Summary
Dans ce protocole, les méthodes de synthèse et de caractérisation des gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase sont décrites.
Abstract
Les gouttelettes à changement de phase sont une classe d’agents de contraste à ultrasons qui peuvent se convertir en microbulles échogéniques in situ avec l’application d’une énergie acoustique suffisante. Les gouttelettes sont plus petites et plus stables que leurs homologues à microbulles. Cependant, les agents de contraste à ultrasons traditionnels ne sont pas traçables au-delà des mesures de rétroaction acoustique, ce qui rend difficile la quantification de la biodiss distribution ou de l’accumulation ex vivo des agents de contraste. Les chercheurs pourraient devoir s’appuyer sur des particules diagnostiques compagnons fluorescentes ou optiquement absorbantes pour déduire la biodisponse. Le but de ce protocole est de détailler les étapes de création de gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase à l’aide d’une méthode de condensation. Les porphyrines sont des molécules fluorescentes avec des bandes d’absorbance distinctes qui peuvent être conjuguées sur des lipides et incorporées dans des gouttelettes pour étendre la polyvalence des gouttelettes, permettant une bio-distribution plus robuste tout en conservant les propriétés acoustiques. Sept formulations avec des teneurs variables en porphyrine-lipides et en lipides de base ont été faites pour étudier les distributions de taille des microbulles et des gouttelettes. Des caractérisations adaptées aux structures contenant de la porphyrine sont également décrites dans le protocole pour démontrer leur polyvalence analytique en solution. Le dimensionnement a montré que les diamètres moyens post-condensés étaient de 1,72 à 2,38 fois plus petits que les populations de précurseurs. La caractérisation de l’absorbance a montré que les assemblages intacts avaient un pic en bande Q de 700 nm tandis que les échantillons perturbés avaient un pic d’absorbance à 671 nm. La caractérisation de la fluorescence a montré que 30% intacts des assemblages porphyrine-lipides étaient trempés par fluorescence (>97%), avec une récupération de fluorescence obtenue lors de la perturbation. La vaporisation acoustique a montré que les gouttelettes de porphyrine n’étaient pas échogènes à des pressions plus basses et pouvaient être converties en microbulles échogéniques avec des pressions suffisantes. Ces caractérisations montrent le potentiel des gouttelettes de porphyrine à éliminer le besoin de stratégies de diagnostic compagnon basées sur l’absorbance ou la fluorescence pour quantifier la biodisance des agents de contraste par ultrasons pour l’administration ou des applications thérapeutiques in vivo ou ex vivo.
Introduction
L’imagerie par ultrasons est une forme non invasive et non ionisante d’imagerie médicale qui utilise des ondes acoustiques. Alors que les échographes sont plus portables et peuvent fournir des images en temps réel, l’imagerie échographique peut souffrir d’un faible contraste, ce qui rend difficile pour les échographistes de distinguer de manière fiable des caractéristiques pathologiques échogéniques similaires. Pour contrer cette limitation, des microbulles peuvent être injectées dans l’hôte pour améliorer le contraste vasculaire. Les microbulles sont des agents de contraste remplis de gaz de la taille d’un micron qui sont hautement échogéniques aux ondes acoustiques et peuvent fournir un contraste de récipient amélioré1,2. Les coquilles et les noyaux de gaz des microbulles peuvent être adaptés à différentes applications, telles que l’imagerie, la thrombolyse, la perméabilisation de la membrane cellulaire ou l’ouverture vasculaire transitoire2.
Un inconvénient des microbulles est leur courte demi-vie de circulation. Par exemple, les microsphères lipidiques de perflutren cliniquement disponibles n’ont qu’une demi-vie de 1,3 minutes3. Pour les longues séances d’imagerie, plusieurs injections de microbulles sont nécessaires. Un autre inconvénient des microbulles est leur grand diamètre. Alors que les microsphères lipidiques perflutren ont un diamètre d’environ 1 à 3 μm, suffisamment petites pour circuler dans le système vasculaire, elles sont trop grandes pour s’extravaser et s’accumulent passivement dans les tissus d’intérêt, tels que les tumeurs4. Une stratégie pour surmonter ces limitations consiste à condenser les microbulles du noyau gazeux en gouttelettes plus petites à noyau liquide5,6. Bien que les gouttelettes ne soient pas échogènes à l’état liquide, elles peuvent être vaporisées en microbulles lors de l’exposition à des ultrasons avec une pression négative de crête suffisamment élevée, retrouvant ainsi leur capacité à fournir un contraste. Cela permet à la gouttelette de tirer parti de la pharmacocinétique plus favorable d’un petit noyau liquide, tout en conservant la capacité de fournir un contraste lorsqu’elle est insonée et sans modifier la composition chimique4,7.
Le décafluorobutane est un composé perfluorocarboné idéal pour le déphasage entre les états gazeux et liquide5,6,7. Le décafluorobutane permet la condensation des microbulles en gouttelettes avec réduction de température seule, tandis que les perfluorocarbures moins denses nécessitent une pressurisation supplémentaire5. Cette méthode douce minimise la destruction des bulles lors de la condensation7,8,9. Comme leurs noyaux sont liquides, les gouttelettes sont non échogéniques et invisibles aux ultrasons. Cependant, avec l’application d’une énergie acoustique ou thermique suffisante, les noyaux liquides peuvent se vaporiser à nouveau dans un état gazeux, générant des microbulles échogéniques8. Cette vaporisation permet de contrôler quand et où générer des microbulles.
Alors que les gouttelettes sont utiles pour l’accumulation passive, la vaporisation in situ ou l’amélioration de la perméabilité cellulaire4,les gouttelettes (et leurs fragments) ne peuvent pas être imagées ou quantifiées ex vivo. Par conséquent, des agents de diagnostic compagnons quantifiables, tels que les fluorescents4,10,11, particules magnétiques12, agents absorbants optiquement13, sont utilisés comme analogue pour évaluer l’administration de gouttelettes aux tissus d’intérêt. Par exemple, Helfield et al. ont utilisé une co-injection de nanobilles fluorescentes pour la quantification d’images histologiques d’organes de souris car les gouttelettes ne pouvaient pas être détectées par fluorescence4. L’inconvénient des agents de diagnostic compagnons est que le composant traçable peut agir indépendamment de la gouttelette en fonction de son profil pharmacocinétique individuel.
Heureusement, la coque des microbulles et des gouttelettes peut être personnalisée. Par exemple, Huynh et al. ont démontré des agents de contraste à ultrasons avec des coquilles porphyrine-lipidique, créant des microbulles multimodales14. Les porphyrines sont une classe de composés organiques à structure macrocylique aromatique14,15. Ils sont optiquement absorbants, fluorescents et peuvent être chélatés en une grande variété de métaux pour la radiothérapie, l’imagerie à base de radionucléides ou la quantification à base de métauxtraces 14. Un exemple de porphyrine est le pyrophéophore (Pyro). En conjuquant Pyro sur des lipides, l’incorporation de pyro-lipides dans des microbulles ou des gouttelettes leur permet d’être imagés et suivis à travers de multiples modalités: acoustiquement, fluorescentement et par absorbance14. Cet agent de contraste multimodal pourrait être utilisé pour suivre et quantifier l’accumulation. Cela pourrait éliminer le besoin d’agents de diagnostic compagnons car le composant quantifiable est maintenant conjugué sur la coque, ce qui permet une quantification plus précise del’administration 16.
Ici, un protocole pour la création de gouttelettes de porphyrine multimodales à changement de phase est décrit. Comme les contrastes échographiques peuvent être utilisés comme plate-forme pour l’administration de médicaments aux tissus d’intérêt, tels que les tumeurs2,4, étendre leur détectabilité au-delà des ultrasons pourrait s’avérer utile pour la quantification de l’efficacité de l’administration. Le but de ces gouttelettes est de fournir des agents de contraste à ultrasons traçables capables d’accumulation passive in vivo,de vaporisation in situ et d’acoustique, et ayant le potentiel de quantifier la biodisance ou l’accumulation à partir d’organes ex vivo sans dépendre de capteurs secondaires. Des méthodes de caractérisation sont également décrites pour mettre en évidence le potentiel des gouttelettes de porphyrine en tant que capteurs de biodiss distribution. Les effets de la charge pyro-lipidique dans la coquille (0% à 50% par rapport molaire) sont également discutés.
Protocol
1. Films lipidiques déshydratés
- Calculez les masses de chacun des composants de la coque nécessaires (voir Fichier supplémentaire « Feuille de formule lipidique »).
