Summary
In questo protocollo vengono delineati i metodi per sintetizzare e caratterizzare le goccioline di porfirina multimodali a cambiamento di fase.
Abstract
Le goccioline a cambiamento di fase sono una classe di agenti di contrasto ad ultrasuoni che possono convertirsi in microbolle ecogeniche in situ con l'applicazione di energia acustica sufficiente. Le goccioline sono più piccole e più stabili delle loro controparti di microbolle. Tuttavia, i tradizionali agenti di contrasto ad ultrasuoni non sono rintracciabili al di là delle misurazioni di feedback acustico, il che rende difficile quantificare la biodistribuendo o l'accumulo di agenti di contrasto ex vivo. I ricercatori potrebbero dover fare affidamento su particelle diagnostiche di accompagnamento fluorescenti o otticamente assorbenti per dedurre la biodisponimo distribuzione. Lo scopo di questo protocollo è quello di dettagliare i passaggi per la creazione di goccioline di porfirina a cambiamento di fase multimodale utilizzando un metodo di condensazione. Le porfirine sono molecole fluorescenti con bande di assorbanza distinte che possono essere coniugate sui lipidi e incorporate in goccioline per estendere la versatilità delle goccioline, consentendo una biodistribuendozione più robusta pur mantenendo le proprietà acustiche. Sono state fatte sette formulazioni con diversi contenuti di porfirina-lipidi e lipidi di base per studiare le distribuzioni di dimensioni di microbolle e goccioline. Caratterizzazioni adatte a strutture contenenti porfirina sono anche descritte nel protocollo per dimostrare la loro versatilità analitica in soluzione. Il dimensionamento ha mostrato che i diametri medie post-condensati erano da 1,72 a 2,38 volte più piccoli delle popolazioni precursori. La caratterizzazione dell'assorbanza ha mostrato che gli assemblaggi intatti avevano un picco in banda Q di 700 nm, mentre i campioni interrotti avevano un picco di assorbanza a 671 nm. La caratterizzazione della fluorescenza ha mostrato che gli assemblaggi intatti del 30% di porfirina-lipidi erano fluorescenti (>97%), con recupero di fluorescenza ottenuto in caso di interruzione. La vaporizzazione acustica ha mostrato che le goccioline di porfirina non erano ecogeniche a pressioni più basse e potevano essere convertite in microbolle ecogeniche con pressioni sufficienti. Queste caratterizzazioni mostrano il potenziale delle goccioline di porfirina per eliminare la necessità di assorbanza o strategie diagnostiche di accompagnamento basate sulla fluorescenza per quantificare la biodisdistribuzioni di agenti di contrasto ad ultrasuoni per la somministrazione o applicazioni terapeutiche in vivo o ex vivo.
Introduction
L'imaging ad ultrasuoni è una forma non invasiva e non ionizzante di imaging medico che utilizza onde acustiche. Mentre gli scanner ad ultrasuoni sono più portatili e possono fornire immagini in tempo reale, l'imaging a ultrasuoni può soffrire di basso contrasto, rendendo difficile per gli ecografisti distinguere in modo affidabile caratteristiche patologiche ecogeniche simili. Per contrastare questa limitazione, le microbolle possono essere iniettate nell'ospite per migliorare il contrasto vascolare. Le microbolle sono agenti di contrasto riempiti di gas di dimensioni micron che sono altamente ecogenici alle onde acustiche e possono fornire un contrasto maggiore del vaso1,2. I gusci e i nuclei di gas delle microbolle possono essere personalizzati per diverse applicazioni, come l'imaging, la trombolisi, la permeabilizzazione della membrana cellulare o l'apertura vascolare transitoria2.
Uno svantaggio delle microbolle è la loro breve emivita di circolazione. Ad esempio, le microsfere lipidiche perflutren clinicamente disponibili hanno solo un'emivita di 1,3 minuti3. Per lunghe sessioni di imaging, sono necessarie iniezioni multiple di microbolle. Un altro inconveniente delle microbolle sono i loro grandi diametri. Mentre le microsfere lipidiche perflutren hanno un diametro compreso tra 1 e 3 μm, abbastanza piccole da circolare in vascolarizzazione, sono troppo grandi per essere stravasate e si accumulano passivamente nei tessuti di interesse, come i tumori4. Una strategia per superare queste limitazioni è quella di condensare le microbolle gas-core in goccioline più piccole, liquid-core5,6. Mentre le goccioline non sono ecogeniche nel loro stato liquido, possono essere vaporizzate in microbolle dopo l'esposizione agli ultrasuoni con una pressione negativa di picco sufficientemente elevata, riacquistando la loro capacità di fornire contrasto. Ciò consente alla goccia di sfruttare la farmacocinetica più favorevole di un piccolo nucleo liquido, pur mantenendo la capacità di fornire contrasto quando insonata e senza modificare la composizione chimica4,7.
Il decafluorobutano è un composto perfluorocarburo ideale per lo sfasare tra gli stati gassoso e liquido5,6,7. Il decafluorobutano consente la condensazione delle microbolle in goccioline con la sola riduzione della temperatura, mentre i perfluorocarburi meno densi richiedono una pressurizzazione aggiuntiva5. Questo metodo delicato riduce al minimo la distruzione delle bolle durante la condensazione7,8,9. Poiché i loro nuclei sono liquidi, le goccioline non sono ecogeniche e invisibili agli ultrasuoni. Tuttavia, con l'applicazione di sufficiente energia acustica o termica, i nuclei liquidi possono vaporizzare di nuovo in uno stato gassoso, generando microbolle ecogeniche8. Questa vaporizzazione consente di controllare quando e dove generare microbolle.
