högre beställa av polysomesna), mer aktivt det mRNA är involverat i översättning. Således kan det vara användbart att separera polysomalfraktionen från resten av materialet ur synvinkeln att isolera det aktivt översatta RNA. Inom fotavtrycksprofileringsmetoderna, och särskilt TCP-seq10,38,39 som genererar en separat population av de befriade SSUs som härrör från skannings-, start- och stoppkodonkomplexen, kan det dessutom vara insiktsfullt att ta bort ribosomala underenheter som inte samevisterar med de kompletta monosomerna eller polysomerna.

Vi har således använt separation av "icke-översatta" mRNPs såsom gratis SSUs (mRNA bundna till enstaka SSU eller SSU: er utan bifogat mRNA) bort från den "aktivt översättande" poolen av mRNAs. För att uppnå detta antog vi att mRNAs involverade i interaktioner med antingen en (mono-) eller flera ribosomer (polysomer) kan översättas aktivt. Sådana komplex kan separeras från de andra genom deras högre sedimenteringskoefficient. Vi föreslog också att separera den "aktivt översatta" poolen av mRNAs i en sackaroskudde (50% w /v sackaros) istället för att direkt pelletera materialet på rörväggen. Centrifugering av de snabbsedimenterande komplexen i kudden gjorde det möjligt för oss att övervaka separationen med hjälp av avläsning av absorbansprofilen och att uppnå en högre effekt av det solubiliserade, icke-aggregerade och icke-denaturerade materialet, jämfört med pelletering och återsmörjande10,38.

För att rena de enskilda SSUs, ribosomer, disomer och potentiellt kompakt packade polysomer av högre ordning utsattes fasta klarnade lysater för en tvåstegs ultracentrifugationsprocess (figur 5). I den första sackarogradienten resulterade ultracentrifugeringen i separerade fria SSO: er och LSO i toppen (10%-20% w/v sackaros) delen av gradienten, medan den tvärbundna översatta poolen inklusive polysomer och mRNAs associerade med en komplett ribosom koncentrerades längst ner (50% w/v sackaros) av gradienten (figur 5a ). De nedre 50% w/v av sackarosskiktet som innehåller den översatta mRNA-poolen koncentrerades sedan och dess RNA smältes med RNase I, följt av en andra sackaros gradient ultracentrifugation för att erhålla separata SSU, LSU, RS, RNase resistenta disomes (DS) och mindre fraktion av högre ordning nukleasresistenta polysomer ( figur5b). Negativ färgning med uranylacetat och avbildning med ett transmissionselektronmikroskop bekräftade identiteten hos de komplex som isolerats i varje sedimenteringssteg (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Isolering av de totala översatta RNA-fraktionerna bort från det oöversatta RNA. (a,c) Schematiska (vänster) och respektive representativa resultat (höger; datatyp och plottning enligt beskrivningen i figur 2-legenden) av (a) första icke-diskontinuerliga sackaros gradientseparation av de icke översatta cytosolfraktionerna inklusive fria SSU: er och den översatta mRNA-poolen som identifieras genom samsedimentation med ribosomer och polysomer. ochc) separation av de enskilda ribosomala komplexen som frigörs från den översatta mRNA-poolen genom kontrollerad RNase I-matsmältning och ultracentrifugation genom en andra linjär sackarosgradient till SSU, LSU, ribosomal (RS) och nukleasresistenta disomala (DS) fraktioner. Höga (15 AU260)och låga (8 AU260)mängder av det icke-svältande smälta materialet inkluderades för att visa en möjlighet att öka ultracentrifugationsbelastningarna när mindre fraktioner är av intresse. Högre ordning nukleasresistenta polysomer kan också identifieras (t.ex. trisomer i de angivna exemplen). b,d) Representativa TEM-bilder av uranylacetatkontraterade fraktioner från (a,c), respektive som märkta. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

