I denne protokol, metoder til syntetisering og karakterisering multi-modal fase-change porphyrin dråber er skitseret.
Faseskiftdråber er en klasse af ultralydkontrastmidler, der kan omdannes til ekkogene mikrobubbles in situ med anvendelse af tilstrækkelig akustisk energi. Dråber er mindre og mere stabile end deres mikrobobler kolleger. Traditionelle ultralydkontrastmidler kan dog ikke spores ud over akustiske feedbackmålinger, hvilket gør det vanskeligt at kvantificere kontrastmidlet biodistribution eller akkumulering ex vivo. Forskere kan være nødt til at stole på fluorescerende eller optisk absorberende følgesvend diagnostiske partikler til at udlede bio-distribution. Formålet med denne protokol er at detaljer trin til at skabe multi-modal fase-change porfyrin dråber ved hjælp af en kondenseringsmetode. Porfyrin er fluorescerende molekyler med forskellige absorbansbånd, der kan konjugeres på lipider og indarbejdes i dråber for at udvide dråbens alsidighed, hvilket muliggør mere robust biofordeling, samtidig med at akustiske egenskaber bevares. Syv formuleringer med varierende porfyrin-lipid og base lipid indhold blev foretaget for at undersøge microbubble og dråbe størrelse distributioner. Karakteriseringer, der er velegnede til porfyrinholdige strukturer, er også beskrevet i protokollen for at demonstrere deres analytiske alsidighed i løsningen. Dimensionering viste, at de post-kondenserede gennemsnitlige diametre var 1,72 til 2,38 gange mindre end prækursor populationer. Absorbanskarakterisering viste intakte samlinger havde en Q-band peak på 700 nm, mens forstyrrede prøver havde en absorbans peak på 671 nm. Fluorescens karakterisering viste intakt 30% porfyrin-lipid forsamlinger var fluorescerende slukkes (>97%), med fluorescens opsving opnået ved forstyrrelser. Akustisk fordampning viste, at porfyrindråber ikke var ekkogene ved lavere tryk og kunne omdannes til ekkogene mikrobubbles med tilstrækkeligt tryk. Disse karakteriseringer viser potentialet for porfyrindråber for at eliminere behovet for absorbans eller fluorescensbaserede ledsagende diagnostiske strategier til kvantificering af ultralydkontrastmidlet biodistribution til levering eller terapeutiske anvendelser in vivo eller ex vivo.
Ultralydsscanning er en ikke-invasiv, ikke-iioniserende form for medicinsk billeddannelse, der udnytter akustiske bølger. Mens ultralydsscannere er mere bærbare og kan give realtidsbilleder, kan ultralydsscanning lide af lav kontrast, hvilket gør det vanskeligt for sonografer pålideligt at skelne mellem lignende ekkogene patologiske træk. For at modvirke denne begrænsning kan mikrobubbles injiceres i værten for at forbedre vaskulær kontrast. Mikrobubbles er mikron-størrelse gasfyldte kontrastmidler, der er meget ekkogen til akustiske bølger og kan give forbedret fartøj kontrast1,2. Skallerne og gaskernerne af mikrobobler kan skræddersys til forskellige applikationer, såsom billeddannelse, trombolyse, cellemembranpermeabilisering eller forbigående vaskulær åbning2.
En ulempe ved mikrobobler er deres korte cirkulation halveringsliv. For eksempel har klinisk tilgængelige perflutren lipidmikrosfærer kun en halveringstid på 1,3 minutter3. For lange billeddannelse sessioner, flere injektioner af mikrobobler er nødvendige. En anden ulempe ved mikrobobler er deres store diametre. Mens perflutren lipidmikrosfærer er omkring 1 til 3 μm i diameter, små nok til at cirkulere i vaskulatur, de er for store til at ekstravasere og passivt ophobes i væv af interesse, såsom tumorer4. En strategi for at overvinde disse begrænsninger er at kondensere gaskernemikrobubbles til mindre, flydende kernedråber5,6. Mens dråber ikke er ekkogene i deres flydende tilstand, kan de fordampes til mikrobubbles ved eksponering for ultralyd med tilstrækkeligt højt top negativt tryk og genvinde deres evne til at give kontrast. Dette gør det muligt for dråben at drage fordel af de mere gunstige farmakokinetik af en lille væskekerne, samtidig med at evnen til at give kontrast, når den er insoneret og uden at ændre den kemiske sammensætning4,7.