Mentre le goccioline sono utili per l'accumulo passivo, la vaporizzazione in situ o il miglioramento della permeabilità cellulare4, le goccioline (e i loro frammenti) non possono essere immagini o quantificate ex vivo. Pertanto, l'agente diagnostico complementare quantificabile, comefluorescenti 4,10,11, particelle magnetiche12, agenti otticamente assorbenti13, sono utilizzati come analogo per misurare la consegna di goccioline ai tessuti di interesse. Ad esempio, Helfield et al. hanno utilizzato una co-iniezione di nano-perline fluorescenti per la quantificazione delle immagini istologiche degli organi di topo poiché le goccioline non potevano essere rilevate fluorescentemente4. Lo svantaggio degli agenti diagnostici di accompagnamento è che il componente tracciabile può agire indipendentemente dalla goccia a seconda del suo profilo farmacocinetico individuale.
Fortunatamente, il guscio di microbolle e goccioline può essere personalizzato. Ad esempio, Huynh et al. hanno dimostrato agenti di contrasto ad ultrasuoni con gusci di porfirina-lipidi, creando microbolle multimodali14. Le porfirine sono una classe di composti organici a struttura macrocilica aromatica14,15. Sono otticamente assorbenti, fluorescenti e possono essere chelati a un'ampia varietà di metalli per la radioterapia, l'imaging a base di radionuclidi o la quantificazione a base di metalli in traccia14. Un esempio di porfirina è il pirofeoforbide (Pyro). Coniugando Pyro sui lipidi, incorporando Piro-lipidi in microbolle o goccioline consente loro di essere ripresi e tracciati attraverso molteplici modalità: acusticamente, fluorescentemente e attraverso l'assorbanza14. Questo agente di contrasto multimodale potrebbe essere utilizzato per tracciare e quantificare l'accumulo. Ciò potrebbe eliminare la necessità di agenti diagnostici complementari poiché il componente quantificabile è ora coniugato sul guscio, consentendo una quantificazione di consegna più accurata16.
Qui viene delineato un protocollo per la creazione di goccioline di porfirina a cambiamento di fase multimodale. Poiché gli agenti di contrasto ad ultrasuoni possono essere utilizzati come piattaforma per la somministrazione di farmaci ai tessuti di interesse, come i tumori2,4, estendere la loro rilevabilità oltre gli ultrasuoni potrebbe rivelarsi utile per la quantificazione dell'efficacia della consegna. Lo scopo di queste goccioline è quello di fornire agenti di contrasto ad ultrasuoni tracciabili in grado di accumulo passivo in vivo,vaporizzazione in situ e acustica, e con il potenziale di quantificare la biodispertura o l'accumulo da organi ex vivo senza la dipendenza da sensori secondari. I metodi di caratterizzazione sono anche delineati per mostrare il potenziale delle goccioline di porfirina come sensori di biodispressione. Vengono anche discussi gli effetti del carico piro-lipidico nel guscio (da 0% a 50% dal rapporto molare).
Protocol
1. Film lipidici disidratati
- Calcolare le masse di ciascuno dei componenti del guscio necessari (vedere File supplementare "Lipid Formula Sheet").
NOTA: Per questo protocollo, la composizione del guscio sarà: 10 molare % 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilenglicole)-5000] sale di ammonio (DSPE-PEG5K), x molare % pirofeoforbide coniugato 1-stearoil-2-idrossi-sn-glicero-3-fosfocolina (Pyro-SPC) e (90 - x) molare % 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC). La quantità di Pyro-SPC sarà variata in 7 composizioni di conchiglie(x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Controllare il peso molecolare di DSPE-PEG5K sul flacone di riserva.- Scalare il protocollo a qualsiasi volume lipidico con un volume minimo di 1 mL. Per questo protocollo, è stato utilizzato un volume lipidico totale di 10 ml con una concentrazione lipidica totale di 1 mg per mL per tutte le formulazioni. La soluzione dell'eccipiente sarà: 10% glicole propilenico, 10% glicerolo e 80% tampone fosfato salino (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (vedere Fase 2.3 e "Lipid Formula Sheet").
NOTA: Il protocollo di sintesi dei pirolipidi è delineato nel file supplementare "Altri protocolli e dati" Passaggi da S1 a S1.19, che è stato modificato dal lavoro svolto da Zheng et al.15.
- Scalare il protocollo a qualsiasi volume lipidico con un volume minimo di 1 mL. Per questo protocollo, è stato utilizzato un volume lipidico totale di 10 ml con una concentrazione lipidica totale di 1 mg per mL per tutte le formulazioni. La soluzione dell'eccipiente sarà: 10% glicole propilenico, 10% glicerolo e 80% tampone fosfato salino (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (vedere Fase 2.3 e "Lipid Formula Sheet").
- Sulla base delle masse calcolate (vedere Fase 1.1 e "Lipid Formula Sheet"), pesare ciascuno dei non pirolipidi e trasferirli in un flaconcino di vetro borosilicato di dimensioni sufficientemente grandi con un tappo avvitabile.