För att kontrollera lämpligheten av fixering regim för lagring av transienta ribosom-associerade proteiner (särskilt, eIM), testade vi för co-sedimentation av eIF4A, en labile eIF dynamiskt bunden till ribosom, över ribosomal fraktioner. Vi utnyttjade eIF4A Tandem Affinity Purification (TAP) taggad jäststam (TIF1-TAP) och undersökte eIF4A-närvaron i material som härrör från de fasta kontra icke-fasta cellerna med hjälp av anti-TAP-antikropp, jämfört med förekomsten av Pab1p som en extra RNA-bindande kontroll, med hjälp av SDS-PAGE följt av western blotting(figur 6).

Figure 6
Figur 6: Stabilisering av övergående proteiner i de translationella komplexen vid in vivo-formaldehydfixering. (a,b) (övre tomter) Helcell lysate (WCL) av (a) icke-fast och (b) 2,2% formaldehyd-fasta eIF4A-TAP jästceller separerade med ultracentrifugation och visualiseras enligt beskrivningen i figure 2 legenden. (nedre tomter) Western-blot imaging av respektive sackaros gradient fraktioner vid separation av det material som analyseras i motsvarande gradienter (övre tomter) och WCL som en kontroll. c)Genomsnittligt förhållande mellan eIF4A- eller Pab1p-överflödet i fraktionerna av fast och icke-fast material. Relativa proportioner (normaliserade till signalen för alla 2-7 fraktioner) av eIF4A (svarta staplar) och Pab1p (grå staplar) beräknades över 2,3 (SSU, LSU), 4,5 (RS, lätta polysomer) och 6,7 (tunga polysomer) från data från (a,b) (nedre tomter) och deras fasta till icke-fasta förhållande. Felstaplar anger standardavvikelsen för förhållandet från medelvärdet med de poolade bråktalen (prickade rutor) som behandlas som replikat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

I överensstämmelse med deras höga överflöd i cellerna observerade vi en hög intensitet av signalen från båda proteinerna i hela cellen lysate (WCL) och långsammare sedimenterande fraktioner som härrör från icke-fasta celler (figur 6a, nedre panelen). Vi har också upptäckt betydande mängder av dessa proteiner i WCL som härrör från de fasta cellerna och säkerställer effektiviteten hos den tvärbundna materialutvinningen och frånvaron av oväntade förluster (figur 6b, bottenpanel). I motsats till de icke-fasta cellerna visade dock material från de fasta cellerna förhöjd relativ närvaro av eIF4A i de snabbare sedimenterande ribosomfraktionerna, jämfört med Pab1p (figur 6c). Detta resultat tyder på att eIF4A förblir mer fast associerad med polysomer i formaldehyd-korslänkat material.

Efter att ha bekräftat den positiva och specifika stabiliseringseffekten av tvärbindning på eIF4A närvaro i ribosomal fraktioner, använde vi det fasta materialet från eIF4A-taggad (TIF1-TAP) jäststam för att fånga och berika eIF4A-innehållande komplex genom affinitetsrening med magnetiska IgG-pärlor. Vi har affinitetberikade WCL, fria SSU- och polysomala (översatta mRNA-pool) fraktioner efter den första sedimenteringen genom sackarogradient (t.ex. avsnitt 1.3 i jästprotokollet), samt SSU- , LSU- och RS-fraktioner från den andra sedimenteringen vid demontering av den översatta poolen i enskilda komplex med RNase I (t.ex. avsnitt 1.4 i jästprotokollet) (figur 7 ). I samtliga fall, med undantag för LSU-fraktionen, kunde vi observera selektiv berikning av eIF4A i de renade fraktionerna (eluat, E), i jämförelse med förekomsten av β-aktin i källmaterialet (ingång, I) (figur 7).