Decafluorobutane er en ideel perfluorcarbonforbindelse til faseskift mellem gasformige og flydende tilstande5,6,7. Decafluorobutane giver mulighed for kondensering af mikrobubbles i dråber med temperaturreduktion alene, mens mindre tætte perfluorcarboner kræver yderligere tryk5. Denne blide metode minimerer ødelæggelsen af bobler under kondens7,8,9. Da deres kerner er flydende, er dråber ikke-ekkogene og usynlige for ultralyd. Men med anvendelsen af tilstrækkelig akustisk eller termisk energi kan de flydende kerner fordampe tilbage til en gasformige tilstand, der genererer ekkogene mikrobubbles8. Denne fordampning giver mulighed for kontrol af, hvornår og hvor man skal generere mikrobobler.
Mens dråber er nyttige til passiv akkumulering, in situ fordampning, eller forbedre celle permeabilitet4, dråber (og deres fragmenter) kan ikke afbildes eller kvantificeres ex vivo. Derfor anvendes kvantificerbare følgesvend diagnostiske middel, såsom fluorescerende4,10,11, magnetiske partikler12, optisk absorberende midler13, som en analog til at måle dråbe levering til væv af interesse. For eksempel brugte Helfield et al. en co-injektion af fluorescerende nanoperler til histologibilledkvantificering af museorganer, da dråber ikke kunne påvises fluorescerende4. Ulempen ved ledsagende diagnostiske midler er den sporbare komponent kan handle uafhængigt af dråben afhængigt af dens individuelle farmakokinetiske profil.
Heldigvis kan skallen af mikrobobler og dråber tilpasses. For eksempel demonstrerede Huynh et al. ultralyd kontrastmidler med porfyrrin-lipid skaller, hvilket skaber multimodale mikrobubbles14. Porfyrin er en klasse af organiske forbindelser med en aromatisk makrocylic struktur14,15. De er optisk absorberende, fluorescerende, og kan være cheated til en bred vifte af metaller til strålebehandling, røntgennukleid-baseret billeddannelse, eller spormetal-baseret kvantificering14. Et eksempel på porfyrin er pyropheophorbid (Pyro). Ved at konjugatere Pyro på lipider, indarbejde Pyro-lipider i mikrobobler eller dråber tillader dem at blive afbildet og sporet gennem flere modaliteter: akustisk, fluorescerende, og gennem absorbans14. Dette multimodale kontrastmiddel kan bruges til at spore og kvantificere akkumulering. Dette kunne eliminere behovet for ledsagende diagnostiske midler, da den kvantificerbare komponent nu konjugeres på skallen, hvilket muliggør mere nøjagtig kvantificering af levering16.
Heri, en protokol til oprettelse af multi-modal fase-change porfyrin dråber er skitseret. Som ultralyd kontraster agenter kan bruges som en platform for lægemiddellevering til væv af interesse, såsom tumorer2,4, udvide deres detektering ud ultralyd kunne vise sig nyttigt for levering effektivitet kvantificering. Formålet med disse dråber er at give sporbare ultralyd kontrast agenter i stand til passiv ophobning in vivo, in situ fordampning og akustik, og med potentiale til at kvantificere bio-distribution eller ophobning fra ex vivo organer uden afhængighed af sekundære sensorer. Karakteriseringsmetoder er også skitseret for at fremvise porfyrindråber potentiale som bio-distribution sensorer. Virkningerne af Pyro-lipid-belastning i skallen (0% til 50% ved molarforhold) diskuteres også.