- Tappare il flaconcino, etichettare il cappuccio e il flaconcino e coprire il fondo e le pareti del flaconcino lipidico con un foglio di alluminio. Questa fiala sarà indicata come "vialla lipidica" per il resto del protocollo. Conservare il flaconcino lipidico in una zona fresca, asciutta e buia.
- Se la formulazione contiene Pyro-SPC, sciogliere 10 mg di film secco Pyro-SPC (vedere "Altri protocolli e dati") in 1 mL di cloroformio. Vortice per 5 s, misurare l'assorbanza e calcolare il volume appropriato da aggiungere al flaconcino lipidico.
ATTENZIONE:il cloroformio è un pericolo per la salute, irritante e tossico. Indossare un cappotto da laboratorio protettivo, protezione per gli occhi, guanti ed evitare di respirare fumi.
NOTA: poiché Pyro-SPC è sensibile alla luce, ridurre le luci nell'area di lavoro, se possibile, durante la manipolazione di Pyro-SPC. Tenere Pyro-SPC sigillato e coperto quando non in uso.- Sullo spettrofotometro ultravioletto-visibile, impostarlo per misurare l'assorbanza da un intervallo di lunghezze d'onda da 800 nm a 300 nm con incrementi di 0,5 nm e misurare una linea di base con 2000 μL di metanolo puro in una cuvetta compatibile di 1 cm di lunghezza del percorso.
ATTENZIONE:il metanolo è un pericolo per la salute, irritante, tossico e infiammabile. Indossare un cappotto da laboratorio protettivo, protezione per gli occhi, guanti ed evitare di respirare fumi. Tenere lontano da scintille e calore. - Aggiungere 2 μL di Pyro-SPC in cloroformio in 2000 μL di metanolo e vortice per 30 s. Trasferirlo in una cuvetta da 1 cm pulita e compatibile e misurare l'assorbanza. Regolare questo fattore di diluizione se il picco di assorbanza a 667 nm esce dall'intervallo di assorbanza dello spettrofotometro ultravioletto-visibile.
NOTA: ogni volta che si trasferisce cloroformio o metanolo, utilizzare una siringa di vetro pulita o una pipetta a spostamento positivo anziché una pipetta meccanica per una maggiore precisione. - Ripetere il passaggio 1.4.2 altre due volte per ottenere valori di assorbanza triplicati.
- Mediare i valori di picco di assorbanza a 667 nm e utilizzare la seguente equazione per calcolare il volume di Pyro-SPC in cloroformio necessario per il flaconcino lipidico14,15:
dove V è il volume di Pyro-SPC nel cloroformio necessario, m è la massa richiesta di Pyro-SPC (vedi Fase 1.1 e "Lipid Formula Sheet"), M è il peso molecolare di Pyro-SPC a 1040.317 g·mol-1, A è l'assorbanza media a 667 nm, d è il fattore di diluizione basato sul metanolo e Pyro-SPC in volumi di cloroformio (Fase 1.4.2), L è la lunghezza del percorso cuvettare a 1 cm, e ε è 667 nm coefficiente di attenuazione molare di Pyro-SPC a 45000 L·mol-1·cm-1.
NOTA: Il denominatore dell'equazione è la legge di Beer-Lambert, che mette in relazione la concentrazione di un analita in soluzione con l'assorbanza ottica misurata su una distanza. - Aggiungere il volume calcolato di Pyro-SPC in cloroformio dal passaggio precedente al flaconcino lipidico utilizzando una siringa di vetro pulita (Figura 1A), quindi tappare e coprire il flaconcino.
NOTA: la Figura 1 mostra solo la formulazione piroipidica al 30%. - Se rimane un Pyro-SPC nel cloroformio: in una cappa aspirante, scollega il flaconcino di cloroformio Pyro-SPC + dal punto 1.4, inclinare parzialmente il flaconcino su un lato e far fluire continuamente il gas di azoto il più delicatamente possibile nel flaconcino di Pyro-SPC/cloroformio. Ruotare il flaconcino per asciugare il cloroformio utilizzando il flusso di azoto gassoso e rivestire uniformemente il Pyro-SPC sulla parete interna del flaconcino mentre si asciuga. Assicurarsi che non vengano effettuati schizzi e che nessuna delle soluzioni cada.
- Una volta che il film lipidico Pyro-SPC appare asciutto e rivestito sulla parete del flaconcino, spegnere il flusso di azoto gassoso. Tappare il flaconcino, sigillare il collo del flaconcino con pellicola cerata e conservare il flaconcino a -20 °C e al buio.
- Sullo spettrofotometro ultravioletto-visibile, impostarlo per misurare l'assorbanza da un intervallo di lunghezze d'onda da 800 nm a 300 nm con incrementi di 0,5 nm e misurare una linea di base con 2000 μL di metanolo puro in una cuvetta compatibile di 1 cm di lunghezza del percorso.
- Preparare una soluzione di cloroformio al 90% e metanolo al 10% (% v/v) e aggiungerne 5 ml al flaconcino lipidico. Tappare la fiala lipidica e ruotare delicatamente per omogeneizzare il contenuto (Figura 1B).
