Summary
이 프로토콜에서는 다중 모달 상변경 포피린 물방울을 합성하고 특성화하는 방법이 설명되어 있습니다.
Abstract
위상 변화 물방울은 충분한 음향 에너지의 적용과 함께 시상에서 에코겐 마이크로 버블로 변환 할 수있는 초음파 조영제의 클래스입니다. 물방울은 마이크로 버블 보다 작고 더 안정적입니다. 그러나, 전통적인 초음파 조영제는 음향 피드백 측정을 넘어 추적할 수 없으며, 이는 정량화 조영제 바이오 분배 또는 축적 전 생체 내 비보를 어렵게 만든다. 연구원은 바이오 분포를 추론하기 위하여 형광 또는 광학 흡수성 동반자 진단 입자에 의지해야 할 지도 모릅니다. 이 프로토콜의 목적은 응축 방법을 사용하여 다중 모달 위상 변화 포르피린 방울을 만들기 위한 단계를 자세히 설명하는 것입니다. 포르피린은 뚜렷한 흡광도 대역을 가진 형광 분자로 지질에 결합하고 액적 의 다양성을 확장하기 위해 액적에 통합되어 음향 특성을 유지하면서 보다 강력한 바이오 분배를 가능하게 합니다. 다양한 포르피린 지질 및 염기 지질 함량을 가진 7개의 제형이 마이크로버블 및 액적 크기 분포를 조사하기 위해 만들어졌습니다. 포르피린 함유 구조에 적합한 특성화는 또한 그들의 분석 다기능성 내 용액을 입증하기 위해 프로토콜에 설명되어 있다. 크기 조정은 응축 된 후 평균 직경이 전구체 인구보다 1.72 ~ 2.38 배 작다는 것을 보여주었습니다. 흡수성 특성화는 그대로 어셈블리가 700nm의 Q밴드 피크를 보였고, 중단된 시료는 671nm에서 흡광도 피크를 가졌다. 형광 특성화는 그대로 30% 포르피린 지질 어셈블리가 형광액(>97%)으로 나타났으며, 혼광 회복은 중단시 달성되었다. 음향 기화는 포르피린 방울이 낮은 압력에서 비 반향적이며 충분한 압력을 가진 에코제닉 마이크로 버블로 변환될 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 특성화는 생체 내 또는 전 비오에서전달 또는 치료 응용을 위한 초음파 조영제 바이오 분배를 정량화하기 위한 흡광도 또는 형광기반 동반자 진단 전략의 필요성을 제거하기 위해 포르피린 액적물의 가능성을 보여준다.
Introduction
초음파 화상 진찰은 음향파를 이용하는 의학 화상 진찰의 비 침습적이고 비 이온화 양식입니다. 초음파 스캐너는 더 휴대성이 있고 실시간 심상을 제공할 수 있지만 초음파 이미징은 낮은 대비로 고통받을 수 있으므로 초음파 검사기가 유사하게 반향 병리학적 특징을 구별하기가 어렵습니다. 이러한 한계를 중화하기 위해 마이크로버블을 숙주에 주입하여 혈관 대비를 개선할 수 있습니다. 마이크로버블은 음향파에 매우 반향이 많으며 향상된 용기 대비1,2를제공할 수 있는 미크론 크기의 가스 충전 콘트라스트에이전트이다. 마이크로버블의 쉘 및 가스 코어는 이미징, 혈전용증, 세포막 투과성, 또는 과도 혈관개구부 2와같은 다양한 용도에 맞게 조정할 수 있다.
마이크로 버블의 단점은 짧은 순환 반감기입니다. 예를 들어, 임상적으로 이용 가능한 퍼플루트렌 지질 마이크로스피어는 1.3분의반감기만 3. 긴 이미징 세션의 경우 마이크로 버블의 여러 주사가 필요합니다. 마이크로 버블의 또 다른 단점은 큰 직경입니다. 퍼플루트렌 지질 마이크로스피어는 직경이 약 1~3μm정도이지만, 혈관에서 순환할 수 있을 만큼 작지만, 너무 커서 종양4와같은 관심 있는 조직에 수동적으로 축적된다. 이러한 한계를 극복하기 위한 한 가지 전략은 가스 코어 마이크로버블을 더 작은 액체 코어 방울5,6로압축하는 것입니다. 물방울은 액체 상태에서 반향이 없지만, 충분히 높은 피크 음압으로 초음파에 노출되면 마이크로 버블로 기화 할 수 있으며 대비를 제공하는 능력을 회복할 수 있습니다. 이를 통해 액적액은 작은 액체 코어의 더 유리한 약동학을 활용할 수 있게 해주며,화학조성물4,7을변경하지 않고 음송될 때 대비를 제공하는 능력을 유지한다.
Decafluorobutane는 기체 및 액체 상태 사이 위상 이동을 위한 이상적인 퍼플루오로카본화합물5,6,7. Decafluorobutane는 온도 감소 혼자있는 방울로 마이크로 버블의 응축을 허용하지만, 덜 조밀 한 perfluorocarbons 추가 가압을 필요로하는 반면5. 이 부드러운 방법은 응축7,8,9동안 기포의 파괴를 최소화합니다. 그들의 코어는 액체이기 때문에, 물방울은 비 반향이고 초음파에 보이지 않습니다. 그러나 충분한 음향 또는 열 에너지를 적용하면 액체 코어가 기체 상태로 다시 기화하여 반향 마이크로버블8을생성할 수 있다. 이 기화는 마이크로 버블을 생성할 시기와 장소를 제어할 수 있습니다.
액적은 수동 축적에 유용하지만, 시투 기화 또는 세포 투과성 향상4,액적(및 그 조각)은 전 비보를이미지화하거나 정량화할 수 없다. 따라서 형광4,10,11,자기입자(12)및 광학흡수제(13)와같은 정량화 가능한 동반자 진단제는 관심 있는 조직에 대한 액적 전달을 측정하는 아날로그로 활용된다. 예를 들어, 헬필드 등은 마우스 장기의 조직화 를 위해 형광 나노구슬을 공동 주입하여 액적4를 검출할 수없었다. 동반자 진단 에이전트의 단점은 추적 가능한 구성 요소는 개별 약동 성 프로파일에 따라 액적으로부터 독립적으로 작용할 수 있다.
다행히도, 마이크로 버블과 물방울의 껍질을 사용자 정의 할 수 있습니다. 예를 들어, Huynh 등은 포르피린 지질 껍질로 초음파 조영제, 다중 모달마이크로버블(14)을생성했다. 포르피린은 방향족 거시동화구조(14,15)를가진 유기 화합물의 클래스이다. 그(것)들은 광학적으로 흡수성, 형광, 및 방사선 요법을 위한 금속의 넓은 다양성으로 응치될 수 있고, 방사선 종종 기지를 둔 화상 진찰, 또는 미량 금속 기지를 둔 정량화14. 포르피린의 한 가지 예는 파이로페포비드(파이로)이다. 파이로를 지질에 접목시킴으로써, 마이크로버블이나 방울에 파이로 지질을 통합하여 음향, 형광, 흡광도14등여러 모달을 통해 이미지를 만들고 추적할 수 있다. 이 다중 모달 조영제는 축적을 추적하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이렇게 하면 정량화 가능한 성분이 쉘에 수렴되어 보다 정확한 전달정량화(16)를가능하게 하므로 동반자 진단 에이전트의 필요성이 제거될 수 있다.
본명, 다중 모달 상변경 포피린 방울을 만들기 위한 프로토콜이 설명되어 있다. 초음파 대조제로서 종양2,4와같은 관심 있는 조직에 약물 전달을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있으며, 초음파를 넘어 검출가능성을 확대하면 전달 효능 정량화에 유용할 수 있다. 이러한 물방울의 목적은 생체 내,시상 기화 및 음향에서 수동 축적이 가능한 추적 가능한 초음파 조영제와 이차 센서에 의존하지 않고 전 생체 기관에서 생체 분포 또는 축적을 정량화할 수 있는 잠재력을 제공하는 것입니다. 특성화 방법은 또한 바이오 분배 센서로서 포르피린 물방울의 잠재력을 보여주기 위해 설명되어 있습니다. 쉘의 파이로 지질 적재 효과(어금니 비율에 의해 0%~50%)도 논의된다.
Protocol
1. 탈수 지질 필름
- 필요한 각 쉘 구성 요소의 질량을 계산합니다(보충 파일 "지질 포뮬러 시트"참조).