NOTE: Pour ce protocole, la composition de la coquille sera: 10 molaires % 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-5000] sel d’ammonium (DSPE-PEG5K), x molaire % pyrophéophorbide conjugué 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (Pyro-SPC), et (90 - x) molaire % 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC). La quantité de Pyro-SPC variera en 7 compositions de coquilles (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Vérifiez le poids moléculaire du DSPE-PEG5K sur le flacon de base.- Adaptez le protocole à n’importe quel volume lipidique avec un volume minimum de 1 mL. Pour ce protocole, un volume lipidique total de 10 mL avec une concentration lipidique totale de 1 mg par mL a été utilisé pour toutes les formulations. La solution d’excipient sera : 10 % de propylène glycol, 10 % de glycérol et 80 % de solution saline tampon phosphate (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (voir l’étape 2.3 et « Feuille de formule lipidique »).
REMARQUE: Le protocole de synthèse des pyro-lipides est décrit dans le fichier supplémentaire « Autres protocoles et données » Étapes S1 à S1.19, qui a été modifié à partir du travail effectué par Zheng et al.15.
- Adaptez le protocole à n’importe quel volume lipidique avec un volume minimum de 1 mL. Pour ce protocole, un volume lipidique total de 10 mL avec une concentration lipidique totale de 1 mg par mL a été utilisé pour toutes les formulations. La solution d’excipient sera : 10 % de propylène glycol, 10 % de glycérol et 80 % de solution saline tampon phosphate (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (voir l’étape 2.3 et « Feuille de formule lipidique »).
- Sur la base des masses calculées (voir l’étape 1.1 et « Lipid Formula Sheet »), peser chacun des non-pyro-lipides et transférer dans un flacon en verre borosilicate de taille suffisante avec un bouchon vissé.
- Coiffez le flacon, étiquetez le bouchon et le flacon et recouvrez le fond et les parois du flacon lipidique avec du papier d’aluminium. Ce flacon sera appelé le « Flacon Lipidique » pour le reste du protocole. Conservez le flacon lipidique dans un endroit frais, sec et sombre.
- Si la formulation contient du Pyro-SPC, dissoudre 10 mg de film sec Pyro-SPC (voir « Autres protocoles et données ») dans 1 mL de chloroforme. Vortex pendant 5 s, mesurez l’absorbance et calculez le volume approprié à ajouter au flacon lipidique.
ATTENTION: Le chloroforme est un danger pour la santé, irritant et toxique. Portez une blouse de laboratoire protectrice, une protection oculaire, des gants et évitez de respirer des vapeurs.
REMARQUE: Comme Pyro-SPC est sensible à la lumière, réduisez les lumières dans la zone de travail si possible lors de la manipulation de Pyro-SPC. Gardez Pyro-SPC scellé et couvert lorsqu’il n’est pas utilisé.- Sur le spectrophotomètre ultraviolet-visible, réglez-le pour mesurer l’absorbance d’une gamme de longueurs d’onde de 800 nm à 300 nm avec des incréments de 0,5 nm, et mesurez une ligne de base avec 2000 μL de méthanol pur dans une cuvette compatible de 1 cm de longueur de trajet.
ATTENTION: Le méthanol est un danger pour la santé, irritant, toxique et inflammable. Portez une blouse de laboratoire protectrice, une protection oculaire, des gants et évitez de respirer des vapeurs. Tenir à l’écart des étincelles et de la chaleur. - Ajouter 2 μL du Pyro-SPC dans du chloroforme dans 2000 μL de méthanol, et vortex pendant 30 s. Transférez-le dans une cuvette propre et compatible de 1 cm et mesurez l’absorbance. Ajustez ce facteur de dilution si l’absorbance culmine à 667 nm hors de la plage d’absorbance du spectrophotomètre ultraviolet-visible.
REMARQUE: Lors du transfert de chloroforme ou de méthanol, utilisez une seringue en verre propre ou une pipette à déplacement positif plutôt qu’une pipette mécanique pour une meilleure précision. - Répétez l’étape 1.4.2 deux fois de plus pour obtenir des valeurs d’absorbance triples.
- Calculer en moyenne les valeurs de pic d’absorbance à 667 nm et utiliser l’équation suivante pour calculer le volume de Pyro-SPC en chloroforme nécessaire pour le flacon lipidique14,15:
où V est le volume de Pyro-SPC dans le chloroforme nécessaire, m est la masse requise de Pyro-SPC (voir Étape 1.1 et « Lipid Formula Sheet »), M est le poids moléculaire du Pyro-SPC à 1040,317 g·mol-1, A est l’absorbance moyenne à 667 nm, d est le facteur de dilution basé sur le méthanol et le Pyro-SPC en volumes de chloroforme (Étape 1.4.2), L est la longueur du chemin de la cuvette à 1 cm, et ε est un coefficient d’atténuation molaire de 667 nm de Pyro-SPC à 45000 L·mol-1·cm-1.
NOTE: Le dénominateur de l’équation est la loi de Beer-Lambert, qui relie la concentration d’un analyte en solution à l’absorbance optique mesurée sur une distance. - Ajouter le volume calculé de Pyro-SPC dans le chloroforme de l’étape précédente au flacon lipidique à l’aide d’une seringue en verre propre(Figure 1A),puis coiucher et couvrir le flacon.
REMARQUE : La figure 1 ne montre que la formulation pyro-lipidique à 30 %. - S’il reste du Pyro-SPC dans le chloroforme : Dans une hotte, décapsulez le flacon de Pyro-SPC + chloroforme de l’étape 1.4, inclinez partiellement le flacon sur le côté et versez continuellement de l’azote gazeux aussi doucement que possible dans le flacon de Pyro-SPC/chloroforme. Faites pivoter le flacon pour sécher le chloroforme à l’aide du flux d’azote gazeux et pour recouvrir uniformément le Pyro-SPC sur la paroi intérieure du flacon pendant qu’il sèche. Assurez-vous qu’aucune éclaboussure n’est faite et qu’aucune solution ne tombe.
- Une fois que le film lipidique Pyro-SPC apparaît sec et enduit sur la paroi du flacon, coupez le flux d’azote gazeux. Coiffez le flacon, scellez le col du flacon avec un film de cire et conservez le flacon à -20 °C et dans l’obscurité.
- Sur le spectrophotomètre ultraviolet-visible, réglez-le pour mesurer l’absorbance d’une gamme de longueurs d’onde de 800 nm à 300 nm avec des incréments de 0,5 nm, et mesurez une ligne de base avec 2000 μL de méthanol pur dans une cuvette compatible de 1 cm de longueur de trajet.
- Préparer une solution de chloroforme à 90 % et de méthanol à 10 % (% v/v) et en ajouter 5 mL au flacon lipidique. Coiuchez le flacon lipidique et tourbillonnez doucement pour en homogénéiser le contenu(Figure 1B).
REMARQUE: Si la formulation contient des lipides d’acide phosphatidique (tels que le sel de sodium 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphate (DSPA)), ajouter: 60% de chloroforme, 32% de méthanol et 8% d’eau doublement désionisée (% v / v / v) au flacon lipidique à la place. Des tourbillons plus intenses peuvent être nécessaires pour dissoudre complètement le contenu lipidique. - Dans une hotte, décapsulez le flacon lipidique, inclinez partiellement le flacon lipidique sur le côté et versez continuellement de l’azote gazeux aussi doucement que possible dans le flacon lipidique. Faites pivoter le flacon lipidique pour sécher la solution à l’aide du flux d’azote gazeux et recouvrir uniformément le film lipidique sur la paroi intérieure du flacon lipidique pendant qu’il sèche. Assurez-vous qu’aucune éclaboussure n’est faite et qu’aucune solution ne tombe.
- Une fois que les lipides apparaissent secs et enduits sur les parois intérieures du flacon lipidique (Figure 1C), coupez le flux d’azote gazeux, recouvrez le fond et la paroi du flacon lipidique avec du papier d’aluminium et recouvrez l’ouverture supérieure avec du papier d’aluminium percé de quelques trous avec une aiguille pour la ventilation (Figure 1D).
- Étiquetez et placez le flacon lipidique recouvert à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide et laissez les lipides sécher davantage pendant au moins 24 h mais pas plus de 72 h.
REMARQUE: Le protocole peut être repris plus tard, après 24 à 72 h.
2. Hydratation lipidique
- Remplissez un sonicator de bain avec de l’eau et chauffez-le à 70 °C. Activez la sonication pour aider à mélanger l’eau.
ATTENTION: L’eau et le sonicator sont à haute température. Évitez de toucher l’eau et le sonicator. Portez une protection oculaire, une blouse de laboratoire protectrice et des gants de protection. - Une fois que le sonicateur de bain a atteint 70 °C, retirez le flacon lipidique du dessiccateur sous vide. Réduisez les lumières dans la zone de travail si possible.