NOTA: Se la formulazione contiene lipidi dell'acido fosfatidico (come sale sodico 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfato (DSPA)), aggiungere: 60% cloroformio, 32% metanolo e 8% acqua doppia deionizzata (% v/v/v) al flaconcino lipidico. Può essere necessario un vortice più intenso per sciogliere completamente il contenuto lipidico. - In una cappa aspirante, scollegano la fiala lipidica, inclinare parzialmente la fiala lipidica su un lato e far fluire continuamente il gas azoto il più delicatamente possibile nella fiala lipidica. Ruotare il flaconcino lipidico per asciugare la soluzione utilizzando il flusso di azoto gassoso e rivestire uniformemente il film lipidico sulla parete interna del flaconcino lipidico mentre si asciuga. Assicurarsi che non vengano effettuati schizzi e che nessuna delle soluzioni cada.
- Una volta che i lipidi appaiono asciutti e rivestiti sulle pareti interne della fiala lipidica (Figura 1C), spegnere il flusso di gas azoto, coprire il fondo e la parete del flaconcino lipidico con un foglio di alluminio e coprire l'apertura superiore con un foglio di alluminio infilato con alcuni fori con un ago per lo sfiato (Figura 1D).
- Etichettare e posizionare il flaconcino lipidico coperto all'interno di un essiccatore sottovuoto e lasciare asciugare ulteriormente i lipidi per almeno 24 ore ma non più di 72 ore.
NOTA: Il protocollo può essere ripreso in un secondo momento, dopo 24-72 ore.
2. Idratazione lipidica
- Riempire un sonicatore da bagno con acqua e riscaldarlo a 70 °C. Accendi la sonicazione per aiutare a mescolare l'acqua.
ATTENZIONE:L'acqua e il sonicatore sono ad alte temperature. Evitare di toccare l'acqua e il sonicatore. Indossare una protezione per gli occhi, un cappotto protettivo da laboratorio e guanti protettivi. - Una volta che il sonicatore da bagno ha raggiunto i 70 °C, rimuovere il flaconcino lipidico dall'essiccatore sottovuoto. Ridurre le luci nell'area di lavoro, se possibile.
- Preparare una soluzione di eccipiente di glicole propilenico al 10%, glicerolo al 10%, PBS all'80% (% v/v/v) e aggiungerne 10 ml al flaconcino lipidico (vedere Fase 1.1.1 e "Foglio formula lipidica").
NOTA: Se si utilizza una pipetta standard con spostamento d'aria, prestare attenzione quando si maneggiano solventi viscosi come glicole propilenico e glicerolo. Aspirare e immergere lentamente il volume e attendere che il volume residuo raggiunga il fondo della punta della pipetta. Assicurarsi che il liquido non si aggrappi all'esterno della punta della pipetta durante il trasferimento dei volumi muovendosi lentamente. - Tappare la fiala lipidica, rimuovere il coperchio in alluminio e ruotare delicatamente la fiala nel sonicatore del bagno per 15 minuti mentre la sonicazione è accesa per sciogliere i lipidi. Assicurarsi che il collo della fiala lipidica sia sopra l'acqua. Di tanto in tanto controllare se il tappo del flaconcino è chiuso in modo sicuro.
- Occasionalmente, rimuovere la fiala lipidica dal bagno d'acqua. Tenerlo brevemente alla luce per verificare se il contenuto è completamente disciolto (Figura 1E).
- Se il contenuto del flaconcino lipidico non è omogeneizzante, rimuovere il flaconcino lipidico dal sonicatore del bagno. Fissare il cappuccio, ruotare in modo più aggressivo e restituirlo al sonicatore del bagno.
- Rimuovere il flaconcino lipidico dal sonicatore da bagno e spegnere il sonicatore da bagno. Asciugare l'esterno del flaconcino lipidico con carta assorbente e rietichettare il flaconcino lipidico.
- Coprire il flaconcino lipidico con un foglio di alluminio e raffreddare il flaconcino lipidico a temperatura ambiente in una zona fresca, buia e asciutta per 10 minuti.
- Aliquota del contenuto del flaconcino lipidico: circa 2 mL della soluzione lipidica in flaconcini di siero trasparente in vetro borosilicato da 3 mL (diametro interno della bocca di 7 mm, diametro esterno della bocca di 13 mm).
NOTA: alcuni protocolli possono utilizzare 1,5 mL di soluzione lipidica nel flaconcino da 3 mL7. - Tappare i flaconcini di siero con tappi di gomma clorobutilica grigia in stile liofilizzazione (diametro interno della bocca di 7 mm, diametro esterno della bocca di 13 mm) e fissare il tappo di gomma con guarnizioni in alluminio strappato (diametro esterno della bocca di 13 mm) e un crimper (Figura 1F).
- Aspirare, degasare e ri-pressurizzare la soluzione lipidica in ciascuno dei flaconcini sierici4,5,7 ( Figura2).
NOTA: Fare riferimento a "Altri protocolli e dati" per istruzioni su come assemblare lo scambiatore di gas e ulteriori dettagli.- Chiudere tutte le valvole tra la valvola di pressione A e la valvola del cilindro del gas (Figura 2). Collegare le fiale di siero agli aghi del collettore, quindi aprire le valvole del collettore corrispondenti, quindi aprire la valvola del vuoto A e la valvola del vuoto B e aspirare a -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) per 5 minuti per rimuovere l'aria atmosferica. NON aspirare il liquido (vedere "Altri protocolli e dati" Passaggi da S3 a S3.1.5).