참고: 이 프로토콜의 경우, 쉘 조성물은 10mm % 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-인포에탄올라민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000] 암모늄 염(DSPE-PEG5K), x 연체율 1-스테아릴-2-하이드록시-센-글리세로-3-인포콜린(파이로-SPC) 및 (90-x) 어금다 % 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-인포콜린(DSPC)을 공주하였다. 파이로-SPC의 양은 7개의 쉘조성물(x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50)에 걸쳐 다양합니다. 재고 병에 DSPE-PEG5K의 분자량을 확인합니다.- 프로토콜을 최소 1mL의 최소 부피로 모든 지질 부피로 조정합니다. 이 프로토콜의 경우, mL당 총 지질 농도1mg의 총 지질 부피가 모든 제형에 사용되었다. 부형제용액은 프로필렌 글리콜 10%, 글리세롤 10%, 인산완충식(PBS, 1X, 7.4 pH) (%v/v/v) (2.3단계 및 "지질 포뮬러 시트"참조)입니다.
참고 : 파이로 지질의 합성 프로토콜은 보충 파일에 설명되어 있습니다 "다른 프로토콜 및 데이터" S1에 단계 S1, 이는 정 외에 의해 수행 된 작업에서 수정된15. 15.
- 프로토콜을 최소 1mL의 최소 부피로 모든 지질 부피로 조정합니다. 이 프로토콜의 경우, mL당 총 지질 농도1mg의 총 지질 부피가 모든 제형에 사용되었다. 부형제용액은 프로필렌 글리콜 10%, 글리세롤 10%, 인산완충식(PBS, 1X, 7.4 pH) (%v/v/v) (2.3단계 및 "지질 포뮬러 시트"참조)입니다.
- 계산된 질량(1.1단계 및 "지질 포뮬러 시트 참조)을 기반으로 각 비파이로 지질을 계량하고 나사온 캡이 있는 충분히 크기의 보로실리케이트 유리 바이알로 옮습니다.
- 유리병을 캡하고 뚜껑과 바이알에 라벨을 부착하고 지질 유리병의 바닥과 벽을 알루미늄 호일로 덮습니다. 이 유리병은 프로토콜의 나머지 부분에 대해 "지질 바이알"이라고 합니다. 시원하고 건조하며 어두운 곳에 지질 바이알을 보관하십시오.
- 제형에 파이로-SPC가 포함되어 있는 경우, 10 mg의 파이로-SPC 건식 필름("기타 프로토콜 및 데이터"참조)을 1mL의 클로로폼으로 용해하십시오. 5s용 소용돌이, 흡광도 측정, 지질 바이알에 첨가할 적절한 부피를 계산한다.
주의: 클로로폼은 건강 위험, 자극제 및 독성입니다. 보호 실험실 코트, 눈 보호, 장갑을 착용하고 호흡 연기를 피하십시오.
참고: 파이로-SPC가 가볍기 때문에 파이로-SPC를 처리할 때 가능하면 작업 영역의 조명을 줄입니다. 사용하지 않을 때는 파이로-SPC를 밀봉하고 덮어 두십시오.- 자외선가 보이는 분광광계에서는 800nm에서 300nm까지의 파장 범위에서 흡광도를 측정하고, 호환되는 1cm 경로 길이 의 2000 μL의 기준선을 측정한다.
주의: 메탄올은 건강 위험, 자극제, 독성 및 인화성입니다. 보호 실험실 코트, 눈 보호, 장갑을 착용하고 호흡 연기를 피하십시오. 불꽃과 열을 멀리하십시오. - 클로로폼에 파이로-SPC의 2 μL을 메탄올 2000 μL에 넣고 30초 동안 소용돌이를 넣습니다. 깨끗하고 호환되는 1cm 큐벳으로 옮기고 흡광도를 측정합니다. 자외선가 보이는 분광계의 흡광도 범위에서 667 nm에서 흡광도 피크가 있는 경우 이 희석 계수를 조정합니다.
참고: 클로로폼이나 메탄올을 옮길 때마다 기계식 파이펫이 아닌 깨끗한 유리 주사기 또는 양수 변위 파이펫을 사용하여 더 나은 정확도를 제공합니다. - 1.4.2 단계를 두 번 더 반복하여 삼중 흡수도 값을 얻습니다.
- 667 nm에서 흡수성 피크 값을 평균하고 다음 방정식을 사용하여 지질 바이알14,15에필요한 클로로포름에서 파이로-SPC의 부피를 계산합니다.
여기서 V는 클로로포름의 파이로-SPC의 부피이며, m은 파이로-SPC의 필수 질량(1.1단계 및 "지질 포뮬러 시트 참조"), M은 파이로-SPC의 분자량 1040.317 g·mol-1, A는 667nm에서 평균 흡광도, d는 메탄올 및 파이로-SPC를 기반으로 한 희석계수(Step 4.2.1)이다. L은 1cm에서 큐벳 경로 길이이며, ε 45000 L·1·1몰-1·1에서 파이로-SPC의667nm 어금반 감쇠 계수이다.
참고: 방정식의 분모는 멀리 측정된 광학 흡수에 대한 용액의 별문 농도와 관련된 맥주-램버트 법칙입니다. - 깨끗한 유리 주사기(도1A)를사용하여 이전 단계에서 엽록소에 파이로-SPC의 계산된 볼륨을 추가한 다음 유리병을 뚜껑을 덮고 있습니다.
참고: 도 1은 30% 파이로 지질 제형만을 나타낸다. - 클로로포름에 파이로-SPC가 남아 있는 경우: 연기 후드에서 파이로-SPC + 클로로폼 바이알을 1.4단계에서 뚜껑을 풀고 유리병을 측면으로 부분적으로 기울이고 가능한 한 부드럽게 파이로-SPC/클로로폼 바이알로 질소 가스를 지속적으로 흐릅니다. 유리병을 회전하여 질소 가스 흐름을 사용하여 클로로폼을 건조시키고 파이로-SPC를 건조시 유리병의 내부 벽에 고르게 코팅합니다. 스플래시가 이루어지지 않고 솔루션이 빠지지 않도록 하십시오.
- 파이로-SPC 지질 필름이 건조하고 유리병 벽에 코팅되면 질소 가스 흐름을 끕니다. 유리병을 캡, 왁스 필름으로 유리골 목을 밀봉하고 - 20 °C와 어둠 속에서 유리병을 저장합니다.
- 자외선가 보이는 분광광계에서는 800nm에서 300nm까지의 파장 범위에서 흡광도를 측정하고, 호환되는 1cm 경로 길이 의 2000 μL의 기준선을 측정한다.
- 90% 클로로폼과 10% 메탄올(% v/v)의 용액을 준비하고, 5mL를 지질 바이알에 추가합니다. 지질 바이알을 캡하고 부드럽게 소용돌이하여 내용(도1B)을균질화합니다.
참고: 제형에 인산화산 지질(예: 1,2-디스테아로일-센-글리세로-3-인산나트륨 염(DSPA)이 포함되어 있는 경우, 추가: 60% 클로로폼, 32% 메탄올, 8% 이중 증분수(% v/v/v) 대신 립드 비알에 첨가한다. 지질 함량을 완전히 용해시키기 위해 더 강렬한 소용돌이가 필요할 수 있습니다. - 연기 후드에서 지질 바이알을 뚜껑을 풀고, 지질 바이알을 부분적으로 옆으로 기울이고 질소 가스를 가능한 한 부드럽게 지질 바이알로 흘린다. 지질 바이알을 회전하여 질소 가스 흐름을 사용하여 용액을 건조시키고 지질 필름을 건조시 지질 바이알의 내부 벽에 고르게 코팅합니다. 스플래시가 이루어지지 않고 솔루션이 빠지지 않도록 하십시오.
- 지질이 건조하고 지질 바이알(도1C)의내부 벽에 코팅되면 질소 가스 흐름을 끄고, 지질 바이알의 바닥과 벽을 알루미늄 호일로 덮고, 알루미늄 호일로 상단 개구부를 덮어 환기를 위한 바늘이 있는 몇 개의 구멍으로 찌르고있다(도 1D).
- 지붕이 덮인 지질 바이알을 진공 건조기 안에 놓고 지질이 적어도 24시간 동안 더 건조할 수 있도록 하고 72h 이상건조할 수 있도록 합니다.
참고: 프로토콜은 24~72시간 후에 나중에 다시 시작할 수 있습니다.
2. 지질 수분 공급
- 목욕 초음파 를 채우고 물을 70 °C로 가열하십시오. 초음파 처리를 켜면 물을 섞어 줍니다.
주의: 물과 초음파 처리기는 고온에 있습니다. 물과 초음파 처리기만 을 건드리지 마십시오. 눈 보호, 보호 실험실 코트 및 보호 장갑을 착용하십시오. - 목욕 초음파 처리기가 70 °C에 도달하면 진공 건조기에서 지질 바이알을 제거하십시오. 가능하면 작업 영역의 조명을 줄입니다.
- 10% 프로필렌 글리콜, 10% 글리세롤, 80% PBS(% v/v/v)의 부형제 용액을 준비하고 지질 바이알에 10mL를 추가합니다(1.1.1 단계 및 "지질 포뮬러 시트"참조).
