Summary
في هذا البروتوكول، يتم تحديد طرق توليف وتميز قطرات بورفيرين متعددة الوسائط لتغيير الطور.
Abstract
قطرات تغيير المرحلة هي فئة من عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية التي يمكن تحويلها إلى فقاعات صغيرة صدى في الموقع مع تطبيق الطاقة الصوتية الكافية. قطرات هي أصغر وأكثر استقرارا من نظرائهم microbubble. ومع ذلك ، فإن عوامل التباين التقليدية بالموجات فوق الصوتية لا يمكن تعقبها بعد قياسات التغذية المرتدة الصوتية ، مما يجعل تحديد عامل التباين التوزيع الحيوي أو التراكم في الجسم الحي أمرا صعبا. قد يضطر الباحثون إلى الاعتماد على جزيئات التشخيص المصاحبة الفلورية أو الماصة بصريا للاستدلال على التوزيع الحيوي. الغرض من هذا البروتوكول هو تفصيل الخطوات اللازمة لإنشاء قطرات بورفيرين متعددة الوسائط لتغيير الطور باستخدام طريقة التكثيف. البورفيرينات هي جزيئات فلورية ذات نطاقات امتصاص متميزة يمكن اقترانها بالدهون ودمجها في قطرات لتوسيع براعة القطرات ، مما يتيح توزيعا بيولوجيا أكثر قوة مع الاحتفاظ بالخصائص الصوتية. تم إجراء سبع تركيبات ذات محتويات مختلفة من البورفيرين والدهون والدهون الأساسية للتحقيق في توزيعات حجم الفقاعات الدقيقة والقطيرات. كما يتم وصف الأوصاف المناسبة للهياكل المحتوية على البورفيرين في البروتوكول لإظهار براعة تحليلية في الحل. وأظهر التحجيم أن متوسط القطر بعد المكثف كان 1.72 إلى 2.38 مرة أصغر من مجموعات السلائف. وأظهر توصيف الامتصاص أن التجمعات السليمة بلغت ذروتها في نطاق Q 700 نانومتر في حين بلغت العينات المعطلة ذروة امتصاص عند 671 نانومتر. أظهر توصيف الفلورية أن تجمعات البورفيرين والدهون سليمة بنسبة 30٪ تم إخمادها فلوريا (>97٪) ، مع تحقيق انتعاش الفلورية عند التعطيل. وأظهر التبخير الصوتي أن قطرات البورفيرين غير صدى عند الضغط المنخفض ويمكن تحويلها إلى فقاعات صغيرة صدى مع ضغوط كافية. هذه التوصيفات تظهر إمكانية قطرات البورفيرين للقضاء على الحاجة إلى ماصة أو الاستراتيجيات التشخيصية الرفيق القائم على الفلورسينس لتحديد عامل التباين بالموجات فوق الصوتية التوزيع الحيوي للتسليم أو التطبيقات العلاجية في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق.
Introduction
التصوير بالموجات فوق الصوتية هو شكل غير الغازية، غير المؤينة من التصوير الطبي الذي يستخدم الموجات الصوتية. في حين أن الماسحات الضوئية بالموجات فوق الصوتية أكثر قابلية للحمل ويمكن أن توفر صورا في الوقت الفعلي ، يمكن أن يعاني التصوير بالموجات فوق الصوتية من تباين منخفض ، مما يجعل من الصعب على السونوغرافيين التمييز بشكل موثوق بين الميزات المرضية ذات الصدى بالمثل. لمواجهة هذا القيد ، يمكن حقن الفقاعات الصغيرة في المضيف لتحسين تباين الأوعية الدموية. Microbubbles هي غاز بحجم ميكرون شغل عوامل التباين التي هي صدى عالية لموجات الصوتية ويمكن أن توفر تعزيز تباينالسفينة 1،2. يمكن تصميم الأصداف ونواة الغاز من الفقاعات الدقيقة لتطبيقات مختلفة ، مثل التصوير ، انحلال الجلطات ، تغلغل غشاء الخلية ، أو فتح الأوعية الدمويةالعابرة 2.
عيب من microbubbles هو تداولها قصيرة نصف العمر. على سبيل المثال، المتاحة سريريا البيرفلوترين الدهون المجهرية لديها فقط نصف عمر 1.3 دقيقة3. لجلسات التصوير الطويلة، هناك حاجة إلى حقن متعددة من الفقاعات الدقيقة. عيب آخر من الفقاعات الصغيرة هي أقطارها الكبيرة. في حين أن الفلورفلورين الدهون المجهرية حوالي 1 إلى 3 ميكرومتر في القطر، صغيرة بما يكفي لتعميم في الأوعية الدموية، فهي كبيرة جدا للبذخ وتتراكم بشكل سلبي في الأنسجة ذات الأهمية، مثل الأورام4. استراتيجية واحدة للتغلب على هذه القيود هو تكثيف الفقاعات الصغيرة الغاز الأساسية في أصغر، قطرات السائل الأساسية5،6. في حين أن القطرات ليست صدى في حالتها السائلة ، يمكن تبخيرها إلى فقاعات صغيرة عند التعرض للموجات فوق الصوتية مع ضغط سلبي ذروة عالية بما فيه الكفاية ، واستعادة قدرتها على توفير التباين. وهذا يسمح للقيرة للاستفادة من الدوائية أكثر ملاءمة من السائل الأساسية الصغيرة، مع الاحتفاظ بالقدرة على توفير التباين عند الرنانة ودون تغيير التركيب الكيميائي4،7.
ديكافلوروبوتان هو مركب البيرفلوروكربون المثالي لتحويل المرحلة بين الدول الغازية والسائلة5،6،7. Decafluorobutane يسمح لتكثيف الفقاعات الصغيرة في قطرات مع انخفاض درجة الحرارة وحدها، في حين أن أقل كثافة البيرفلوروكربون تتطلب الضغط إضافية5. هذا الأسلوب لطيف يقلل من تدمير فقاعات أثناء التكثيف7،8،9. كما النوى السائلة، قطرات غير echogenic وغير مرئية للموجات فوق الصوتية. ومع ذلك ، مع تطبيق ما يكفي من الطاقة الصوتية أو الحرارية ، يمكن للنوى السائلة أن تتبخر مرة أخرى إلى حالة غازية ، مما يولد فقاعات صغيرة صدى8. يسمح هذا التبخير بالتحكم في متى وأين تولد الفقاعات الصغيرة.
في حين أن قطرات مفيدة للتراكم السلبي، في الموقع التبخير، أو تحسين نفاذية الخلية4،قطرات (وشظاياها) لا يمكن تصويرها أو كميا ex vivo. لذلك ، يتم استخدام عامل التشخيص المصاحب القابل للقياس الكمي ، مثل الفلورسنت4و10و11والجسيمات المغناطيسية12والعوامل الماصة بصريا13، كنظير لقياس تسليم القطيرات إلى الأنسجة ذات الاهتمام. على سبيل المثال، استخدم هيلفيلد وآخرون حقنة مشتركة من حبات النانو الفلورية للقياس الكمي لصورة الأنسجة لأعضاء الماوس حيث لا يمكن اكتشاف قطرات فلورية4. عيب عوامل التشخيص المصاحبة هو أن المكون القابل للتتبع قد يعمل بشكل مستقل عن القطيرات اعتمادا على ملفه الدوائي الفردي.
لحسن الحظ ، يمكن تخصيص قشرة الفقاعات الصغيرة والقطرات. على سبيل المثال، أظهرت Huynh وآخرون وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية مع قذائف البورفيرين الدهون، وخلق microbubbles متعددة الوسائط14. البورفيرينات هي فئة من المركبات العضوية مع هيكل دوري العطرية14،15. فهي ماصة بصريا، الفلورسنت، ويمكن أن تكون chelated إلى مجموعة واسعة من المعادن للعلاج الإشعاعي، والتصوير القائم على النويدات المشعة، أو تتبع القياس الكمي القائم على المعادن14. ومن الأمثلة على البورفيرين بيروفيوفورد (بيرو). من خلال اقتران بيرو على الدهون ، ودمج الدهون في الدهون في الفقاعات الصغيرة أو قطرات تسمح لهم أن تكون مصورة وتتبع من خلال طرائق متعددة : صوتيا ، فلوريا ، ومن خلال امتصاص14. ويمكن استخدام عامل التباين المتعدد الوسائط هذا لتتبع التراكم وقياسه كميا. وهذا يمكن أن يلغي الحاجة إلى عوامل التشخيص المصاحبة حيث يتم الآن اقتران المكون القابل للقياس الكمي على القشرة ، مما يتيح تحديد كمية التسليمبدقة أكبر 16.
هنا ، يتم تحديد بروتوكول لإنشاء قطرات بورفيرين متعددة الوسائط لتغيير المرحلة. كما الموجات فوق الصوتية التناقضات وكلاء يمكن استخدامها كمنصة لتسليم المخدرات إلى الأنسجة ذات الأهمية، مثل الأورام2،4،وتوسيع نطاق الكشف عنها وراء الموجات فوق الصوتية يمكن أن تكون مفيدة لقياس كمية فعالية التسليم. الغرض من هذه القطرات هو توفير عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية القابلة للتتبع القادرة على التراكم السلبي في الجسم الحي، في التبخير الصوتي في الموقع ، ومع إمكانية تحديد التوزيع الحيوي أو التراكم من أجهزة الجسم الحي السابق دون الاعتماد على أجهزة الاستشعار الثانوية. كما يتم تحديد طرق التوصيف لعرض إمكانات قطرات البورفيرين كأجهزة استشعار للتوزيع الحيوي. كما تناقش آثار تحميل الدهون بيرو في قذيفة (0٪ إلى 50٪ بنسبة الضرس).
Protocol
1. أفلام الدهون المجففة
- حساب الجماهير من كل من مكونات قذيفة اللازمة (انظر الملف التكميلي "ورقة الصيغة الدهون").