ATTENZIONE:la pompa per vuoto può scoppiare se maneggiata in modo errato. Non utilizzare la pompa per vuoto con prodotti chimici organici, acidi o di base. - Con il vuoto ancora acceso, tenere una fiala di siero (per evitare che oscilli) e toccarla rapidamente con una penna o un pennarello per degasare. Continuare a picchiettare fino a quando non si formano bolle e non ci sono bolle nel flaconcino. NON lasciare che alcun liquido venga aspirato. Se necessario, sospendi il tocco. Ripetere per tutti i flaconcini di siero collegati. Dopo aver degassato tutti i flaconcini di siero, CHIUDERE la valvola per vuoto A e la valvola per vuoto B e SPEGNERE la pompa per vuoto (vedere "Altri protocolli e dati" Passaggi da S3.2 a S3.2.3).
- Con il flaconcino di siero ancora collegato all'ago e con la pompa per vuoto spenta, ruotare lentamente la valvola del cilindro del gas da 1/16 a 1/8 (circa 22,5-45 ° di giro completo) in senso antiorario per aprirla parzialmente, quindi aprire la valvola a T e RUOTARE LENTAMENTE la valvola del regolatore dell'aria in senso orario a 3 psi (20,7 kPa). Quindi, aprire la valvola di pressione A e la valvola di pressione B (vedere "Altri protocolli e dati" Passaggi da S3.3 a S3.3.21).
ATTENZIONE:La bombola di gas decafluorobutano è sotto pressione e può esplodere se riscaldata. Tenere lontano dal calore e dall'impatto. Il gas decafluorobutano può causare spostamento e soffocamento di ossigeno. Indossare un'adeguata protezione per gli occhi e maneggiare in una cappa aspirante. Se gestito in modo errato, è possibile aspirare la bombola del gas, che può causare una rapida depressurizzazione e implosione. L'apertura della valvola della bombola del gas più di 1/8 di giro può danneggiare il regolatore dell'aria. - Dopo 30 s di pressurizzazione (il calibro dovrebbe ancora leggere 3 psi (20,7 kPa)), chiudere tutte le valvole del collettore con fiale di siero, scollegare le fiale di siero, infiaccare gli aghi e CHIUDERE la valvola del cilindro del gas.
- Alleviare la pressione accumulata aprendo parzialmente una singola valvola collettore fino a quando l'ago del manometro del regolatore dell'aria non va nella sua posizione di riposo. Quindi chiudi tutto tra e comprese le valvole del collettore e la maniglia a T.
- Chiudere tutte le valvole tra la valvola di pressione A e la valvola del cilindro del gas (Figura 2). Collegare le fiale di siero agli aghi del collettore, quindi aprire le valvole del collettore corrispondenti, quindi aprire la valvola del vuoto A e la valvola del vuoto B e aspirare a -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) per 5 minuti per rimuovere l'aria atmosferica. NON aspirare il liquido (vedere "Altri protocolli e dati" Passaggi da S3 a S3.1.5).
- Etichettare i flaconcini di siero e conservarli a 4 °C e al buio. Assicurarsi che tutte le valvole dello scambiatore di gas siano chiuse e che la pompa per vuoto sia spenta in seguito.
NOTA: Il siero deve essere stabile fino a 4 mesi in questo stato. In questa fase, il protocollo può essere ripreso in seguito, dopo 4 mesi al massimo.
3. Flaconcini di decafluorobutano
- Con flaconcini di siero trasparente in vetro borosilicato puliti e vuoti da 3 mL (diametro interno della bocca di 7 mm, diametro esterno della bocca di 13 mm), coprirli con tappi di gomma clorobutilica grigia in stile liofilizzazione (diametro interno della bocca di 7 mm, diametro esterno della bocca di 13 mm) e fissare il tappo di gomma con guarnizioni in alluminio a strappo (diametro della bocca esterna di 13 mm) e un crimper4, 7,8.
- Seguire il passaggio 2.9.1 per aspirare l'aria atmosferica (vedere "Altri protocolli e dati" Passaggi da S3.1 a S3.1.5).
- Saltare il degasaggio e seguire i passaggi da 2.9.3 a 2.9.5 per pressurizzare il flaconcino (vedere "Altri protocolli e dati" Passaggi da S3.3 a S3.3.21).
- Etichettare i flaconcini di decafluorobutano e conservarli a 4 °C e al buio. Assicurarsi che tutte le valvole dello scambiatore di gas siano chiuse e che la pompa per vuoto sia spenta in seguito.
NOTA: per la condensazione delle gocce di goccioline saranno necessari flaconcini di siero riempiti con gas decafluorobutano. Dovrebbero essere stabili fino a 4 mesi in questo stato. In questa fase, il protocollo può essere ripreso in seguito, dopo 4 mesi al massimo.
4. Formazione di goccioline
- Rimuovere una soluzione lipidica idratata nel flaconcino di siero (dal passaggio 2.10) dal frigorifero.
- Utilizzando un decapper, rimuovere il sigillo di alluminio sul flaconcino di siero e trasferire 1 mL della soluzione lipidica in un flaconcino campione di vetro borosilicato da 1,85 mL (con un tappo a vite fenolico) lasciando che la soluzione lipidica scorra lungo la parete interna. Non creare bolle.
- Se c'è una soluzione lipidica rimanente nel flaconcino di siero, seguire i passaggi da 2.9 a 2.10 per degasare e ri-pressurizzare il flaconcino di siero per la conservazione (vedere "Altri protocolli e dati" Passaggi da S3 a S3.3.21).