참고: 표준 공기 변위 파이펫을 사용하는 경우 프로필렌 글리콜 및 글리세롤과 같은 점성 용매를 취급할 때 는 주의하십시오. 볼륨을 천천히 흡입하고 급락시키고 잔류 볼륨이 파이펫 팁의 바닥에 도달할 때까지 기다립니다. 액체가 천천히 이동하여 볼륨을 전송할 때 파이펫 팁의 바깥쪽에 달라붙지 않도록 하십시오. - 지질 바이알을 캡, 알루미늄 커버를 제거하고, 초음파 처리가 지질을 용해하는 동안 15 분 동안 목욕 초음파 처리기에서 유리병을 부드럽게 소용돌이. 지질 비알의 목이 물 위에 있는지 확인하십시오. 때때로 바이알 캡이 단단히 닫혀 있는지 확인합니다.
- 때때로, 수조에서 지질 바이알을 제거합니다. 내용이 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 빛을 간략하게 유지하십시오(그림1E).
- 지질 바이알 내용이 균질화되지 않으면 욕조 초음파 처리기에서 지질 바이알을 제거하십시오. 캡을 고정하고, 더 공격적으로 소용돌이를 가하고, 목욕 초음파 처리기로 되돌십시오.
- 목욕 초음파 식기에서 지질 바이알을 제거하고 목욕 초음파 처리기를 끕니다. 지질 바이알 외관을 종이 타월로 말리고 지질 바이알에 라벨을 다시 붙입니다.
- 지질 바이알을 알루미늄 호일로 덮고, 시원하고 어두운 건조한 지역에서 실온에서 지질 바이알을 10분간 식힙니다.
- 지질 바이알 함량 알리쿼트: 지질 용액의 약 2mL 3 mL 보로실리케이트 유리 클리어 세럼 바이알 (7mm 내입 직경, 13mm 외입 직경).
참고: 일부 프로토콜은 3mL 바이알7에서지질 용액 1.5mL를 사용할 수 있다. - lyophilization 스타일의 회색 클로로부틸 고무 스토퍼 (7mm 내입 직경, 13mm 외부 입 직경)로 혈청 바이알을 캡하고 찢어진 알루미늄 씰 (13mm 외부 입 직경)과 크림퍼(도 1F)로고무 스토퍼를 고정시하십시오.
- 각 혈청 바이알4,5,7(도 2)에서진공,드가 및 지질 용액을 재가압한다.
참고: 가스 교환기를 조립하는 방법과 자세한 내용은 "기타 프로토콜 및 데이터"를 참조하십시오.- 압력 밸브 A와 가스 실린더밸브(그림 2)를포함한 모든 밸브를 닫습니다. 세럼 바이알을 매니폴드 바늘에 연결한 다음 해당 매니폴드 밸브를 열고 진공 밸브 A와 진공 밸브 B를 열고 -90 kPa(-13 psi, -900 mbar)에서 진공 청소기를 5분 동안 진공 상태에서 대기 공기를 제거합니다. 액체 중 어느 라도 진공 청소기를 진공 청소기로 청소하지 마십시오("기타 프로토콜 및 데이터" 단계 S3에서 S3.1.5로 참조).
주의: 진공 펌프가 잘못 처리되면 파열될 수 있습니다. 유기, 산성 또는 기본 화학 물질과 진공 펌프를 사용하지 마십시오. - 진공이 계속 켜진 상태에서 혈청 바이알을 잡고 (스윙을 방지) 펜이나 마커로 빠르게 눌러 가스를 제거합니다. 거품이 형성되지 않고 유리병에 거품이 없을 때까지 계속 두드려보세요. 액체를 진공 청소기로 청소하지 마십시오. 필요한 경우 탭을 일시 중지합니다. 연결된 모든 혈청 바이알에 대해 반복합니다. 모든 혈청 바이알을 탈착한 후 진공 밸브 A 및 진공 밸브 B를 닫고 진공 펌프를 끕니다("기타 프로토콜 및 데이터" 단계 S3.2 ~ S3.2.3 참조).
- 혈청 바이알은 여전히 바늘에 연결되어 있고 진공 펌프가 꺼져 있는 상태에서 가스 실린더 밸브 1/16에서 1/8(전체 레볼루션의 약 22.5 ~45°)을 시계 반대 방향으로 천천히 돌린 다음 T 핸들 밸브를 열고 천천히 시계 방향으로 3 psi(20.7kPa)로 시계 방향으로 전환합니다. 그런 다음, 오픈 압력 밸브 A 및 압력 밸브 B (참조 "다른 프로토콜 및 데이터" 단계 S3.3 s3.3.21).
주의: 데파플루오로부탄 가스 실린더가 압력을 받고 있으며 가열하면 폭발할 수 있습니다. 열과 충격으로부터 벗어나십시오. Decafluorobutane 가스는 산소 변위와 질식을 일으킬 수 있습니다. 적절한 눈 보호 기능을 착용하고 연기 후드에 핸들을 착용하십시오. 잘못 처리하면 가스 실린더를 진공 청소기로 진공 청소기로 청소하여 가압 및 파열을 신속하게 유발할 수 있습니다. 가스 실린더 밸브를 1/8 턴 이상 열면 공기 레귤레이터가 손상될 수 있습니다. - 30s의 가압(게이지는 여전히 3psi(20.7kPa)를 읽어야 함) 세럼 바이알로 모든 매니폴드 밸브를 닫고, 혈청 바이알을 분리하고, 바늘을 숨막히게 하고, 가스 실린더 밸브를 닫습니다.
- 공기 조절기 게이지 바늘이 휴식 위치로 이동 할 때까지 부분적으로 하나의 매니폴드 밸브를 열어 내장 압력을 완화. 그런 다음 매니폴드 밸브와 T 핸들을 포함한 모든 것을 닫습니다.
- 압력 밸브 A와 가스 실린더밸브(그림 2)를포함한 모든 밸브를 닫습니다. 세럼 바이알을 매니폴드 바늘에 연결한 다음 해당 매니폴드 밸브를 열고 진공 밸브 A와 진공 밸브 B를 열고 -90 kPa(-13 psi, -900 mbar)에서 진공 청소기를 5분 동안 진공 상태에서 대기 공기를 제거합니다. 액체 중 어느 라도 진공 청소기를 진공 청소기로 청소하지 마십시오("기타 프로토콜 및 데이터" 단계 S3에서 S3.1.5로 참조).
- 세럼 바이알을 라벨과 4 °C와 어둠 속에서 저장합니다. 모든 가스 교환기 밸브가 닫히고 진공 펌프가 나중에 꺼져 있는지 확인합니다.
참고: 혈청은 이 상태에서 최대 4개월 동안 안정되어야 합니다. 이 단계에서 프로토콜은 4개월 후에 다시 시작할 수 있습니다.
3. 데카플루오로부탄 바이알
- 깨끗하고 비어 있는 3mL 보로실리케이트 유리 클리어 세럼 바이알(입 내경 7mm, 외향성 13mm)으로, 라이오필화 스타일의 회색 클로로부틸 고무 스토퍼(입 내 경약 7mm, 외향13mm)로 캡을 씌우고,눈물이 나는 알루미늄 씰(13mm 바깥입 직경)과 43mm 의 알루미늄 씰로 고무 스토퍼를 고정하고, 4m의 바운퍼, 4m의 크림 7,8.
- 2.9.1 단계를 따라 대기 공기를 진공 청소기로 청소하십시오("기타 프로토콜 및 데이터" 단계 S3.1 ~ S3.1.5 참조).
- 탈가를 건너뛰고 2.9.3에서 2.9.5 단계를 수행하여 바이알을 다시 가압합니다("기타 프로토콜 및 데이터" 단계 S3.3에서 S3.3.21).
- 데카플루오로부탄 바이알에 라벨을 부착하고 4°C와 어둠 속에서 보관하십시오. 모든 가스 교환기 밸브가 닫히고 진공 펌프가 나중에 꺼져 있는지 확인합니다.
참고: 물방울 응축을 위해 데카플루오로부탄 가스로 채워진 혈청 바이알이 필요합니다. 그들은이 상태에서 최대 4 개월 동안 안정되어야한다. 이 단계에서 프로토콜은 4개월 후에 다시 시작할 수 있습니다.
4. 물방울 형성
- 냉장고에서 혈청 바이알(2.10단계에서)에 수분화 된 지질 용액을 제거합니다.
- 디캡퍼를 사용하여, 혈청 바이알에 알루미늄 씰을 제거하고 지질 용액의 1mL을 1.85 mL borosilicate 유리 샘플 바이알 (페놀 스크류 캡 포함)으로 전송하여 지질 용액이 내부 벽 아래로 흐르게합니다. 거품을 만들지 마십시오.