ملاحظة: لهذا البروتوكول، تركيبة القشرة ستكون: 10 مولر ٪ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوإيثانولامين-ن-[ميثوكسي (البولي إيثيلين غليكول)-5000] ملح الأمونيوم (DSPE-PEG5K)، x مولر ٪ بيروفيوفهوربيد كون 1-stearoyl-2-هيدروكسي-سن-غليسيرو-3-فوسفوتشولين (بيرو-SPC)، و(90-x) مولار ٪ 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوتشولين (DSPC). سيتم تباين كمية Pyro-SPC عبر 7 تركيبات قذيفة (x = 0 ، 1 ، 10 ، 20 ، 30 ، 40 ، 50). تحقق من الوزن الجزيئي ل DSPE-PEG5K على زجاجة المخزون.- مقياس البروتوكول إلى أي حجم الدهون مع الحد الأدنى لحجم 1 مل. لهذا البروتوكول، تم استخدام حجم الدهون الكلي من 10 مل مع تركيز الدهون الكلي من 1 ملغ لكل مل لجميع الصيغ. الحل الأولي سيكون: 10٪ بروبيلين غليكول، 10٪ جلسيرول، و 80٪ فوسفات عازلة ملحية (PBS، 1X، 7.4 درجة الحموضة) (٪ v/v/v) (انظر الخطوة 2.3 و "ورقة الصيغة الدهنية").
ملاحظة: يتم تحديد بروتوكول توليف الدهون بيرو في الملف التكميلي "بروتوكولات وبيانات أخرى" الخطوات S1 إلى S1.19، الذي تم تعديله من العمل الذي قام به تشنغوآخرون.
- مقياس البروتوكول إلى أي حجم الدهون مع الحد الأدنى لحجم 1 مل. لهذا البروتوكول، تم استخدام حجم الدهون الكلي من 10 مل مع تركيز الدهون الكلي من 1 ملغ لكل مل لجميع الصيغ. الحل الأولي سيكون: 10٪ بروبيلين غليكول، 10٪ جلسيرول، و 80٪ فوسفات عازلة ملحية (PBS، 1X، 7.4 درجة الحموضة) (٪ v/v/v) (انظر الخطوة 2.3 و "ورقة الصيغة الدهنية").
- استنادا إلى الجماهير المحسوبة (انظر الخطوة 1.1 و "ورقة الصيغة الدهون"),تزن كل من غير الدهون بيرو ونقلها إلى قارورة زجاجية بوروسيليكات الحجم بما فيه الكفاية مع غطاء المسمار على.
- قم بتغطية القارورة، وسم الغطاء والقارورة، واغط الجزء السفلي وجدران القارورة الدهنية بورق الألومنيوم. وستشار إلى هذه القارورة باسم "فيال الدهون" لبقية البروتوكول. تخزين فيال الدهون في منطقة باردة وجافة ومظلمة.
- إذا كانت التركيبة تحتوي على Pyro-SPC ، قم بإذابة 10 ملغ من فيلم Pyro-SPC الجاف (انظر "بروتوكولات وبيانات أخرى") إلى 1 مل من الكلوروفورم. دوامة لمدة 5 ق، وقياس الامتصاص، وحساب حجم المناسبة لإضافة إلى فيال الدهون.
تنبيه:الكلوروفورم هو خطر صحي، مهيج، وسامة. ارتداء معطف مختبر واقية، وحماية العين، والقفازات، وتجنب أبخرة التنفس.
ملاحظة: بما أن Pyro-SPC حساس للضوء، قم بتقليل الأضواء في منطقة العمل إذا أمكن عند التعامل مع Pyro-SPC. الحفاظ على بيرو-SPC مختومة ومغطاة عندما لا تكون قيد الاستخدام.- على الطيف المرئي فوق البنفسجي، قم بتعيينه لقياس الامتصاص من نطاق طول موجي يتراوح بين 800 نانومتر و300 نانومتر مع زيادات 0.5 نانومتر، وقياس خط أساس مع 2000 ميكرولتر من الميثانول النقي في cuvette طول مسار متوافق 1 سم.
تنبيه:الميثانول هو خطر صحي، مهيج، سام، و قابل للاشتعال. ارتداء معطف مختبر واقية، وحماية العين، والقفازات، وتجنب أبخرة التنفس. الابتعاد عن الشرر والحرارة. - إضافة 2 ميكرولتر من بيرو-SPC في الكلوروفورم إلى 2000 ميكرولتر من الميثانول، ودوامة لمدة 30 ثانية. نقلها إلى نظيفة، متوافقة 1 سم cuvette، وقياس الامتصاص. اضبط عامل التخفيف هذا إذا بلغت ذروة الامتصاص 667 نانومترا من نطاق امتصاص مطياف الطيف المرئي فوق البنفسجي.
ملاحظة: كلما نقل الكلوروفورم أو الميثانول، استخدم حقنة زجاجية نظيفة أو ماصة الإزاحة الإيجابية بدلا من ماصة ميكانيكية للحصول على دقة أفضل. - كرر الخطوة 1.4.2 مرتين إضافيتين للحصول على قيم امتصاص ثلاثية.
- متوسط قيم ذروة الامتصاص عند 667 نانومتر واستخدام المعادلة التالية لحساب حجم Pyro-SPC في الكلوروفورم اللازم ل Lipid Vial14,15:
حيث V هو حجم بيرو-SPC في الكلوروفورم اللازمة، m هو الكتلة المطلوبة من Pyro-SPC (انظر الخطوة 1.1 و "ورقة الصيغة الدهنية")، M هو الوزن الجزيئي ل Pyro-SPC عند 1040.317 g·mol-1، A هو متوسط الامتصاص عند 667 نانومتر، D هو عامل التخفيف على أساس الميثانول و Pyro-SPC في أحجام الكلوروفورم (الخطوة 1.4.2)، L هو طول مسار cuvette في 1 سم، ε هو 667 نانومتر معامل توهين الضرس من بيرو-SPC في 45000 L·مول-1·سم-1.
ملاحظة: المقام في المعادلة هو قانون بير لامبرت، الذي يربط تركيز التحليل في حل لامتصاص البصرية قياس على مسافة. - إضافة حجم محسوب من بيرو-SPC في الكلوروفورم من الخطوة السابقة إلى فيال الدهون باستخدام حقنة زجاجية نظيفة(الشكل 1A)ومن ثم الغطاء وتغطية القارورة.
ملاحظة: الشكل 1 يظهر فقط 30٪ صياغة بيرو الدهون فقط. - إذا كان هناك أي بيرو-SPC في الكلوروفورم المتبقية: في غطاء الدخان، فك غطاء محرك السيارة بيرو-SPC + قارورة الكلوروفورم من الخطوة 1.4، إمالة جزئيا القارورة إلى جانبها وتدفق غاز النيتروجين باستمرار بلطف قدر الإمكان في قارورة بيرو-SPC/chloroform. تدوير القارورة لتجفيف الكلوروفورم باستخدام تدفق غاز النيتروجين ومعطف بالتساوي بيرو-SPC على الجدار الداخلي للقارورة لأنها تجف. تأكد من عدم إجراء البقع ويسقط أي من الحل.
- بمجرد أن يظهر فيلم الدهون Pyro-SPC جافا ومغلفا على جدار القارورة ، قم بإيقاف تدفق غاز النيتروجين. قم بغطاء القارورة، واغلق عنق القارورة بفيلم الشمع، وخزن القارورة عند -20 درجة مئوية وفي الظلام.
- على الطيف المرئي فوق البنفسجي، قم بتعيينه لقياس الامتصاص من نطاق طول موجي يتراوح بين 800 نانومتر و300 نانومتر مع زيادات 0.5 نانومتر، وقياس خط أساس مع 2000 ميكرولتر من الميثانول النقي في cuvette طول مسار متوافق 1 سم.
- إعداد حل من 90٪ الكلوروفورم و 10٪ الميثانول (٪ v/v)، وإضافة 5 مل منه إلى فيال الدهون. كاب فيال الدهون، ودوامة بلطف لتجانس محتويات(الشكل 1B).
ملاحظة: إذا كانت التركيبة تحتوي على دهون حمض فوسفاتيديك (مثل ملح الصوديوم 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate(DSPA))، أضف: 60٪ كلوروفورم، و32٪ من الميثانول، و8٪ ماء مزدوج ال ديون (٪ v/v/v) إلى فيال الدهون بدلا من ذلك. قد يكون من الضروري إجراء المزيد من الدوامات المكثفة لإذابة محتويات الدهون بالكامل. - في غطاء الدخان، فك غطاء فيال الدهون، إمالة جزئيا فيال الدهون إلى جانبها وتدفق غاز النيتروجين باستمرار بلطف قدر الإمكان في فيال الدهون. تدوير فيال الدهون لتجفيف الحل باستخدام تدفق غاز النيتروجين ومعطف بالتساوي فيلم الدهون على الجدار الداخلي للفيانيل الدهون لأنها تجف. تأكد من عدم إجراء البقع ويسقط أي من الحل.
- مرة واحدة في الدهون تظهر الجافة والمغلفة على الجدران الداخلية للقارورة الدهون (الشكل 1C)، إيقاف تدفق غاز النيتروجين، وتغطية الجزء السفلي والجدار من فيال الدهون مع رقائق الألومنيوم، وتغطية الفتحة العلوية مع رقائق الألومنيوم مطعون مع عدد قليل من الثقوب مع إبرة للتنفيس(الشكل 1D).
- تسمية ووضع الدهون المغطاة فيال داخل فراغ المجفف والسماح للدهون لتجف أكثر لمدة 24 ساعة على الأقل ولكن لا يزيد عن 72 ساعة.
ملاحظة: يمكن استئناف البروتوكول لاحقا، بعد 24 إلى 72 ساعة.
2. ترطيب الدهون
- ملء sonicator حمام مع الماء وتسخينه إلى 70 درجة مئوية. بدوره على سونيكيشن للمساعدة في خلط المياه.