Figure 7
Figur 7: Selektiv immunspurifiering av in vivo-formaldehydstabiliserade translationella komplex med transientt associerade eIF4A.  Schemat illustrerar källan till olika translationella komplex och eIF4A epitope, inklusive den icke-fraktionerade klargjorda WCL av eIF4A-TAP jästceller. fria SSUs och översatta RNA-pool (polysomer) segregerade i den första ultracentrifugationen; SSU, LSU och RS fraktioner befriade från översatta RNA av RNase I matsmältning och segregerade med andra ultracentrifugation (se text). Western blot-bilden ger en visualisering av eIF4A-överflöd i fraktionerna jämfört med överflödet av samtidigt färgade β-aktinkontroll. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Tilläggstabell 1. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Formaldehydfixering är en bekväm och populär metod för att uppnå snabb in vivo-korslänkning av biomolekyler10,36,45,46,47,48. Jämfört med de andra potentiella biomolekylära målen kräver framgångsrik fångst av translationella komplex en omedelbar fixering under snapkylan av cellerna eller annat material. Utan den odelade stabiliseringen finns det en potential för olika översättningsrelaterade processer att fortsätta, vilket flyttar den komplexa fördelningen bort från det ostörda in vivo-tillståndet 49. Jämfört med de andra metoderna för translationell arrestering och ribosomal komplex stabilisering, snabbheten av formaldehydverkan över cellmembran och korslänkarnas urskillningslösa natur lovar bevarandet av den maximala mångfalden av översättningskomplexet intermediärer närmare deras infödda distribuerade tillstånd50.

Tillvägagångssättet som presenteras här har etablerats och optimerats i både jäst- och däggdjursceller, och metoder har nu härletts av andra grupper för användning över mer olika biologiska material, såsom i hela ryggradsdjur (t.ex. zebrafiskembryon)10,38,39,49,51,52 . Även om dessa verk kollektivt lugnar mångsidigheten och den breda tillämpligheten av metoden, kan snabb formaldehyd tvärbindning av translationella komplex anses vara något svårt att överföra till nya typer av biologiskt material på grund av behovet av optimeringar och justeringar.

Ett främsta krav för att metoden ska lyckas är omoptimering av koncentrationen av formaldehyden och cellinsamlings- och störningstekniken. Mindre genomsläppliga, små och runda jästceller kräver mycket högre (åtminstone 10-faldig) formaldehydkoncentration och fysisk störning av de fasta cellerna. Däremot kan stora och tillplattade vidhäftande däggdjursceller i kulturen lätt överfixeras och kräva skonsam hantering vid fixering, medan extraktionen av de fasta komplexen kan utföras kemiskt med membranstörning med tvättmedel. Underlänkning kan göra det möjligt för mindre stabila eller mer kortlivade intermediärer att separera eller läcka in i ett senare tillstånd. Överlänkning kan påverka förmågan att isolera och studera ribosomala fraktioner negativt och kan skapa selektiva fördomar såsom djupare utarmning av tunga komplex. I vår observation, även mindre förändringar, såsom den typ av vidhäftande mänskliga celler som används, kan påverka utbytet av de återvunna tvärbundna komplexen och kan kräva omoptimering av tvärbindning regim. Vi kan också förvänta oss att celler med väsentligt olika permeabilitetsegenskaper, såsom växtceller, kommer att kräva ytterligare omfattande optimering av fixeringsförhållandena52. Ändå är det svårt att föreställa sig en typ av biologiskt material som skulle vara helt oförenligt med tillvägagångssättet.

En faktor som är relevant för protokollet för fixering av däggdjur är densiteten och mängden cellmaterial som används som indata. Det rekommenderas att cellerna kontinuerligt växer utan återsådd eller andra störtdyningar i minst 2 dagar för att undvika yttre påverkan på cellulär översättningsdynamik. Tillämpligt för de flesta celltyper, men för de flesta vidhäftande celler uppnås konsekvent sammanflödesnivåer på högst 70% kommer att säkerställa avsaknad av större kontakthämningseffekter som kan påverka översättningsfrekvensen negativt och oförutsägbart.