- 혈청 바이알에 남아있는 지질 용액이있는 경우 2.9 ~ 2.10 단계를 따라 저장을위한 혈청 유리병을 탈취하고 다시 가압하십시오 ("기타 프로토콜 및 데이터"단계 S3.3.21).
- 1.85 mL 샘플 바이알을 사용하면 가스 교환기를 사용하여 시료 바이알 헤드 스페이스로 데카플루오로부탄 가스로 부드럽게 흐릅니다(특정 밸브 이름에 대한 그림 2 참조).
- 가스 교환기의 모든 밸브가 제대로 닫혀 있고 펌프가 꺼져 있는지 확인합니다.
주의: 잘못 수행되면 가스 실린더를 진공 청소기로 진공 청소기로 청소하여 급속한 감압과 파열을 일으킬 수 있습니다. - 매니폴드 밸브 1개를 열고 해당 바늘을 매니폴드에서 조심스럽게 풀어보라고 합니다.
주의: 날카로운 물체, 접촉 / 피어싱을 피하십시오. - 오픈 압력 밸브 A 및 압력 밸브 B와 가스 실린더 밸브 1/16 ~ 1/8 (전체 회전의 약 22.5 ~ 45 °) 시계 반대 방향으로 부분적으로 열고 T 핸들 밸브를 엽니 다.
주의: 가스 실린더 밸브가 공기 레귤레이터에 손상을 줄 수 있으므로 이밸브를 더 열지 마십시오. - 지질 용액으로 시료 유리병을 풀고 매니폴드 바늘이 유리병 내부의 액체 공기 인터페이스 위에 있도록 이동합니다. 바이알을 잡아.
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공기 조절기 게이지 바늘이 휴식 위치에서 약간 이동하고 퍼플루오로카본 가스가 매니폴드 바늘에서 부드럽게 흘러 나올 때까지 천천히 공기 조절 밸브를 시계 방향으로 돌립니다. 퍼플루오로카본 가스가 30s의 유리병 헤드스페이스로 부드럽게 흐르게 하십시오. 거품을 만들지 마십시오. 필요한 경우 공기 레귤레이터 밸브를 조정합니다.
참고: 액체 공기 인터페이스는 데파플루오로부탄 가스 흐름에 의해 약간 혼란스러워져야 합니다. 시스템이 이제 열려 있기 때문에 공기 조절기 게이지는 압력을 제대로 읽을 수 없습니다. - 30 s 후, 신중 하 고 신속 하 게 유리병을 너무 많이 이동 하지 않고 샘플 유리 병을 캡.
- 가스 실린더 밸브(시계 방향), T-핸들 밸브, 공기 레귤레이터 밸브(시계 반대 방향), 압력 밸브 A, 압력 밸브 B 및 매니폴드 밸브를 닫습니다.
- 조심스럽게 바늘을 칼집.
- 샘플 유리병에 라벨을 부착하고 왁스 필름으로 목을 시계 방향으로 밀봉합니다(그림3A 및 3B).
참고: 그림 3B ~ 3F는 30% 파이로 지질 제형만 을 나타낸다.
- 가스 교환기의 모든 밸브가 제대로 닫혀 있고 펌프가 꺼져 있는지 확인합니다.
- 샘플 바이알을 어둠 속에서 저장하고 4°C에서 적어도 10분 또는 최대 24시간 동안 보관하십시오.
참고: 이 단계에서 프로토콜은 24시간 후에 다시 시작할 수 있습니다. - 약 100g의 드라이 아이스(이산화탄소)를 절연 용기에 넣고 일반 얼음을 다른 절연 용기에 놓습니다. 3단계에서 언급된 준비된 데카플루오로부탄 혈청 바이알을 검색하여 3단계, 2개의 3.81cm(1.5인치) 20게이지 바늘, 1mL 플라스틱 주사기(사용하기 전에 플런저 풀림), 200mL 용기, 금속 집게 및 온도계(-20~ 100°C)를 검색합니다.
참고: 마이크로 버블만 만드는 경우 이소프로판올, 드라이 아이스 및 얼음이 필요하지 않습니다. - 45s(도3C)에대한 기계적 교반기 및 동요에 지질 용액을 사용하여 시료 유리병을 놓습니다.
- 기계적 동요 후, 빛으로부터 보호된 시료 유리병 오른쪽 업을 서서 15분 카운트다운을 시작하여 유리병을 식히고 마이크로버블8,17을선택한다.
- 15분 카운트다운이 10분(카운트다운에 5분 남았음)에 도달하면, 약 200mL의 이소프로판올로 용기를 채우고 금속 집게를 사용하여 드라이 아이스로 -20°C로 식힙니다.
참고: 목표 온도는 -15 ~ -17 °C이지만 마이크로 버블을 처리하는 동안 이소 프로판올이 예열됩니다.
주의: 이소프로판올은 인화성입니다. 열과 불꽃에서 멀리. 드라이 아이스는 피부 손상을 일으킬 수 있습니다. 집게로 처리합니다. 장갑, 눈 보호 및 보호 실험실 코트를 착용하십시오.
- 15분 카운트다운이 10분(카운트다운에 5분 남았음)에 도달하면, 약 200mL의 이소프로판올로 용기를 채우고 금속 집게를 사용하여 드라이 아이스로 -20°C로 식힙니다.
- 마이크로 버블이 15분 동안 크기를 선택한 후 샘플 바이알(그림3D)내부의 크기 선택 파티션을 찾습니다.
- 시료 유리병을 오른쪽 측면으로 유지하고, 시료 유리병을 조심스럽게 풀고, 1mL 플라스틱 주사기에 부착된 1.5인치 20게이지 바늘로 바닥 파티션의 약 0.7mL를 인출한다. 상단 파티션이 철회되지 않았는지 확인합니다. 주사기를 쓸어 넣어 에어 포켓을 제거하지 마십시오.
- 다른 20 게이지 바늘을 데카플루오로부탄 혈청 바이알(혈청 바이알 의 상단 근처에 바늘을 유지)에 삽입한 다음 크기선택 마이크로 버블로 바늘/주사기를 삽입합니다.
- 크기선택 마이크로 버블을 천천히 전송합니다. 유리병을 기울이고 주사기를 기울여 액체가 데카플루오로부탄 혈청 바이알의 내부 벽아래로 미끄러지게 합니다.
- 모든 크기 선택 마이크로 버블 용액이 전달되면 주사기로 바늘을 제거하지만 음압(도 3E)을완화하기 위해 환기 바늘을 유지합니다.
- 크기선택 마이크로 버블만 만드는 경우 여기에서 중지하십시오. 통풍 바늘을 상단과 가까이에 두십시오. 유리병을 어둡고 실온에 유지하십시오.
- 소량의 드라이 아이스 또는 실온 이소프로판올을 이소프로판올 욕조에 추가하여 목욕 온도가 -15에서 -17 °C 사이인지 확인합니다.
- 20게이지 환기 바늘이 혈청 병병의 상단 근처에 삽입되어 이소프로판올 욕조에 혈청 바이알을 배치하여 이소프로판올의 수준 보다 낮은 미세 버블 레벨을 유지하지만 바이알 목을 위에 두어 간헐적으로 혈청 유리병을 2분 간헐적으로 소용돌이어 마이크로버블을 응축합니다.
참고 : 이 단계는 Sheeran 외 6에 의해 수행 된 작업에서 수정되었습니다.- 이소프로판올에서 혈청 바이알을 지속적으로 소용돌이치지 말고 용액이 동결되지 않도록 하십시오. 약 5 s에 대 한 소용돌이, 이소 프로 판 올에서 혈 청 유리병을 들어 올립니다. 얼음 핵을 확인하고 이소프로판올에서 소용돌이를 재개합니다. 얼음이 형성되면 혈청 유리알이 사라질 때까지 공중에서 소용돌이치게 됩니다.
- 2분간 응축 후, 이소프로판올 욕조에서 혈청 바이알을 제거하고 환기 바늘을 제거합니다.
참고: 마이크로버블은 반투명도의 변화에 의해 나타난 바와 같이 액적으로 응축되어야한다(30% 파이로 지질 제형에 대한 도 3E 대 도 3F). - 세럼 바이알을 닦고 라벨을 붙이며, 사용할 준비가 될 때까지 어둡고 절연된 용기에 일반 얼음위에 놓습니다. 개봉되지 않은(그대로 알루미늄 씰) 물방울은 용융된 얼음이 필요에 따라 교체되는 한 최대 6시간 동안 이 상태에서 안정되어야 합니다.
- 사용 준비가 되면 캐퍼로 알루미늄 씰을 제거하십시오. 사용 하지 않는 동안 얼음과 어둠 속에서 물방울 (심지어 열린 바이알)을 유지합니다. 마이크로 버블을 어둡고 실온에서 유지하십시오.