تنبيه:المياه و sonicator في درجات حرارة عالية. تجنب لمس الماء و sonicator. ارتداء حماية العين، ومعطف مختبر واقية، وقفازات واقية. - بمجرد أن يصل صوتنة الحمام إلى 70 درجة مئوية ، قم بإزالة فيال الدهون من مجفف الفراغ. تقليل الأضواء في منطقة العمل إذا أمكن.
- إعداد حل متعجل من 10٪ البروبيلين غليكول، 10٪ الجلسرين، 80٪ PBS (٪ v/v/v) وإضافة 10 مل منه إلى فيال الدهون (انظر الخطوة 1.1.1 و "ورقة الصيغة الدهون").
ملاحظة: إذا كنت تستخدم ماصة قياسية للإزاحة الهوائية، فاستخدم الرعاية عند التعامل مع المذيبات اللزجة مثل البروبيلين غليكول والجلسرين. أسبيرات ويغرق حجم ببطء وانتظر حجم المتبقية للوصول إلى الجزء السفلي من طرف ماصة. تأكد من أن السائل لا يتشبث بطرف ماصة عند نقل الأحجام عن طريق التحرك ببطء. - كاب فيال الدهون، وإزالة غطاء الألومنيوم، ودوامة بلطف القارورة في سونيكاتور حمام لمدة 15 دقيقة في حين سونيكيشن على لإذابة الدهون. تأكد من أن رقبة فيال الدهون فوق الماء. تحقق أحيانا مما إذا كان غطاء القارورة مغلقا بشكل آمن.
- أحيانا، إزالة فيال الدهون من حمام الماء. عقد لفترة وجيزة على ضوء للتحقق مما إذا كانت محتويات حلها بالكامل(الشكل 1E).
- إذا لم تكن محتويات قارورة الدهون متجانسة، قم بإزالة فيال الدهون من جهاز صوتنة الحمام. تأمين الغطاء، دوامة أكثر عدوانية، وإعادته إلى sonicator حمام.
- إزالة فيال الدهون من sonicator حمام، وإيقاف sonicator حمام. جفف السطح الخارجي لقارورة الدهون بالمناشف الورقية، وإعادة تسمية فيال الدهون.
- غطي فيال الدهون بورق الألومنيوم، وبردي فيال الدهون في درجة حرارة الغرفة في منطقة باردة ومظلمة وجافة لمدة 10 دقائق.
- Aliquot محتويات فيال الدهون: حوالي 2 مل من محلول الدهون في 3 مل borosilicate الزجاج قارورات مصل واضحة (7 مم قطر الفم الداخلي، قطر الفم الخارجي 13 ملم).
ملاحظة: قد تستخدم بعض البروتوكولات 1.5 مل من محلول الدهون في قارورة 3 مل7. - قم بسقف قارورة المصل مع سدادات مطاطية رمادية على غرار الكلوروبوتيل (قطر الفم الداخلي 7 مم وقطر الفم الخارجي 13 ملم) وتأمين سدادة المطاط بأختام الألومنيوم المسيل للدموع (قطر الفم الخارجي 13 ملم) ومكبر(الشكل 1F).
- فراغ، ديغا، وإعادة الضغط على محلول الدهون في كل من قارورة المصل4،5،7 ( الشكل2).
ملاحظة: الرجوع إلى "بروتوكولات وبيانات أخرى" للحصول على إرشادات حول كيفية تجميع مبادل الغاز والمزيد من التفاصيل.- أغلق كل صمام بين صمام الضغط A وصمام اسطوانة الغاز بما في ذلك (الشكل 2). ربط قارورة المصل إلى الإبر متعددة، ثم فتح الصمامات المنوعة المقابلة، ثم فتح صمام فراغ A وفراغ صمام B، وفراغ في -90 كيلو باسكال (-13 psi، -900 mbar) لمدة 5 دقائق لإزالة الهواء في الغلاف الجوي. لا فراغ من أي من السائل (انظر "البروتوكولات الأخرى والبيانات" الخطوات S3 إلى S3.1.5).
تنبيه:يمكن أن تنفجر مضخة الفراغ إذا تم التعامل معها بشكل غير صحيح. لا تستخدم مضخة فراغ مع المواد الكيميائية العضوية، الحمضية، أو الأساسية. - مع فراغ لا يزال على، عقد قارورة مصل (لمنعه من يتأرجح) والاستفادة منه بسرعة مع قلم أو علامة لdgas. الحفاظ على التنصت حتى لا شكل فقاعات وليس هناك فقاعات في القارورة. لا تدع أي سائل يكون كنس بها. إيقاف النقر مؤقتا إذا لزم الأمر. كرر لجميع قوارير المصل المتصلة. بعد إزالة الغاز من جميع قوارير المصل، إغلاق صمام فراغ A وفراغ صمام B وإيقاف مضخة فراغ (انظر "بروتوكولات وبيانات أخرى" الخطوات S3.2 إلى S3.2.3).
- مع قارورة المصل لا تزال متصلة الإبرة ومع مضخة فراغ إيقاف، بدوره ببطء صمام اسطوانة الغاز 1/16 إلى 1/8 (حوالي 22.5 إلى 45 درجة من الثورة الكاملة) عكس عقارب الساعة لفتح جزئيا، ثم فتح صمام تي مقبض، وتحويل ببطء صمام منظم الهواء في اتجاه عقارب الساعة إلى 3 psi (20.7 كيلو باسكال) قياس. ثم افتح صمام الضغط A وصمام الضغط B (راجع الخطوات "بروتوكولات وبيانات أخرى" S3.3 إلى S3.3.21).
تنبيه:اسطوانة غاز ديكافلوروبوتان تحت الضغط ويمكن أن تنفجر إذا تم تسخينها. الابتعاد عن الحرارة والتأثير. قد يسبب غاز ديكافلوروبوتان إزاحة الأكسجين والاختناق. ارتداء حماية العين المناسبة والتعامل معها في غطاء الدخان. إذا تم التعامل معها بشكل غير صحيح ، فمن الممكن تفريغ أسطوانة الغاز ، والتي يمكن أن تسبب إزالة الضغط السريع والانهياش. فتح صمام اسطوانة الغاز أكثر من 1/8 بدوره يمكن أن تلحق الضرر منظم الهواء. - بعد 30 ق من الضغط (يجب أن يكون قياس لا يزال قراءة 3 psi (20.7 كيلو باسكال))، وإغلاق جميع الصمامات متعددة مع قوارير المصل، وقطع قوارير المصل، غمد الإبر، وإغلاق صمام اسطوانة الغاز.
- تخفيف الضغط المبني عن طريق فتح جزئيا صمام متعددة واحدة حتى إبرة قياس منظم الهواء يذهب إلى موقفها يستريح. ثم أغلق كل شيء بين الصمامات المتعددة و T-Handle بما في ذلك.
- أغلق كل صمام بين صمام الضغط A وصمام اسطوانة الغاز بما في ذلك (الشكل 2). ربط قارورة المصل إلى الإبر متعددة، ثم فتح الصمامات المنوعة المقابلة، ثم فتح صمام فراغ A وفراغ صمام B، وفراغ في -90 كيلو باسكال (-13 psi، -900 mbar) لمدة 5 دقائق لإزالة الهواء في الغلاف الجوي. لا فراغ من أي من السائل (انظر "البروتوكولات الأخرى والبيانات" الخطوات S3 إلى S3.1.5).
- تسمية قارورة مصل وتخزينها في 4 درجة مئوية وفي الظلام. تأكد من إغلاق جميع صمامات مبادل الغاز وإيقاف تشغيل مضخة التفريغ بعد ذلك.
ملاحظة: يجب أن يكون المصل مستقرا لمدة تصل إلى 4 أشهر في هذه الحالة. في هذه الخطوة، يمكن استئناف البروتوكول لاحقا، بعد 4 أشهر على الأكثر.
3. قوارير ديكافلوروبوتان
- مع نظيفة، فارغة 3 مل borosilicate الزجاج قارورة مصل واضحة (7 مم قطر الفم الداخلي، 13 ملم قطر الفم الخارجي)، وغطاء لهم مع lyophilization على غرار الرمادي الكلوروبوتيل المطاط سدادات (7 مم قطر الفم الداخلي، 13 ملم قطر الفم الخارجي) وتأمين سدادة المطاط مع الأختام الألومنيوم المسيل للدموع قبالة (13 ملم قطر الفم الخارجي) ومكبر4، 7،8.
- اتبع الخطوة 2.9.1 لتفريغ الهواء الجوي (انظر خطوات "البروتوكولات والبيانات الأخرى" S3.1 إلى S3.1.5).
- تخطي إزالة الغازات واتبع الخطوات 2.9.3 إلى 2.9.5 لإعادة الضغط على القارورة (راجع "البروتوكولات والبيانات الأخرى" الخطوات S3.3 إلى S3.3.21).
- تسمية قارورة ديكافلوروبوتان وتخزينها في 4 درجة مئوية وفي الظلام. تأكد من إغلاق جميع صمامات مبادل الغاز وإيقاف تشغيل مضخة التفريغ بعد ذلك.
ملاحظة: سوف تكون هناك حاجة قوارير المصل مليئة غاز ديكافلوروبوتان لتكثيف قطرة. يجب أن تكون مستقرة لمدة تصل إلى 4 أشهر في هذه الولاية. في هذه الخطوة، يمكن استئناف البروتوكول لاحقا، بعد 4 أشهر على الأكثر.
4. تشكيل القطيرات
- إزالة محلول الدهون رطب في قارورة المصل (من الخطوة 2.10) من الثلاجة.
- باستخدام ديكابر، إزالة ختم الألومنيوم على قارورة المصل ونقل 1 مل من محلول الدهون إلى 1.85 مل قارورة عينة زجاج بوروسيليكاتي (مع غطاء المسمار الفينول) عن طريق السماح للحل الدهون تتدفق أسفل الجدار الداخلي. لا تخلق فقاعات.
- إذا كان هناك أي محلول الدهون المتبقية في قارورة المصل، اتبع الخطوات 2.9 إلى 2.10 إلى ديغا وإعادة الضغط على قارورة المصل للتخزين (انظر "بروتوكولات وبيانات أخرى" الخطوات S3 إلى S3.3.21).