En annan intressant, och potentiellt unikt bekväm, egenskap hos formaldehydfixering som härrör från dess urskillningslösa reaktivitet är stabiliseringseffekten på translationella komplex i system av blandad taxonomi. Bakteriella, och ännu mer translationella komplex av mitokondrier, kloroplaster och olika intracellulära parasiter, har varit notoriskt svåra att rikta in sig på med specifika översättningshämmare. I TCP-seq-data kan däremot fotavtrycksmappning till mitotranskriptom lätt observeras i data38,39,50. En intressant efterföljande utveckling skulle kunna vara användningen av metoden för att undersöka översättning i hela mikrokommuner, till exempel i jord-, vatten- eller tarmprover, där tillförlitlig snabb translationell arrestering och komplex stabilisering med andra medel skulle vara problematisk.

Det bör också nämnas att för det mest komplicerade materialet (såsom hårda och/ eller skrymmande vävnader) förhindrar ingenting användning av formaldehydstabilisering omedelbart vid cellstörning och material homogenisering. Detta tillvägagångssätt används redan ofta för att ta bort cellinträdefördröjningen vid stabilisering av translationella komplex med specifika små molekylhämmare33,53,54,55. Med tanke på att formaldehydfixering traditionellt har använts med utmärkta resultat för ex vivo/ in vitro-provstabilisering i applikationer som elektronmikroskopi45,56,57,58, kan vi förvänta oss ännu mindre negativa effekter i detta fall, särskilt de som är förknippade med dålig extraktion av translationella komplex från de noggrant fasta cellerna.

Våra resultat bekräftar användbarheten av snabb formaldehyd fixering för att stabilisera mycket övergående komplex, såsom de som inkluderar eIF4A. Det är anmärkningsvärt att jäst eIF4A, till skillnad från däggdjur, är mycket svagare förknippad med locket bindande komplex eIF4F och, som ett resultat, translationella komplex i allmänhet. eIF4A går vanligtvis förlorad under någon omfattande rening av ribosommaterialet i jäst29,59,60,61,62,63. Ändå är det i in vivo-fastjästmaterial möjligt att uppnå tillförlitlig berikning av eIF4A i alla fraktioner av translationella komplex där dess närvaro skulle förväntas. De tidigare publicerade Sel-TCP-seq-data har visat berikningen av eIF2 och eIF3 som starkare associerar med ribosomerna (men också visade övergående förekommande samöversättningsproteinkomplexsammansättning)39. Således är metoden lämplig för detektion av både, starkare och svagare bifogade beståndsdelar i translationella komplex.