- Con il flaconcino campione da 1,85 mL, fluire delicatamente nel gas decafluorobutano nello spazio di testa del flaconcino del campione utilizzando lo scambiatore di gas (vedere la Figura 2 per i nomi specifici delle valvole).
- Assicurarsi che tutte le valvole dello scambiatore di gas siano chiuse correttamente e che la pompa sia spenta.
ATTENZIONE:Se fatto in modo errato, è possibile aspirare la bombola del gas causando una rapida decompressione e implosione. - Aprire una valvola del collettore e rimuovere con attenzione l'ago corrispondente dal collettore.
ATTENZIONE:oggetto appuntito, evitare il contatto / piercing. - Aprire la valvola di pressione A e la valvola di pressione B e ruotare la valvola del cilindro del gas da 1/16 a 1/8 (circa 22,5-45 ° di giro completo) in senso antiorario per aprire parzialmente e quindi aprire la valvola a T.
ATTENZIONE:Non aprire la valvola della bombola del gas più di questo in quanto potrebbe causare danni al regolatore dell'aria. - Scolleghi il flaconcino del campione con la soluzione lipidica e spostalo in modo che l'ago Manifold si trova sopra l'interfaccia liquido-aria all'interno del flaconcino. Tenga lì il flaconcino.
-
Ruotare LENTAMENTE la valvola regolatrice dell'aria in senso orario fino a quando l'ago del misuratore del regolatore dell'aria si sposta leggermente dalla sua posizione di riposo e il gas perfluorocarburo fuoriesci delicatamente dall'ago del collettore. Lasciare che il gas perfluorocarburo fluisca delicatamente nello spazio di testa del flaconcino per 30 s. Non creare bolle. Se necessario, regolare la valvola regolatrice dell'aria.
NOTA: L'interfaccia aria-liquido deve essere leggermente perturbata dal flusso di gas decafluorobutano. Poiché il sistema è ora aperto, il manometro del regolatore dell'aria non è in grado di leggere correttamente la pressione. - Dopo 30 s, chiudere con attenzione e rapidamente il flaconcino del campione senza muovere troppo il flaconcino.
- Chiudere la valvola del cilindro del gas (in senso orario), la valvola a T, la valvola del regolatore dell'aria (in senso antiorario), la valvola di pressione A, la valvola di pressione B e la valvola del collettore.
- Inghirlandare con cura l'ago.
- Etichettare il flaconcino campione e sigillare il collo con un film di cera in senso orario (Figura 3A e 3B).
NOTA: le figure da 3B a 3F mostrano solo la formulazione piroipidica al 30%.
- Assicurarsi che tutte le valvole dello scambiatore di gas siano chiuse correttamente e che la pompa sia spenta.
- Conservare il flaconcino del campione al buio e a 4 °C per almeno 10 minuti o fino a 24 ore.
NOTA: In questa fase, il protocollo può essere ripreso in un secondo momento, 24 ore al massimo. - Mettere circa 100 g di ghiaccio secco (anidride carbonica) in un contenitore isolato e posizionare il ghiaccio normale in un altro contenitore isolato. Recuperare i flaconcini di siero di decafluorobutano preparati menzionati nella fase 3, due aghi da 3,81 cm (1,5 pollici) calibro 20, una siringa di plastica da 1 mL (scollegare lo stantuffo prima dell'uso), un contenitore da 200 ml, pinze metalliche e un termometro (da -20 a 100 °C).
NOTA: Se si fanno solo microbolle, non c'è bisogno di isopropanolo, ghiaccio secco e ghiaccio. - Posizionare il flaconcino campione con la soluzione lipidica nell'agitatore meccanico e agitare per 45 s (Figura 3C).
- Dopo l'agitazione meccanica, tenere la fiala del campione sul lato destro verso l'alto, schermata dalla luce, e iniziare un conto alla rovescia di 15 minuti per raffreddare la fiala e selezionare le microbolle8,17.
- Quando il conto alla rovescia di 15 minuti ha raggiunto i 10 minuti (5 minuti rimasti sul conto alla rovescia), riempire un contenitore con circa 200 ml di isopropanolo e raffreddarlo a -20 °C con ghiaccio secco usando pinze metalliche.
NOTA: la temperatura target è da -15 a -17 °C, ma l'isopropanolo si riscalda durante la manipolazione delle microbolle.
ATTENZIONE:l'isopropanolo è infiammabile. Tenere lontano da fonti di calore e scintille. Il ghiaccio secco può causare danni alla pelle. Maneggiare con pinze. Indossare guanti, protezione per gli occhi e un cappotto protettivo da laboratorio.
- Quando il conto alla rovescia di 15 minuti ha raggiunto i 10 minuti (5 minuti rimasti sul conto alla rovescia), riempire un contenitore con circa 200 ml di isopropanolo e raffreddarlo a -20 °C con ghiaccio secco usando pinze metalliche.
- Dopo che le microbolle sono state selezionate per 15 minuti, cercare la partizione selezionata per la dimensione all'interno della fiala campione (Figura 3D).
- Mantenendo il flaconcino del campione sul lato destro verso l'alto, aprire accuratamente il flaconcino del campione e prelevare circa 0,7 mL della partizione inferiore con un ago da 1,5 pollici calibro 20 attaccato a una siringa di plastica da 1 mL. Assicurarsi che nessuna delle partizioni superiori venga ritirata. Non azionare la siringa per rimuovere le sacche d'aria.