- مع قارورة عينة 1.85 مل، تدفق بلطف في غاز ديكافلوروبوتان في مساحة رأس القارورة العينة باستخدام مبادل الغاز (انظر الشكل 2 لأسماء صمام محددة).
- تأكد من إغلاق جميع الصمامات الموجودة على مبادل الغاز بشكل صحيح وإيقاف تشغيل المضخة.
تنبيه:إذا تم ذلك بشكل غير صحيح، فمن الممكن فراغ من اسطوانة الغاز مما تسبب في تخفيف الضغط السريع والانهياش. - فتح صمام واحد متعددة وفك بعناية الإبرة المقابلة من متعددة.
تنبيه: كائن حاد, تجنب الاتصال / ثقب. - فتح صمام الضغط A وصمام الضغط B وتحويل صمام اسطوانة الغاز 1/16 إلى 1/8 (حوالي 22.5 إلى 45 درجة من الثورة الكاملة) عكس عقارب الساعة لفتح جزئيا ومن ثم فتح صمام تي مقبض.
تنبيه:لا تفتح صمام اسطوانة الغاز أكثر من هذا لأنه يمكن أن يسبب ضررا لمنظم الهواء. - فك قارورة العينة مع محلول الدهون وتحريكه حتى إبرة متعددة فوق واجهة الهواء السائل داخل القارورة. أمسك القارورة هناك.
-
بدوره ببطء صمام منظم الهواء في اتجاه عقارب الساعة حتى إبرة قياس منظم الهواء يتحرك قليلا من موقفها يستريح والغاز البيرفلوروكربون يتدفق بلطف من إبرة متعددة. دع غاز البيرفلوروكربون يتدفق بلطف إلى مساحة رأس القارورة لمدة 30 s. لا تخلق فقاعات. ضبط صمام منظم الهواء إذا لزم الأمر.
ملاحظة: يجب أن تكون واجهة الهواء السائل مضطربة قليلا بسبب تدفق غاز ديكافلوروبوتان. وبما أن النظام مفتوح الآن، فإن مقياس تنظيم الهواء لا يستطيع قراءة الضغط بشكل صحيح. - بعد 30 ق، بعناية وبسرعة سقف القارورة عينة دون تحريك القارورة كثيرا.
- أغلق صمام اسطوانة الغاز (باتجاه عقارب الساعة)، وصمام T-Handle، وصمام تنظيم الهواء (عكس عقارب الساعة)، وصمام الضغط A، وصمام الضغط B، والصمام متعدد الجوانب.
- غمد الإبرة بعناية.
- تسمية قارورة عينة وختم الرقبة مع فيلم الشمع تسير في اتجاه عقارب الساعة (الشكل 3A و 3B).
ملاحظة: تظهر الأرقام من 3B إلى 3F فقط تركيبة Pyro-lipid بنسبة 30٪.
- تأكد من إغلاق جميع الصمامات الموجودة على مبادل الغاز بشكل صحيح وإيقاف تشغيل المضخة.
- تخزين قارورة عينة في الظلام وعلى 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل أو ما يصل إلى 24 ساعة.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن استئناف البروتوكول لاحقا، 24 ساعة على الأكثر. - ضع حوالي 100 غرام من الجليد الجاف (ثاني أكسيد الكربون) في حاوية معزولة ووضع الجليد العادي في حاوية معزولة أخرى. استرداد قوارير مصل ديكافلوروبوتان المعدة المذكورة في الخطوة 3، واثنين من 3.81 سم (1.5 بوصة) إبر قياس 20، حقنة بلاستيكية 1 مل (فك المكبس قبل الاستخدام)، حاوية 200 مل، ملقط معدني، وميزان الحرارة (-20 إلى 100 درجة مئوية).
ملاحظة: إذا كان فقط جعل microbubbles، ثم ليست هناك حاجة لisopropanol، والجليد الجاف، والجليد. - ضع القارورة عينة مع محلول الدهون في المحرض الميكانيكية والتحريض ل 45 ق (الشكل 3C).
- بعد الهياج الميكانيكي، والوقوف على عينة قارورة الجانب الأيمن المتابعة، محمية من الضوء، وبدء العد التنازلي 15 دقيقة لتهدئة القارورة وحجم حدد microbubbles8،17.
- عندما يصل العد التنازلي لمدة 15 دقيقة إلى 10 دقائق (5 دقائق متبقية على العد التنازلي)، املأ حاوية بحوالي 200 مل من الأيزوبروبانول وبردها إلى -20 درجة مئوية مع الثلج الجاف باستخدام ملقط معدني.
ملاحظة: درجة الحرارة المستهدفة هي -15 إلى -17 درجة مئوية ولكن سوف isopropanol الاحماء أثناء التعامل مع microbubbles.
تنبيه: ايزوبروبانول قابل للاشتعال. الابتعاد عن الحرارة والشرر. يمكن أن يسبب الجليد الجاف تلفا في الجلد. التعامل مع ملقط. ارتداء قفازات، وحماية العين، ومعطف مختبر واقية.
- عندما يصل العد التنازلي لمدة 15 دقيقة إلى 10 دقائق (5 دقائق متبقية على العد التنازلي)، املأ حاوية بحوالي 200 مل من الأيزوبروبانول وبردها إلى -20 درجة مئوية مع الثلج الجاف باستخدام ملقط معدني.
- بعد أن تم اختيار الفقاعات الصغيرة الحجم لمدة 15 دقيقة ، ابحث عن القسم المحدد بالحجم داخل قارورة العينة(الشكل 3D).
- الحفاظ على عينة قارورة الجانب الأيمن المتابعة، فك بعناية قارورة العينة، وسحب حوالي 0.7 مل من القسم السفلي مع إبرة قياس 1.5 بوصة 20 تعلق على حقنة بلاستيكية 1 مل. تأكد من عدم سحب أي من القسم العلوي. لا نفض الغبار الحقنة لإزالة جيوب الهواء.
- أدخل إبرة مختلفة من عيار 20 في قارورة مصل ديكافلوروبوتان (الحفاظ على الإبرة بالقرب من الجزء العلوي من قارورة المصل) للتنفيس ثم إدخال الإبرة / الحقنة مع الفقاعات الدقيقة المختارة بالحجم.
- نقل ببطء الفقاعات الصغيرة التي تم اختيارها بالحجم. إمالة القارورة وزاوية الحقنة للسماح للسائل الانزلاق أسفل الجدار الداخلي للقارورة مصل ديكافلوروبوتان.
- مرة واحدة وقد تم نقل جميع الحل microbubble الحجم المحدد، وإزالة الإبرة مع الحقنة ولكن الحفاظ على إبرة التنفيس في لتخفيف الضغط السلبي(الشكل 3E).
- إذا كان صنع الفقاعات الصغيرة التي تم اختيارها بالحجم فقط ، فتوقف هنا. إبقاء إبرة التنفيس في وبالقرب من أعلى. إبقاء القارورة في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة.
- إضافة كميات صغيرة من الثلج الجاف أو درجة حرارة الغرفة isopropanol إلى حمام ايزوبروبانول لضمان درجة حرارة الحمام بين -15 إلى -17 درجة مئوية.
- مع إبرة تنفيس قياس 20 إدراجها بالقرب من الجزء العلوي من قارورة المصل، ووضع قارورة المصل في حمام ايزوبروبانول، والحفاظ على مستوى microbubble تحت مستوى الايزوبروبانول ولكن الرقبة قارورة فوقه، ودوامة متقطعة قارورة المصل لمدة 2 دقيقة لتكثيف microbubbles.
ملاحظة: تم تعديل هذه الخطوة من العمل الذي قامت به شيرانوآخرون.- لا دوامة قارورة المصل باستمرار في ايزوبروبانول ولا تدع تجميد الحل. دوامة لحوالي 5 ق، ورفع قارورة المصل من الايزوبروبانول. تحقق من وجود نواة الجليد، واستئناف دوامة في ايزوبروبانول. إذا كان هناك تشكيل الجليد، دوامة قارورة المصل في الهواء حتى يتبدد.
- بعد التكثيف لمدة دقيقتين، قم بإزالة قارورة المصل من حمام الأيزوبروبانول وإزالة إبرة التنفيس.
ملاحظة: كان ينبغي تكثيف الفقاعات الصغيرة إلى قطرات، كما هو مبين في التغير في الشفافية(الشكل 3E مقابل الشكل 3F لصياغة 30٪ بيرو الدهون). - مسح قارورة المصل، وتسميتها، ووضعها على الجليد العادية في الظلام، حاوية معزولة حتى تصبح جاهزة للاستخدام. يجب أن تكون قطرات الألمنيوم غير المفتوحة (ختم الألومنيوم السليم) مستقرة في هذه الحالة لمدة تصل إلى 6 ساعة طالما يتم استبدال الجليد الذائب حسب الحاجة.
- عندما تكون جاهزة للاستخدام، وإزالة ختم الألومنيوم مع decapper. الحفاظ على قطرات (حتى قوارير مفتوحة) على الجليد وفي الظلام في حين لا تستخدم. الحفاظ على الفقاعات الصغيرة في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة.
5. توصيف مورفولوجي والبصري
- إعداد 1٪ تريتون من قبل: إضافة 5 مل من تريتون X-100 إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني (1x، pH 7.4) ويحرك مع شريط اثارة المغناطيسي حتى14متجانسة .
ملاحظة: تريتون X-100 لزجة جدا. إذا كنت تستخدم ماصة قياسية للإزاحة الهوائية، فاستخدم الرعاية عند التعامل معها. أسبيرات ويغرق حجم ببطء وانتظر حجم المتبقية للوصول إلى الجزء السفلي من ماصة. تأكد من أن السائل لا يتشبث بطرف ماصة عند نقل الأحجام عن طريق التحرك ببطء. - إعداد قطرات (الخطوة 4). إذا تم أيضا توصيف الفقاعات الصغيرة، فاجمع حجما صغيرا من الفقاعات الصغيرة المختارة قبل التكثيف (الخطوة 4.9).