Sammanfattningsvis har vi presenterat ett tillvägagångssätt som är användbart för att få insikter främst om de förändringar som sker i initieringsfasen av översättning och när minimalt störd ribosomal fördelning över mRNA krävs. Viktigt är att metoden är lämplig för stabilisering av relativt labila och dynamiska komponenter i translationella komplex, såsom eIF4A, och kan användas i stort sett föremål för nödvändiga optimeringar. Vi har också lagt fram bevis för nyttan av formaldehydfixering i scenarierna för snabb dynamisk förändring av översättningen, vilket öppnar upp undersökningsområden som snabba cellulära svar på miljöförändringar eller stressförhållanden.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Australian Research Council Discovery Project grant (DP1801001111 till T.P. och N.E.S), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 till N.E.S.) och Research Fellowship (APP1135928 till T.P.). Författarna erkänner faciliteterna i Microscopy Australia vid Centre for Advanced Microscopy, Australian National University, en anläggning som finansieras av universitetet och den federala regeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Merck, Sigma-Aldrich 70161
Peptone Merck, Sigma-Aldrich 70178
D-Glucose (Dextrose) Merck, Sigma-Aldrich 49139
Adenine sulphate Amresco 0607-50G
Formaldehyde solution Merck Sigma-Aldrich F11635-500ML ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation)
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific 10777019
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail COEDTAF-RO Roche by Merck 11873580001
Magnesium chloride solution (Merck/Sigma-Aldrich) M1028
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (Merck/Sigma-Aldrich) E7889
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL Ambion AM2294
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL) Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific AM2694
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0) (Merck/Sigma-Aldrich) P1944-100ML
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) 11033
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) AM9740
Glycogen (5 mg/ml) Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) AM9510
Ethyl alcohol, Pure Merck; Sigma Aldrich E7023
Amersham™ Hybond® P Western blotting membranes, PVDF Merck GE10600023 PVDF membrane for western blotting
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific NW04120BOX Protein gel
4X Bolt™ LDS Sample Buffer Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific B0007  LDS sample loading buffer
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards BioRad 1610375 Protein ladder
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer ThermoFischer Scientific B0002 PAGE runninjg buffer
Intercept® (PBS) Blocking Buffer LI-COR 927-70001 Odyssey Blcoking buffer (PBS)
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 92632210
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 92632211
TAP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific CAB1001
Anti-beta Actin antibody Abcam ab8227
Sucrose (Merck/Sigma-Aldrich) 84097 BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC)
DL-Dithiothreitol solution (Merck/Sigma-Aldrich) 43816 BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O
Terumo Syringe 1CC/mL Terumo Syringe 878499
Potassium chloride (Merck/Sigma-Aldrich) 60128
HEPES (Merck/Sigma-Aldrich) H3375
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich 12003C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300062
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium Sigma-Aldrich D8662
Glycine Sigma-Aldrich G7126
Tris hydrochloride Merck/Sigma-Aldrich 10812846001
Sodium dodecyl sulfate Merck/Sigma-Aldrich 436143
IGEPAL CA-630 Merck/Sigma-Aldrich I3021
Rnasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111
Stainless steel grinding jar Retsch 02.462.0059
MM400 mixer mill Retsch 20.745.0001
Gradient Fractionator Brandel BRN-BR-188
Thermomixer R Eppendorf Z605271
Nanodrop spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices Eppendorf Safe-Lock 30121023
Mini Gel Tank (Thermo Fisher Scientific) A25977 PAGE running tank
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm Beckman-Coulter 344057
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm - 50Pk Beckman-Coulter 331372
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices Merck UFC5030 Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge Cambridge Scientific 15566
Beckman Coulter Optima L-90K GMI 8043-30-1191
Nunc EasYFlask 175cm2 Thermofisher Scientific 159910
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Thermofisher Scientific 14-432-22
25 mL Serological Pipette Sigma-Aldrich SIAL1250
10 mL Serological Pipette Sigma-Aldrich SIAL1100
DNA lobind tubes Eppendorf 30108051
Cold Centrifuge 5810 R Eppendorf EP022628188 for 50 mL tubes
Orbital Shaking Incubator Ratek OM11
Frezco 17 Microcentrifuge Thermofisher Scientific 75002402
Eppendorf DNA lo-bind tubes Merck/Sigma-Aldrich EP0030108051
Eppendorf® Protein LoBind tubes Merck/Sigma-Aldrich EP0030108116
SW 41 Ti Swinging bucket rotor Beckman-Coulter 331362