5. 형태학적 및 광학 특성화
- 1% 트리톤준비: 5mL의 TRIton X-100을 PBS 500mL(1x, pH 7.4)에 추가하고균질14가될 때까지 자기 교반 막대로 저어줍니다.
참고 : 트리톤 X-100 매우 점성. 표준 공기 변위 파이펫을 사용하는 경우 취급 시 주의하십시오. 볼륨을 느리게 흡입하고 급락시키고 잔류 볼륨이 파이펫의 바닥에 도달할 때까지 기다립니다. 액체가 천천히 이동하여 볼륨을 전송할 때 파이펫 팁의 바깥쪽에 달라붙지 않도록 하십시오. - 물방울 준비(4단계). 마이크로 버블도 특징인 경우 응축(4.9단계)에 앞서 크기 선택된 마이크로버블의 소량을 수집한다.
- 쿨터 카운터(CC)의 마이크로버블 또는 액적 크기를 0.2~6μm에서 크기 분포 및농도(도 4)를얻습니다.
- 0.2 μm 모공 폴레서술폰 멤브레인 필터를 통해 여과된 CC 전해질 10mL로 깨끗한 20mL 커벳을 채웁니다. 기준선을 얻기 위해 세 번의 실행으로 CC에서 측정합니다.
- 동일한 CC 전해질에서 마이크로 버블 또는 액적 샘플 5 μL을 추가하고 부드럽게 혼합합니다.
참고: 샘플의 2~20μL는 시료가 얼마나 집중되었는지에 따라 첨가할 수 있습니다. - CC(3실행)에서 샘플을 실행하고, 평균 기준선을 빼고, 크기 분포 및 농도(mL당 수)를 계산합니다.
- UV-비스 분광법(그림5)으로액적 흡광도를 측정합니다.
참고: 도 5는 30% 파이로 지질 제형만을 나타낸다.- UV-Vis 분광포토미터에서 흡광도 측정값을 0.5nm 증분으로 800nm ~ 300nm 파장으로 설정하고 기준선 보정을 가능하게 합니다.
- PBS로 채워진 깨끗한 1cm 경로 길이 큐벳을 사용하여 기준측정을 수행합니다. 분광경 빔 경로를 교차할 만큼 볼륨이 충분히 높은지 확인합니다.
- 파이로 지질 방울을 PBS로 희석 (2 μL ~ 500 μL의 액적 2000 μL을 희석제의 2000 μL로 권장)에 희석하고 파이펫팅하여 혼합합니다.
참고: 소용돌이를 타지 마십시오 또는 다른 어셈블리가 파괴됩니다. - 희석된 액적을 세척된 큐벳으로 옮기고 흡광도를 측정합니다. 필요한 경우 희석을 변경합니다.
- 5.4.1에서 5.4.4단계를 반복하지만 PBS 대신 트리톤을 1% 사용하십시오. 희석 후 측정하기 전에 밀봉 가능/덮인 바이알 및 소용돌이로 샘플을 전송합니다.
- 마이크로 버블 또는 액적의 형광을 측정합니다(그림 6).
참고: 도 6은 30% 파이로 지질 제형만을 나타낸다.- 형광 분광계에서 발아 파장을 410 nm로 설정하고 방출 파장 범위는 600에서 750 nm까지 1 nm 단위로 설정합니다.
- 형광 분광광계와 호환되는 큐벳을 사용하여 기준선을 얻기 위해 PBS 희석제의 형광을 측정합니다.
- 파이로 지질 마이크로 버블 또는 액적을 PBS로 희석 (0.5 μL ~ 10 μL의 액적 2000 μL희석제로 권장)에 희석하여 혼합하십시오.
참고: 소용돌이를 타지 마십시오 또는 다른 어셈블리가 파괴됩니다. - 희석된 샘플을 세척된 기준큐벳으로 옮기고 형광을 측정합니다. 필요한 경우 희석제를 변경하고 신호 포화를 피하십시오.
- 5.5.1 ~ 5.5.4 단계를 반복하지만 PBS 대신 1 % 트리톤을 사용합니다. 1% 트리톤으로 희석한 후 희석된 샘플을 밀봉 가능/덮인 바이알 및 소용돌이로 옮겨 측정하기 전에 30초간 전달합니다. 소용돌이에서 생성된 거품이 레이저 경로 위에 있는지 확인하기에 충분한 볼륨을 추가합니다.
참고: 트리톤 시료의 형광 신호는 형광 불해제(도6)로인해 PBS보다 훨씬 높을 것이다.
6. 기화 이미징
- 적당히 크기의 물 탱크를 탈온물로 채우고 24시간 동안 휴식을 취하여 물과 물 속에서 가스를 평형화하십시오.
- 물방울을 준비하고 얼음을 유지하고 사용할 때까지 어둠 속에서 유지하십시오.
- 펠로우등(18)에 의해 설명된 대로 2% 천에서 유동 팬텀 튜브를 37°C로 가열된 물 탱크로 잠급한다.
- PBS를 37°C로 데우고 팬텀을 통해 흐르고 있습니다.
- 전임상 초음파 시스템과 21MHz 선형 어레이 트랜스듀서(재료표참조)를 사용하여 뷰를 유동 팬텀에 정렬하고 B 모드 이미징으로 설정하고 출력 압력을 설정하고 각 압력에서 기준선을 획득하기 위해 비디오 또는 이미지를 캡처합니다.
- 액적 의 20 μL을 37 °C PBS의 50 mL로 희석하고 부드럽게 섞습니다. 솔루션을 30mL 플라스틱 주사기로 옮기고 용액을 한천 팬텀을 통해 밀어 넣습니다.
- 단계 6.5와 동일한 정렬을 유지, 기화가 관찰 될 때까지 출력 압력을 증가 (유령의 밝은 반점, 그림 7참조).
참고: 그림 7은 30% 파이로 지질 액적 샘플을 나타낸다. 이 시판되는 21MHz 선형 어레이 트랜스듀서는 이미징 및 기화 물방울을 모두 사용할 수 있습니다.
Representative Results
사전 응축된 크기 선택 된 마이크로 버블 샘플(n = 3) 및 후 응축 된 액적 샘플(n = 3)은 10 μm 조리개를 가진 쿨터 카운터 (CC)에 크기가 조정되었습니다. 10 μm 조리개 중 제한은 평균 크기와 농도를 편향시킬 수 있는 200nm 보다 작은 입자를 측정할 수 없다는 것입니다. 도 4는 파이로 지질 함량 제형각각에 대한 크기 조정 데이터를 나타낸다. 표 1에는 크기 조정 데이터를 기반으로 하는 통계가 표시됩니다. 전유 및 후 응축된 평균 직경의 비율을 사용하여, 결과는 0% 파이로 지질 제형이 1.72± 0.02에서 가장 작은 평균 직경 교대를 가졌다는 것을 보여주었습니다. 50% 파이로 지질 제제는 2.38± 0.08에서 가장 큰 평균 직경을 가졌다. 1% 파이로지질 물방울 샘플은 1010/mL × (2.71 ± 0.13)에서 가장 높은 관찰 농도를 보였으며 40% 파이로 지질 방울 샘플은 109/mL × (7.36 ± 0.81)에서 가장 낮은 관찰 농도를 가졌다. 크기 조정 데이터는 10% 파이로 지질 물방울 샘플이 261 ± 13nm에서 가장 작은 피크 디미터를 보였으며 50% 파이로 지질 방울 샘플은 390 ± 55 nm에서 가장 큰 것으로 나타났습니다. 일반적으로 파이로 지질 함량이 증가함에 따라 농도가 감소하고 평균 직경이 증가하였다. 응축 된 후 샘플은 전구체 마이크로 버블 샘플을 기반으로하므로 두 유형의 초음파 조영제에 대한 추세가 발생했습니다. 파이로 지질 함량이 증가함에 따라 마이크로 버블 하위 인구(약 2000 μm의 피크 크기)가 형성되기 시작했습니다. 이 이 두 번째 피크는 0% 파이로 지질 마이크로 버블 샘플에 존재하지 않았으며 40 %와 50 % 파이로 지질 집단에서 가장 명백합니다.
도 5는 30% 파이로 지질 액적 샘플의 대표적인 흡광도 측정을 나타낸다. PBS에서 그대로 샘플의 피크는 700 nm였고 트리톤의 중단된 샘플은 피크를 671 nm로 옮겼습니다. 이는 그대로 조립이 개별, 조립되지 않은 지질 성분에 비해 다른 광학 특성을 갖는 것으로 나타났다.