- حجم microbubbles أو قطرات على عداد كولتر (CC) من 0.2 إلى 6 ميكرومتر للحصول على حجم التوزيعات والتركيزات (الشكل 4).
- ملء نظيفة 20 مل cuvette مع 10 مل من الكهارل CC التي تمت تصفيتها من خلال 0.2 ميكرومتر المسام البولي إيثرسولفون مرشح الغشاء. قياسه على CC مع ثلاثة أشواط للحصول على خط الأساس.
- في نفس الكهارل CC، إضافة 5 ميكرولتر من الفقاعات الصغيرة أو عينة قطرة ومزيج بلطف.
ملاحظة: يمكن إضافة 2 إلى 20 ميكرولتر من العينة اعتمادا على مدى تركيز العينة. - تشغيل العينة على CC (3 أشواط) وطرح خط الأساس المتوسط وحساب توزيع الحجم والتركيز (رقم لكل مل).
- قياس امتصاص القطيرات مع الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيف (الشكل 5).
ملاحظة: الشكل 5 يظهر فقط 30٪ صياغة بيرو الدهون فقط.- على مطياف UV-Vis، قم بتعيين قياس الامتصاص على أنه أطوال موجية من 800 نانومتر إلى 300 نانومتر مع زيادات 0.5 نانومتر وتمكين تصحيح خط الأساس.
- باستخدام نظيفة 1 سم طول المسار cuvette مليئة برنامج تلفزيوني ، وإجراء قياس خط الأساس. تأكد من أن مستوى الصوت مرتفع بما يكفي ليتقاطع مع مسار شعاع الطيف.
- تمييع قطرات بيرو الدهون في برنامج تلفزيوني (يوصي 2 ميكرولتر إلى 500 ميكرولتر من قطرات في 2000 ميكرولتر من الذوبان) وتخلط عن طريق الأنابيب.
ملاحظة: لا دوامة وإلا سيتم إتلاف التجميعات. - نقل قطرات مخففة في cuvette تنظيفها وقياس امتصاص. تغيير التخفيفات إذا لزم الأمر.
- كرر الخطوات 5.4.1 إلى 5.4.4 ولكن استخدام 1٪ تريتون بدلا من برنامج تلفزيوني. بعد التخفيف، نقل العينة إلى قارورة قابلة للغلق / توج ودوامة لمدة 30 ثانية قبل القياس.
- قياس مضان الفقاعات الصغيرة أو قطرات (الشكل 6).
ملاحظة: الشكل 6 يظهر فقط 30٪ صياغة بيرو الدهون فقط.- على مطياف مضان، تعيين الطول الموجي الإثارة كما 410 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات تتراوح من 600 إلى 750 نانومتر مع زيادات نانومتر 1.
- قياس مضان من م سلونت PBS للحصول على خط الأساس باستخدام cuvette التي تتوافق مع مطياف مضان.
- تمييع الفقاعات الدقيقة الدهون بيرو أو قطرات في برنامج تلفزيوني (يوصي 0.5 ميكرولتر إلى 10 ميكروغرام من قطرات في 2000 ميكروغرام من الذوبان) ومزيج عن طريق pipetting.
ملاحظة: لا دوامة وإلا سيتم إتلاف التجميعات. - نقل العينة المخففة إلى cuvette تنظيفها، خط الأساس وقياس الفلورسينس. تغيير التخفيفات إذا لزم الأمر وتجنب تشبع الإشارة.
- كرر الخطوات 5.5.1 إلى 5.5.4 ولكن استخدام 1٪ تريتون بدلا من برنامج تلفزيوني. بعد التخفيف في تريتون 1٪، نقل العينة المخففة إلى قارورة قابلة للغلق / توج ودوامة لمدة 30 ثانية قبل القياس. أضف حجما كافيا لضمان أن تكون الفقاعات الناتجة عن الدوامة فوق مسار الليزر.
ملاحظة: ستكون إشارة الفلورسينس للعينة في تريتون أعلى بكثير مما كانت عليه في برنامج تلفزيوني بسبب الفلورسينس unquenching(الشكل 6).
6. التصوير التبخير
- ملء خزان مياه بحجم مناسب مع الماء deionized والسماح لها بقية لمدة 24 ساعة لتوازن الغازات في الماء مع الغلاف الجوي.
- إعداد قطرات والحفاظ على الجليد والظلام حتى الاستخدام.
- جعل تدفق أنبوب الوهمية من 2٪ أجار كما هو موضح من قبل بيلو وآخرون.18 غمر الشبح في خزان مياه ساخنة إلى 37 درجة مئوية.
- الاحماء برنامج تلفزيوني إلى 37 درجة مئوية وتدفق من خلال الوهمية.
- مع نظام الموجات فوق الصوتية قبل السريرية ومحول صفيف خطي 21 ميغاهرتز (انظر جدول المواد)، محاذاة وجهةالنظر إلى تدفق الوهمية، وتعيينها إلى التصوير ب وضع، تعيين ضغوط الإخراج، والتقاط أشرطة الفيديو أو الصور للحصول على خطوط الأساس في كل ضغط.
- تمييع 20 ميكرولتر من القطيرات إلى 50 مل من 37 درجة مئوية PBS وتخلط بلطف. نقل الحل إلى حقنة بلاستيكية 30 مل ودفع الحل من خلال شبح أجار.
- الحفاظ على نفس المحاذاة كما الخطوة 6.5، وزيادة الضغوط الناتج حتى يتم ملاحظة التبخير (بقع ساطعة في الوهمية، انظر الشكل 7).
ملاحظة: يظهر الشكل 7 عينة قطرة بيرو-دهون بنسبة 30٪. هذا محول الصفيف الخطي المتاح تجاريا 21 ميغاهرتز قادر على كل من التصوير ورذاذ التبخير.
Representative Results
تم قياس عينات الفقاعات الصغيرة المحددة مسبقا(n = 3) وعينات قطرات ما بعد المكثف(n = 3) على عداد كولتر (CC) بفتحة 10 ميكرومتر. وهناك قيود على فتحة 10 ميكرومتر هو أنه لا يمكن قياس الجسيمات أصغر من 200 نانومتر، والتي يمكن أن التحيز متوسط الحجم والتركيز. ويبين الشكل 4 بيانات التحجيم لكل صيغة من تركيبات محتوى البيرو - الدهون. ويبين الجدول 1 الإحصاءات استنادا إلى بيانات الحجم. باستخدام نسبة من أقطار المتوسط قبل وبعد المكثف، وأظهرت النتائج أن 0٪ صياغة بيرو الدهون كان أصغر متوسط قطر التحول في 1.72 ± 0.02. وكان 50٪ صياغة بيرو الدهون أكبر متوسط القطر في 2.38 ± 0.08. وكان عينة قطرات بيرو الدهون 1٪ أعلى تركيز لوحظ في (2.71 ± 0.13) × 1010 / مل في حين أن عينة قطرات بيرو الدهون 40٪ كان أدنى تركيز ملحوظ في (7.36 ± 0.81) × 109 / مل. وأظهرت بيانات التحجيم أن عينة قطرات بيرو-الدهون بنسبة 10٪ كان لديها أصغر ديميتر الذروة في 261 ± 13 نانومتر في حين أن عينة قطرات بيرو-الدهون بنسبة 50٪ كان أكبرها عند 390 ± 55 نانومتر. عموما، مع زيادة محتوى الدهون بيرو، انخفض التركيز وزاد متوسط القطر. وبما أن العينات ما بعد المكثفة تستند إلى عينة الفقاعات الدقيقة السلائف، حدث الاتجاه لكلا النوعين من عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية. ومع زيادة محتوى الدهون في بيرو، بدأ تشكيل مجموعة فرعية من الفقاعات الدقيقة (يبلغ حجمها ذروتها حوالي 2000 ميكرومتر). لم تكن هذه الذروة الثانوية موجودة في عينة الفقاعات الدقيقة 0٪ من بيرو-الدهون والأكثر وضوحا في 40٪ و 50٪ من السكان الدهون البريرو.
ويبين الشكل 5 قياسات امتصاص تمثيلية لعينة قطرات بيرو -الدهون بنسبة 30 في المائة. وكانت ذروة العينة سليمة في برنامج تلفزيوني 700 نانومتر في حين أن العينة تعطلت في تريتون تحولت الذروة إلى 671 نانومتر. وأظهر ذلك أن التجميعات السليمة لها خصائص بصرية مختلفة مقارنة بالمكونات الدهنية الفردية غير المجمعة.
ويبين الشكل 6 ألف قياسات مضان تمثيلية لعينة الفقاعات الدقيقة المكثفة مسبقا، بينما يبين الشكل 6B عينة قطرة ما بعد المكثفة مع 30 في المائة من الدهون البيرو. العينة سليمة في برنامج تلفزيوني كان ذروة مضان في 704 نانومتر في حين أن النموذج تعطلت كان ذروتها في 674 نانومتر. طرح المنطقة المعطلة تحت المنحنى مع منطقة سليمة تحت المنحنى، وتقسيم الفرق على المنطقة المعطلة تحت المنحنى يعطي كفاءة التبريد، والتي تعمل بها لتكون 98.61٪ و 98.07٪ لعينة الفقاعات الدقيقة بيرو الدهون 30٪ وعينة قطرة، على التوالي.
لإثبات قطرات تحويل إلى microbubbles، تم تصوير قطرات مخففة وتبخيرها في شبح تدفق 37 درجة مئوية مع نظام الموجات فوق الصوتية. يظهر الشكل 7 صورا تمثيلية بالموجات فوق الصوتية لعينة قطرات بيرو-دهون بنسبة 30٪ المصورة بضغوط مختلفة. في الضغوط المنخفضة (الشكل 7A)، كان هناك إشارة قليلة جدا، فقط إشارة الخلفية من فقاعات الهواء عالقة من توليف أجار. وذلك لأن قطرات غير echogenic ولا مبعثر الموجات فوق الصوتية. في قوة عالية قليلا، تم إنشاء بعض الفقاعات الصغيرة(الشكل 7B)كما هو مبين من خلال ظهور بقع ساطعة. ومع زيادة الضغط، تم توليد المزيد من الفقاعات الصغيرة(الشكل 7C و7D). كما أظهر ذلك أن القطرات لن تتبخر تلقائيا عند 37 درجة مئوية.