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L Thermofisher Scientific 51026282
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe BD Medical 328822
3 mL syringe with Luer Lok tip BD Medical 302113
25 G x 16 mm Hypodermic Needle Terumo TUAN2516R1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janapala, Y., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Control of translation at the initiation phase during glucose starvation in yeast. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4043 (2019).
  2. Masvidal, L., Hulea, L., Furic, L., Topisirovic, I., Larsson, O. mTOR-sensitive translation: Cleared fog reveals more trees. RNA Biology. 14 (10), 1299-1305 (2017).
  3. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Molecular Biology of the Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  4. Crawford, R. A., Pavitt, G. D. Translational regulation in response to stress in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 36 (1), 5-21 (2019).
  5. Melamed, D., Pnueli, L., Arava, Y. Yeast translational response to high salinity: global analysis reveals regulation at multiple levels. RNA. 14 (7), 1337-1351 (2008).
  6. Hershey, J. W., Sonenberg, N., Mathews, M. B. Principles of translational control: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 011528 (2012).
  7. Mata, J., Marguerat, S., Bähler, J. Post-transcriptional control of gene expression: a genome-wide perspective. Trends in Biochemical Sciences. 30 (9), 506-514 (2005).
  8. Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational regulation of gene expression during conditions of cell stress. Molecular Cell. 40 (2), 228-237 (2010).
  9. Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 5 (3), 301-315 (2014).
  10. Archer, S. K., Shirokikh, N. E., Beilharz, T. H., Preiss, T. Dynamics of ribosome scanning and recycling revealed by translation complex profiling. Nature. 535 (7613), 570-574 (2016).
  11. Hinnebusch, A. G., Ivanov, I. P., Sonenberg, N. Translational control by 5'-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Science. 352 (6292), 1413-1416 (2016).
  12. Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (7), 013706 (2012).
  13. Shirokikh, N. E., Preiss, T. Translation initiation by cap-dependent ribosome recruitment: Recent insights and open questions. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 9 (4), 1473 (2018).
  14. Jiménez-Díaz, A., Remacha, M., Ballesta, J. P., Berlanga, J. J. Phosphorylation of initiation factor eIF2 in response to stress conditions is mediated by acidic ribosomal P1/P2 proteins in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 8 (12), 84219 (2013).
  15. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  16. Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
  17. Barraza, C. E., et al. The role of PKA in the translational response to heat stress in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 12 (10), 0185416 (2017).
  18. Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: Life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
  19. Jamar, N. H., Kritsiligkou, P., Grant, C. M. The non-stop decay mRNA surveillance pathway is required for oxidative stress tolerance. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6881-6893 (2017).
  20. Chen, Z., et al. The complete pathway for thiosulfate utilization in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology. 84 (22), (2018).
  21. Marzluf, G. A. Molecular genetics of sulfur assimilation in filamentous fungi and yeast. Annual Review of Microbiology. 51, 73-96 (1997).
  22. Miller, D., Brandt, N., Gresham, D. Systematic identification of factors mediating accelerated mRNA degradation in response to changes in environmental nitrogen. PLoS Genetics. 14 (5), 1007406 (2018).
  23. Zhang, W., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Regulation of sensing, transportation, and catabolism of nitrogen sources in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82 (1), (2018).
  24. Tokpohozin, S. E., Fischer, S., Becker, T. Selection of a new Saccharomyces yeast to enhance relevant sorghum beer aroma components, higher alcohols, and esters. Food Microbiology. 83, 181-186 (2019).
  25. Walker, G. M., Stewart, G. G. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages. Beverages. 2 (4), 30 (2016).
  26. Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
  27. Jin, H. Y., Xiao, C. An integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
  28. Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3889-3894 (2003).
  29. Lackner, D. H., et al. A network of multiple regulatory layers shapes gene expression in fission yeast. Molecular Cell. 26 (1), 145-155 (2007).
  30. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  31. Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), (2019).
  32. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  33. Hussmann, J. A., Patchett, S., Johnson, A., Sawyer, S., Press, W. H. Understanding biases in ribosome profiling experiments reveals signatures of translation dynamics in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences Genetics. 11 (12), 1005732 (2015).