도 6A는 사전 응축된 마이크로버블 샘플의 대표적인 형광 측정을 나타내고 도 6B는 30%의 파이로 지질을 가진 후 응축된 액적 샘플을 나타낸다. PBS의 손상되지 않은 샘플은 704 nm에서 형광 피크를 보였고, 중단된 형태는 674nm에서 최고조에 달했습니다. 곡선 아래의 그대로 영역으로 곡선 아래의 중단된 영역을 빼고 곡선 아래의 중단된 영역에 의해 차이를 나누면 30% 파이로 지질 마이크로버블 샘플 및 액적 시료에 대해 각각 98.61%와 98.07%로 작용한다.
마이크로 버블로 변환하는 액적을 시연하기 위해, 희석된 물방울은 초음파 시스템을 가진 37°C 흐름 팬텀에서 이미지화되고 기화되었다. 도 7은 서로 다른 압력에서 이미지된 30% 파이로 지질 액적 샘플의 대표적인 초음파 이미지를 나타낸다. 저기압(도7A)에서는신호가 거의 없었고, 천 합성에서 붙어 있는 기포로부터의 배경 신호만 있었다. 이것은 물방울이 비 에코제닉이며 초음파를 흩어지지 않기 때문입니다. 약간 높은 전력에서, 밝은 반점의 모양에 의해 도시된 바와 같이 몇 개의 마이크로버블(도 7B)이생성되었다. 압력이 증가함에 따라 더 많은 마이크로 버블이 생성되었습니다(그림7C 및 7D). 이것은 또한 물방울이 37 °C에서 자발적으로 기화하지 않을 것이라는 점을 입증했습니다.
그림 1: 30% 파이로 지질 용액을 형성하는 단계의 이미지. A)지질 분말 플러스 클로로폼파이로-SPC. B)용해 솔루션이 추가되었습니다. C)지질 필름건조 및 바이알의 내부 벽에 코팅. D)알루미늄 호일로 감싸인 지질 유리병(재사용을 위해 테이핑된 외장 호일). E) 수화 지질 용액. F) 혈청 바이알의 지질 용액. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 10 매니 폴드 가스 교환기. 프로토콜에서 참조되는 밸브에 레이블이 지정됩니다. 가스 교환기를 조립하는 방법에 대한 지침은 추가 파일 "기타 프로토콜 및 데이터"를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: A)시료 바이알에서 7제제(0%~ 50% 파이로-SPC)의 지질 용액. 그림 B에서 D는 30% 파이로 지질 방울을 만들기 위해 취한 단계의 이미지를 보여줍니다. B) 샘플 바이알에서 30% 파이로 지질 용액. C)교반 후. D)15 분 크기 선택. E)하단 파티션은 데카플루오로부탄 바이알로 전송됩니다. D)응축 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 쿨터 카운터(CC) 상이한 파이로 지질 쉘 함량(n=3)을 가진 크기 선택된 마이크로버블 및 액적 샘플의 크기 조정 데이터. 고체 녹색 선은 마이크로 버블을 나타내고 점선은 방울을 나타냅니다. A) 0% 파이로-SPC. B) 1 % 파이로 - SPC. C) 10% 파이로-SPC. D) 20% 파이로-SPC. E) 30% 파이로-SPC. F) 40% 파이로-SPC. G) 50% 파이로-SPC. H)쉘내 파이로-SPC 함량을 기반으로 CC로부터 마이크로버블 및 액적 샘플의 총 관찰 농도. 모든 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 모든 측정은 200nm ~ 6000nm의 크기 범위를 가지는 10 μm 조리개를 사용하여 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대표적인 자외선가시(UV-Vis) 분광흡광흡수력 측정은 PBS에서 희석된 30% 파이로 지질 액적 샘플의 300~800nm에서 800nm로, 1% 트리톤으로 이 수치를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 대표 형광 방출600에서 750 nm410 nm에서 흥분. A)PBS및 1% 트리톤에서 크기 선택, 미리 응축된 파이로 지질 마이크로버블 샘플. B)PBS및 1% 트리톤에서 30% 파이로 지질 물방울 샘플을 후축하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: B 모드에서 전임상 21MHz 선형 어레이 트랜스듀서로 촬영한 37°C 식기 흐름 팬텀의 대표적인 초음파 이미지(재료표 참조). 왼쪽열(그림 A, C, E및 G)은PBS 컨트롤을 표시합니다. 오른쪽 컬럼(FiguresB, D, F및 H)은37°C PBS의 50mL로 희석된 후 응축된 30% 파이로 지질 액적 물방울 샘플의 20 μL을 나타낸다. 각 행은 Sheeran 등에서 수행한 작업에서 추정된 자유 필드 피크 음압을 나타내며 노란색삼각형은 초점 깊이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 메서드 | 대리인 | 파이로 쉘 % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| CC | 거품 | Conc. [/mL] | (2.76 ± 0.28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1.91 ± 0.22) × 10^10 | (1.47 ± 0.05) × 10^10 | (8.47 ± 0.95) × 10^9 | (9.89 ± 0.15) × 10^9 |
| CC | 거품 | 피크 [nm] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| CC | 거품 | 평균 [nm] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| CC | 거품 | 중앙값 [nm] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| CC | 비말 | Conc. [/mL] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1.75 ± 0.18) × 10^10 | (1.72 ± 0.13) × 10^10 | (1.09 ± 0.01) × 10^10 | (7.36 ± 0.81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| CC | 비말 | 피크 [nm] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| CC | 비말 | 평균 [nm] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| CC | 비말 | 중앙값 [nm] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
표 1: 쿨터 카운터(CC)(n=3)로부터 다른 파이로-SPC 함량을 가진 마이크로버블 및 액적 샘플의 데이터 통계를 크기 조정합니다. 모든 오류는 표준 편차를 나타냅니다.
보충 정보 - 지질 공식 시트 : 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 정보 - 다른 프로토콜 및 데이터 : 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
모든 지질 성분(1.2단계 및 1.4.5, 도 1A)을함께 추가한 후 클로로폼 및 메탄올의 용액(및 DSPA와 같은 인산 지질이 존재하는 경우 물)을 첨가하여 파이로 지질 및 비파이로 지질 성분이 완전히 균질화되었는지 확인하였다(1.5단계, 도 1B). 이질지질 조성물로 지질 소포의 형성을 방지하기 위해 용존지질은 박막(도1C)으로서바이알 벽의 내부로 건조및 코팅하였다. 코팅(1.6단계)은 또한 건조필름의 표면적을 증가시키기 때문에 수분공급(2.1단계 ~ 2.4단계)을 더 쉽게 만든다. 건조(1.6단계, 도 1C)및 진공 청소기(1.8단계, 도 1D)는이러한 화학 물질이 마이크로버블의 형성을 방해할 수 있기 때문에 클로로폼과 메탄올이 완전히 증발되도록 하였다. 프로토콜을 축소하여 지질 용액 볼륨을 1mL로 낮게 만들 수 있지만, 볼륨이 클수록 유리병에서 유리병 간 변형이 감소할 수 있습니다. 이것은 사용하지 않는 동안 파이로-SPC를 저하시키는 위험을 실행할 수 있지만, 지질 용액의 저장 상태 (2.9 에서 2.10 단계)는 그 위험을 줄이기위한 것이었습니다. 가스 교환기(2.9.2단계, 도 1F 및 도 2)를사용하여 탈기 단계는 산화를 방지하기 위해 가능한 한 많은 산소를 제거하는 역할을 한다. 대기 가스가 용액에 용해되는 동안 포르피린 지질을 함유한 지질 용액을 저장하는 것이좋습니다(도 1E).
2.10 단계에서, 지질 용액은 가압 된 헤드 스페이스를 가진 혈청 유리병에, 임상적으로 승인 된 초음파 조영제 perflutren 지질 마이크로 스피어가 판매되는 방법과 유사 (도 1F와유사). 내부 작업은 캡이 고무 스토퍼와 같은 부드러운 재료인 경우 파이로 지질의 존재와 기계적 동요를 통해 안정적인 마이크로 버블을 생성 할 수 없습니다 보여 주었다. 따라서, 지질 용액은 비고무 페놀 캡(단계 4.1 에서 4.4, 도 3A 및 3B)을가진 샘플 바이알로 옮겨졌다. 데바플루오로부탄 가스가 시료 바이알(4.1단계 4.4)으로 유입되었을 때, 밀도가 높은 데파플루오로부탄은 시료 바이알 헤드스페이스에서 대기공기를 대체해야 한다. 현재 파이로 지질이 고무 스토퍼로 마이크로 버블을 형성 할 수없는 이유는 알려져 있습니다. 파이로 지질이 없는 안정적인 마이크로버블은 고무 스토퍼4,7이있는 세럼 바이알에서 직접 만들 수 있습니다. 따라서, 가스 교환기를 이용하여 혈청 바이알을 탈가시키고 재가압한 다음 파이로 지질 제형4,5,6,7("기타 프로토콜 및 데이터 참조)에 대한 혈청 바이알 자체를 교반하는 것이 좋습니다. 혈청 바이알에서 기계적으로 동요할 수 있다는 장점은 헤드스페이스가 가압될 수 있고 크기 선택은 혈청 바이알 거꾸로8을반전시킴으로써 이루어질 수 있다는 것이다. 본 프로토콜에서, 0% 파이로 지질 제제는 파이로 지질을 함유한 제형과 일치하도록 시료 바이알(Steps 4.1 ~ 4.4)으로 이송되었다. 또한, 더 긴 아킬 지질 사슬 길이로 인해 더 나은 반 데르 발스 상호 작용19로인해 더 안정적인 물방울이 발생합니다. 지질 쉘 조성물은 모든 지질 유형에 대해 시판되는 18-아실 사슬 길이에 기초하여 선택되었다. DSPE-PEG5K는 폴리에틸렌 글리콜 체인의 존재가 반발성황체력(19)을통해 구조물의 결합을 방지함에 따라 모든 제형(Step 1.1)에 통합되었다. 지질 수분 동안, 목욕 초음파 식기 목욕은 18-아실 사슬 길이 지질필름(18)을완전히 분산시킬 수 있을 만큼 충분히 높은 70°C(2.1단계)로 설정되었다. 아실 체인 길이가 길어지면 더 높은 온도가 필요합니다.