الشكل 1: صور من الخطوات لتشكيل الحل 30٪ بيرو الدهون. أ) مسحوق الدهون بالإضافة إلى بيرو-SPC في الكلوروفورم. ب)حل حل المضافة. ج) فيلم الدهون المجففة والمغلفة على الجدار الداخلي للقارورة. د) قارورة الدهون ملفوفة في رقائق الألومنيوم (احباط الخارجي مسجلة لإعادة استخدامها). E) محلول الدهون رطب. F) محلول الدهون في قارورة المصل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مبادل الغاز 10 متعددة. الصمامات المشار إليها في البروتوكول موسومة. انظر الملف التكميلي "بروتوكولات وبيانات أخرى" للحصول على تعليمات حول كيفية تجميع مبادل الغاز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: أ) حلول الدهون من 7 تركيبات (0٪ إلى 50٪ بيرو-SPC) في قوارير العينة. تظهر الأرقام B إلى D صورا للخطوات المتخذة لصنع قطرات بيرو-دهون بنسبة 30٪. ب) محلول بيرو-دهون بنسبة 30٪ في قارورة عينة. ج)ما بعد التحريض. D) 15 دقيقة الحجم المحدد. ه) القسم السفلي نقل إلى قارورة ديكافلوروبوتان. د)بعد التكثيف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: كولتر كاونتر (CC) بيانات التحجيم من حجم المحددة microbubble وعينات قطرات مع مختلف محتوى قذيفة بيرو الدهون(ن = 3). تمثل الخطوط الخضراء الصلبة الفقاعات الدقيقة وتمثل خطوط السماوي المنقط قطرات. أ) 0٪ بيرو-SPC. ب) 1٪ بيرو-SPC. ج) 10٪ بيرو-SPC. د) 20٪ بيرو-SPC. ه) 30٪ بيرو-SPC. F) 40٪ بيرو-SPC. G) 50٪ بيرو-SPC. ح)مجموع التركيزات الملاحظة لعينات الفقاعات الصغيرة والقطيرات من CC استنادا إلى محتوى Pyro-SPC في القشرة. تشير كافة أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. وقد أجريت جميع القياسات باستخدام فتحة 10 ميكرومتر التي لديها نطاق حجم من 200 نانومتر إلى 6000 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: ممثل الأشعة فوق البنفسجية مرئية (الأشعة فوق البنفسجية فيس) قياسات امتصاص الطيفية من 300 إلى 800 نانومتر من عينة قطرة بيرو الدهون بعد مكثف 30٪ مخففة في برنامج تلفزيوني وفي 1٪ تريتون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6:انبعاثات مضان تمثيلي من 600 إلى 750 نانومتر متحمس في 410 نانومتر. أ)حجم مختارة، قبل مكثف 30٪ عينة الفقاعات الصغيرة بيرو الدهون في برنامج تلفزيوني وفي 1٪ تريتون. ب)بعد مكثف 30٪ عينة قطرات بيرو الدهون في برنامج تلفزيوني وفي 1٪ تريتون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7:صور تمثيلية بالموجات فوق الصوتية لشبح تدفق أجار 37 درجة مئوية تم التقاطها باستخدام محول صفيف خطي قبل السريري 21 ميغاهرتز في الوضع B (انظر جدول المواد). يظهر العمود الأيسر (الأشكال Aو Cو Eو G) عناصر تحكم PBS. العمود الأيمن (الأشكال B, D, F, و H) يظهر 20 ميكرولتر من عينة قطرة بيرو-دهون بعد المكثف 30٪ مخففة إلى 50 مل من 37 درجة مئوية PBS. يمثل كل صف ضغوط سلبية في ذروة الحقل الحر، والتي قدرت من العمل الذي قام به شيران وآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أسلوب | عامل | بيرو شل ٪ | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| نسخة | الفقاقيع | Conc. [/mL] | (2.76 ± 0.28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1.91 ± 0.22) × 10^10 | (1.47 ± 0.05) × 10^10 | (8.47 ± 0.95) × 10^9 | (9.89 ± 0.15) × 10^9 |
| نسخة | الفقاقيع | الذروة [نانومتر] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| نسخة | الفقاقيع | يعني [نانومتر] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| نسخة | الفقاقيع | متوسط [نانومتر] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| نسخة | الرذاذ | Conc. [/mL] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1.75 ± 0.18) × 10^10 | (1.72 ± 0.13) × 10^10 | (1.09 ± 0.01) × 10^10 | (7.36 ± 0.81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| نسخة | الرذاذ | الذروة [نانومتر] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| نسخة | الرذاذ | يعني [نانومتر] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| نسخة | الرذاذ | متوسط [نانومتر] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
الجدول 1: إحصائيات بيانات التحجيم لعينات الفقاعات الصغيرة والقطيرات ذات المحتوى Pyro-SPC المختلف من كولتر كونتر (CC) (n = 3). تشير كافة الأخطاء إلى الانحراف المعياري.
معلومات تكميلية - ورقة الصيغة الدهون: الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
معلومات تكميلية - بروتوكولات وبيانات أخرى: الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
بعد إضافة جميع مكونات الدهون معا (الخطوتان 1.2 و 1.4.5، الشكل 1A)،تمت إضافة محلول الكلوروفورم والميثانول (والماء إذا كانت الدهون الحمضية فوسفاتيديك مثل DSPA موجودة) لضمان أن مكونات الدهون بيرو والدهون وغير بيرو كانت متجانسة تماما (الخطوة 1.5، الشكل 1B). لمنع تشكيل الحويصلات الدهنية مع تكوين الدهون غير المتجانسة ، تم تجفيف الدهون الذائبة والمغلفة على الجزء الداخلي من جدار القارورة كفيلم رقيق(الشكل 1C). الطلاء (الخطوة 1.6) يجعل أيضا الترطيب (الخطوة 2.1 إلى 2.4) أسهل لأنه يزيد من مساحة سطح الفيلم المجفف. وقد تم التجفيف (الخطوة 1.6، الشكل 1C)والكنس (الخطوة 1.8، الشكل 1D)لضمان تبخر الكلوروفورم والميثانول بالكامل لأن هذه المواد الكيميائية يمكن أن تعطل تكوين الفقاعات الدقيقة. في حين يمكن تقليص البروتوكول لجعل أحجام محلول الدهون منخفضة إلى 1 مل ، يمكن أن تقلل الأحجام الكبيرة من التباين من القارورة إلى القارورة. وفي حين أن هذا قد ينطوي على خطر الحط من قدرة البرو - SPC في حين لا تستخدم، فإن حالة تخزين محلول الدهون (الخطوة 2-9 إلى 2.10) كان المقصود منها الحد من هذا الخطر. تعمل خطوة إزالة الغاز مع مبادل الغاز (الخطوة 2.9.2 والشكل 1F والشكل 2)على القضاء على أكبر قدر ممكن من الأكسجين لمنع الأكسدة. لا ينصح بتخزين المحاليل الدهنية التي تحتوي على البورفيرين الدهون في حين لا تزال تذاب غازات الغلاف الجوي في المحلول(الشكل 1E).
في الخطوة 2.10 ، يكون محلول الدهون في قارورة مصل مع مساحة رأس مضغوطة ، على غرار كيفية بيع عامل التباين بالموجات فوق الصوتية المعتمد سريريا perflutren lipid microspheres (على غرار الشكل 1F). وقد أظهرت الأعمال الداخلية الفقاعات الدقيقة مستقرة لا يمكن أن تتولد عن طريق التحريض الميكانيكية مع وجود الدهون بيرو إذا كان الغطاء مادة لينة مثل سدادة المطاط. لذلك ، تم نقل محلول الدهون إلى قارورة عينة ذات غطاء فينول غير مطاطي (الخطوات 4.1 إلى 4.4 ، الشكل 3A و 3B). عندما تم تدفق غاز ديكافلوروبوتان إلى قارورة العينة (الخطوات من 4.1 إلى 4.4)، يجب أن يحل ديكافلوروبوتان الأكثر كثافة محل الهواء الجوي في مساحة رأس القارورة العينة. حاليا، من غير المعروف لماذا الدهون بيرو غير قادر على تشكيل الفقاعات الصغيرة مع سدادات المطاط. مع عدم وجود الدهون بيرو، يمكن إجراء microbubbles مستقرة مباشرة في قارورة المصل مع سدادات المطاط4،7. وهكذا، فمن المستحسن استخدام مبادل الغاز إلى ديغا وإعادة الضغط على قارورة المصل ثم هياج قارورة المصل نفسها لصياغات غير بيرو الدهون4،5،6،7 (انظر "بروتوكولات وبيانات أخرى"). ميزة القدرة على التحريض ميكانيكيا في قارورة المصل هو مساحة الرأس يمكن الضغط عليها ويمكن القيام به من خلال اختيار حجم عكس قارورة المصل رأسا على عقب8. في هذا البروتوكول، تم نقل صيغة بيرو-الدهون 0٪ إلى قارورة عينة (الخطوات 4.1 إلى 4.4) لتكون متسقة مع الصيغ التي تحتوي على الدهون بيرو. بالإضافة إلى ذلك، أطول أطوال سلسلة الدهون أسيل يؤدي إلى قطرات أكثر استقرارا بسبب أفضل فان دير والس التفاعلات19. تم اختيار تكوين قذيفة الدهون على أساس ما كان متاحا تجاريا، وطول سلسلة 18 أسيل لجميع أنواع الدهون. تم دمج DSPE-PEG5K في جميع الصياغة (الخطوة 1.1) حيث أن وجود سلاسل جليكول البولي إيثيلين يمنع تجمع الهياكل عن طريق قوى ستيريك مثيرة للاشمئزاز19. خلال ترطيب الدهون، تم تعيين حمام سونيكاتور حمام إلى 70 درجة مئوية (الخطوة 2.1) عالية بما يكفي لتفريق تماما 18-acyl سلسلة طول فيلم الدهون18. لأطول أطوال سلسلة أسيل، وسوف تكون هناك حاجة إلى ارتفاع درجات الحرارة.