Efter tilsætning af alle lipidkomponenterne sammen (trin 1.2 og 1.4.5, figur 1A) blev der tilsat en opløsning af chloroform og methanol (og vand, hvis fosfatidsyrelipider som DSPA er til stede) for at sikre, at Pyro-lipid- og ikke-Pyro-lipidkomponenterne blev fuldt homogeniseret (Trin 1.5, figur 1B). For at forhindre dannelsen af lipid vesikler med heterogen lipid sammensætning, blev de opløste lipider tørret og belagt på det indre af væggen af hætteglasset som en tynd film (Figur 1C). Belægningen (trin 1.6) gør også hydreringen (trin 2.1 til 2.4) lettere, da det øger overfladen af den tørrede film. Tørring (trin 1.6, figur 1C) og støvsugning (trin 1.8, figur 1D) blev udført for at sikre, at chloroformen og methanolen blev fuldstændig fordampet, da disse kemikalier kan forstyrre dannelsen af mikrobobler. Mens protokollen kan skaleres ned for at gøre lipid løsning mængder så lavt som 1 mL, større mængder kan reducere hætteglas-til-hætteglas variation. Selv om dette kan risikere at forringe Pyro-SPC,mens den ikke er i brug, var opbevaringstilstanden for lipidopløsningen (trin 2.9 til 2.10) beregnet til at reducere denne risiko. Afgasningstrinnet med gasveksleren (trin 2.9.2, figur 1F og figur 2)tjener til at fjerne så meget ilt som muligt for at forhindre oxidering. Det anbefales ikke at opbevare lipidopløsninger, der indeholder porfyrrin-lipider, mens atmosfæriske gasser stadig opløses i opløsningen (Figur 1E).
I trin 2.10 er lipidopløsningen i et serumglas med et trykhovedrum, svarende til, hvordan det klinisk godkendte ultralydkontrastmiddel perflutren lipidmikrosfærer sælges (svarende til figur 1F). Internt arbejde har vist, at stabile mikrobobler ikke kunne genereres via mekanisk agitation med tilstedeværelsen af Pyro-lipider, hvis hætten var et blødt materiale som gummiproppen. Lipidopløsningen blev derfor overført til et prøveglas med en ikke-gummi phenolhætte (trin 4.1 til 4.4, figur 3A og 3B). Når decafluorobutangassen blev strømmet ind i prøveglasset (trin 4.1 til 4.4), skulle tættere decafluorobutan fortrænge den atmosfæriske luft i prøveglasset. I øjeblikket er det uvist, hvorfor Pyro-lipider ikke er i stand til at danne mikrobobler med gummipropper. Uden Pyro-lipider kan stabile mikrobobler laves direkte i serumglassene med gummipropper4,7. Det anbefales således at bruge gasveksleren til at afgas og presse serumglasset igen og derefter omrøre selve serumglasset for ikke-Pyro-lipidformuleringer4,5,6,7 (se “Andre protokoller og data”). Fordelen ved at være i stand til mekanisk agitere i serum hætteglas er headspace kan presses og størrelse-udvælgelse kan gøres ved at vende serum hætteglasset på hovedet8. I denne protokol blev 0% Pyro-lipid-formuleringen overført til et prøveglas (trin 4.1 til 4.4) for at være i overensstemmelse med de formuleringer, der indeholdt Pyro-lipider. Derudover resulterer længere acyl lipid kædelængder i mere stabile dråber på grund af bedre van der Waals interaktioner19. Lipid shell sammensætning blev valgt baseret på, hvad der var kommercielt tilgængelige, 18-acyl kæde længde for alle lipid typer. DSPE-PEG5K blev indarbejdet i hele formuleringen (trin 1.1), da tilstedeværelsen af polyethylenglykolkæderne forhindrer sammensendelse af strukturer via frastødende steriske kræfter19. Under lipidhydrering blev badet sonicator badet indstillet til 70 °C (trin 2.1) så høj nok til fuldt ud at sprede 18-acyl kæde længde lipid film18. For længere acyl kædelængder, vil højere temperaturer være påkrævet.