- Inserire un altro ago calibro 20 in un flaconcino di siero di decafluorobutano (mantenendo l'ago vicino alla parte superiore del flaconcino di siero) per sfogare e quindi inserire l'ago/siringa con le microbolle selezionate in base alle dimensioni.
- Trasferire lentamente le microbolle selezionate in formato. Inclinare il flaconcino e inclinare la siringa per far scivolare il liquido lungo la parete interna del flaconcino di siero di decafluorobutano.
- Una volta trasferita tutta la soluzione di microbolle selezionata, rimuovere l'ago con la siringa ma tenere l'ago di sfiato per alleviare la pressione negativa (Figura 3E).
- Se fai solo microbolle selezionate per dimensioni, fermati qui. Tenere l'ago di sfiato dentro e vicino alla parte superiore. Conservare il flaconcino al buio e a temperatura ambiente.
- Aggiungere piccole quantità di ghiaccio secco o isopropanolo a temperatura ambiente al bagno di isopropanolo per assicurarsi che la temperatura del bagno sia compresa tra -15 e -17 °C.
- Con l'ago di sfiato calibro 20 inserito vicino alla parte superiore del flaconcino di siero, posizionare il flaconcino di siero nel bagno di isopropanolo, mantenendo il livello di microbolle al di sotto del livello dell'isopropanolo ma il collo del flaconcino sopra di esso, e a intermittenza ruotare il flaconcino di siero per 2 minuti per condensare le microbolle.
NOTA: Questo passaggio è stato modificato dal lavoro svolto da Sheeran et al.6- Non far roteare continuamente il flaconcino di siero nell'isopropanolo e non lasciare che la soluzione si congeli. Ruotare per circa 5 s e sollevare il flaconcino di siero dall'isopropanolo. Controllare la nucleazione del ghiaccio e riprendere a turbinare in isopropanolo. Se c'è formazione di ghiaccio, ruotare la fiala di siero nell'aria fino a quando non si dissipa.
- Dopo la condensazione di 2 minuti, rimuovere il flaconcino di siero dal bagno di isopropanolo e rimuovere l'ago di sfiato.
NOTA: Le microbolle avrebbero dovuto essere condensate in goccioline, come indicato dalla variazione della traslucenza(Figura 3E rispetto alla Figura 3F per la formulazione pirolipidica al 30%). - Pulire il flaconcino di siero, etichettarlo e metterlo su ghiaccio normale in un contenitore buio e isolato fino al momento dell'uso. Le goccioline non epre dipendenti (guarnizione in alluminio intatta) devono essere stabili in questo stato fino a 6 ore finché il ghiaccio fuso viene sostituito secondo necessità.
- Quando è pronto per l'uso, rimuovere la guarnizione in alluminio con il decapper. Tenere le goccioline (anche aperte) sul ghiaccio e al buio mentre non sono in uso. Tenere le microbolle al buio e a temperatura ambiente.
5. Caratterizzazione morfologica e ottica
- Preparare 1% Triton: aggiungendo 5 mL di Triton X-100 in 500 mL di PBS (1x, pH 7,4) e mescolare con una barra magnetica fino a14omogeneo.
NOTA: Triton X-100 molto viscoso. Se si utilizza una pipetta standard a spostamento d'aria, prestare attenzione durante la manipolazione. Aspirare e immergere lentamente il volume e attendere che il volume residuo raggiunga il fondo della pipetta. Assicurarsi che il liquido non si aggrappi all'esterno della punta della pipetta durante il trasferimento dei volumi muovendosi lentamente. - Preparare le goccioline (Passaggio 4). Se vengono caratterizzate anche microbolle, raccogliere un piccolo volume delle microbolle selezionate prima della condensazione (Fase 4.9).
- Dimensionare le microbolle o le goccioline su un contatore Coulter (CC) da 0,2 a 6 μm per ottenere distribuzioni dimensionali e concentrazioni (Figura 4).
- Riempire una cuvetta pulita da 20 mL con 10 mL di elettrolita CC che è stato filtrato attraverso un filtro a membrana di polietersolfone da 0,2 μm. Misuralo sul CC con tre esecuzioni per ottenere una linea di base.
- Nello stesso elettrolita CC, aggiungere 5 μL di microbolle o campione di goccioline e mescolare delicatamente.
NOTA: è possibile aggiungere da 2 a 20 μL di campione a seconda della concentrazione del campione. - Eseguire il campione sul CC (3 esecuzioni), sottrarre la linea di base mediata e calcolare la distribuzione dimensionale e la concentrazione (numero per ml).
- Misurare l'assorbanza delle goccioline con la spettroscopia UV-Vis (Figura 5).
NOTA: la Figura 5 mostra solo la formulazione piroipidica al 30%.- Sullo spettrofotometro UV-Vis, impostare la misurazione dell'assorbanza su lunghezze d'onda da 800 nm a 300 nm con incrementi di 0,5 nm e abilitare la correzione della linea di base.
- Utilizzando una cuvetta pulita di 1 cm di lunghezza del percorso riempita con PBS, eseguire una misurazione di base. Assicurarsi che il volume sia abbastanza alto da intersecare il percorso del fascio dello spettroscopio.
- Diluire le goccioline pirolipidiche in PBS (raccomandare da 2 μL a 500 μL di goccioline in 2000 μL di diluente) e mescolare mediante pipettaggio.