- Préparer une solution d’excipient de 10 % de propylène glycol, 10 % de glycérol, 80 % de PBS (% v/v/v) et en ajouter 10 mL au flacon lipidique (voir l’étape 1.1.1 et « Feuille de formule lipidique »).
REMARQUE: Si vous utilisez une pipette à déplacement d’air standard, faites attention lorsque vous manipulez des solvants visqueux comme le propylène glycol et le glycérol. Aspirer et plonger lentement le volume et attendre que le volume résiduel atteigne le fond de l’embout de la pipette. Assurez-vous que le liquide ne s’accroche pas à l’extérieur de l’extrémité de la pipette lors du transfert de volumes en se déplaçant lentement. - Coiffez le flacon lipidique, retirez le couvercle en aluminium et faites tourbillonner doucement le flacon dans le sonicateur de bain pendant 15 minutes pendant que la sonication est activée pour dissoudre les lipides. Assurez-vous que le cou du flacon lipidique est au-dessus de l’eau. Vérifiez de temps en temps si le bouchon du flacon est bien fermé.
- De temps en temps, retirez le flacon lipidique du bain-marie. Tenez-le brièvement à la lumière pour vérifier si le contenu est complètement dissous (Figure 1E).
- Si le contenu du flacon lipidique n’est pas homogénéisant, retirez le flacon lipidique du sonicateur de bain. Fixez le capuchon, tourbillonnez plus agressivement et retournez-le au sonificateur de bain.
- Retirez le flacon lipidique du sonicateur de bain et éteignez le sonicateur de bain. Séchez l’extérieur du flacon lipidique avec des serviettes en papier et réétiquetez le flacon lipidique.
- Couvrez le flacon lipidique avec du papier d’aluminium et refroidissez le flacon lipidique à température ambiante dans un endroit frais, sombre et sec pendant 10 minutes.
- Aliquot le contenu du flacon lipidique: environ 2 mL de la solution lipidique dans des flacons de sérum transparent en verre borosilicate de 3 mL (diamètre de la bouche interne de 7 mm, diamètre de la bouche externe de 13 mm).
REMARQUE: Certains protocoles peuvent utiliser 1,5 mL de solution lipidique dans le flacon de 3 mL7. - Boucher les flacons de sérum avec des bouchons en caoutchouc chlorobutyle gris de type lyophilisation (diamètre de la bouche intérieure de 7 mm, diamètre de la bouche extérieure de 13 mm) et fixer le bouchon en caoutchouc avec des joints en aluminium dérachants (diamètre de la bouche extérieure de 13 mm) et un sertisseur(Figure 1F).
- Aspirer, dégazer et re-pressuriser la solution lipidique dans chacun des flacons sériques4,5,7 ( Figure2).
REMARQUE: Reportez-vous à « Autres protocoles et données » pour obtenir des instructions sur la façon d’assembler l’échangeur de gaz et plus de détails.- Fermez chaque soupape entre et y compris la soupape de pression A et la soupape de bouteille de gaz (Figure 2). Connectez les flacons de sérum aux aiguilles du collecteur, puis ouvrez les vannes de collecteur correspondantes, puis ouvrez la soupape de vide A et la soupape de vide B, et le vide à -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) pendant 5 minutes pour éliminer l’air atmosphérique. NE PAS aspirer le liquide (voir « Autres protocoles et données » Étapes S3 à S3.1.5).
ATTENTION: La pompe à vide peut éclater si elle n’est pas manipulée correctement. N’utilisez pas la pompe à vide avec des produits chimiques organiques, acides ou basiques. - Avec l’aspirateur toujours allumé, tenez un flacon de sérum (pour l’empêcher de se balancer) et tapotez-le rapidement avec un stylo ou un marqueur pour dégazer. Continuez à tapoter jusqu’à ce qu’aucune bulle ne se forme et qu’il n’y ait pas de bulles dans le flacon. NE LAISSEZ PAS de liquide être aspiré. Arrêtez le tapotement si nécessaire. Répétez l’opération pour tous les flacons de sérum connectés. Après avoir dégazé tous les flacons de sérum, FERMEZ la soupape de vide A et la soupape de dépression B et ÉTEIGNEZ la pompe à vide (voir les étapes S3.2 à S3.2.3 « Autres protocoles et données »).
- Avec le flacon de sérum toujours connecté à l’aiguille et avec la pompe à vide éteinte, tournez lentement la vanne de la bouteille de gaz 1/16 à 1/8 (environ 22,5 à 45 ° de révolution complète) dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour l’ouvrir partiellement, puis ouvrez la vanne à poignée en T et tournez LENTEMENT la vanne du régulateur d’air dans le sens des aiguilles d’une montre à une jauge de 3 psi (20,7 kPa). Ensuite, ouvrez la soupape de pression A et la soupape de pression B (voir les étapes S3.3 à S3.3.21 « Autres protocoles et données »).
ATTENTION: La bouteille de gaz décafluorobutane est sous pression et peut exploser si elle est chauffée. Gardez le chemin de la chaleur et de l’impact. Le décafluorobutane peut provoquer un déplacement et une suffocation de l’oxygène. Portez une protection oculaire appropriée et manipulez-la dans une hotte aspirante. S’il est mal manipulé, il est possible d’aspirer la bouteille de gaz, ce qui peut provoquer une dé-pressurisation et une implosion rapides. L’ouverture de la vanne de la bouteille de gaz plus de 1/8 tour peut endommager le régulateur d’air. - Après 30 s de pressurisation (la jauge doit toujours lire 3 psi (20,7 kPa)), fermez toutes les vannes de collecteur avec des flacons de sérum, débranchez les flacons de sérum, gainez les aiguilles et FERMEZ la vanne de bouteille de gaz.
- Soulagez la pression accumulée en ouvrant partiellement une seule vanne de collecteur jusqu’à ce que l’aiguille de la jauge du régulateur d’air aille à sa position de repos. Ensuite, fermez tout ce qui se trouve entre et y compris les vannes du collecteur et la poignée en T.
- Fermez chaque soupape entre et y compris la soupape de pression A et la soupape de bouteille de gaz (Figure 2). Connectez les flacons de sérum aux aiguilles du collecteur, puis ouvrez les vannes de collecteur correspondantes, puis ouvrez la soupape de vide A et la soupape de vide B, et le vide à -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) pendant 5 minutes pour éliminer l’air atmosphérique. NE PAS aspirer le liquide (voir « Autres protocoles et données » Étapes S3 à S3.1.5).
- Étiquetez les flacons de sérum et conservez-les à 4 °C et dans l’obscurité. Assurez-vous que toutes les vannes de l’échangeur de gaz sont fermées et que la pompe à vide est éteinte par la suite.
REMARQUE: Le sérum doit être stable jusqu’à 4 mois dans cet état. À cette étape, le protocole peut être repris plus tard, après 4 mois au maximum.
3. Flacons de décafluorobutane
- Avec des flacons de sérum transparent en verre borosilicate propres et vides de 3 mL (diamètre de la bouche intérieure de 7 mm, diamètre de la bouche extérieure de 13 mm), les envelopper de bouchons en caoutchouc chlorobutyle gris de style lyophilisation (diamètre de la bouche intérieure de 7 mm, diamètre de la bouche extérieure de 13 mm) et fixer le bouchon en caoutchouc avec des joints en aluminium dérachants (diamètre de la bouche extérieure de 13 mm) et un sertisseur4, 7,8.
- Suivez l’étape 2.9.1 pour aspirer l’air atmosphérique (voir les étapes S3.1 à S3.1.5 « Autres protocoles et données »).
- Sautez le dégazage et suivez les étapes 2.9.3 à 2.9.5 pour pressuriser à nouveau le flacon (voir « Autres protocoles et données », étapes S3.3 à S3.3.21).
- Étiqueter les flacons de décafluorobutane et les conserver à 4 °C et dans l’obscurité. Assurez-vous que toutes les vannes de l’échangeur de gaz sont fermées et que la pompe à vide est éteinte par la suite.
REMARQUE: Des flacons de sérum remplis de décafluorobutane seront nécessaires pour la condensation des gouttelettes. Ils devraient être stables jusqu’à 4 mois dans cet état. À cette étape, le protocole peut être repris plus tard, après 4 mois au maximum.
4. Formation de gouttelettes
- Retirer une solution lipidique hydratée dans le flacon de sérum (à partir de l’étape 2.10) du réfrigérateur.
- À l’aide d’un décapant, retirez le joint en aluminium du flacon de sérum et transférez 1 mL de la solution lipidique dans un flacon d’échantillon en verre borosilicate de 1,85 mL (avec un bouchon à vis phénolique) en laissant la solution lipidique s’écouler le long de la paroi intérieure. Ne créez pas de bulles.