Højere Pyro-lipidbelastning ville øge koncentrationen af optisk absorberende og fluorescerende komponenter, hvilket kan ønskes til visse applikationer, der drager fordel af maksimeret porfyrinbelastning. Men efterhånden som Pyro-lipidindholdet steg, faldt den observerbare dråbekoncentration, og diametererne steg (figur 4 og tabel 1). Dette illustrerer en afvejning mellem optisk fluorescens og absorbans egenskaber versus dråbe koncentration og diameter. Til forskere, der skal prioritere små diametre for in vivo ophobning gennem små utætte fartøjer, eller hvis en høj koncentration af dråber skal injiceres, stigende Pyro-lipid belastning kan ikke være værd at stigningen i dråbe dimeter eller fald i dråbe koncentration. Hvis høje dråbekoncentrationer og/eller små dråbediametre er altafgørende, bør lignende størrelse ledsagende diagnostiske midler overvejes i stedet for Pyro-lipider. Mens 1 % Pyro-lipiddråber ikke resulterede i et fald i koncentrationen eller forøgelsen af størrelsen, kan 1 % Pyro-lipidbelastning være for lav til, at den med rimelighed kan påvises fra vævsbaggrundslysstofrør. Imidlertid giver fleksibiliteten af porfyrrinmoiety flere muligheder for funktionalisering, som vil give alternative metoder til kvantificering, der er mere egnet til applikationer med lav koncentration. For eksempel kan Pyro-lipider være chelateret med kobber-64 for positon emission tomografi imaging og gamma tælle20, eller med palladium for spormetal kvantificering ved hjælp af massespektrometri, eller med mangan for magnetisk resonans imaging14.
Mens nogle eksperimenter kun kan kræve en lille mængde af dråbeopløsningen, er 1 mL af lipidopløsningen nødvendig for at fylde 1,85 mL prøveglasset. Goertz et al. viste, at ændringer i håndtering, headspace tryk, væske-til-gas-forhold, og selv hætteglasformen kan alle påvirke mikrobobble populationer17. Hætteglastemperatur under omrøring og størrelsesvalg kan også påvirke størrelsesfordelingen. Derfor er det vigtigt at være så konsekvent som muligt for de metoder, der er optimeret af slutbrugeren, når du laver dråber. Uåbnede dråber kan fryses (-20 °C) og optøs senere til fremtidig brug, men dette vil påvirke størrelsespopulationer.
Den agitationsprocedure, der aktiverer en lipidopløsning i mikrobubbles, producerer ikke en morfologisk homogen population (trin 4.6); snarere, prøven er fyldt med mikrobobler, multilamellar vesikler, liposomer, og micelles18,21,22. Mens mikrobobble størrelser spænder over mikron og nanometer rækkevidde, de andre strukturer er stort set under 800 nm 23. De anvendte dimensioneringsteknikker skelner ikke mellem disse forskellige strukturer, og de postkonditerede mikrobobbleprøver (trin 4.6, figur 3C) og de postkonterede dråbeprøver (trin 4.14, figur 3F),må antages som blandinger. Ultralyd-ufølsomme forsamlinger (multilamellar vesikler, liposomer, og micelles) er sandsynligvis bevaret post-kondens og vil ikke ændre størrelse, da de ikke har fase-foranderlige kerner. Da Coulter-tælleren ikke kan skelne mellem disse forskellige supramolekulære forsamlinger, bør forskydningen i befolkningsstørrelsen efter kondens fortolkes ud fra den antagelse, at en del af nanoskalastrukturerne er uomvendte og bidrager til den observerede befolkning i denne størrelsesregion. Derudover bidrager disse konstruktioner til de spektroskopiske og fluorescerende signaturer i disse prøver14. Fluorescens og absorbans signaturer af micelles, liposom / vesikler, og dråber er alle ens, herunder deres grad af fluorescens slukke14. Det er derfor vigtigt at overveje, at der er en blanding af samlinger i figur 3C til 3F, figur 4, pbs fortyndet prøve i figur 5og PBS fortyndet prøve i figur 6.