파이로 지질 하중이 높을수록 광학 흡수 및 형광 성분의 농도가 증가하며, 이는 최대화 된 포르피린 하중의 이점을 누릴 수있는 특정 응용 분야에 요구 될 수 있습니다. 그러나 파이로지질 함량이 증가함에 따라 관찰 가능한 액적 농도가 감소하고 직경이 증가합니다(도4 및 표 1). 이는 광학 형광및 흡수특성과 액적 농도 및 직경 간의 절충을 보여줍니다. 작은 새는 혈관을 통해 생체 내 축적을 위해 작은 직경을 우선시해야 하거나 고농도의 물방울을 주입해야 하는 경우, 파이로 지질 적재량을 증가시키는 것은 액적 디미터의 증가 또는 물방울 농도 감소의 가치가 없을 수 있습니다. 높은 물방울 농도 및/또는 작은 물방울 직경이 가장 중요한 경우, 유사하게 크기의 동반자 진단 에이전트는 파이로 지질 대신 고려되어야 합니다. 1% 파이로 지질 방울 농도 감소 또는 크기 증가 발생 하지 않았다 하는 동안, 1% 파이로 지질 적재 조직 배경형에서 합리적으로 감지 하기 위해 너무 낮은 수 있습니다. 그러나, 포르피린 모이티의 유연성은 저농도 응용 분야에 더 적합한 정량화의 대체 수단을 부여할 기능화를 위한 다중 옵션을 제공합니다. 예를 들어, 파이로 지질은 양손 방출 단층 촬영 영상 및 감마 계수20,또는 질량 분광법을 사용하여 미량 금속 정량화를 위한 팔라듐 또는 자기 공명영상(14)을위한 망간으로 구리-64로 응치될 수 있다.
일부 실험은 소량의 액적 용액만 필요할 수 있지만, 지질 용액의 1mL은 1.85 mL 샘플 바이알을 채우기 위해 필요하다. Goertz 외. 취급, 헤드 스페이스 압력, 액체 대 가스 비율 및 심지어 바이알 모양의 변화가 모두 마이크로 버블집단(17)에영향을 줄 수 있음을 입증하였다. 동요 및 크기 선택 시 바이알 온도도 크기 분포에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 최종 사용자가 최적화한 방법의 경우 물방울을 만들 때 가능한 한 일관성을 유지해야 합니다. 미개봉 된 물방울은 동결 (-20 °C) 나중에 해동 될 수 있지만 이것은 크기 집단에 영향을 미칠 것입니다.
지질 용액을 마이크로 버블로 활성화시키는 교반 절차는 형태학적으로 균질적으로 집단적인 집단을 생성하지 않습니다 (단계 4.6); 오히려, 샘플은 마이크로 버블, 다발성 소포, 리포솜 및 미셀18,21,22로채워져 있다. 마이크로 버블 크기는 미크론 과 나노 미터 범위에 걸쳐 있지만, 다른 구조는 크게 아래 800 nm 23. 사용되는 크기 조정 기술은 이러한 다양한 구조를 구별하지 않으며, 따라서 교반 후 마이크로 버블 샘플(Step 4.6, 도 3C)및 후 응축된 액적 샘플(Step 4.14, 도 3F)을혼합물로 가정해야 한다. 초음파 에 민감한 어셈블리 (다중 멜라 소포, 리포솜 및 미셀)는 응축 후 보존 될 가능성이 있으며 위상 변경 가능한 코어가 없기 때문에 크기를 변경하지 않습니다. 쿨터 카운터는 이러한 상이한 초분자 어셈블리를 구별할 수 없기 때문에 응축 에 따른 인구 규모의 변화는 나노스케일 구조의 일부 비율이 변환할 수 없고 그 크기의 영역에서 관찰된 인구에 기여한다는 가정하에 해석되어야 한다. 또한, 이러한 구조는 이러한샘플(14)의분광 및 형광 서명에 기여한다. 미셀, 리포솜/소포 및 물방울의 형광 및 흡수성 시그니처는모두 14의형광을 포함한 유사합니다. 따라서, 도 3C에서 3F, 도 4,PBS 희석 샘플인 도 5,및 PBS 희석 샘플에서 어셈블리의 혼합물이 있는 것을 고려하는 것이 중요하다.
크기 선택 후 응축(Step 4.9) 전에, 페시탄등(21)에 의해 설명된 바와 같이 부력 부력 어셈블리로부터 부력 포를 분리하기 위해 마이크로버블 샘플을 원심분리하여 비버블 어셈블리를 제거할 수 있다. 그러나, 이러한 크기 격리 샘플의 마이크로 버블 응축 실험은 크기 격리 절차를 사용하여 선택되는 더 큰 전구체 마이크로 버블 집단을 사용하여 더 큰 물방울을 산출한 것으로 나타났습니다("기타 프로토콜 및 데이터" 단계 S5 후 분사 버블 및 물방울 크기 조정). 이 프로토콜로 생산된 액적의 의도된 적용은 마이크로버블4,8,액적 집단에 비해 작은 크기로 인해 수동적인 사치및 축적을 위한 플랫폼이기 때문에 가능한 한 작은 물방울 집단이 필요했다. 따라서, 이 프로토콜은 최종 해결책에 초음파 무감각 한 미겔, 리포솜 및 소포를 의미하는 경우에도 원심분리를 통해 크기로 분리되지 않은 교반 후 마이크로 버블 샘플을 사용했다. 이것은 바이오 분포에 대한 정량화 절차가 주입 된 모든 구조에 대한 신호를 파생하고 단지 물방울에 국한되지 않는다는 것을 의미합니다. 그러나 이러한 유사 크기의 구조는 주로 크기별로 지시되는 수동 메커니즘을 통해 축적될 가능성이 높기 때문에 이 플랫폼이 생체 내에서활용될 경우 발생할 수 있는 주요 추론을 변경해야 한다고 의심하지 는 않지만 이러한 모든 측면은 플랫폼을 사용할 수 있는 컨텍스트에 따라 개별적으로 고려해야 합니다. 초음파 유무에 관계없이 실험용 암을 이용한 테스트는 용액의 퍼플루오로카본 코어 어셈블리만이 초음파에 반응하기 때문에 바이오 분포의 변화에 책임이 있는 초음파 민감물인지 확인하기 위해 수행될 수 있습니다.
동요 후, 바이알은 15분 동안 쉬었고 바이알(도3C 대 3D)에서파티션이 관찰되었다. 부력을 통한 크기 선택은 활성화된 마이크로버블 용액8,17로부터더 큰 구조/기포를 제거하는 간단한 방법입니다. 이 경우 직경이 5μm를 초과하는 입자는 크기 선택 후 대부분 제거하였다(도4). 크기 선택의 범위는 크기선택(17)의지속 시간을 제어하여 조정할 수 있다. Sheeran 외. 크기 선택하지 않으면 혈관을 폐색하는 생성 된 마이크로 버블을 초래할 수 있음을 보여주었습니다8.