- S’il reste une solution lipidique dans le flacon de sérum, suivez les étapes 2.9 à 2.10 pour dégazer et pressuriser à nouveau le flacon de sérum pour le stockage (voir « Autres protocoles et données » Étapes S3 à S3.3.21).
- Avec le flacon d’échantillon de 1,85 mL, écouler doucement dans le gaz décafluorobutane dans l’espace de tête du flacon d’échantillon à l’aide de l’échangeur de gaz (voir la figure 2 pour les noms de vannes spécifiques).
- Assurez-vous que toutes les vannes de l’échangeur de gaz sont correctement fermées et que la pompe est éteinte.
ATTENTION: Si cela n’est pas fait correctement, il est possible d’aspirer la bouteille de gaz provoquant une décompression et une implosion rapides. - Ouvrez une vanne de collecteur et détélez soigneusement l’aiguille correspondante du collecteur.
ATTENTION: Objet tranchant, évitez le contact/perçage. - Ouvrez la soupape de pression A et la soupape de pression B et tournez la vanne de bouteille de gaz 1/16 à 1/8 (environ 22,5 à 45 ° de révolution complète) dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour ouvrir partiellement, puis ouvrez la vanne à poignée en T.
ATTENTION: N’ouvrez pas la soupape de la bouteille de gaz plus que cela, car cela pourrait endommager le régulateur d’air. - Décapsipez le flacon d’échantillon avec la solution lipidique et déplacez-le de sorte que l’aiguille manifold soit au-dessus de l’interface liquide-air à l’intérieur du flacon. Tenez le flacon là.
-
Tournez LENTEMENT la vanne du régulateur d’air dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que l’aiguille de la jauge du régulateur d’air se déplace légèrement de sa position de repos et que le gaz perfluorocarboné s’écoule doucement de l’aiguille du collecteur. Laissez le gaz perfluorocarboné s’écouler doucement dans l’espace de tête du flacon pendant 30 s. Ne créez pas de bulles. Réglez la vanne du régulateur d’air si nécessaire.
REMARQUE: L’interface liquide-air doit être légèrement perturbée par le flux de gaz décafluorobutane. Comme le système est maintenant ouvert, la jauge du régulateur d’air ne peut pas lire correctement la pression. - Après 30 s, coincez soigneusement et rapidement le flacon d’échantillon sans trop déplacer le flacon.
- Fermez la vanne de la bouteille de gaz (dans le sens des aiguilles d’une montre), la vanne à poignée en T, la vanne du régulateur d’air (dans le sens inverse des aiguilles d’une montre), la soupape de pression A, la soupape de pression B et la vanne de collecteur.
- Gainez soigneusement l’aiguille.
- Étiquetez le flacon d’échantillon et scellez le col avec un film de cire dans le sens des aiguilles d’une montre(figure 3A et 3B).
REMARQUE: Les figures 3B à 3F ne montrent que la formulation pyro-lipidique à 30%.
- Assurez-vous que toutes les vannes de l’échangeur de gaz sont correctement fermées et que la pompe est éteinte.
- Conserver le flacon d’échantillon dans l’obscurité et à 4 °C pendant au moins 10 min ou jusqu’à 24 h.
REMARQUE: À cette étape, le protocole peut être repris plus tard, 24 heures au maximum. - Placez environ 100 g de glace carbonique (dioxyde de carbone) dans un récipient isotherme et placez de la glace ordinaire dans un autre récipient isotherme. Récupérez les flacons de sérum de décafluorobutane préparés mentionnés à l’étape 3, deux aiguilles de calibre 20 de 3,81 cm (1,5 pouce), une seringue en plastique de 1 mL (détez le piston avant utilisation), un récipient de 200 mL, des pinces métalliques et un thermomètre (-20 à 100 °C).
REMARQUE: Si vous ne faites que des microbulles, il n’y a pas besoin d’isopropanol, de glace sèche et de glace. - Placer le flacon d’échantillon avec la solution lipidique dans l’agitateur mécanique et agiter pendant 45 s (Figure 3C).
- Après l’agitation mécanique, placez le flacon d’échantillon sur le côté droit, à l’abri de la lumière, et lancez un compte à rebours de 15 minutes pour refroidir le flacon et sélectionnez la taille des microbulles8,17.
- Lorsque le compte à rebours de 15 minutes a atteint 10 minutes (5 minutes restantes sur le compte à rebours), remplissez un récipient avec environ 200 mL d’isopropanol et refroidissez-le à -20 °C avec de la glace carbonique à l’aide de pinces métalliques.
REMARQUE: La température cible est de -15 à -17 ° C, mais l’isopropanol se réchauffera lors de la manipulation des microbulles.
ATTENTION: L’isopropanol est inflammable. Tenir à l’écart de la chaleur et des étincelles. La glace carbonique peut causer des dommages à la peau. Poignée avec pinces. Portez des gants, une protection oculaire et une blouse de laboratoire protectrice.
- Lorsque le compte à rebours de 15 minutes a atteint 10 minutes (5 minutes restantes sur le compte à rebours), remplissez un récipient avec environ 200 mL d’isopropanol et refroidissez-le à -20 °C avec de la glace carbonique à l’aide de pinces métalliques.
- Une fois que les microbulles ont été sélectionnées pendant 15 minutes, recherchez la partition de taille sélectionnée à l’intérieur du flacon d’échantillon(Figure 3D).
- Gardez le flacon d’échantillon sur le côté droit, décapsez soigneusement le flacon d’échantillon et retirez environ 0,7 mL de la cloison inférieure avec une aiguille de calibre 20 de 1,5 pouce attachée à une seringue en plastique de 1 mL. Assurez-vous qu’aucune des partitions supérieures n’est retirée. Ne faites pas glisser la seringue pour retirer les poches d’air.
- Insérez une aiguille de calibre 20 différente dans un flacon de sérum de décafluorobutane (en gardant l’aiguille près du haut du flacon de sérum) pour éventiler, puis insérez l’aiguille / seringue avec les microbulles de taille sélectionnée.
- Transférez lentement les microbulles de taille sélectionnées. Inclinez le flacon et inclinez la seringue pour laisser le liquide glisser le long de la paroi intérieure du flacon de sérum au décafluorobutane.
- Une fois que toute la solution de microbulles sélectionnée par la taille a été transférée, retirez l’aiguille avec la seringue, mais gardez l’aiguille de ventilation à l’intérieur pour soulager la pression négative (Figure 3E).
- Si vous ne faites que des microbulles de taille sélectionnée, arrêtez-vous ici. Gardez l’aiguille de ventilation à l’intérieur et près du sommet. Conservez le flacon dans l’obscurité et à température ambiante.
- Ajouter de petites quantités de glace carbonique ou d’isopropanol à température ambiante au bain d’isopropanol pour s’assurer que la température du bain est comprise entre -15 et -17 °C.
- Avec l’aiguille de ventilation de calibre 20 insérée près du haut du flacon de sérum, placez le flacon de sérum dans le bain d’isopropanol, en maintenant le niveau de microbulles en dessous du niveau de l’isopropanol mais le col du flacon au-dessus, et faites tourbillonner par intermittence le flacon de sérum pendant 2 minutes pour condenser les microbulles.
REMARQUE : Cette étape a été modifiée à partir des travaux effectués par Sheeran et al.6- Ne pas faire tourbillonner le flacon de sérum en continu dans l’isopropanol et ne pas laisser la solution geler. Tourbillonner pendant environ 5 s et soulever le flacon de sérum de l’isopropanol. Vérifiez s’il n’y a pas de nucléation de la glace et recommencez à tourbillonner dans l’isopropanol. S’il y a formation de glace, faites tourbillonner le flacon de sérum dans l’air jusqu’à ce qu’il se dissipe.
- Après la condensation de 2 minutes, retirez le flacon de sérum du bain d’isopropanol et retirez l’aiguille de ventilation.
REMARQUE: Les microbulles doivent avoir été condensées en gouttelettes, comme l’indique le changement de translucidité(figure 3E par rapport à la figure 3F pour la formulation pyro-lipidique à 30%). - Essuyez le flacon de sérum, étiquetez-le et placez-le sur de la glace ordinaire dans un récipient sombre et isolé jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Les gouttelettes non ouvertes (joint en aluminium intact) doivent être stables dans cet état jusqu’à 6 h tant que la glace fondue est remplacée au besoin.
- Lorsqu’il est prêt à l’emploi, retirez le joint en aluminium avec le décapant. Conservez les gouttelettes (même les flacons ouverts) sur la glace et dans l’obscurité lorsqu’ils ne sont pas utilisés. Gardez les microbulles dans l’obscurité et à température ambiante.