Efter størrelsesvalg og før kondens (trin 4.9) er det muligt at eliminere ikke-boblesamlinger ved at centrifugere mikrobobbleprøven for at adskille de flydende bobler fra de ikke-flydende samlinger som beskrevet af Feshitan et al.21 Graden af adskillelse kan styres ved at justere spinkraften og varigheden. Men eksperimenter med mikrobobble kondensering af sådanne størrelses isolerede prøver afslørede, at ved hjælp af de større prækursor mikrobobble populationer, der er valgt ved hjælp af størrelse isolation procedurer gav større dråber (se “Andre protokoller og data” Trin S5 for post-spundet boble og dråbestørrelse). Da en bestemt anvendelse af dråber produceret med denne protokol er en platform for passiv ekstravasation og akkumulering på grund af deres lille størrelse sammenlignet med mikrobubbles4,8, dråbepopulationer, der er så små som muligt, var ønsket. Således brugte denne protokol post-ophidsede mikrobubble prøver, der ikke var størrelsesisoleret via centrifugering, selvom det betød ultralyd-ufølsomme micelles, liposomer og vesikler var til stede i den endelige løsning. Dette indebærer, at kvantificeringsprocedurerne for biodistribution vil udlede signal for alle de injicerede strukturer og ikke kun er begrænset til dråberne. Da disse strukturer af samme størrelse sandsynligvis akkumuleres via en passiv mekanisme, der primært er dikteret af størrelse, er der dog ikke mistanke om, at dette bør ændre de vigtigste slutninger, der kan foretages, hvis denne platform skal udnyttes in vivo, selvom alle disse aspekter bør overvejes individuelt afhængigt af den sammenhæng, hvori platformen kan anvendes. Tests ved hjælp af eksperimentelle arme med og uden ultralyd kan udføres for at sikre, at det er de ultralydsfølsomme dråber, der er ansvarlige for eventuelle ændringer i biodistributionen, da kun perfluorcarbonkernesamlinger i opløsningen vil reagere på ultralyd.
Efter omrøring blev hætteglasset udhvilet i 15 minutter, og der blev observeret en skillevæg i hætteglasset (Figur 3C versus 3D). Størrelsesvalg via opdrift er en enkel metode til at eliminere de større strukturer /bobler fra en aktiveret mikrobobbleopløsning8,17. I dette tilfælde blev partikler med diametre på over 5 μm for det meste fjernet efter størrelsesvalg (figur 4). Omfanget af størrelsesvalg kan indstilles ved at kontrollere varigheden af størrelsesvalg17. Sheeran et al. har vist, at ikke størrelsesvalg kan resultere i genererede mikrobobler, der okkluderer vaskulatur8.
Perfluorcarboner har den fordel, at de er biologisk inert7. Mens decafluorobutanes kogepunkt er -1,7 °C, over kropstemperaturen, fordamper dråberne ikke umiddelbart, når de udsættes for 37 °C (Figur 7B). Da dråberne er metastabile ved 37 °C, er der behov for yderligere akustisk energi for at fordampe dråberne til mikrobubbles7,9. Poprosky et al. har demonstreret porfyrindråber kondenseret via tryk22. Dette er en levedygtig og endda vigtig metode, når du bruger mindre tætte perfluorcarboner, men højt tryk kan ødelægge nogle bobler i processen. Octafluoropropane (C3F8) har et kogepunkt på -36,7 °C, så både køling og tryk er nødvendig for dråbekondensering. Men den lettere perfluorcarbon fører til mindre stabile dråber. Dodecafluoropentane (C5F12) kan føre til mere stabile dråber med et kogepunkt på 28 °C. Det er dog en væske ved stuetemperatur og har brug for stærkere akustiske energier til at fordampe. Valget af den indeholdende gas af ultralydkontrastmidlet bør derfor overveje betingelserne for dets tilsigtede biologiske anvendelse ud over parametrene for dets fremstilling. I denne protokol blev isopropanolbadet til kondens indstillet til -15 til -17 °C (trin 4.7.1 og trin 4.13), mens andre protokoller anvendte -10 °C 5,6. Selv med en fælles decafluorobutan kerne, kondens temperatur kan variere afhængigt af begyndende sammensætning, samlede lipid koncentration, og lipid shell sammensætning. Hvis du bruger andre formuleringer, kan optimering være nødvendig for at sikre korrekt dråbekondensering uden at få opløsningen til at fryse.