ومن شأن التحميل العالي للبيرو والدهون أن يزيد من تركيز مكونات الامتصاص البصري والفلور، وهو ما قد يكون مرغوبا فيه لبعض التطبيقات التي تستفيد من زيادة تحميل البورفيرين إلى أقصى حد. ومع ذلك، ومع زيادة محتوى البيرو-الدهون، انخفض تركيز القطيرات الملحوظة وزادت الأقطار(الشكل 4 والجدول 1). وهذا يوضح المفاضلة بين الفلورسينس البصري وخصائص الامتصاص مقابل تركيز قطرة وقطرها. للباحثين الذين يجب أن تعطي الأولوية لأقطار صغيرة لتراكم في الجسم الحي من خلال الأوعية الصغيرة راشح أو إذا كان تركيز عال من قطرات يحتاج إلى حقن, زيادة تحميل بيرو الدهون قد لا يكون يستحق الزيادة في ديميتر قطرة أو انخفاض في تركيز قطرة. إذا كانت تركيزات قطرات عالية و / أو قطر قطرة صغيرة هي ذات أهمية قصوى ، وينبغي النظر في عوامل التشخيص رفيق الحجم بالمثل بدلا من الدهون بيرو. في حين أن 1٪ قطرات بيرو الدهون لم تسفر عن انخفاض في التركيز أو زيادة في الحجم، 1٪ تحميل بيرو الدهون قد تكون منخفضة جدا لتكون قابلة للكشف بشكل معقول من خلفية الأنسجة الفلورية. ومع ذلك ، فإن مرونة moiety البورفيرين يوفر خيارات متعددة للوظائف التي من شأنها أن تضفي وسائل بديلة للقياس الكمي أكثر ملاءمة للتطبيقات منخفضة التركيز. على سبيل المثال، يمكن أن تكون chelated Pyro-lipids مع النحاس-64 للتصوير المقطعي انبعاثات البوزيتون وغاما العد20،أو مع البلاديوم لقياس كمي تتبع المعادن باستخدام قياس الطيف الكتلي، أو مع المنغنيز للتصوير بالرنين المغناطيسي14.
في حين أن بعض التجارب قد تتطلب فقط حجم صغير من محلول القطيرات ، هناك حاجة إلى 1 مل من محلول الدهون لملء قارورة عينة 1.85 مل. أثبت جورتز وآخرون أن التغييرات في المناولة وضغط مساحة الرأس ونسبة السائل إلى الغاز وحتى شكل القارورة يمكن أن تؤثر جميعها على مجموعات الفقاعات الدقيقة17. يمكن أن تؤثر درجة حرارة القارورة أثناء الهياج واختيار الحجم أيضا على توزيع الحجم. لذلك ، بالنسبة للأساليب الأمثل من قبل المستخدم النهائي ، من الأهمية بمكان أن تكون متسقة قدر الإمكان عند صنع قطرات. قد يتم تجميد قطرات غير مفتوحة (-20 درجة مئوية) وتذوب في وقت لاحق للاستخدام في المستقبل ولكن هذا سيؤثر على أعداد السكان الحجم.
إجراء التحريض الذي ينشط محلول الدهون في الفقاعات الدقيقة لا ينتج مجموعة متجانسة شكليا (الخطوة 4.6)؛ بدلا من ذلك ، يتم تعبئة العينة مع microbubbles ، vesicles multilamellar ، الليبوسومات ، وmicelles18،21،22. في حين أن أحجام microbubble تمتد على نطاق ميكرون ونانمتر، والهياكل الأخرى هي إلى حد كبير أقل من 800 نانومتر 23. تقنيات التحجيم المستخدمة لا تميز بين هذه الهياكل المختلفة، وبالتالي يجب افتراض عينات الفقاعات الصغيرة بعد الهياج (الخطوة 4.6، الشكل 3C)وعينات القطيرات بعد المكثف (الخطوة 4.14، الشكل 3F)كخلائط. من المرجح أن يتم الحفاظ على التجميعات غير الحساسة بالموجات فوق الصوتية (الحويصلات متعددة المصابيح والليبوسومات والميشيل) بعد التكثيف ولن تتغير حجمها لأنها لا تحتوي على نواة قابلة للتغيير التدريجي. وبما أن عداد كولتر لا يستطيع التمييز بين هذه التجمعات فوق الجزيئية المختلفة، ينبغي تفسير التحول في حجم السكان بعد التكثيف بافتراض أن نسبة ما من الهياكل النانوية غير قابلة للعكس وتسهم في السكان الملاحظين في تلك المنطقة ذات الحجم. بالإضافة إلى ذلك، تساهم هذه الهياكل في التوقيعات الطيفية والفلورسنتلهذه العينات 14. الفلورسينس والامتصاص التوقيعات من micelles، ليبوسوم / الحويصلات، وقطرات كلها متشابهة، بما في ذلك درجة من مضان إخماد14. وهكذا، من المهم أن تنظر إلى أن هناك خليط من الجمعيات في الأرقام 3C إلى 3F، الشكل 4،عينة برنامج تلفزيوني المخفف في الشكل 5،وعينة برنامج تلفزيوني المخفف في الشكل 6.
بعد اختيار الحجم وقبل التكثيف (الخطوة 4.9) ، من الممكن القضاء على التجميعات غير الفقاعة عن طريق الطرد المركزي لعينة الفقاعات الدقيقة لفصل الفقاعات المزدهرة عن التجميعات غير المزدهرة كما وصفها Feshitanوآخرون. ومع ذلك ، كشفت تجارب تكثيف microbubble لمثل هذه العينات المعزولة الحجم أن استخدام مجموعات الفقاعات الصغيرة السلائف الأكبر التي يتم اختيارها باستخدام إجراءات عزل الحجم أسفرت عن قطرات أكبر (انظر "بروتوكولات وبيانات أخرى" الخطوة S5 لفقاعة ما بعد نسج وتحجيم قطرة). منذ تطبيق المقصود من قطرات المنتجة مع هذا البروتوكول هو منصة للبذخ السلبي وتراكم بسبب صغر حجمها مقارنة مع microbubbles4،8، وكانت هناك حاجة مجموعات قطرات صغيرة قدر الإمكان. وهكذا، استخدم هذا البروتوكول عينات الفقاعات الدقيقة بعد الهياج التي لم تكن معزولة الحجم عن طريق الطرد المركزي، حتى لو كان ذلك يعني أن الميكليس غير الحساس بالموجات فوق الصوتية، والليبوسومات، والحويصلات كانت موجودة في الحل النهائي. وهذا يعني أن إجراءات القياس الكمي للتوزيع البيولوجي ستستمد إشارة لجميع الهياكل المحقونة ولا تقتصر على القطرات فقط. ومع ذلك ، نظرا لأن هذه الهياكل ذات الحجم المماثل تتراكم على الأرجح عبر آلية سلبية يمليها الحجم في المقام الأول ، فلا يشتبه فيأن هذا يجب أن يغير الاستدلالات الرئيسية التي يمكن إجراؤها إذا كان لهذا المنبر أن يستخدم في الجسم الحي ، على الرغم من أنه يجب النظر في جميع هذه الجوانب بشكل فردي اعتمادا على السياق الذي يمكن فيه استخدام المنصة. يمكن إجراء اختبارات باستخدام أذرع تجريبية باستخدام الموجات فوق الصوتية وبدونها لضمان أن القطرات الحساسة للموجات فوق الصوتية هي المسؤولة عن أي تغييرات في التوزيع الحيوي ، حيث أن التجميعات الأساسية للبيرفلوروكربون في المحلول فقط هي التي ستستجيب للموجات فوق الصوتية.
بعد الهياج ، استراحت القارورة لمدة 15 دقيقة ولوحظ وجود قسم في القارورة(الشكل 3C مقابل 3D). اختيار الحجم عن طريق الطفو هو وسيلة بسيطة للقضاء على أكبر هياكل / فقاعات من حل microbubble تنشيط8،17. في هذه الحالة، تمت إزالة الجسيمات التي يزيد قطرها عن 5 ميكرومتر في الغالب بعد اختيار الحجم(الشكل 4). يمكن ضبط مدى تحديد الحجم من خلال التحكم في مدة اختيار الحجم17. وقد أظهرت شيران وآخرون أن عدم اختيار الحجم يمكن أن يؤدي إلى الفقاعات الصغيرة المتولدة التي تحصين الأوعيةالدموية 8.
البيرفلوروكربونات لديها ميزة كونها خاملة بيولوجيا7. في حين أن نقطة الغليان ديكافلوروبوتان هو -1.7 درجة مئوية، فوق درجة حرارة الجسم، وقطرات لا تتبخر على الفور عندما تتعرض ل37 درجة مئوية (الشكل 7B). كما قطرات هي الفوقية مستقرة في 37 درجة مئوية، وهناك حاجة إلى طاقة صوتية إضافية لتبخير قطرات إلى microbubbles7،9. وقد أظهرت Poprosky وآخرون قطرات البورفيرين مكثفة عن طريق الضغط22. هذا هو وسيلة قابلة للتطبيق وحتى ضرورية عند استخدام أقل كثافة البيرفلوروكربونات ولكن الضغوط العالية قد تدمر بعض الفقاعات في هذه العملية. Octafluoropropane (C3F8) لديه نقطة غليان -36.7 درجة مئوية ، لذلك هناك حاجة إلى كل من التبريد والضغط لتكثيف القطيرات. ومع ذلك ، فإن البيرفلوروكربون الأخف يؤدي إلى قطرات أقل استقرارا. دوديكافلوروبينتان (C5F12) يمكن أن يؤدي إلى قطرات أكثر استقرارا مع نقطة الغليان من 28 درجة مئوية. ومع ذلك، فهو سائل في درجة حرارة الغرفة، وسوف تحتاج إلى طاقات صوتية أقوى لتبخير. وبالتالي ، فإن اختيار الغاز المحتوي على عامل التباين بالموجات فوق الصوتية يجب أن يأخذ في الاعتبار شروط تطبيقه البيولوجي المقصود بالإضافة إلى معايير تصنيعه. في هذا البروتوكول، تم تعيين حمام ايزوبروبانول للتكثيف إلى -15 إلى -17 درجة مئوية (الخطوة 4.7.1 والخطوة 4.13) في حين استخدمت بروتوكولات أخرى -10 درجة مئوية 5،6. حتى مع وجود نواة ديكافلوروبوتان شائعة ، قد تختلف درجة حرارة التكثيف اعتمادا على التركيب الأولي ، وتركيز الدهون الكلي ، وتكوين قشرة الدهون. إذا كنت تستخدم تركيبات أخرى، قد تكون هناك حاجة إلى التحسين لضمان التكثيف القطيرات المناسبة دون التسبب في حل لتجميد.
كما قطرات هي أصغر وأكثر استقرارا من السلائف microbubble7، فإنها يمكن أن تستفيد بشكل أفضل من آليات التراكم السلبي للبذخ في بعض الأنسجة ذات الأهمية ، مثل نفاذية وتعزيز تأثير الاحتفاظ ببعض أنواع الأورام4،24. مع الفلورسنت، ماصة بصريا، والأساليب الصوتية للكشف14،فمن الممكن استخدام صياغة واحدة لقياس امتصاص. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه المنصة للتحقيق فيما إذا كان التبخير الصوتي للقطرات يمكن أن يحسن كسر العامل المسلم خارج المستوياتالسلبية 16. لتحديد التوزيع الحيوي للعامل في الأنسجة والأعضاء ذات الأهمية بعد الحقن ، يجب حقن كمية معروفة من قطرات الدهون في الحيوان ، وقد يتم تطبيق الموجات فوق الصوتية أو لا يتم تطبيقها اعتمادا على مجموعة التحكم ، وينبغي التضحية بالحيوان بنقطة زمنية محددة مسبقا ، وينبغي إزالة الأعضاء ووزنها. يجب تجانس الأعضاء وتصفيتها وتمييعها في السطحي (المنظفات) لإزالة الخلايا من الأنسجة ، وقياسها كميا مع التحليل الطيفي الفلوري أو الأشعة فوق البنفسجية للحصول على نسب الجرعة المحقونة لكل كتلة عضو استنادا إلى إشارات بيرو. بالنسبة للخطوة 5.4.5(الشكل 5)والخطوة 5.5.5(الشكل 6)،تم استخدام مادة Triton X-100 السطحية (المنظفات) لتعطيل العينات لأنها غير فلورية عند 410 نانومتر ولا تتداخل أطوالها الموجية للامتصاص مع أطوال بيرو.
لم تكن تتميز الفقاعات الدقيقة بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية. وبما أن مصدر الليزر للأشعة فوق البنفسجية-فيس يوازي الكاشف، فإن أي فقاعات كبيرة يمكن أن تبعثر الضوء بعيدا عن الكاشف، مما يجعلها تبدو أكثر امتصاصا بصريا14. وخلافا لمطياف الأشعة فوق البنفسجية- فيس، فإن كاشف مطياف الطيف الفلوري هو/ينبغي أن يكون عموديا على مصدر الليزر لمنع المصدر من التداخل مع الكاشف. تم استخدام الأشعة فوق البنفسجية فيس لقياس امتصاص عينات القطيرات السليمة والمعطلة (الخطوة 5.4، الشكل 5). تم اختيار 300 إلى 800 نانومتر كأطوال موجية للامتصاص حيث يقع النطاقان الرئيسيان للامتصاص من البيرو-الدهون، وهما نطاق سوريت (340 إلى 500 نانومتر) والفرقة Q (640 إلى 730 نانومتر)، ضمن هذا النطاق14. عند تجميعها في قطرة (أو غيرها من الهياكل فوق الجزيئية)، وQ-الفرقة الذروة من بيرو الدهون هو أحمر تحول من 671 نانومتر إلى 700 نانومتر(الشكل 5). عندما يتم تعطيل هذا الهيكل فوق الجزيئي من قبل السطحي مثل تريتون، والتحولات الذروة مرة أخرى إلى 671 نانومتر14،15. وبناء على هذا التحول، من الممكن معرفة ما إذا كانت الدهون في بيرو في حالة تجميع أو في حالة تعطل. ويمكن استخدام نسبة من اثنين من قمم لتقدير تسوس الجمعيات مع مرور الوقت.
لقياسات الفلورسينس (الخطوة 5.5، الشكل 6)،تم اختيار الطول الموجي للإثارة من 410 نانومتر كما يتوافق مع ذروة الفرقة سوريت لبيرو الدهون غير مجمعة14. تم اختيار نطاق الطول الموجي للانبعاثات من 600 إلى 800 نانومتر حيث يتم احتواء قمم التجميعات السليمة في PBS وتعطل الدهون البيرو في تريتون ضمن هذا النطاق. التحول وزيادة في الفلورسينس(الشكل 6)بين سليمة (704 نانومتر في برنامج تلفزيوني) وتعطل (674 نانومتر في تريتون) وقعت العينات بسبب التبريد الناجم عن الهيكل. في الشكل المجمع ، كانت جزيئات بيرو الدهون معبأة معا بشكل وثيق بحيث تم امتصاص الفوتونات المولدة بواسطة جزيئات Pyro-lipid القريبة. وهذا واضح في كفاءة التبريد السليمة مقابل المعطلة. وبالتالي ، فمن الضروري لتخفيف العينات في السطحي (المنظفات) مثل 1 ٪ تريتون X - 100 لتخفيف إخماد وتعظيم إشارة لتوزيع الحيوية الكمي14.
للبساطة، تم استخدام محول الموجات فوق الصوتية الصفيف الخطي نفسه للتبخير والصورة (الخطوتان 6.5 و 6.7، الشكل 7). وكان هذا محول الموجات فوق الصوتية (جدول المواد) قادرة على الوصول إلى ذروة الضغوط السلبية اللازمة اللازمة لتبخيرقطرات 8. ملء خزان مع الماء deionized من الصنبور يولد الغازات التي تصبح مذابة في الماء (الخطوة 6.1). لتقليل التداخل من الغازات المذابة في الماء مع التبخير والتصوير ، تم استراحة الماء لمدة 24 ساعة في الخزان للسماح للغازات في الماء بالتوازن مع الغلاف الجوي (الخطوة 6.1). بدلا من ذلك، يمكن إزالة الغاز من الماء deionized مع حاوية قابلة للغلق بحجم كاف متصلة فراغ قوي بما فيه الكفاية. وأظهرت الصور بالموجات فوق الصوتية الفقاعات الدقيقة تم تكثيف بنجاح كما كانت قطرات غير قابلة للخطر / غير echogenic في الضغوط المنخفضة (الشكل 7B). إلا أنه في ارتفاع ضغط الناتج أن قطرات تبخرت في الفقاعات الدقيقة يمكن ملاحظتها ، echogenic (الشكل 7D، 7F ، 7H). في حين أن عينة القطيرات بعد المكثف تحتوي على micelles وliposomes / vesicles ، فإن هذه التجميعات غير صدى ويمكن أن تتبخر فقط قطرات في الفقاعات الدقيقة صدى. تدفق عنصر تحكم برنامج تلفزيوني من خلال الشبح لإنشاء صور خط الأساس(الأرقام 7A، 7C، 7E، 7G). ومع تزايد الضغط في برنامج تلفزيوني، لم يتم توليد أي تباين. وهذا يشير إلى أن الضغوط العالية من محول لا يمكن أن تنتج التجويف التلقائي في وسط المياه القائمة وحدها، وبالتالي يمكن أن يعزى كل التباين الأخرى المتولدة إلى عامل التباين بالموجات فوق الصوتية المستخدمة. إذا كان ضغط الناتج مرتفعا جدا ، فيمكن تدمير الفقاعات الصغيرة المتولدة. من خلال زيادة الضغط تدريجيا ومراقبة التباين المتولد ، يمكن العثور على الضغط الأمثل8. الدورة الدموية نصف عمر قطرات يمكن تحديدها بطريقة مماثلة عن طريق تبخير قطرات هي فترات زمنية معينة ومراقبة التباين المتولدة على مر الزمن7.
وباختصار، تم إنشاء قطرات متعددة الوسائط لتغيير المرحلة مع محتوى الدهون ببيرو متفاوتة مع طريقة التكثيف. وأظهر التحجيم أن هناك مقايضة بين تحميل الدهون بيرو وتركيز microbubble / قطرة. وأظهرت الأوصاف وجود اختلافات في الأشكال السليمة والمعطلة في كل من الامتصاص والفلور. أظهر التصوير بالموجات فوق الصوتية أن القطرات غير صدى عند 37 درجة مئوية وكانت قابلة للتبخير في فقاعات صغيرة صدى في ضغوط كافية. كما أظهرت الأوصاف إمكانية استبدال قطرات البيرو-الدهون بعوامل التشخيص المصاحبة لاختبارات التوزيع البيولوجي أو التراكم القطيرات. وسوف يحقق العمل المستقبلي في عتبات التبخير في المحلول ، والاستقرار في الحل ، وفي فترات الدورة الدموية في الجسم الحي في الفئران العارية.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور براندون هيلفيلد على المساعدة في بناء مبادل الغاز والدكتور ميفي هوك يان تشنغ على المناقشات التقنية. ويود المؤلفون أن يشكروا مصادر التمويل التالية: منحة أونتاريو للدراسات العليا، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية، ومعهد تيري فوكس للأبحاث، ومؤسسة الأميرة مارغريت للسرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M.
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