5. Caractérisation morphologique et optique
- Préparer 1% de Triton en : ajoutant 5 mL de Triton X-100 dans 500 mL de PBS (1x, pH 7,4) et remuer avec une barre d’agitation magnétique jusqu’à homogénéité14.
REMARQUE: Triton X-100 très visqueux. Si vous utilisez une pipette à déplacement d’air standard, faites attention lors de la manipulation. Aspirer et plonger le volume lentement et attendre que le volume résiduel atteigne le fond de la pipette. Assurez-vous que le liquide ne s’accroche pas à l’extérieur de l’extrémité de la pipette lors du transfert de volumes en se déplaçant lentement. - Préparez les gouttelettes (étape 4). Si des microbulles sont également caractérisées, prélever un petit volume des microbulles de taille sélectionnée avant la condensation (étape 4.9).
- Dimensionner les microbulles ou les gouttelettes sur un compteur coulter (CC) de 0,2 à 6 μm pour obtenir des distributions granulométriques et des concentrations (Figure 4).
- Remplissez une cuvette propre de 20 mL avec 10 mL d’électrolyte CC qui a été filtré à travers un filtre à membrane de polyéthersulfone poreux de 0,2 μm. Mesurez-le sur le CC avec trois exécutions pour obtenir une base de référence.
- Dans le même électrolyte CC, ajouter 5 μL d’échantillon de microbulles ou de gouttelettes et mélanger doucement.
REMARQUE: 2 à 20 μL d’échantillon peuvent être ajoutés en fonction de la concentration de l’échantillon. - Exécutez l’échantillon sur le CC (3 essais), soustrayez la ligne de base moyenne et calculez la distribution de taille et la concentration (nombre par mL).
- Mesurer l’absorbance des gouttelettes par spectroscopie UV-Vis (Figure 5).
REMARQUE : La figure 5 ne montre que la formulation pyro-lipidique à 30 %.- Sur le spectrophotomètre UV-Vis, réglez la mesure d’absorbance sur des longueurs d’onde de 800 nm à 300 nm avec des incréments de 0,5 nm et activez la correction de la ligne de base.
- À l’aide d’une cuvette propre de 1 cm de longueur de trajet remplie de PBS, effectuez une mesure de référence. Assurez-vous que le volume est suffisamment élevé pour croiser le trajet du faisceau spectroscope.
- Diluer les gouttelettes de pyro-lipides dans du PBS (recommander 2 μL à 500 μL de gouttelettes dans 2000 μL de diluant) et mélanger par pipetage.
REMARQUE: NE PAS vortex sinon les assemblages seront détruits. - Transférer les gouttelettes diluées dans une cuvette nettoyée et mesurer l’absorbance. Modifiez les dilutions si nécessaire.
- Répétez les étapes 5.4.1 à 5.4.4, mais utilisez 1% Triton au lieu de PBS. Après dilution, transférer l’échantillon dans un flacon scellable/bouché et vortex pendant 30 s avant de mesurer.
- Mesurer la fluorescence des microbulles ou des gouttelettes (Figure 6).
REMARQUE : La figure 6 ne montre que la formulation pyro-lipidique à 30 %.- Sur le spectrophotomètre de fluorescence, réglez la longueur d’onde d’excitation sur 410 nm et la plage de longueur d’onde d’émission de 600 à 750 nm avec des incréments de 1 nm.
- Mesurez la fluorescence du diluant PBS pour obtenir une ligne de base à l’aide d’une cuvette compatible avec le spectrophotomètre de fluorescence.
- Diluer les microbulles ou gouttelettes pyro-lipidiques dans du PBS (recommander 0,5 μL à 10 μL de gouttelettes dans 2000 μL de diluant) et mélanger par pipetage.
REMARQUE: NE PAS vortex sinon les assemblages seront détruits. - Transférer l’échantillon dilué dans la cuvette nettoyée et baseline et mesurer la fluorescence. Modifiez les dilutions si nécessaire et évitez la saturation du signal.
- Répétez les étapes 5.5.1 à 5.5.4, mais utilisez 1 % de Triton au lieu de PBS. Après dilution dans 1% de Triton, transférer l’échantillon dilué dans un flacon scellable/bouché et vortex pendant 30 s avant de mesurer. Ajoutez suffisamment de volume pour vous assurer que les bulles générées par le vortex sont au-dessus du trajet laser.
REMARQUE: Le signal de fluorescence de l’échantillon dans Triton sera beaucoup plus élevé que dans PBS en raison de la désenchantement de la fluorescence (Figure 6).
6. Imagerie par vaporisation
- Remplissez un réservoir d’eau de taille appropriée avec de l’eau désionisée et laissez-le reposer pendant 24 heures pour équilibrer les gaz dans l’eau avec l’atmosphère.
- Préparer les gouttelettes et les conserver sur la glace et dans l’obscurité jusqu’à utilisation.
- Fabriquer un tube fantôme d’écoulement à partir d’une gélose à 2 % comme décrit par Pellow et al.18 Immerger le fantôme dans un réservoir d’eau chauffé à 37 °C.
- Réchauffez le PBS à 37 °C et circulez à travers le fantôme.
- Avec un système d’échographie préclinique et un transducteur linéaire à matrice 21 MHz (voir tableau des matériaux),alignez la vue sur le fantôme d’écoulement, réglez-la sur l’imagerie en mode B, réglez les pressions de sortie et capturez des vidéos ou des images pour acquérir des lignes de base à chaque pression.
- Diluer 20 μL de la gouttelette dans 50 mL de PBS à 37 °C et mélanger doucement. Transférer la solution dans une seringue en plastique de 30 mL et pousser la solution à travers le fantôme de la gélose.
- En gardant le même alignement que l’étape 6.5, augmentez les pressions de sortie jusqu’à ce que la vaporisation soit observée (taches brillantes dans le fantôme, voir Figure 7).
REMARQUE : La figure 7 montre l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 30 %. Ce transducteur linéaire 21 MHz disponible dans le commerce est capable d’imager et de vaporiser des gouttelettes.
Representative Results
Des échantillons de microbulles précondensés et de taille sélectionnée (n = 3) et des échantillons de gouttelettes post-condensées (n = 3) ont été dimensionnés sur un compteur Coulter (CC) avec une ouverture de 10 μm. Une limitation de l’ouverture de 10 μm est qu’il ne peut pas mesurer des particules inférieures à 200 nm, ce qui peut biaiser la taille et la concentration moyennes. La figure 4 montre les données de dimensionnement pour chacune des formulations à teneur en pyro-lipides. Le tableau 1 présente des statistiques basées sur les données de dimensionnement. En utilisant un rapport de diamètres moyens pré- et post-condensés, les résultats ont montré que la formulation pyro-lipidique à 0% avait le plus petit décalage de diamètre moyen à 1,72 ± 0,02. La formulation pyro-lipidique à 50 % avait le plus grand diamètre moyen à 2,38 ± 0,08. L’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 1 % avait la concentration observée la plus élevée à (2,71 ± 0,13) ×10 10 /mL, tandis que l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 40 % avait la concentration observée la plus faible à (7,36 ± 0,81) × 109 /mL. Les données de dimensionnement ont montré que l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 10% avait le plus petit dimètre de crête à 261 ± 13 nm tandis que l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 50% avait le plus grand à 390 ± 55 nm. Généralement, à mesure que la teneur en pyro-lipides augmentait, la concentration diminuait et le diamètre moyen augmentait. Comme les échantillons post-condensés sont basés sur l’échantillon de microbulles précurseurs, la tendance s’est produite pour les deux types d’agents de contraste à ultrasons. Au fur et à mesure que la teneur en pyro-lipides augmentait, une sous-population de microbulles (avec une taille maximale d’environ 2000 μm) a commencé à se former. Ce pic secondaire n’était pas présent dans l’échantillon de microbulles pyro-lipidiques à 0 % et le plus apparent dans les populations de pyro-lipides à 40 % et 50 %.
La figure 5 montre des mesures d’absorbance représentatives de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 30 %. Le pic de l’échantillon intact dans PBS était de 700 nm tandis que l’échantillon perturbé dans Triton a déplacé le pic à 671 nm. Cela a montré que les assemblages intacts ont des propriétés optiques différentes de ceux des composants lipidiques individuels non assemblés.
La figure 6A montre des mesures de fluorescence représentatives de l’échantillon de microbulles pré-condensées tandis que la figure 6B montre un échantillon de gouttelettes post-condensées avec 30% de pyro-lipides. L’échantillon intact dans PBS avait un pic de fluorescence à 704 nm tandis que la forme perturbée avait un pic à 674 nm. En soustrayant la zone perturbée sous la courbe avec la zone intacte sous la courbe et en divisant la différence par la zone perturbée sous la courbe, on donne l’efficacité de trempe, qui s’avère être de 98,61% et 98,07% pour l’échantillon de microbulles pyro-lipidiques à 30% et l’échantillon de gouttelettes, respectivement.
Pour démontrer la conversion des gouttelettes en microbulles, des gouttelettes diluées ont été imagées et vaporisées dans un fantôme d’écoulement à 37 °C avec un système à ultrasons. La figure 7 montre des images échographiques représentatives de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques à 30 % imagé à différentes pressions. À basse pression(Figure 7A),il y avait très peu de signal, seulement un signal de fond provenant de bulles d’air bloquées par la synthèse de la gélose. En effet, les gouttelettes ne sont pas échogènes et ne diffusent pas d’ultrasons. À une puissance légèrement élevée, quelques microbulles ont été générées(figure 7B),comme le montre l’apparition de mouchetures brillantes. Au fur et à mesure que la pression augmentait, davantage de microbulles étaient générées(Figure 7C et 7D). Cela a également démontré que les gouttelettes ne se vaporisent pas spontanément à 37 °C.
Figure 1: Images des étapes pour former la solution pyro-lipidique à 30%. A) Poudre lipidique plus Pyro-SPC dans le chloroforme. B) Solution dissolvante ajoutée. C) Film lipidique séché et enduit sur la paroi intérieure du flacon. D) Flacon lipidique enveloppé dans du papier d’aluminium (feuille extérieure scotchée pour réutilisation). E) Solution lipidique hydratée. F) Solution lipidique en flacon de sérum. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: L’échangeur de gaz à 10 collecteurs. Les vannes référencées dans le protocole sont étiquetées. Voir le fichier supplémentaire « Autres protocoles et données » pour obtenir des instructions sur la façon d’assembler l’échangeur de gaz. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: A) Les solutions lipidiques des 7 formulations (0% à 50% pyro-SPC) dans des flacons d’échantillons. Les figures B à D montrent des images des mesures prises pour fabriquer 30% de gouttelettes pyro-lipidiques. B) Solution pyro-lipidique à 30 % dans un flacon d’échantillon. C) Post-agitation. D) 15 min taille sélectionnée. E) Cloison inférieure transférée dans le flacon de décafluorobutane. D) Post-condensation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Données de dimensionnement du compteur coulter (CC) des échantillons de microbulles et de gouttelettes sélectionnés par taille avec une teneur différente en coquille pyro-lipidique (n = 3). Les lignes vertes pleines représentent des microbulles et les lignes cyan pointillées représentent des gouttelettes. A) 0 % Pyro-SPC. B) 1 % Pyro-SPC. C) 10 % pyro-RCP. D) 20 % pyro-RCP. E) 30 % pyro-RCP. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H) Concentrations totales observées d’échantillons de microbulles et de gouttelettes du CC sur la base de la teneur en pyro-RCP dans la coquille. Toutes les barres d’erreur indiquent un écart-type. Toutes les mesures ont été effectuées en utilisant une ouverture de 10 μm qui a une plage de taille de 200 nm à 6000 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Mesures représentatives de l’absorbance par spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis) de 300 à 800 nm de l’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques post-condensées à 30 % diluées dans du PBS et dans du Triton à 1 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Émission de fluorescence représentative de 600 à 750 nm excitée à 410 nm. A) Échantillon de microbulles pyro-lipidiques pré-condensé de 30 % sélectionné en taille dans pbS et dans 1 % de triton. B)Échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques post-condensées à 30 % dans le PBS et dans le Triton à 1 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7: Images échographiques représentatives d’un fantôme à flux d’agar à 37 °C prises avec un transducteur à réseau linéaire préclinique de 21 MHz en mode B (voir Tableau des matériaux). La colonne de gauche (Figures A, C, E, & G) montre les contrôles PBS. La colonne de droite(figures B, D, Fet H)montre 20 μL d’échantillon de gouttelettes pyro-lipidiques post-condensées à 30 % diluées dans 50 mL de PBS à 37 °C. Chaque rangée représente les pressions négatives de pointe en champ libre, qui ont été estimées à partir des travaux effectués par Sheeran et al.8 Les triangles jaunes indiquent la profondeur de mise au point. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Méthode | Agent | Pyro Shell % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| CC | Bulles | Conc. [/mL] | (2,76 ± 0,28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1,91 ± 0,22) × 10^10 | (1,47 ± 0,05) × 10^10 | (8,47 ± 0,95) × 10^9 | (9,89 ± 0,15) × 10^9 |
| CC | Bulles | Crête [nm] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| CC | Bulles | Moyenne [nm] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| CC | Bulles | Médiane [nm] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| CC | Gouttelettes | Conc. [/mL] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2,71 ± 0,13) × 10^10 | (1,75 ± 0,18) × 10^10 | (1,72 ± 0,13) × 10^10 | (1.09 ± 0.01) × 10^10 | (7,36 ± 0,81) × 10^9 | (7,38 ± 0,28) × 10^9 |
| CC | Gouttelettes | Crête [nm] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| CC | Gouttelettes | Moyenne [nm] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| CC | Gouttelettes | Médiane [nm] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
Tableau 1 : Statistiques des données de dimensionnement des échantillons de microbulles et de gouttelettes ayant une teneur en Pyro-SPC différente de celles du compteur Coulter (CC) (n = 3). Toutes les erreurs indiquent un écart-type.
Renseignements supplémentaires - Feuille de formule lipidique : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Informations supplémentaires - Autres protocoles et données : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Après avoir additionné tous les composants lipidiques ensemble (étapes 1.2 et 1.4.5, figure 1A),une solution de chloroforme et de méthanol (et d’eau si des lipides d’acide phosphatidique comme le DSPA sont présents) a été ajoutée pour s’assurer que les composants pyro-lipidiques et non pyro lipidiques étaient complètement homogénéisés (étape 1.5, figure 1B). Pour éviter la formation de vésicules lipidiques à composition lipidique hétérogène, les lipides dissous ont été séchés et enduits à l’intérieur de la paroi du flacon sous forme de film mince (Figure 1C). Le revêtement (étape 1.6) facilite également l’hydratation (étapes 2.1 à 2.4) car il augmente la surface du film séché. Le séchage (étape 1.6, figure 1C)et l’aspiration (étape 1.8, figure 1D)ont été effectués pour s’assurer que le chloroforme et le méthanol étaient complètement évaporés, car ces produits chimiques peuvent perturber la formation de microbulles. Alors que le protocole peut être réduit pour rendre les volumes de solution lipidique aussi bas que 1 mL, des volumes plus importants peuvent réduire la variation de flacon à flacon. Bien que cela puisse entraîner le risque de dégrader le Pyro-SPC lorsqu’il n’est pas utilisé, l’état de stockage de la solution lipidique (étapes 2.9 à 2.10) visait à réduire ce risque. L’étape de dégazage avec l’échangeur de gaz (étape 2.9.2, figure 1F et figure 2)sert à éliminer autant d’oxygène que possible pour éviter l’oxydation. Il n’est pas recommandé de stocker des solutions lipidiques contenant des lipides de porphyrine pendant que les gaz atmosphériques sont encore dissous dans la solution (Figure 1E).
À l’étape 2.10, la solution lipidique se trouve dans un flacon de sérum avec un espace de tête sous pression, semblable à la façon dont les microsphères lipidiques perflutren de l’agent de contraste à ultrasons cliniquement approuvé sont vendues (similaire à la figure 1F). Des travaux internes ont montré que des microbulles stables ne pouvaient pas être générées par agitation mécanique avec la présence de pyro-lipides si le capuchon était un matériau mou comme le bouchon en caoutchouc. Par conséquent, la solution lipidique a été transférée dans un flacon d’échantillon avec un capuchon phénolique non en caoutchouc (étapes 4.1 à 4.4, figure 3A et 3B). Lorsque le décafluorobutane a été coulé dans le flacon de l’échantillon (étapes 4.1 à 4.4), le décafluorobutane plus dense devrait déplacer l’air atmosphérique dans l’espace de tête du flacon de l’échantillon. Actuellement, on ne sait pas pourquoi les pyro-lipides sont incapables de former des microbulles avec des bouchons en caoutchouc. Sans pyro-lipides, des microbulles stables peuvent être fabriquées directement dans les flacons de sérum avec des bouchons en caoutchouc4,7. Ainsi, il est recommandé d’utiliser l’échangeur de gaz pour dégazer et re-pressuriser le flacon de sérum puis agiter le flacon de sérum lui-même pour des formulations non pyro-lipidiques4,5,6,7 (voir « Autres protocoles et données »). L’avantage de pouvoir agiter mécaniquement dans le flacon de sérum est que l’espace de tête peut être pressurisé et que la sélection de la taille peut être effectuée en inversant le flacon de sérum à l’envers8. Dans ce protocole, la formulation de pyro-lipides à 0 % a été transférée dans un flacon d’échantillon (étapes 4.1 à 4.4) pour être cohérente avec les formulations contenant des pyro-lipides. De plus, des longueurs de chaîne lipidique acyle plus longues entraînent des gouttelettes plus stables en raison de meilleures interactions de van der Waals19. La composition de la coquille lipidique a été choisie en fonction de ce qui était disponible dans le commerce, la longueur de la chaîne 18-acyle pour tous les types de lipides. DSPE-PEG5K a été incorporé dans toute la formulation (Étape 1.1) car la présence des chaînes de polyéthylène glycol empêche la coalescence des structures via des forces stériques répulsives19. Pendant l’hydratation lipidique, le bain sonicator de bain a été réglé à 70 °C (étape 2.1) à une hauteur suffisante pour disperser complètement le film lipidique de longueur de chaîne 18-acyle18. Pour les longueurs de chaîne acyle plus longues, des températures plus élevées seront nécessaires.
Une charge plus élevée en pyro-lipides augmenterait la concentration de composants optiquement absorbants et fluorescents, ce qui peut être souhaité pour certaines applications qui bénéficient d’une charge maximale en porphyrine. Cependant, à mesure que la teneur en pyro-lipides augmentait, la concentration observable de gouttelettes diminuait et les diamètres augmentaient(figure 4 et tableau 1). Cela illustre un compromis entre la fluorescence optique et les propriétés d’absorbance par rapport à la concentration et au diamètre des gouttelettes. Pour les chercheurs qui doivent donner la priorité aux petits diamètres pour l’accumulation in vivo à travers de petits vaisseaux qui fuient ou si une forte concentration de gouttelettes doit être injectée, l’augmentation de la charge en pyro-lipides peut ne pas valoir l’augmentation du dimètre de gouttelettes ou la diminution de la concentration de gouttelettes. Si des concentrations élevées de gouttelettes et/ou de petits diamètres de gouttelettes sont primordiaux, des agents de diagnostic compagnons de taille similaire doivent être envisagés à la place des pyro-lipides. Alors que les gouttelettes pyro-lipidiques à 1 % n’ont pas entraîné de diminution de la concentration ou d’augmentation de la taille, la charge en pyro-lipides à 1 % peut être trop faible pour être raisonnablement détectable à partir du fond tissulaire de manière fluorescente. Cependant, la flexibilité de la fraction porphyrine offre de multiples options de fonctionnalisation qui donneront d’autres moyens de quantification plus adaptés aux applications à faible concentration. Par exemple, les pyro-lipides peuvent être chélatés avec du cuivre-64 pour l’imagerie par tomographie par émission de positons et le comptage gamma20,ou avec du palladium pour la quantification des métaux traces par spectrométrie de masse, ou avec du manganèse pour l’imagerie par résonance magnétique14.
Bien que certaines expériences ne nécessitent qu’un petit volume de la solution de gouttelettes, 1 mL de la solution lipidique est nécessaire pour remplir le flacon d’échantillon de 1,85 mL. Goertz et al. ont démontré que les changements dans la manipulation, la pression de l’espace de tête, le rapport liquide-gaz et même la forme du flacon peuvent tous affecter les populations de microbulles17. La température du flacon pendant l’agitation et le choix de la taille peuvent également influencer la distribution de la taille. Par conséquent, pour les méthodes optimisées par l’utilisateur final, il est essentiel d’être aussi cohérent que possible lors de la fabrication de gouttelettes. Les gouttelettes non ouvertes peuvent être congelées (-20 °C) et décongelées plus tard pour une utilisation future, mais cela affectera les populations de taille.
La procédure d’agitation qui active une solution lipidique en microbulles ne produit pas une population morphologiquement homogène (étape 4.6); l’échantillon est plutôt rempli de microbulles, de vésicules multilamellaires, de liposomes et de micelles18,21,22. Alors que les tailles de microbulles couvrent la gamme du micron et du nanomètre, les autres structures sont largement inférieures à 800 nm 23. Les techniques de dimensionnement utilisées ne font pas de distinction entre ces différentes structures, de sorte que les échantillons de microbulles post-agitées (étape 4.6, figure 3C)et les échantillons de gouttelettes post-condensées (étape 4.14, figure 3F)doivent être considérés comme des mélanges. Les assemblages insensibles aux ultrasons (vésicules multilamellaires, liposomes et micelles) sont probablement conservés après la condensation et ne changeront pas de taille car ils n’ont pas de noyaux à changement de phase. Étant donné que le compteur de Coulter ne peut pas distinguer ces différents assemblages supramoléculaires, le changement de taille de la population à la suite de la condensation doit être interprété en supposant qu’une certaine proportion des structures à l’échelle nanométrique sont inconvertibles et contribuent à la population observée dans cette région de taille. De plus, ces structures contribuent aux signatures spectroscopiques et fluorescentes de ces échantillons14. Les signatures de fluorescence et d’absorbance des micelles, des liposomes/vésicules et des gouttelettes sont toutes similaires, y compris leur degré de trempe de fluorescence14. Ainsi, il est important de considérer qu’il existe un mélange d’assemblages dans les figures 3C à 3F, la figure 4,l’échantillon dilué PBS dans la figure 5et l’échantillon dilué PBS dans la figure 6.
Après sélection de la taille et avant la condensation (étape 4.9), il est possible d’éliminer les assemblages sans bulles en centrifugant l’échantillon de microbulles pour séparer les bulles flottantes des assemblages non flottants tels que décrits par Feshitan et al.21 Le degré de séparation peut être contrôlé en ajustant la force de spin et la durée. Cependant, des expériences de condensation de microbulles de tels échantillons isolés de taille ont révélé que l’utilisation des plus grandes populations de microbulles précurseurs sélectionnées à l’aide de procédures d’isolement de taille donnait des gouttelettes plus grosses (voir l’étape S5 des « Autres protocoles et données » pour le dimensionnement des bulles et des gouttelettes post-filées). Étant donné qu’une application prévue de gouttelettes produites avec ce protocole est une plate-forme d’extravasation passive et d’accumulation en raison de leur petite taille par rapport aux microbulles4,8, des populations de gouttelettes aussi petites que possible ont été souhaitées. Ainsi, ce protocole utilisait des échantillons de microbulles post-agités qui n’étaient pas isolés par centrifugation, même si cela signifiait que des micelles, des liposomes et des vésicules insensibles aux ultrasons étaient présents dans la solution finale. Cela implique que les procédures de quantification pour la biodiss distribution dériveront un signal pour toutes les structures injectées et ne se limitent pas aux gouttelettes. Cependant, étant donné que ces structures de taille similaire s’accumulent très probablement via un mécanisme passif qui est principalement dicté par la taille, il n’est pas soupçonné que cela devrait changer les principales inférences qui peuvent être faites si cette plate-forme doit être utilisée in vivo, bien que tous ces aspects doivent être considérés individuellement en fonction du contexte dans lequel la plate-forme peut être utilisée. Des tests utilisant des bras expérimentaux avec et sans ultrasons peuvent être effectués pour s’assurer que ce sont les gouttelettes sensibles aux ultrasons qui sont responsables de tout changement dans la biodisso distribution, car seuls les assemblages de noyaux de perfluorocarbone dans la solution répondront aux ultrasons.
Après agitation, le flacon a été reposé pendant 15 minutes et une partition a été observée dans le flacon(Figure 3C versus 3D). La sélection de la taille via la flottabilité est une méthode simple d’élimination des structures / bulles plus grandes d’une solution de microbullesactivées 8,17. Dans ce cas, les particules d’un diamètre supérieur à 5 μm ont été pour la plupart éliminées après sélection de la taille(figure 4). L’étendue de la sélection de la taille peut être réglée en contrôlant la durée de la sélection de la taille17. Sheeran et al. ont montré que le fait de ne pas sélectionner la taille peut entraîner des microbulles générées qui obstruent le système vasculaire8.
Les perfluorocarbures ont l’avantage d’être biologiquementinertes 7. Alors que le point d’ébullition du décafluorobutane est de -1,7 °C, au-dessus de la température corporelle, les gouttelettes ne se vaporisent pas immédiatement lorsqu’elles sont exposées à 37 °C(figure 7B). Comme les gouttelettes sont méta-stables à 37 °C, une énergie acoustique supplémentaire est nécessaire pour vaporiser les gouttelettes en microbulles7,9. Poprosky et al. ont démontré des gouttelettes de porphyrine condensées par pressurisation22. C’est une méthode viable et même essentielle lors de l’utilisation de perfluorocarbures moins denses, mais des pressions élevées peuvent détruire certaines bulles dans le processus. L’octafluoropropane(C3F8)a un point d’ébullition de -36,7 °C, de sorte que le refroidissement et la pressurisation sont nécessaires pour la condensation des gouttelettes. Cependant, le perfluorocarbure plus léger conduit à des gouttelettes moins stables. Le dodécafluoropentane(C5F12)peut conduire à des gouttelettes plus stables avec un point d’ébullition de 28 °C. Cependant, il s’agit d’un liquide à température ambiante et aura besoin d’énergies acoustiques plus fortes pour se vaporiser. Ainsi, le choix du gaz contenant l’agent de contraste à ultrasons doit tenir compte des conditions de son application biologique prévue en plus des paramètres de sa fabrication. Dans ce protocole, le bain d’isopropanol pour la condensation a été réglé à -15 à -17 °C (étape 4.7.1 et étape 4.13) tandis que d’autres protocoles utilisaient -10 °C 5,6. Même avec un noyau de décafluorobutane commun, la température de condensation peut varier en fonction de la composition de l’excipient, de la concentration totale de lipides et de la composition de la coquille lipidique. Si vous utilisez d’autres formulations, une optimisation peut être nécessaire pour assurer une condensation adéquate des gouttelettes sans provoquer le gel de la solution.
Comme les gouttelettes sont plus petites et plus stables que leur précurseur de microbulles7,elles peuvent mieux tirer parti des mécanismes d’accumulation passive pour extravaser dans certains tissus d’intérêt, tels que la perméabilité accrue et l’effet de rétention de certains types de tumeurs4,24. Avec les méthodes de détection fluorescentes, optiquement absorbantes etacoustiques 14, il est possible d’utiliser une seule formulation pour quantifier l’absorption. En outre, cette plate-forme peut être utilisée pour étudier si la vaporisation acoustique des gouttelettes peut améliorer la fraction d’agent délivrée au-delà des niveaux passifs16. Pour quantifier la biodisponsabilité de l’agent dans les tissus et les organes d’intérêt après l’injection, une quantité connue de gouttelettes pyro-lipidiques doit être injectée dans l’animal, des ultrasons peuvent ou non être appliqués en fonction de l’ensemble de contrôle, l’animal doit être sacrifié à un moment prédéterminé et les organes doivent être prélevés et pesés. Les organes doivent être homogénéisés, filtrés, dilués dans un tensioactif (détergent) pour décellulariser le tissu, et quantifiés par fluorescence ou spectroscopie UV-Vis pour obtenir des pourcentages de dose injectée par masse d’organe basés sur les signaux Pyro. Pour l’étape 5.4.5 (Figure 5) et l’Étape 5.5.5 (Figure 6), le tensioactif Triton X-100 (détergent) a été utilisé pour perturber les échantillons car il n’est pas fluorescent à 410 nm et ses longueurs d’onde d’absorbance ne se chevauchent pas avec pyro.s.
Les microbulles n’ont pas été caractérisées par une absorbance UV-Vis. Comme la source laser du spectroscope UV-Vis est parallèle au détecteur, toute grande bulle pourrait disperser la lumière loin du détecteur, ce qui les rendrait plus absorbantes optiquement14. Contrairement au spectrophotomètre UV-Vis, le détecteur du spectrophotomètre à fluorescence est/doit être perpendiculaire à la source laser pour éviter que la source n’interfère avec le détecteur. UV-Vis a été utilisé pour quantifier l’absorbance des échantillons de gouttelettes intactes et perturbées (étape 5.4, figure 5). 300 à 800 nm ont été choisis comme longueurs d’onde d’absorbance car les deux principales bandes d’absorbance du pyro-lipide, la bande de Soret (340 à 500 nm) et la bande Q (640 à 730 nm), se situent dans cette plage14. Lorsqu’il est assemblé en une gouttelette (ou d’autres structures supramoléculaires), le pic en bande Q du pyro-lipide est décalé vers le rouge de 671 nm à 700 nm(Figure 5). Lorsque cette structure supramoléculaire est perturbée par un tensioactif comme Triton, le pic revient à 671 nm14,15. Sur la base de ce changement, il est possible de dire si les pyro-lipides sont dans un état assemblé ou dans un état perturbé. Le rapport des deux pics peut être utilisé pour estimer la désintégration des assemblages au fil du temps.
Pour les mesures de fluorescence (étape 5.5, figure 6),une longueur d’onde d’excitation de 410 nm a été choisie car elle correspond au pic de bande de Soret pour le pyro-lipide14non assemblé. Une gamme de longueurs d’onde d’émission de 600 à 800 nm a été sélectionnée car les pics des assemblages intacts dans PBS et les pyro-lipides perturbés dans Triton sont contenus dans cette plage. Le déplacement et l’augmentation de la fluorescence(figure 6)entre les échantillons intacts (704 nm dans PBS) et perturbés (674 nm dans Triton) se sont produits en raison de la trempe induite par la structure. Sous forme assemblée, les molécules pyro-lipidiques ont été étroitement emballées ensemble, de sorte que les photons générés ont été absorbés par les molécules pyro-lipidiques voisines. Cela est évident dans l’efficacité de trempe intacte par rapport à l’efficacité de trempe perturbée. Ainsi, il est nécessaire de diluer les échantillons dans un tensioactif (détergent) comme 1% de Triton X-100 pour soulager la trempe et maximiser le signal pour la quantification de la bio-distribution14.
Par souci de simplicité, le même transducteur à ultrasons linéaire a été utilisé à la fois pour vaporiser et imager (étapes 6.5 et 6.7, figure 7). Ce transducteur à ultrasons (Table des matériaux) était capable d’atteindre les pressions négatives maximales nécessaires pour vaporiser les gouttelettes8. Le remplissage d’un réservoir avec de l’eau désionisée provenant d’un robinet génère des gaz qui se dissolvent dans l’eau (étape 6.1). Pour minimiser les interférences des gaz dissous dans l’eau avec la vaporisation et l’imagerie, l’eau a été reposée pendant 24 h dans le réservoir pour permettre aux gaz dans l’eau de s’équilibrer avec l’atmosphère (étape 6.1). Alternativement, l’eau désionisée peut être dégazée avec un récipient suffisamment dimensionné et scellable relié à un vide suffisamment puissant. Les images échographiques ont démontré que les microbulles étaient condensées avec succès car les gouttelettes étaient inobservables/non échogéniques à basse pression (Figure 7B). Ce n’est qu’à des pressions de sortie plus élevées que les gouttelettes se sont vaporisées en microbulles échogènes observables(Figure 7D,7F, 7H). Bien que l’échantillon de gouttelettes post-condensées contienne des micelles et des liposomes/vésicules, ces assemblages ne sont pas échogéniques et seules les gouttelettes peuvent se vaporiser en microbulles échogéniques. Un contrôle PBS a été transmis à travers le fantôme pour établir des images de base(figures 7A, 7C, 7E, 7G). Comme la pression augmentait dans le PBS, aucun contraste n’a été généré. Cela indiquait que les pressions élevées du transducteur ne pouvaient pas produire de cavitation spontanée dans un milieu à base d’eau seul, et donc tous les autres contrastes générés pouvaient être attribués à l’agent de contraste à ultrasons utilisé. Si la pression de sortie est trop élevée, les microbulles générées peuvent être détruites. En augmentant progressivement la pression et en observant le contraste généré, la pression optimale peut être trouvée8. La demi-vie de circulation des gouttelettes peut être déterminée de la même manière en vaporisant les gouttelettes sont certains intervalles de temps et en observant le contraste généré au fil du temps7.
En résumé, des gouttelettes multimodales à changement de phase avec une teneur variable en pyro-lipides ont été créées avec la méthode de condensation. Le dimensionnement a montré qu’il y avait un compromis entre la charge en pyro-lipides et la concentration de microbulles/gouttelettes. Les caractérisations ont montré qu’il y avait des différences dans les formes intactes et perturbées à la fois dans l’absorbance et la fluorescence. L’imagerie échographique a montré que les gouttelettes n’étaient pas échogènes à 37 °C et étaient vaporisables en microbulles échogéniques à des pressions suffisantes. Les caractérisations ont également montré le potentiel des gouttelettes pyro-lipidiques pour remplacer les agents diagnostiques compagnons pour les tests de biodiss distribution ou d’accumulation des gouttelettes. Les travaux futurs étudieront les seuils de vaporisation en solution, la stabilité en solution et les durées de circulation in vivo chez des souris nues.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier le Dr Brandon Helfield pour avoir aidé à construire l’échangeur de gaz et le Dr Miffy Hok Yan Cheng pour les discussions techniques. Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement suivantes : Bourse d’études supérieures de l’Ontario, Instituts de recherche en santé du Canada, Institut de recherche Terry Fox et Fondation du cancer Princess Margaret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
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