  34. Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
  35. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
  36. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
  37. Kage, U., Powell, J. J., Gardiner, D. M., Kazan, K. Ribosome profiling in plants: What is not lost in translation. Journal of Experimental Botany. 71 (18), 5323-5332 (2020).
  38. Shirokikh, N. E., Archer, S. K., Beilharz, T. H., Powell, D., Preiss, T. Translation complex profile sequencing to study the in vivo dynamics of mRNA-ribosome interactions during translation initiation, elongation and termination. Nature Protocols. 12 (4), 697-731 (2017).
  39. Wagner, S., et al. Selective translation complex profiling reveals staged initiation and co-translational assembly of initiation factor complexes. Molecular Cell. 79 (4), 546-560 (2020).
  40. Zlotorynski, E. Profiling ribosome dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (9), 535-535 (2016).
  41. Sen, N. D., Gupta, N., S, K. A., Preiss, T., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Functional interplay between DEAD-box RNA helicases Ded1 and Dbp1 in preinitiation complex attachment and scanning on structured mRNAs in vivo. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8785-8806 (2019).
  42. Zhao, J., Qin, B., Nikolay, R., Spahn, C. M. T., Zhang, G. Translatomics: The global view of translation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 20010212 (2019).
  43. Luthe, D. S. A simple technique for the preparation and storage of sucrose gradients. Analytical Biochemistry. 135 (1), 230-232 (1983).
  44. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Review Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  45. Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends in Biochemical Sciences. 25 (3), 99-104 (2000).
  46. Schmiedeberg, L., Skene, P., Deaton, A., Bird, A. A Temporal Threshold for Formaldehyde Crosslinking and Fixation. PLoS One. 4 (2), 4636 (2009).
  47. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: A probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  48. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping proteinDNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  49. Bohlen, J., Fenzl, K., Kramer, G., Bukau, B., Teleman, A. A. Selective 40S footprinting reveals cap-tethered ribosome scanning in human cells. Molecular Cell. 79 (4), 561-574 (2020).
  50. Shirokikh, N. E. Translation complex stabilization on messenger RNA and footprint profiling to study the RNA responses and dynamics of protein biosynthesis in the cells. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. , (2021).
  51. Giess, A., et al. Profiling of small ribosomal subunits reveals modes and regulation of translation initiation. Cell Reports. 31 (3), 107534 (2020).
  52. Firmino, A. A. P., et al. Separation and paired proteome profiling of plant chloroplast and cytoplasmic ribosomes. Plants (Basel). 9 (7), (2020).
  53. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Research. 42 (17), 134 (2014).
  54. Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
  55. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
  56. Plénat, F., et al. Formaldehyde fixation in the third millennium. Annales De Pathologie. 21 (1), 29-47 (2001).
  57. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  58. Wang, N. S., Minassian, H. The formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues for diagnostic transmission electron microscopy: A retrospective and prospective study. Human Pathology. 18 (7), 715-727 (1987).
  59. Grifo, J. A., et al. Characterization of eukaryotic initiation factor 4A, a protein involved in ATP-dependent binding of globin mRNA. Journal of Biological Chemistry. 257 (9), 5246-5252 (1982).
  60. Li, Y. Commonly used tag combinations for tandem affinity purification. Biotechnology and Applied Biochemistry. 55 (2), 73-83 (2010).
  61. Blum, S., et al. ATP hydrolysis by initiation factor 4A is required for translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (16), 7664-7668 (1992).
  62. Merrick, W. C. eIF4F: A Retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
  63. Rogers, G. W., Komar, A. A., Merrick, W. C. eIF4A: The godfather of the DEAD box helicases. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 72, 307-331 (2002).

Tags

Biologi nummer 178 ögonblicksbild av proteinbiosyntes översättningskomplexstabilisering snabba cellsvar cellulär stress ribosomkomplex affinitetsrening av översättningsintermediärer translationell kontroll översättning komplex profilsekvensering TCP-seq ribosom (översättning) profilering ribo-seq ribosom sedimentering genom ultracentrifugation i sackaros gradient
Snabb <em>in vivo-fixering</em> och isolering av translationella komplex från eukaryota celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Janapala, Y., Woodward, K., Lee, J., … More

Janapala, Y., Woodward, K., Lee, J., Rug, M., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells. J. Vis. Exp. (178), e62639, doi:10.3791/62639 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter