Summary
本プロトコルでは、マルチモーダル位相変化ポルフィリン滴を合成および特徴付けする方法を概説する。
Abstract
位相変化液滴は、十分な音響エネルギーを適用してその 時に エコー原性マイクロバブルに変換することができる超音波造影剤のクラスである。液滴は、マイクロバブルの対応よりも小さく、より安定しています。しかし、従来の超音波造影剤は音響フィードバック測定を超えて追跡可能ではなく、造影剤の生体分布または蓄積 ex vivo の定量化が困難になる。研究者は、生体分布を推測するために蛍光または光学吸収性コンパニオン診断粒子に依存する必要があります。このプロトコルの目的は、凝縮法を用いてマルチモーダル位相変化ポルフィリン液滴を作成するためのステップを詳述することにある。ポルフィリンは、脂質に結合し、液滴に組み込んで液滴に組み込むことができる明確な吸光度バンドを持つ蛍光分子であり、音響特性を保持しながらより堅牢な生体分布を可能にします。ポルフィリン-脂質および塩基脂質含量の異なる7つの製剤を、マイクロバブルおよび液滴サイズ分布を調べるために作られた。ポルフィリン含有構造に適した特性評価は、その解析的汎用性をインソリューションで実証するプロトコルにも記載されている。サイジングは、凝縮後の平均直径が前駆体集団よりも1.72〜2.38倍小さいことを示した。吸光度特性は、無傷のアセンブリが700nmのQバンドピークを有し、破壊されたサンプルは671nmで吸光度ピークを有したことを示した。蛍光特性評価は、30%のポルフィリン-脂質集合体が蛍光的に消光(>97%)であり、中断時に蛍光回復が達成されたことを示した。音響気化により、ポルフィリン液滴は低圧で非エコー原性であり、十分な圧力でエコー原性マイクロバブルに変換できることが示された。これらの特性評価は、 インビボ またはex vivoでの送達または治療用途のための超音波造影剤の生体分布を定量化するための吸光度または蛍光ベースのコンパニオン診断戦略の必要性を排除するポルフィリン滴滴の可能性を示す。
Introduction
超音波画像は、音響波を利用する医療画像の非侵襲的な非イオン化形態です。超音波スキャナはよりポータブルでリアルタイムの画像を提供できますが、超音波画像は低コントラストに苦しむ可能性があり、ソノグラファーが同様にエコー原性の病理学的特徴を確実に区別することは困難です。この制限に対抗するために、マイクロバブルを宿主に注入して血管のコントラストを改善することができる。マイクロバブルは、マイクロンサイズのガス充填造影剤であり、音響波に対して高いエコー原性を有し、血管のコントラストを強化することができる1,2である。マイクロバブルのシェルおよびガスコアは、イメージング、血栓溶解、細胞膜透過化、または過渡血管開口部2のような異なる用途に合わせて調整することができる。
マイクロバブルの欠点は、その短い循環半減期です。例えば、臨床的に入手可能な過フルトレン脂質微小球は、半減期が1.3分3.長いイメージングセッションでは、マイクロバブルの複数の注入が必要です。マイクロバブルのもう一つの欠点は、その大きな直径です。パーフルトレン脂質微小球は直径が1~3μm程度であるが、血管系で循環するのに十分小さいが、腫瘍4のような目的の組織に飛散し、受動的に蓄積するには大き過ぎである。これらの制限を克服するための1つの戦略は、気体マイクロバブルをより小さい液体コア液滴5,6に凝縮することです。液滴は液体状態ではエコー原性ではありませんが、十分に高いピーク陰圧で超音波に曝露するとマイクロバブルに気化し、コントラストを提供する能力を取り戻すことができます。これにより、液滴は、小さな液体コアのより有利な薬物動態を利用することができ、内振した場合に対照を提供する能力を保持しながら、化学組成4、7を変更しない。
デカフルオロブタンは、気体状態と液体状態5、6、7の間で相転移を行うのに理想的なパーフルオロカーボン化合物である。デカフルオロブタンは、マイクロバブルを温度低下だけで液滴に凝縮することを可能にするが、一方、より密度の低いパーフルオロカーボンは追加の加圧5を必要とする。この穏やかな方法は結露7、8、9の間に気泡の破壊を最小にする。そのコアは液体であるとして、液滴は非エコー原性であり、超音波には見えない。しかし、十分な音響エネルギーまたは熱エネルギーの適用により、液体コアは気体状態に戻って気化し、エコー原性マイクロバブル8を発生させることができる。この気化により、マイクロバブルを生成するタイミングと場所を制御できます。
液滴は受動的蓄積に有用であるが、その際に気化、または細胞透過性を改善する4において、液滴(およびそれらの断片)を画像化または定量化することは不可能である。したがって、蛍光4、10、11、磁性粒子12、光学吸収剤13などの定量可能なコンパニオン診断剤が、目的の組織への液滴送を測るアナログとして利用される。例えば、Helfieldらは、蛍光を検出できなかったようにマウス臓器の画像定量のために蛍光ナノビーズの共注入を用いた4。コンパニオン診断薬の欠点は、追跡可能な成分が、個々の薬物動態プロファイルに応じて液滴から独立して作用し得る。
幸いなことに、マイクロバブルと液滴のシェルをカスタマイズすることができます。例えば、Huynhらは、ポルフィリン-脂質シェルを有する超音波造影剤を実証し、マルチモーダルマイクロバブル14を作成した。ポルフィリンは、芳香族マクロキリック体構造14,15を有する有機化合物のクラスである。それらは、光学的に吸収性、蛍光性、および放射線治療、放射性核種ベースのイメージング、または微量金属ベース定量14のための多種多様な金属にキレートすることができる。ポルフィリンの一例は、ピロフェオフォビド(パイロ)である。ピロを脂質に結合させることにより、マイクロバブルまたは液滴にパイロ脂質を組み込むことで、音響的、蛍光的、および吸光度14を介して複数のモダリティを介して画像化および追跡を行うことができます。このマルチモーダル造影剤は、蓄積を追跡し、定量化するために使用することができる。これにより、定量可能なコンポーネントがシェルに結合され、より正確な配信定量化が可能になるため、コンパニオン診断エージェントの必要性がなくなる可能性があります。
本明細書において、マルチモーダル位相変化ポルフィリン液滴を作成するためのプロトコルが概説される。超音波造影剤は、腫瘍2、4などの目的の組織への薬物送達のためのプラットフォームとして使用することができるように、超音波を超えてそれらの検出可能性を拡張することは、送達効果の定量化に有用であることが証明できる。これらの液滴の目的は、生体内で受動的蓄積が可能な追跡可能な超音波造影剤を提供すること、その機動気化および音響において、そして二次センサーに依存することなく、生体分布またはex vivo器官からの蓄積を定量化する可能性を有する。また、バイオディストリビューションセンサーとしてのポルフィリン滴の可能性を示す特性評価方法も概説されています。また、殻中のパイロ-脂質負荷の影響(モル比で0%~50%)も議論されている。
Protocol
1. 脱水脂質フィルム
- 必要なシェルコンポーネントの質量を計算します(補足ファイル「脂質式シート」を参照)。
注: このプロトコルの場合、 シェル組成物は、10モル%1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000]アンモニウム塩(DSPE-PEG5K)、xモル%ピロフェオフォア 1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(パイロ-SPC)、および(90 - x)モル% 1,2-ディステアロイル-snグリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)。 パイロSPCの量は、7つのシェル組成物(x = 0、1、10、20、30、40、50)にわたって変化します。ストックボトルのDSPE-PEG5Kの分子量を確認してください。- 最低体積1 mLの任意の脂質ボリュームにプロトコルをスケーリングします。このプロトコルでは、全脂質濃度が1mg/mLの10mLの総脂質体積を全ての製剤に使用した。賦形液は、10%プロピレングリコール、10%グリセロール、および80%リン酸緩衝液生理食塩水(PBS、1X、7.4 pH)(%v/v/v/v)(ステップ2.3および「脂質式シート」を参照)になります。
注:パイロ脂質の合成プロトコルは、補足ファイル「その他のプロトコルとデータ」ステップS1からS1.19に概説され、これは鄭ららによって行われた作業から変更された。
- 最低体積1 mLの任意の脂質ボリュームにプロトコルをスケーリングします。このプロトコルでは、全脂質濃度が1mg/mLの10mLの総脂質体積を全ての製剤に使用した。賦形液は、10%プロピレングリコール、10%グリセロール、および80%リン酸緩衝液生理食塩水(PBS、1X、7.4 pH)(%v/v/v/v)(ステップ2.3および「脂質式シート」を参照)になります。
- 計算された質量(ステップ1.1および「脂質式シート」を参照)に基づいて、非パイロ脂質のそれぞれを計量し、スクリューオンキャップ付きの十分なサイズのホウケイ酸ガラスバイアルに移ります。
- バイアルをキャップし、キャップとバイアルにラベルを付け、脂質バイアルの底部と壁をアルミニウム箔で覆います。このバイアルは、プロトコルの残りの部分については「脂質バイアル」と呼ばれます。脂質バイアルは、涼しく乾燥した暗い領域に保管してください。
- 製剤にパイロ-SPCが含まれている場合は、10 mgのパイロ-SPCドライフィルム(「その他のプロトコルとデータ」を参照)をクロロホルムの1 mLに溶解します。5sの渦は、吸光度を測定し、脂質バイアルに加える適切な体積を計算する。
注意: クロロホルムは健康被害、刺激性、毒性があります。保護ラボコート、目の保護、手袋を着用し、煙を吸い込むのを避けてください。
注:Pyro-SPCは光に敏感であるため、パイロ-SPCを扱う際に可能であれば作業領域のライトを減らしてください。Pyro-SPCを密閉し、使用しないときに覆われておいてください。- 紫外線可視分光光度計では、0.5 nm単位で800nmから300nmまでの波長範囲の吸光度を測定し、互換性のある1cmパス長キュベットで2000 μLの純粋メタノールでベースラインを測定します。
注意: メタノールは健康の危険、刺激性、毒性、および可燃性です。保護ラボコート、目の保護、手袋を着用し、煙を吸い込むのを避けてください。火花や熱から遠ざけてください。 - 2000 μLのメタノールにクロロホルムで2 μL、30秒の渦に2μLを加えます。清潔で互換性のある1cmキュベットに移し、吸光度を測定します。紫外線可視分光光度計の吸光度範囲から667nmで吸光度がピークに達した場合は、この希釈倍率を調整してください。
注: クロロホルムやメタノールを転送する場合は、正確性を高めるため、機械ピペットではなく、清潔なガラス注射器または正変位ピペットを使用してください。 - ステップ 1.4.2 をさらに 2 回繰り返して、3 重の吸光度値を取得します。
- 667 nmで吸光度ピーク値を平均し、脂質バイアル14、15に必要なクロロホルムでパイロ-SPCの体積を計算するために次の式を使用します。
Vは、必要なクロロホルムのパイロSPCの体積である、 mはパイロ-SPCの必要質量(ステップ1.1および「脂質式シート」を参照)、Mは1040.317 g・mol-1でパイロ-SPCの分子量であり、Aは667nmでの平均吸光度、dはクロロホルム体積のメタノールおよびピロ-SPCに基づく希釈係数である(ステップ1.4.2)。 Lは1cmでキュベット経路長、εは45000L·1·cm-1でパイロ-SPCの667nmモル減衰係数である。
注:方程式の分母は、溶液中の検体の濃度を距離を超えて測定された光学吸光度に関連付けるビール・ランバート法です。 - きれいなガラスの注射器(図1A)を使用して脂質バイアルに前のステップからクロロホルムでパイロ-SPCの計算された容積を加え、次いで、バイアルをキャップしてカバーします。
注: 図1 は、30%のパイロ脂質製剤のみを示しています。 - クロロホルムにパイロ-SPCが残っている場合:ヒュームフードで、ステップ1.4からパイロSPC+クロロホルムバイアルをアンキャップし、バイアルを側に部分的に傾け、パイロSPC/クロロホルムバイアルにできるだけ穏やかに窒素ガスを流し続けます。バイアルを回転させて窒素ガスの流れを利用してクロロホルムを乾燥させ、パイロ-SPCをバイアルの内壁に均等にコーティングして乾燥させます。スプラッシュが作成されず、ソリューションが脱落しないようにします。
- パイロ-SPCの脂質フィルムが乾燥してバイアルの壁にコーティングされたら、窒素ガスの流れをオフにします。バイアルをキャップし、バイアルネックをワックスフィルムで密封し、バイアルを-20°Cと暗闇の中に保管します。
- 紫外線可視分光光度計では、0.5 nm単位で800nmから300nmまでの波長範囲の吸光度を測定し、互換性のある1cmパス長キュベットで2000 μLの純粋メタノールでベースラインを測定します。
- 90%クロロホルムと10%メタノール(%v/v)の溶液を調製し、脂質バイアルに5 mLを加えます。脂質バイアルをキャップし、内容物を均質化するためにそっと旋回する(図1B)。
注:製剤にホスファチジン酸脂質(例えば1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3リン酸ナトリウム塩(DSPA))が含まれている場合は、60%クロロホルム、32%メタノール、および8%二重脱イオン水(%v/v/v)を脂質バイアルに追加します。より強い旋回は、脂質内容物を完全に溶解するために必要な場合がある。 - ヒュームフードでは、脂質バイアルをアンキャップし、部分的に脂質バイアルをその側に傾け、脂質バイアルにできるだけ穏やかに窒素ガスを流し続けます。脂質バイアルを回転させて、窒素ガスの流れを利用して溶液を乾燥させ、脂質バイアルの内壁に均一にコーティングして乾燥させます。スプラッシュが作成されず、ソリューションが脱落しないようにします。
- 脂質が乾燥して脂質バイアルの内壁にコーティングされたら(図1C)、窒素ガスの流れを止め、脂質バイアルの底部と壁をアルミニウム箔で覆い、上部開口部を通気用の針で数個の穴で突き刺したアルミニウム箔で覆います(図1D)。
- 覆われた脂質バイアルを真空デシケーターの中にラベル付けして配置し、脂質をさらに24時間乾燥させますが、72時間以下です。
注: プロトコルは、24 ~ 72 時間後に再開できます。
2. 脂質ハイドレーション
- バスソシエーターに水を入れ、70°Cに加熱します。 水を混ぜるのを助けるために超音波処理をオンにします。
注意: 水と超音波処理器は高温です。水と超音波処理器に触れないようにしてください。目の保護、保護ラボコート、および保護手袋を着用してください。 - 浴の超音波装置が70°Cに達したら、真空デシケーターから脂質バイアルを取り除きます。可能であれば、作業領域のライトを減らします。
- 10%プロピレングリコール、10%グリセロール、80%PBS(%v/v/v)の賦形液を調製し、その10 mLを脂質バイアルに加えます(ステップ1.1.1および「脂質式シート」を参照)。
注:標準的な空気変位ピペットを使用する場合は、プロピレングリコールやグリセロールのような粘性溶媒を扱う際に注意してください。吸気し、ゆっくりとボリュームを突っ込み、残りの体積がピペットチップの底に達するのを待ちます。ゆっくりと動いてボリュームを移すときに、液体がピペットチップの外側にしがみつかないようにしてください。 - 脂質バイアルをキャップし、アルミニウムカバーを取り外し、超音波処理がオンになっている間、15分間浴超音波器でバイアルを穏やかに旋回させます。脂質バイアルの首が水の上にあることを確認してください。バイアルキャップがしっかりと閉じられているかどうかを確認する場合があります。
- 時折、水浴から脂質バイアルを取り除きます。ライトに短く保持して内容物が完全に溶解しているかどうかを確認します(図1E)。
- 脂質バイアルの内容物が均質化されていない場合は、浴超音波処理器から脂質バイアルを除去します。キャップを固定し、より積極的に旋回し、バスソニッケーターに戻します。
- 浴の超音波処理器から脂質バイアルを取り外し、バスの超音波処理器をオフにします。リピッドバイアルの外装をペーパータオルで乾かし、脂質バイアルのラベルを再設定します。
- 脂質バイアルをアルミホイルで覆い、室温で脂質バイアルを冷やして、暗く乾燥した部分で10分間冷却します。
- アリコート脂質バイアル内容物:3mLホウケイ酸ガラス透明血清バイアル(7mm内口径、13mm外口径)における脂質溶液の約2mL。
注:一部のプロトコルは、3 mLバイアル7で1.5 mLの脂質溶液を使用することがあります。 - 血清バイアルを凍結乾燥スタイルのグレークロロブチルゴムストッパー(7mm内口径、13mm外口径)でキャップし、ゴム栓を引き裂きアルミニウムシール(13mm外口径)とクリンパー(図1F)で固定します。
- 真空、脱気、および各血清バイアル4、5、7の脂質溶液を再加圧する(図2)。
注: Gas Exchanger の組み立て方法と詳細については、「その他のプロトコルとデータ」を参照してください。- 圧力バルブAとガスボンベバルブを含むすべてのバルブを閉じます(図2)。血清バイアルをマニホールド針に接続し、対応するマニホールドバルブを開き、真空バルブAと真空バルブBを開き、-90 kPa(-13 psi、-900 mbar)で真空を5分間真空にして大気を除去します。液体の掃除機をかけないでください(「その他のプロトコルとデータ」ステップS3からS3.1.5を参照)。
注意: 真空ポンプは、誤って処理すると破裂する可能性があります。真空ポンプは、有機、酸性、塩基性の化学薬品と一緒に使用しないでください。 - 真空を維持したまま、(スイングするのを防ぐために)血清バイアルを保持し、脱ガスするためにペンまたはマーカーで素早くそれをタップします。泡が形成されず、バイアルに泡がなくなるまでタップし続けます。液体を真空にしないでください。必要に応じてタップを一時停止します。接続されているすべての血清バイアルについて繰り返します。すべての血清バイアルを脱気した後 、CLOSE 真空バルブAと真空バルブBと真空ポンプ をオフ にします(「その他のプロトコルとデータ」ステップS3.2からS3.2.3を参照)。
- セラムバイアルを針に接続したまま、真空ポンプをオフにした状態で、ガスボンベバルブ1/16~1/8(全回転の約22.5~45°)を反時計回りに回して部分的に開き、Tハンドルバルブを開き、空気調整バルブを時計回りに3 psi(20.7 kPa)ゲージに ゆっくりと 回します。次に、圧力バルブAと圧力バルブBを開きます(「その他のプロトコルとデータ」ステップS3.3からS3.3.21を参照)。
注意: デカフルオロブタンガスボンベは圧力を受けており、加熱すると爆発する可能性があります。熱や衝撃から離れておいてください。デカフルオロブタンガスは酸素変位や窒息を引き起こす可能性があります。適切な目の保護を着用し、ヒュームフードでハンドル。誤って取り扱うとガスボンベを真空にすることができ、急速な脱圧や爆発を引き起こす可能性があります。ガスボンベバルブを1/8回転以上開くと、エアレギュレータが破損する可能性があります。 - 30 s の加圧(ゲージはまだ3 psi(20.7 kPa)を読み取る必要があります)、すべてのマニホールドバルブを血清バイアルで閉じ、血清バイアルを切断し、針をシースし、ガスボンベバルブを 閉じます 。
- エアレギュレータゲージ針が休息位置に入るまで、単一のマニホールドバルブを部分的に開けて、内蔵圧力を緩和します。その後、マニホールドバルブとTハンドルを含む、との間のすべてを閉じます。
- 圧力バルブAとガスボンベバルブを含むすべてのバルブを閉じます(図2)。血清バイアルをマニホールド針に接続し、対応するマニホールドバルブを開き、真空バルブAと真空バルブBを開き、-90 kPa(-13 psi、-900 mbar)で真空を5分間真空にして大気を除去します。液体の掃除機をかけないでください(「その他のプロトコルとデータ」ステップS3からS3.1.5を参照)。
- 血清バイアルにラベルを付け、4°Cと暗闇の中に保管してください。すべてのガス交換器バルブが閉じられ、その後真空ポンプがオフになっていることを確認します。
注:血清は、この状態で4ヶ月まで安定している必要があります。このステップでは、プロトコルは、4ヶ月後に、後で、せいぜい再開することができます。
3. デカフルオロブタンバイアル
- 清潔で空の3mLホウケイ酸ガラス透明のセラムバイアル(7mm内口径、13mm外口径)を使用し、凍結乾燥スタイルのグレークロロブチルゴムストッパー(内口直径7mm、外口径13mm)でキャップし、ゴム栓を引き裂きアルミニウムシール(13mm外口径)とクリンパー4で固定します。 7,8.
- ステップ 2.9.1 に従って大気の空気を真空にします(「その他のプロトコルとデータ」ステップ S3.1 から S3.1.5 を参照)。
- 脱ガスをスキップし、手順2.9.3から2.9.5に従ってバイアルを再加圧します(「その他のプロトコルとデータ」ステップS3.3からS3.3.21を参照)。
- デカフルオロブタンバイアルにラベルを付け、4°Cと暗闇の中に保管します。すべてのガス交換器バルブが閉じられ、その後真空ポンプがオフになっていることを確認します。
注:液滴凝縮には、デカフルオロブタンガスで満たされた血清バイアルが必要になります。彼らは、この状態で4ヶ月まで安定している必要があります。このステップでは、プロトコルは、4ヶ月後に、後で、せいぜい再開することができます。
4. 液滴形成
- 血清バイアル(ステップ2.10から)の水分補給脂質溶液を冷蔵庫から取り出します。
- デキャッパーを使用して、血清バイアルのアルミニウムシールを取り外し、脂質溶液を1.85mLのホウケイ酸ガラスサンプルバイアル(フェノールスクリューキャップ付き)に1mL移動し、脂質溶液を内壁に流し込みます。バブルを作成しないでください。
- 血清バイアルに残っている脂質溶液がある場合は、ステップ2.9〜2.10に従って脱ガスし、血清バイアルを再加圧して貯蔵します(「その他のプロトコルとデータ」ステップS3からS3.3.21を参照)。
- 1.85 mLサンプルバイアルを使用すると、ガス交換器を使用してサンプルバイアルヘッドスペースにデカフルオロブタンガスを穏やかに流します(特定のバルブ名については 図2 を参照)。
- ガス交換器のすべてのバルブが適切に閉じられており、ポンプの電源が切れていることを確認します。
注意: 間違って行った場合、急速な減圧および爆発を引き起こすガスボンベを真空にすることが可能です。 - マニホールドバルブを1つ開き、マニホールドから対応する針を慎重に外します。
注意:鋭利な物体は、接触/ピアスを避ける。 - 圧力バルブAと圧力バルブBを開き、ガスボンベバルブ1/16~1/8(全回転の約22.5~45°)を反時計回りに回し、Tハンドルバルブを部分的に開きます。
注意: エアレギュレータに損傷を与える可能性がありますので、ガスボンベバルブを開けないでください。 - 脂質溶液でサンプルバイアルをアンキャップし、マニホールド針がバイアル内の液体空気界面の上になるように動かします。そこにバイアルを保持します。
-
エアレギュレータゲージの針が静止位置からわずかに移動し、パーフルオロカーボンガスがマニホールド針からそっと流れるまで、エアレギュレータバルブを時計回りにゆっくりと回します。パーフルオロカーボンガスを30秒のバイアルヘッドスペースに静かに流し込みます。バブルを作成しないでください。必要に応じて、エアレギュレータバルブを調整します。
注: 液体空気界面は、デカフルオロブタンガスの流れによって若干動揺する必要があります。システムが開いているため、エアレギュレータゲージは圧力を正しく読み取ることができません。 - 30 sの後、慎重かつ迅速にバイアルをあまり動かさずにサンプルバイアルをキャップします。
- ガスボンベバルブ(時計回り)、Tハンドルバルブ、エアレギュレータバルブ(反時計回り)、圧力バルブA、圧力バルブB、マニホールドバルブを閉じます。
- 慎重に針をシース。
- サンプルバイアルにラベルを付け、時計回りに行くワックスフィルムで首を密封します(図3Aと3B)。
注:図3B〜3Fは、30%のパイロ脂質製剤のみを示す。
- ガス交換器のすべてのバルブが適切に閉じられており、ポンプの電源が切れていることを確認します。
- サンプルバイアルは暗闇の中で、4°Cで少なくとも10分間、または24時間まで保管してください。
注: このステップでは、プロトコルは後で、24時間再開することができます。 - 約100gのドライアイス(二酸化炭素)を断熱容器に入れ、別の断熱容器に規則的な氷を入れます。ステップ3で述べた調製されたデカフルオロブタン血清バイアル、2つの3.81 cm(1.5インチ)20ゲージ針、1mLプラスチックシリンジ(使用前にプランジャーを取り外す)、200mL容器、金属トング、および温度計(-20〜100°C)を取り出します。
注:マイクロバブルを作るだけなら、イソプロパノール、ドライアイス、氷は必要ありません。 - 45 sの機械的攪拌機に脂質溶液とサンプルバイアルを入れ、攪拌する(図3C)。
- 機械的撹拌の後、サンプルバイアルを右サイドアップに立ち、光から遮光し、15分のカウントダウンを開始してバイアルを冷却し、マイクロバブル8,17をサイズ選択する。
- 15分のカウントダウンが10分(カウントダウンに残り5分)になったら、容器に約200mLのイソプロパノールを充填し、金属トングを使用したドライアイスで-20°Cに冷却します。
注:目標温度は-15〜-17 °Cですが、イソプロパノールはマイクロバブルを扱いながらウォームアップします。
注意: イソプロパノールは可燃性です。熱や火花から遠ざけてください。ドライアイスは皮膚損傷を引き起こす可能性があります。トングでハンドル。手袋、目の保護、保護ラボコートを着用してください。
- 15分のカウントダウンが10分(カウントダウンに残り5分)になったら、容器に約200mLのイソプロパノールを充填し、金属トングを使用したドライアイスで-20°Cに冷却します。
- マイクロバブルのサイズを15分間選択した後、サンプルバイアル内でサイズ選択されたパーティションを探します(図3D)。
- サンプルバイアルを右サイドアップに保ち、サンプルバイアルを慎重にアンキャップし、1.5インチの20ゲージ針を1mLプラスチックシリンジに取り付けた底部の仕切り約0.7mLを引き出します。最上位パーティションがいずれも取り下げられないようにします。エアポケットを取り外すために注射器をフリックしないでください。
- 別の20ゲージの針をデカフルオロブタン血清バイアル(血清バイアルの上部付近に針を保持する)に挿入し、サイズ選択されたマイクロバブルで針/注射器を挿入します。
- サイズ選択したマイクロバブルをゆっくりと転送します。バイアルを傾け、シリンジを角度にして、液体がデカフルオロブタン血清バイアルの内壁を滑り落ちるようにします。
- サイズ選択されたマイクロバブル溶液をすべて転送したら、注射器で針を取り外しますが、通気針を入れ、負圧を緩和します(図3E)。
- サイズ選択されたマイクロバブルのみを作る場合は、ここで停止します。通気針を上部と上部付近に保管します。バイアルは暗く室温に保ちます。
- イソプロパノール浴に少量のドライアイスまたは室温イソプロパノールを加え、浴温度が-15〜-17°Cの間であることを確認します。
- 20ゲージの通気針をセラムバイアルの上部付近に挿入し、セラムバイアルをイソプロパノール浴に入れ、マイクロバブルレベルをイソプロパノールのレベル以下に保ち、バイアルネックを上に保ち、2分間血清バイアルを断続的に旋回してマイクロバブルを凝縮します。
注:このステップは、Sheeranらによって行われた作業から変更されました6- イソプロパノールで血清バイアルを連続的に旋回させず、溶液を凍結させないでください。約5sのために旋回し、イソプロパノールから血清バイアルを持ち上げます。氷の核形成を確認し、イソプロパノールで旋回を再開します。氷の形成がある場合は、空気中の血清バイアルを放散するまで旋回する。
- 2分間の結露の後、イソプロパノール浴から血清バイアルを取り出し、通気針を取り除きます。
注:マイクロバブルは、半透明の変化によって示されるように、液滴に凝縮されているはずです(図3E 対 図3F は30%パイロ脂質製剤用)。 - 血清バイアルを拭き、ラベルを付け、使用する準備ができるまで、暗い断熱容器の中の通常の氷の上に置きます。未開封の(無傷のアルミニウムシール)液滴は、溶けた氷が必要に応じて交換される限り、この状態で最大6時間安定している必要があります。
- 使用する準備ができたら、デキャッパーでアルミニウムシールを取り外します。使用していない間、氷の上や暗い状態で(バイアルを開いたとしても)液滴を保管してください。マイクロバブルを暗く室温に保ちます。
5. 形態学的・光学的特性評価
- 1%トリトンを準備する:5mLのトリトンX-100をPBS(1x、pH 7.4)の500mLに加え、均質な14まで磁気攪拌棒でかき混ぜる。
注:トリトンX-100非常に粘性。標準的な空気変位ピペットを使用する場合は、取り扱い時に注意してください。吸気し、ゆっくりとボリュームを突っ込み、残りの体積がピペットの底に達するのを待ちます。ゆっくりと動いてボリュームを移すときに、液体がピペットチップの外側にしがみつかないようにしてください。 - 液滴を準備します(ステップ4)。マイクロバブルも特徴付けられる場合は、凝縮前にサイズ選択されたマイクロバブルの少量を収集します(ステップ4.9)。
- 0.2~6μmのコールターカウンター(CC)上のマイクロバブルまたは液滴のサイズを設定して、サイズ分布と濃度を得る(図4)。
- 0.2 μmのポアポリエーテルサルホン膜フィルターを通して濾過した10 mLのCC電解質をクリーンな20 mLキュベットに充填します。ベースラインを取得するために3つの実行でCCでそれを測定します。
- 同じCC電解質に、マイクロバブルまたは液滴サンプルを5 μL加えて、穏やかに混ぜます。
注:サンプルの濃縮量に応じて、2~20 μLのサンプルを追加できます。 - サンプルをCC(3回実行)で実行し、平均ベースラインを減算し、サイズ分布と濃度(mLあたりの数)を計算します。
- UV-Vis分光法で液滴吸光度を測定する(図5)。
注: 図5 は、30%のパイロ脂質製剤のみを示しています。- UV-Vis 分光光度計で、吸光度測定を 0.5 nm 単位で 800 nm ~ 300 nm の波長に設定し、ベースライン補正を有効にします。
- PBSで満たされたきれいな1cmパス長キュベットを使用して、ベースライン測定を行う。分光器ビームパスと交差するほどの高さであることを確認します。
- パイロリピッド液滴をPBSに希釈し(2μL~500μLの液滴を2000μLの希釈液に推奨)、ピペットで混ぜます。
注: 渦を出さない か、またはアセンブリが破壊されます。 - 希釈液滴を洗浄されたキュベットに移し、吸光度を測定します。必要に応じて希釈を変更します。
- ステップ 5.4.1 から 5.4.4 までを繰り返しますが、PBS の代わりに 1% トリトンを使用します。希釈後、測定前に30sの密閉可能/キャップバイアルと渦にサンプルを移します。
- マイクロバブルまたは液滴の蛍光を測定する(図6)。
注: 図6 は、30%のパイロ脂質製剤のみを示しています。- 蛍光分光光度計では、励起波長を410nm、発光波長範囲を600~750nm(1nm単位)に設定します。
- PBS希釈液の蛍光を測定し、蛍光分光光度計と互換性のあるキュベットを用いてベースラインを得る。
- パイロ-脂質マイクロバブルまたは液滴をPBSに希釈し(0.5 μL~10 μLの液滴を2000 μLの希釈液に推奨)、ピペットで混ぜます。
注: 渦を出さない か、またはアセンブリが破壊されます。 - 希釈したサンプルを洗浄されたベースラインキュベットに移し、蛍光を測定します。必要に応じて希釈を変更し、信号飽和を避けます。
- ステップ 5.5.1 から 5.5.4 までを繰り返しますが、PBS の代わりに 1% トリトンを使用します。1%トリトンで希釈した後、希釈したサンプルを30sの密封可能/キャップされたバイアルと渦に移してから測定します。渦巻きから発生する気泡がレーザーパスの上にあることを確認するのに十分なボリュームを追加します。
注:トリトンのサンプルの蛍光シグナルは、蛍光アンクチングのためにPBSよりもはるかに高くなります(図6)。
6. 気化イメージング
- 適切な大きさの水タンクに脱イオン水を充填し、24時間休んで水中のガスを大気と平衡させます。
- 液滴を準備し、使用するまで氷の上と暗闇の中に保ちます。
- Pellowら.18 で説明したように2%寒天から流れファントムチューブを作り、ファントムを37°Cに加熱した水槽に沈下します。
- PBSを37°Cに温め、ファントムを流します。
- 前臨床超音波システムと21 MHzリニアアレイトランスデューサ( 材料表を参照)を使用して、ビューをフローファントムに合わせ、Bモードイメージングに設定し、出力圧力を設定し、ビデオまたは画像をキャプチャして各圧力でベースラインを取得します。
- 液滴20μLを37°CPBSの50mLに希釈し、軽く混ぜます。溶液を30 mLのプラスチックシリンジに移し、溶液を寒天ファントムに押し込みます。
- ステップ6.5と同じ位置合わせを保ち、気化が観察されるまで出力圧力を高める(ファントムの明るい斑点、 図7を参照)。
注: 図7 は30%のパイロ-脂質液滴サンプルを示しています。この市販の21 MHzリニアアレイトランスデューサは、液滴のイメージングと気化の両方が可能です。
Representative Results
あらかじめ凝縮されたサイズ選択されたマイクロバブルサンプル(n=3)とポスト凝縮されたドロップレットサンプル(n= 3)を、10 μmの開口部を有するコールターカウンター(CC)でサイズ設定しました。10 μmの絞りの制限は、200 nmより小さい粒子を測定できないことであり、平均サイズと濃度を偏らさせる可能性があります。図4は、パイロ-脂質含有量製剤の各々のサイジングデータを示す。表 1 は、サイズ変更データに基づく統計を示しています。前および縮合後平均直径の比率を用いて、結果は0%パイロ-脂質製剤が0.02±1.72で最小の平均直径シフトを有することを示した。50%のパイロ-脂質製剤は、0.08±2.38で最大の平均直径を持っていました。1%のパイロ-脂質液滴サンプルは、10 10 /mL×1010 /mLで最も高い観測濃度(2.71±0.13)を持ち、40%のパイロ-リドロップレットサンプルは10 9/mL×最も低い(7.36±0.81)で最も低い観察濃度を持っていました。サイジングデータは、10%のパイロ-リピッド液滴サンプルが261±13nmで最小のピークダイメーターを有し、50%のパイロリピッド液滴サンプルが390±55nmで最大であったことを示した。一般的に、パイロ-脂質含量が増加するにつれて、濃度が低下し、平均直径が増加した。凝縮後のサンプルは前駆体マイクロバブルサンプルに基づいているため、両方のタイプの超音波造影剤に対して傾向が生じた。パイロ-脂質含量が増加するにつれて、微小気泡亜集団(ピークサイズは約2000μm)が形成され始めた。この二次ピークは、0%のパイロ-脂質マイクロバブルサンプルには存在せず、40%および50%のパイロ脂質集団において最も明らかであった。
図5は、30%パイロ-脂質液滴サンプルの代表的な吸光度測定を示す。PBSの無傷のサンプルのピークは700nmであったが、トリトンでの破壊されたサンプルはピークを671nmにシフトした。これは、無傷の組立体が、個々の未組立脂質成分と比較して異なる光学特性を有することを示した。
図6A は、予縮されたマイクロバブルサンプルの代表的な蛍光測定を示し、 図6B は30%パイロ脂質を有するポスト凝縮液滴サンプルを示す。PBSの無傷のサンプルは704 nmで蛍光ピークを有し、破壊された形態は674nmでピークを有した。カーブの下の破壊領域を曲線の下の無傷の領域で差を引き、その差を曲線の下の破壊された領域で除算すると、クエンチ効率が得られ、30%のパイロ脂質マイクロバブルサンプルと液滴サンプルでそれぞれ98.61%と98.07%になります。
マイクロバブルに変換する液滴を実証するために、希釈された液滴を、超音波システムを用いた37°Cフローファントムで画像化および気化した。 図7 は、異なる圧力で画像化された30%パイロ-リドロップレットサンプルの代表的な超音波画像を示す。低圧(図7A)では、寒天合成から立ち往生した気泡からのバックグラウンド信号のみ、信号がほとんどなかった。これは、液滴はエコー原性ではなく、超音波を散乱しないためです。わずかに高い電力で、明るい斑点の出現によって示されるように、いくつかのマイクロバブル(図7B)が発生した。圧力が高くなるにつれて、より多くのマイクロバブルが発生した(図7C および 7D)。また、液滴が37°Cで自然気化しないことも実証した。
図1:30%パイロ-脂質溶液を形成するステップの画像。A)クロロホルムの脂質粉末とパイロ-SPC。 B)溶解ソリューションを追加しました。 C)脂質フィルムを乾燥し、バイアルの内壁にコーティングした。 D)アルミ箔で包まれた脂質バイアル(再利用のためにテーピングされた外装箔)。 E)水和脂質溶液。 F)血清バイアル中の脂質溶液。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 10マニホールドガス交換器 プロトコルで参照されているバルブにはラベルが付いている。ガス 交換器を組み立てる方法については、補足ファイル「その他のプロトコルとデータ」を参照してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3 :A)サンプルバイアル中の7製剤(0%~50%パイロ-SPC)の脂質溶液。図B〜Dは、30%のパイロ-脂質滴を作るために取られたステップの画像を示す。 B)30%のパイロ-脂質溶液をサンプルバイアルに含む。C)攪拌後。D)15分サイズ選択。E)デカフルオロブタンバイアルに転送されたボトムパーティション。D)縮合後。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:異なるパイロ-脂質シェル含有量を有するサイズ選択されたマイクロバブルおよびドロップレットサンプルのコールターカウンタ(CC)のサイズデータ(n=3)。 緑色の実線はマイクロバブルを表し、点線のシアン線は液滴を表します。A)0% パイロ-SPC.B)1%パイロ-SPC。C)10% パイロ-SPC.D)20% パイロ-SPC.E)30%パイロ-SPC。F)40%パイロ-SPC。G)50%パイロ-SPC。H)シェル内のパイロ-SPC含有量に基づくCCからのマイクロバブルおよびドロップレットサンプルの総観測濃度。すべての誤差範囲は標準偏差を示します。すべての測定は200 nmから6000 nmのサイズ範囲を有する10 μmの開口を使用して行われた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:PBSおよび1%トリトンで希釈した300~800nmの光熱吸収率測定を、紫外線可視(UV-Vis)分光測定の代表的な測定方法で、1%Tritonで希釈します。
図6:410nmで励起された600〜750nmの代表的な蛍光放出。A)PBSおよび1%トリトンでサイズ選択、予め凝縮された30%のパイロ-脂質マイクロバブルサンプル。 B)PBSおよび1%トリトンでの30%パイロ-脂質液滴サンプル後凝縮。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:Bモードで前臨床21MHzの線形配列トランスデューサで撮影された37°C寒天流ファントムの代表的な超音波画像(材料表を参照)。左の列 (図A、C 、E、および G)は PBS コントロールを示しています。右カラム(図B、D、F、H)は、37°CPBSの50 mLに希釈した20μLの縮合後30%パイロ-リドロップレットサンプルを示しています。 各行は、フリーフィールドピーク負圧を表し、これはSheeranららによって行われた作業から推定された黄色の三角形は焦点深さを示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 方式 | エージェント | パイロシェル % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| CC | 泡 | コンク[/mL] | (2.76 ± 0.28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1.91 ± 0.22) × 10^10 | (1.47 ± 0.05) × 10^10 | (8.47 ± 0.95) × 10^9 | (9.89 ± 0.15) × 10^9 |
| CC | 泡 | ピーク [nm] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| CC | 泡 | 平均 [nm] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| CC | 泡 | 中央値 [nm] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| CC | 飛沫 | コンク[/mL] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1.75 ± 0.18) × 10^10 | (1.72 ± 0.13) × 10^10 | (1.09 ± 0.01) × 10^10 | (7.36 ± 0.81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| CC | 飛沫 | ピーク [nm] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| CC | 飛沫 | 平均 [nm] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| CC | 飛沫 | 中央値 [nm] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
表1:コールターカウンター(CC)とは異なるパイロSPC含有量を有するマイクロバブルおよびドロップレットサンプルのサイジングデータ統計(n= 3)。すべての誤差は標準偏差を示します。
補足情報 - 脂質式シート: このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足情報 - その他のプロトコルとデータ: このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
すべての脂質成分を一緒に添加した後(ステップ1.2および1.4.5、図1A)、クロロホルムおよびメタノール(およびDSPAのようなホスファチジン酸脂質が存在する場合は水)の溶液を添加し、パイロ脂質および非パイロ脂質成分を完全に均質化した(ステップ1.5、図1B)。不均一な脂質組成物を用いた脂質小胞の形成を防ぐために、溶解した脂質を乾燥し、薄膜としてバイアルの壁の内部に被覆した(図1C)。コーティング(ステップ1.6)はまた、乾燥したフィルムの表面積を増加させるので、水分補給(ステップ2.1〜2.4)を容易にします。乾燥(ステップ1.6、図1C)と真空(ステップ1.8、図1D)は、これらの化学物質がマイクロバブルの形成を妨げる可能性があるため、クロロホルムとメタノールを完全に蒸発させるために行われました。プロトコルを縮小して、脂質溶液の体積を1 mLまで小さくすることができますが、大きなボリュームはバイアルからバイアルへの変動を減らすことができます。これは使用中でない間にPyro-SPCを分解するリスクを実行する可能性がありますが、脂質溶液の貯蔵状態(ステップ2.9〜2.10)は、そのリスクを軽減することを意味していました。ガス交換器を使用した脱ガス工程(ステップ2.9.2、図1Fおよび図2)は、酸化を防止するためにできるだけ多くの酸素を除去する役割を果たします。大気中のガスが溶液中に溶解している間、ポルフィリン-脂質を含む脂質溶液を保存することは推奨されません(図1E)。
ステップ2.10において、脂質溶液は、加圧ヘッドスペースを有する血清バイアル中に、臨床的に承認された超音波造影剤パーフルトレン脂質微小球の販売方法と同様である(図1Fに類似)。内部の研究は、キャップがゴム栓のような柔らかい材料であった場合、パイロ脂質の存在と機械的攪拌を介して安定したマイクロバブルを生成することができなかった示しています。従って、脂質溶液を、非ゴムフェノールキャップを用いてサンプルバイアルに移した(ステップ4.1〜4.4、図3A及び図3B)。デカフルオロブタンガスがサンプルバイアルに流入ったとき(ステップ4.1〜4.4)、より密度の高いデカフルオロブタンは、サンプルバイアルヘッドスペース内の大気を置き換える必要があります。現在、パイロ脂質がゴムストッパーでマイクロバブルを形成できない理由は不明です。パイロ脂質を使用しない場合、安定したマイクロバブルはゴムストッパー4、7で血清バイアルで直接作ることができます。したがって、ガス交換器を使用して血清バイアルを脱気し、再加圧し、非パイロ脂質製剤4、5、6、7のために血清バイアル自体を攪拌することを推奨する(「その他のプロトコルおよびデータ」を参照)。血清バイアルで機械的に攪拌することができるという利点は、ヘッドスペースを加圧することができ、サイズ選択は、血清バイアルを逆さまに反転させることによって行うことができる8。このプロトコルにおいて、0%パイロ-脂質製剤をサンプルバイアル(ステップ4.1〜4.4)に移し、パイロ脂質を含んでいた製剤と一致させる。さらに、長いアシル脂質鎖長は、より良いファンデルワールス相互作用によるより安定した液滴をもたらす19.脂質シェル組成物は、市販されたものに基づいて選択した、全ての脂質タイプに対して18-アシル鎖長。DSPE-PEG5Kは、ポリエチレングリコール鎖の存在として全ての製剤(ステップ1.1)に組み込まれ、反発的な立体力19を介して構造の合体を防止する。脂質水和中、浴超音波浴は、18-アシル鎖長さの脂質膜18を十分に分散させるのに十分な高さとして70°C(ステップ2.1)に設定した。アシルチェーンの長さを長くする場合は、より高い温度が必要になります。
高いパイロ-脂質負荷は、光学的に吸収および蛍光成分の濃度を増加させるであろう, これは、最大のポルフィリン負荷の恩恵を受ける特定のアプリケーションのために望まれる可能性があります.しかし、パイロ-脂質含量が増加するにつれて、観察可能な液滴濃度が低下し、直径が増加した(図4 および 表1)。これは、光蛍光と吸光度特性対液滴濃度と直径とのトレードオフを示しています。小さな漏れやすい血管を介した インビボ 蓄積のために小さな直径を優先しなければならない研究者や、高濃度の液滴を注入する必要がある場合、パイロ脂質の増加は、液滴のダイメーターの増加や液滴濃度の低下に値しない可能性があります。高い液滴濃度および/または小さな液滴径が最も重要である場合、同様のサイズのコンパニオン診断薬は、パイロ脂質の代わりに考慮されるべきです。1%のパイロ-脂質滴は濃度の低下やサイズの増加をもたらさなかったが、1%のパイロ-脂質負荷は、組織のバックグラウンドから蛍光的に合理的に検出するには低すぎる可能性がある。しかし、ポルフィリン部分の柔軟性は、低濃度のアプリケーションに適した定量の代替手段を付与する機能化のための複数のオプションを提供します。例えば、パイロ脂質は、陽電子放出断層撮影法およびガンマ計20の銅-64で、または質量分析を用いて微量金属定量のためのパラジウム、または磁気共鳴画像法用のマンガンを用いて、偏光することができる。
いくつかの実験は、液滴溶液の少量を必要とするかもしれないが、1.85 mLサンプルバイアルを満たすために1 mLの脂質溶液が必要である。Goertzらは、ハンドリング、ヘッドスペース圧、液体対気体比、さらにはバイアル形状の変化が、マイクロバブル集団17に影響を及ぼす可能性があることを実証した。攪拌およびサイズ選択の間のバイアル温度はまたサイズの配分に影響を与えることができる。したがって、エンドユーザーによって最適化された方法については、液滴を作るときに可能な限り一貫性を保つ必要があります。未開封の液滴は凍結され(-20°C)、後で使用するために解凍される可能性がありますが、これはサイズ集団に影響を与えます。
マイクロバブルに脂質溶液を活性化する攪拌手順は、形態学的に均質な集団を生成しない(ステップ4.6);むしろ、サンプルはマイクロバブル、マルチラメラ小胞、リポソーム、ミセル18、21、22で満たされています。マイクロバブルサイズはミクロンとナノメートルの範囲に及ぶが、他の構造は、主に800 nm 23を下回る。使用されるサイジング技術は、これらの様々な構造を区別しないため、攪拌後のマイクロバブルサンプル(ステップ4.6、図3C)と縮み込み後のドロップレットサンプル(ステップ4.14、図3F)を混合物として想定しなければならない。超音波に敏感なアセンブリ(マルチラメラ小胞、リポソーム、ミセル)は、縮合後に保存される可能性が高く、相変化可能なコアを持たないため、サイズは変更されません。コールターカウンターはこれらの異なる上分子集合体を区別することができないので、縮合後の母集団サイズの変化は、ナノスケール構造の一部の割合が変換不可能であり、そのサイズ領域で観察された集団に寄与することを前提に解釈されるべきである。さらに、これらの構造は、これらのサンプル14の分光および蛍光シグネチャに寄与する。ミセル、リポソーム/小胞、および液滴の蛍光および吸光度シグネチャは、蛍光焼入れ14の程度を含め、すべて類似している。したがって、図3C~3Fにアセンブリの混合物が存在することを考慮することが重要であり、図4、図5のPBS希釈サンプル、および図6のPBS希釈サンプルを含む。
サイズ選択後、縮合前(ステップ4.9)、微気泡サンプルを遠心分離して、Feshitanらの21で説明した非浮力アセンブリから浮力の気泡を分離することにより、非気泡アセンブリを排除することができ、分離の程度は、スピン力と持続時間を調整することによって制御することができる。しかし、このようなサイズ分離サンプルのマイクロバブル凝縮の実験は、サイズ分離手順を使用して選択されたより大きな前駆体マイクロバブル集団を使用して、より大きな液滴を生み出したことを明らかにした(ポストスピンバブルおよび液滴サイジングのためのステップS5「その他のプロトコルおよびデータ」を参照)。このプロトコルで生成される液滴の意図された適用は、マイクロバブル4、8と比較してその小さなサイズによる受動的な外挿および蓄積のためのプラットフォームであるため、可能な限り小さい液滴集団が望まれていた。したがって、このプロトコルは、超音波無神経なミセル、リポソーム、および小胞が最終的な溶液に存在していたことを意味する場合でも、遠心分離によってサイズ分離されなかったポスト攪拌マイクロバブルサンプルを使用した。これは、バイオ分布の定量化手順が注入されたすべての構造のシグナルを導き出し、液滴だけに限定されないことを意味します。しかし、これらの同様の大きさの構造は主にサイズによって決まる受動的なメカニズムを介して蓄積される可能性が高いので、このプラットフォームをvivoで利用する場合に行うことができる主な推論を変えるべきであるとは考えられません。超音波の有無にかかわらず実験的な腕を使用してテストを行い、溶液中のパーフルオロカーボンコアアセンブリのみが超音波に応答するため、生体分布の変化を引き起こす超音波感受性液滴であることを確認することができます。
攪拌後、バイアルを15分間休ませ、バイアル内でパーティションを観察した(図3C対3D)。浮力によるサイズ選択は、活性化されたマイクロバブル溶液8,17からより大きな構造/気泡を除去する簡単な方法である。この場合、直径が5μmを超える粒子は、サイズ選択後に大部分を除去した(図4)。サイズ選択の範囲は、サイズ選択の期間を制御することによって調整することができます17.Sheeranら. サイズ選択を行わない場合、血管系8を閉塞するマイクロバブルが発生する可能性があることを示しています。
パーフルオロカーボンは、生物学的に不活性である利点を有する7.デカフルオロブタンの沸点は-1.7°Cであるが、体温を上回るが、液滴は37°Cに曝された場合にすぐに気化しない(図7B)。液滴は37°Cでメタ安定性であるため、液滴をマイクロバブル7,9に気化させるために追加の音響エネルギーが必要である。ポプロスキーらは、加圧22を介して凝縮されたポルフィリン液滴を実証した。これは、より密度の低いパーフルオロカーボンを使用する場合でも、実行可能で不可欠な方法ですが、高圧は、プロセス内のいくつかの気泡を破壊する可能性があります。オクターフルオロプロパン(C3F8)は-36.7°Cの沸点を有するため、液滴凝縮には冷却と加圧の両方が必要です。しかし、より軽いパーフルオロカーボンは、より安定した液滴を導く。ドデカフルオロペンタン(C5F12)は、28°Cの沸点を有するより安定した液滴を導くことができる。 しかし、それは室温で液体であり、気化するためにより強い音響エネルギーを必要とします。したがって、超音波造影剤の含有ガスの選択は、その製造のパラメータに加えて、その意図された生物学的用途の条件を考慮すべきである。このプロトコルでは、結露用のイソプロパノール浴を-15〜-17°C(ステップ4.7.1およびステップ4.13)に設定し、他のプロトコルは-10°C5、6を使用した。 一般的なデカフルオロブタンコアを有しても、結露温度は賦形剤組成物、総脂質濃度、および脂質シェル組成物によって変化する可能性がある。他の製剤を使用する場合、溶液を凍結させることなく適切な液滴凝縮を確実にするために最適化が必要となる場合があります。
液滴は、マイクロバブル前駆体7よりも小さくかつ安定であるため、受動蓄積機構をより有効に活用して、特定の腫瘍タイプ4,24の透過性および保持効果の増強など、関心のある特定の組織に浸透させる。蛍光、光学的吸収性、および音響検出14の方法を用いて、取り込み量を定量化するために単一の製剤を用いることが可能である。さらに、このプラットフォームは、液滴の音響気化が受動的レベル16を超えて配信されたエージェント分率を改善できるかどうかを調べるために使用することができる。注射後の目的の組織や臓器の生体分布を定量化するには、既知の量のパイロ-脂質滴を動物に注入し、超音波は制御セットに応じて適用され得る、動物は事前に指定された時間ポイントを犠牲にする必要があり、臓器を取り除いて計量する必要があります。器官は、組織を脱細胞化するために均質化、濾過、界面活性剤(洗剤)で希釈し、蛍光またはUV-Vis分光法で定量し、パイロ信号に基づいて臓器質量当たりの注入用量パーセンテージを得る必要があります。ステップ5.4.5(図5)およびステップ5.5.5(図6)では、410nmで非蛍光性であるため、サンプルを破壊するためにTriton X-100界面活性剤(洗剤)を使用し、その吸光度波長はパイロと重なりません。
マイクロバブルはUV-Vis吸光度を特徴としなかった。UV-Vis分光器のレーザー光源は検出器と平行であるため、大きな気泡は検出器から光を散乱させ、より光学的に吸収性が14に見えるようにする。UV-Vis分光光度計とは異なり、蛍光分光光度計の検出器はレーザー光源に対して垂直にする必要があり、ソースが検出器に干渉するのを防ぎます。UV-Visを使用して、無傷および破壊されたドロップレットサンプルの吸光度を定量化した(ステップ5.4、図5)。300〜800nmは、この範囲14に収まる、この範囲の14に該当する、この範囲の14に該当する、熱脂質の2つの主な吸光度帯として吸光度波長として選択された、ソレットバンド(340〜500nm)およびQバンド(640〜730nm)に該当する。液滴(または他の上分子構造)に組み立てられると、パイロ-脂質のQバンドピークは671nmから700nmに赤ずるシフトする(図5)。この上分子構造がトリトンのような界面活性剤によって破壊されると、ピークは671 nm14、15に戻ります。このシフトに基づいて、パイロ-脂質が組み立てられた状態にあるか、または破壊された状態にあるかを判断することが可能です。2 つのピークの比率を使用して、アセンブリの減衰を時間の経過に応じて推定できます。
蛍光測定(ステップ5.5、図6)では、未組み立てパイロ-脂質14のソレット帯ピークに相当する410nmの励起波長を選択した。PBSでは600〜800nmの発光波長範囲を選択し、トリトン内の破壊されたパイロ脂質はこの範囲内に含まれる。蛍光のシフトおよび増加(図6)は、無傷(PBS中の704 nm)と破壊された(トリトンでは674 nm)サンプルの間で、構造誘発性の急流のために起こった。組み立てられた形では、パイロ-脂質分子を密接に詰め込んだため、生成された光子は近くのパイロ脂質分子によって吸収されました。これは、無傷と破壊されたクエンチ効率で明らかです。したがって、1%Triton X-100のような界面活性剤(洗剤)でサンプルを希釈して、焼入れを緩和し、バイオ分布定量化のためのシグナルを最大化する必要がある。
分かりやすくするために、同一の線形アレイ超音波トランスデューサを使用して、気化と画像の両方を行いました(ステップ6.5および6.7、図7)。この超音波トランスデューサ(材料表)は、液滴8を気化するために必要なピーク負圧に到達することができた。タンクに水道水を注入すると、水に溶解するガスが発生します(ステップ6.1)。水中の溶存ガスからの干渉を気化およびイメージングで最小限に抑えるために、水をタンク内で24時間休ませて、水中のガスが大気と平衡化できるようにした(ステップ6.1)。あるいは、脱イオン水は十分に強力な真空に接続された十分な大きさの密封可能な容器で脱気することができる。超音波画像は、液滴が低圧で観察不能/非エコー原性であったため、マイクロバブルが正常に凝縮されたことを示した(図7B)。液滴が観測可能なエコー原性マイクロバブルに気化したのは、より高い出力圧力でのみであった(図7D、7F、7H)。凝縮後の液滴サンプルにはミセルとリポソーム/小胞が含まれていますが、これらのアセンブリはエコー原性が無く、液滴だけがエコー原性マイクロバブルに気化します。PBS制御は、ベースライン画像を確立するためにファントムを通して流された(図7A、7C、7E、7G)。PBSで圧力が上昇するにつれて、コントラストは生じなかった。これは、トランスデューサからの高圧が水系媒体単独で自発的なキャビテーションを生じることができないことを示し、したがって、他のすべての生成されたコントラストは、使用される超音波造影剤に起因する可能性がある。出力圧力が高すぎると、発生したマイクロバブルが破壊され得る。徐々に圧力を増加させ、生成されたコントラストを観察することによって、最適な圧力は8.液滴の循環半減期は、一定の時間間隔である液滴を気化させ、時間7にわたって発生するコントラストを観察することによって、同様の方法で決定することができる。
要約すると、パイロ-脂質含量が変化するマルチモーダル位相変化液滴を、凝縮法で作成した。サイジングは、パイロ- 脂質負荷とマイクロバブル/液滴濃度の間にトレードオフがあることを示した。特徴付けは、吸光度と蛍光の両方に無傷および破壊された形態に違いがあることを示した。超音波画像診断は、液滴が37°Cで非エコー原性であり、十分な圧力でエコー原性マイクロバブルに気化可能であったことを示した。特徴付けはまた、熱脂質液滴が液滴バイオ分布または蓄積試験のためのコンパニオン診断薬を置き換える可能性を示した。今後の研究では、ヌードマウスにおける溶液中気化閾値、溶液中安定性、 生体内 循環持続時間を調査する。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ガス交換器の建設を支援してくれたブランドン・ヘルフィールド博士と、技術的な議論のためにミフィー・ホク・ヤン・チェン博士に感謝したいと思います。著者らは、オンタリオ大学奨学金、カナダ保健研究所、テリーフォックス研究所、プリンセスマーガレットがん財団の資金源に感謝したいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
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