퍼플루오로카본은 생물학적으로 불활성7이라는장점이 있다. 데카플루오로부탄의 비등점은 -1.7°C이지만 체온보다 높지만, 37°C(도7B)에노출되면 물방울이 즉시 증발하지 않는다. 37°C에서 메타안정물인 액적물이므로, 액적을 마이크로버블7,9로기화하기 위해서는 추가음향에너지가 필요하다. Poprosky 외.가압(22)을통해 응축된 포르피린 방울을 시연했다. 이것은 덜 조밀 한 perfluorocarbons를 사용 하는 경우 실행 가능 하 고 심지어 필수적인 방법 하지만 높은 압력 과정에서 일부 거품을 파괴할 수 있습니다. 옥타플루오로프로판(C3F8)은-36.7°C의 비등점을 가지므로 물방울 응축을 위해 냉각 및 가압이 모두 필요합니다. 그러나, 가벼운 퍼플루오로카본은 덜 안정된 물방울로 이어집니다. 도디카플루오로펜탄(C5F12)은28°C의 비등점을 통해 보다 안정적인 물방울로 이어질 수 있다. 그러나, 그것은 실온에서 액체이며 기화하기 위해 더 강한 음향 에너지가 필요합니다. 따라서, 초음파 조영제의 함유 가스의 선택은 제조의 매개 변수 이외에 의도 된 생물학적 응용 프로그램의 조건을 고려해야한다. 본 프로토콜에서 응축을 위한 이소프로판올 목욕은 -15 ~ -17°C(4.7.1 단계 및 4.13단계)로 설정되었으며 다른 프로토콜은 -10°C 5,6을사용했다. 일반적인 디플루오로부탄 코어에서도 응축 온도는 부형제 조성물, 총 지질 농도 및 지질 껍질 조성에 따라 달라질 수 있습니다. 다른 제형을 사용하는 경우 용액이 동결되지 않고 적절한 물방울 응축을 보장하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다.
물방울은 마이크로 버블 전구체7보다작고 더 안정적이기 때문에 특정 종양유형4,24의향상된 투과성 및 보존 효과와 같은 특정 관심 조직으로 사치화하기 위해 수동 축적 메커니즘을 더 잘 활용할 수 있습니다. 형광, 광학 흡수성 및 음향 검출방법(14)을통해, 단일 제형을 사용하여 흡수를 정량화할 수 있다. 또한,이 플랫폼은 물방울의 음향 기화가 수동 수준16을넘어 전달 된 에이전트 분획을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 주사 후 조직 및 관심 기관의 바이오 분배를 정량화하기 위해, 알려진 양의 파이로 지질 방울을 동물에 주입해야 하며, 초음파는 대조군 세트에 따라 적용될 수도 있고, 동물이 미리 지정된 시간 점을 희생해야 하며, 장기를 제거하고 계량해야 한다. 장기는 조직을 탈세포화하기 위해 계면활성제(세제)에서 균질화, 여과, 희석, 희석되어야 하며, 파이로 신호에 기초하여 장기 질량당 주입된 용량 비율을 얻기 위해 형광 또는 UV-Vis 분광법으로 정량화되어야 한다. 5.4.5 단계(도 5)및 단계 5.5.5(도 6),트리톤 X-100 계면활성제 (세제)는 410 nm에서 비형광이며 흡수파장이 파이로와 겹치지 않기 때문에 샘플을 방해하는 데 사용되었습니다.
마이크로 버블은 UV-Vis 흡광도를 특징으로하지 않았다. UV-Vis 분광의 레이저 소스가 검출기와 평행하기 때문에 큰 기포가 검출기에서 빛을 분산시켜 광학적으로 흡수성이14로나타날 수 있습니다. UV-Vis 분광광미터와 는 달리 형광 분광광측기의 검출기는 레이저 소스에 수직으로 침투하여 소스가 검출기를 방해하지 않도록 해야 합니다. UV-Vis는 손상되지 않고 손상된 액적 샘플의 흡광도를 정량화하는 데 사용되었습니다(5.4 단계, 도 5). 300~800nm는 파이로지질의 두 가지 주요 흡광도 대역, 소레밴드(340~500nm) 및 Q밴드(640~730nm)로 흡수파장으로선택되었다. 물방울(또는 다른 수퍼마분자 구조)으로 조립될 때, 파이로 지질의 Q밴드 피크는 671nm에서 700nm(그림5)로적색으로 이동한다. 이 초분자 구조가 트리톤과 같은 계면활성제에 의해 중단되면 피크는 671 nm14,15로다시 이동합니다. 이러한 변화에 따라 파이로 지질이 조립된 상태인지 또는 중단된 상태인지 알 수 있습니다. 두 피크의 비율을 사용하여 시간이 지남에 따라 어셈블리의 붕괴를 추정할 수 있습니다.
형광 측정(5.5단계, 도 6)의경우, 410nm의 포각 파장이 소레 밴드 피크에 상응하는 것으로선택되었다(14) 600nm에서 800nm까지의 방출 파장 범위가 PBS의 그대로 어셈블리의 봉우리로 선택되었으며 트리톤의 파이로 지질이 이 범위 내에 포함되어 있습니다. 변속 및증가(도 6)는손상되지 않은(PBS의 704nm) 및 중단(Triton의 674nm) 샘플 사이의 구조 유도 담금질로 인해 발생하였다. 조립된 형태로, 파이로 지질 분자는 밀접하게 함께 포장되었기 때문에 생성된 광자는 근처의 파이로 지질 분자에 의해 흡수되었습니다. 이것은 손상되지 않은 굴절 효율과 명백합니다. 따라서, 담금질을 완화하고 바이오 분배정량화(14)에대한 신호를 최대화하기 위해 1% 트리톤 X-100과 같은 계면활성제(세제)로 시료를 희석할 필요가 있다.
단순성, 동일한 선형 어레이 초음파 트랜스듀서는 기화 및 이미지 모두에 사용되었다(단계 6.5 및 6.7, 도 7). 이 초음파 트랜스듀서 (재료의 표)는 물방울8을기화하는 데 필요한 피크 음압에 도달 할 수 있었다. 수돗물에서 탈이온된 물로 탱크를 채우면 물에 용해되는 가스가 생성됩니다(6.1 단계). 기화 및 이미징을 통해 물에 용해된 가스로부터의 간섭을 최소화하기 위해, 물은 탱크에서 24시간 동안 휴식을 취하여 수중의 가스가 대기와 평형화될 수 있도록 하였다(6.1단계). 또는, 탈이온된 물은 충분히 강력한 진공에 연결된 충분히 크기의 밀봉 가능한 용기로 탈가스처리될 수 있다. 초음파 이미지는 작은 압력(도 7B)에서부적물들이 관찰 할 수없는 / 비 반향이 있었기 때문에 마이크로 버블이 성공적으로 응축되었다는 것을 입증했습니다. 물방울이 관찰 가능한 에코 생성 마이크로 버블(도 7D,7F, 7H)으로기화한 것은 더 높은 출력 압력이었습니다. 응축 후 액적 샘플에는 미셀과 리포솜/소포가 포함되어 있지만, 이러한 어셈블리는 비 에코제닉이며 물방울만이 에코제닉 마이크로버블로 기화할 수 있습니다. PBS 컨트롤은 기준선 이미지를 설정하기 위해 팬텀을 통해 흐르고(그림7A, 7C, 7E, 7G). PBS에서 압력이 증가함에 따라 대조가 발생하지 않았습니다. 이것은 트랜스듀서로부터의 고압이 단독으로 수성 매체에서 자발적인 캐비테이션을 생성할 수 없다는 것을 나타내었고, 따라서 다른 모든 생성된 콘트라스트는 채택된 초음파 조영제에 기인할 수 있었다. 출력 압력이 너무 높으면 생성된 마이크로 버블을 파괴할 수 있습니다. 점진적으로 압력을 증가시키고 생성된 대비를 관찰함으로써 최적의 압력을 찾을 수있습니다 8. 액적의 순환 반감기는 물방울을 기화하여 유사한 방법으로 결정될 수 있으며, 특정 시간 간격은 특정 시간 간격이며, 시간이 지남에 따라 생성된 콘트라스트를관찰7.
요약하자면, 다양한 파이로 지질 함량을 가진 다중 모달 위상 변화 물방울이 응축 방법으로 만들어졌습니다. 크기 조정은 파이로 지질 적재와 마이크로 버블 / 물방울 농도 사이에 절충이 있었다는 것을 보여 주었다. 특성화는 흡수성과 형광 모두에서 손상되지 않고 중단된 형태의 차이가 있음을 보여주었습니다. 초음파 화상 진찰은 물방울이 37°C에서 비 반향이고 충분한 압력에서 반향 마이크로 버블로 증발할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 특성화는 또한 Pyro 지질 물방울이 물방울 바이오 분배 또는 축적 테스트를 위해 동반자 진단 에이전트를 대체할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 향후 작업은 용액 기화 임계값, 용액 안정성 및 누드 마우스의 생체 내 순환 기간을 조사할 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 브랜든 헬필드 박사에게 가스 교환기 구축을 도와준 것에 대해 감사를 표하고 있으며, Miffy Hok Yan Cheng 박사에게 기술 적인 토론을 해 주었습니다. 저자는 온타리오 대학원 장학금, 캐나다 보건 연구 기관, 테리 폭스 연구소 및 공주 마가렛 암 재단 : 다음과 같은 자금 출처에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
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