Da dråberne er mindre og mere stabile end deres mikrobobbleprækursor7, kan de drage bedre fordel af passive akkumuleringsmekanismer for at ekstravasere i visse interessevæv, såsom den forbedrede permeabilitet og retentionseffekt af visse tumortyper4,24. Med fluorescerende, optisk absorberende og akustiske metoder til detektion14er det muligt at bruge en enkelt formulering til at kvantificere optagelse. Derudover kan denne platform bruges til at undersøge, om den akustiske fordampning af dråber kan forbedre leveret agentfraktion ud over passive niveauer16. For at kvantificere agentbiodistribution i væv og organer af interesse efter injektionen skal der sprøjtes en kendt mængde Pyro-lipiddråber ind i dyret, ultralyd kan eller ikke må påføres afhængigt af kontrolsættet, dyret skal ofres et forudbestemt tidspunkt, og organerne skal fjernes og vejes. Organerne skal homogeniseres, filtreres, fortyndes i overfladeaktivt (vaskemiddel) for at decellulisere vævet og kvantificeres med fluorescens eller UV-Vis spektroskopi for at opnå injicerede dosisprocenter pr. organmasse baseret på Pyro-signalerne. For trin 5.4.5 (figur 5) og trin 5.5.5 (figur 6) blev Triton X-100 overfladeaktivt (vaskemiddel) brugt til at forstyrre prøverne, da det ikke er fluorescerende ved 410 nm, og dets absorbansbølgelængder overlapper ikke Pyros.
Mikrobobler var ikke karakteriseret ved UV-Vis absorbans. Da UV-Vis spektroskopets laserkilde er parallel med detektoren, kan store bobler sprede lys væk fra detektoren, hvilket får dem til at fremstå mere optisk absorberende14. I modsætning til UV-Vis-spektrofotometret er/bør fluorescensspektrofotometerets detektor være/bør være vinkelret på laserkilden for at forhindre kilden i at forstyrre detektoren. UV-Vis blev anvendt til at kvantificere absorbansen af de intakte og forstyrrede dråbeprøver (trin 5.4, figur 5). 300 til 800 nm blev valgt som absorbans bølgelængder som de to vigtigste absorbans bands af pyro-lipid, Soret band (340 til 500 nm) og Q-båndet (640 til 730 nm), falder inden for dette interval14. Når den samles i en dråbe (eller andre supramolekulære strukturer), skiftes Q-båndstoppen af Pyro-lipid fra 671 nm til 700 nm (Figur 5). Når denne supramolecular struktur forstyrres af et overfladeaktivt middel som Triton, skifter toppen tilbage til 671 nm14,15. Baseret på dette skift er det muligt at fortælle, om Pyro-lipiderne er i samlet tilstand eller i en forstyrret tilstand. Forholdet mellem de to toppe kan bruges til at estimere samlingernes forfald over tid.
For fluorescensmålingerne (trin 5.5, figur 6) blev der valgt en excitationsbølgelængde på 410 nm, da den svarer til Soret-båndets top for usamlet Pyro-lipid14. En emission bølgelængde spænder fra 600 til 800 nm blev valgt som toppe af de intakte samlinger i PBS og forstyrrede Pyro-lipider i Triton er indeholdt inden for dette interval. Skiftet og stigningen i fluorescens (figur 6) mellem de intakte (704 nm i PBS) og forstyrrede (674 nm i Triton) prøver forekom på grund af struktur-induceret slukning. I den samlede form blev Pyro-lipidmolekylerne pakket tæt sammen, så genererede fotoner blev absorberet af nærliggende Pyro-lipidmolekyler. Dette er tydeligt i den intakte versus forstyrrede slukningseffektivitet. Det er således nødvendigt at fortynde prøver i overfladeaktivt (vaskemiddel) som 1% Triton X-100 for at lindre slukning og maksimere signalet til biodistribution kvantificering14.
For nemheds skyld blev den samme lineære ultralydstransducer brugt til både at fordampe og billedet (trin 6.5 og 6.7, figur 7). Denne ultralydtransducer (Tabel over materialer) var i stand til at nå det nødvendige højeste negative tryk, der var nødvendigt for at fordampe dråber8. Påfyldning af en tank med deioniseret vand fra en hane genererer gasser, der opløses i vandet (trin 6.1). For at minimere interferens fra de opløste gasser i vandet med fordampning og billeddannelse blev vandet udhvilet i 24 timer i tanken for at gøre det muligt for gasserne i vandet at ekvilibrere med atmosfæren (trin 6.1). Alternativt kan det deioniserede vand afgasses med en tilstrækkelig størrelse, tætningsbeholder, der er forbundet til et tilstrækkeligt kraftigt vakuum. Ultralydsbillederne viste, at mikroboblerne med succes blev kondenseret, da dråberne var observerbare / ikke-ekkogene ved lavt tryk (Figur 7B). Det var kun ved højere udgangstryk, at dråberne fordampede til observerbare, ekkogene mikrobubbles (Figur 7D, 7F, 7H). Mens den postkontæterede dråbeprøve indeholder miceller og liposomer / vesikler, er disse samlinger ikke-ekkogene, og kun dråber kan fordampe til ekkogene mikrobubbles. En PBS kontrol blev flød gennem fantomet til at etablere baseline billeder (Tal 7A, 7C, 7E, 7G). Da trykket steg i PBS, blev der ikke skabt nogen kontrast. Dette indikerede, at det høje tryk fra transduceren ikke kunne producere spontan kavitation i et vandbaseret medium alene, og dermed kunne al anden genereret kontrast tilskrives det anvendte ultralydskontrastmiddel. Hvis udgangstrykket er for højt, kan genererede mikrobobler ødelægges. Ved gradvist at øge trykket og observere den genererede kontrast, kan det optimale tryk findes8. Cirkulationen halveringstid af dråberne kan bestemmes på samme måde ved at fordampe dråberne er visse tidsintervaller og observere kontrasten genereret over tid7.
Sammenfattende blev multimodale faseskiftdråber med varierende Pyro-lipid-indhold skabt med kondensmetoden. Dimensionering viste, at der var en afvejning mellem Pyro-lipid lastning og microbubble / dråbe koncentration. Karakteriseringer viste, at der var forskelle i intakte og forstyrrede former i både absorbans og fluorescens. Ultralydsscanning viste, at dråber ikke var ekkogene ved 37 °C og kunne fordampes til ekkogene mikrobubbles ved tilstrækkeligt tryk. Karakteriseringer viste også potentialet for Pyro-lipiddråber til at erstatte ledsagende diagnostiske midler til dråbebiodistributions- eller akkumuleringstest. Fremtidigt arbejde vil undersøge in-solution fordampningstærskler, stabilitet i opløsning og in vivo-cirkulationsvarigheder hos nøgenmus.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Brandon Helfield for at hjælpe med at opbygge gasveksleren og Dr. Miffy Hok Yan Cheng for tekniske diskussioner. Forfatterne vil gerne takke følgende finansieringskilder: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute og Princess Margaret Cancer Foundation.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
Aluminum Foil | Any brand | ||
Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
Chloroform | Any brand | ||
Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
Deionized Water | Any brand | ||
Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
Glycerol | Any brand | ||
Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
Isopropanol | Any brand | ||
Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
Metal Tongs | Any brand | ||
Methanol | Any brand | ||
MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
Propylene Glycol | Any brand | ||
Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
Vacuum Desiccator | Any brand | ||
Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
Vortex Mixer | Any brand |