NOTA: NON vortex altrimenti gli assiemi verranno distrutti. - Trasferire le goccioline diluite in una cuvetta pulita e misurare l'assorbanza. Modificare le diluizioni se necessario.
- Ripetere i passaggi da 5.4.1 a 5.4.4, ma utilizzare Triton all'1% anziché PBS. Dopo la diluizione, trasferire il campione in un flaconcino sigillabile/tappato e vortice per 30 s prima della misurazione.
- Misurare la fluorescenza di microbolle o goccioline (Figura 6).
NOTA: la Figura 6 mostra solo la formulazione piroipidica al 30%.- Sullo spettrofotometro a fluorescenza, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 410 nm e l'intervallo di lunghezza d'onda di emissione da 600 a 750 nm con incrementi di 1 nm.
- Misurare la fluorescenza del diluente PBS per ottenere una linea di base utilizzando una cuvetta compatibile con lo spettrofotometro a fluorescenza.
- Diluire le microbolle o le goccioline piroilipidiche in PBS (raccomandare da 0,5 μL a 10 μL di goccioline in 2000 μL di diluente) e mescolare mediante pipettaggio.
NOTA: NON vortex altrimenti gli assiemi verranno distrutti. - Trasferire il campione diluito nella cuvetta pulita e basale e misurare la fluorescenza. Modificare le diluizioni se necessario ed evitare la saturazione del segnale.
- Ripetere i passaggi da 5.5.1 a 5.5.4 ma utilizzare Triton all'1% anziché PBS. Dopo aver diluito in Triton all'1%, trasferire il campione diluito in un flaconcino sigillabile/tappato e vortice per 30 s prima della misurazione. Aggiungi un volume sufficiente per assicurarti che le bolle generate dal vortice siano al di sopra del percorso laser.
NOTA: Il segnale di fluorescenza del campione in Tritone sarà molto più alto che in PBS a causa dell'inestinguimento della fluorescenza (Figura 6).
6. Imaging di vaporizzazione
- Riempire un serbatoio d'acqua di dimensioni appropriate con acqua deionizzata e lasciarlo riposare per 24 ore per equilibrare i gas nell'acqua con l'atmosfera.
- Preparare le goccioline e tenerle sul ghiaccio e al buio fino all'uso.
- Crea un tubo fantasma di flusso da agar al 2% come descritto da Pellow et al.18 Immergi il fantasma in un serbatoio d'acqua riscaldato a 37 ° C.
- Riscaldare PBS a 37 °C e fluire attraverso il fantasma.
- Con un sistema a ultrasuoni pre-clinico e un trasduttore a matrice lineare a 21 MHz (vedere Tabella dei materiali),allineare la vista al fantasma di flusso, impostarla sull'imaging in modalità B, impostare le pressioni di uscita e acquisire video o immagini per acquisire linee di base ad ogni pressione.
- Diluire 20 μL della goccia in 50 mL di PBS a 37 °C e mescolare delicatamente. Trasferire la soluzione in una siringa di plastica da 30 ml e spingere la soluzione attraverso il fantasma di agar.
- Mantenendo lo stesso allineamento del passo 6.5, aumentare le pressioni di uscita fino a quando non si osserva la vaporizzazione (macchie luminose nel fantasma, vedere Figura 7).
NOTA: la Figura 7 mostra il campione di goccioline piroipidiche al 30%. Questo trasduttore lineare a 21 MHz disponibile in commercio è in grado di imaging e vaporizzare le goccioline.
Representative Results
Campioni di microbolle precon condensati e selezionati per dimensioni(n = 3) e campioni di goccioline post-condensate(n = 3) sono stati dimensionati su un contatore Coulter (CC) con un'apertura di 10 μm. Una limitazione dell'apertura di 10 μm è che non può misurare particelle più piccole di 200 nm, il che può distorcere la dimensione media e la concentrazione. La Figura 4 mostra i dati di dimensionamento per ciascuna delle formulazioni con contenuto pirolipidico. La tabella 1 mostra le statistiche basate sui dati di dimensionamento. Utilizzando un rapporto tra diametri medie pre- e post-condensati, i risultati hanno mostrato che la formulazione piro-lipidica allo 0% aveva il più piccolo spostamento medio del diametro a 1,72 ± 0,02. La formulazione piroipidica al 50% aveva il diametro medio maggiore a 2,38 ± 0,08. Il campione di goccioline pirolipidiche all'1% aveva la più alta concentrazione osservata a (2,71 ± 0,13) ×10 10 /mL mentre il campione di goccioline pirolipidiche al 40% aveva la concentrazione più bassa osservata a (7,36 ± 0,81) × 109 /mL. I dati di dimensionamento hanno mostrato che il campione di goccioline piro-lipidiche al 10% aveva il più piccolo dimetro di picco a 261 ± 13 nm, mentre il campione di goccioline piro-lipidiche al 50% aveva il più grande a 390 ± 55 nm. Generalmente, con l'aumentare del contenuto pirolipidico, la concentrazione diminuiva e il diametro medio aumentava. Poiché i campioni post-condensati si basano sul campione di microbolle precursori, la tendenza si è verificata per entrambi i tipi di agenti di contrasto ad ultrasuoni. Con l'aumento del contenuto di piro-lipidi, una sottopopolazione di microbolle (con una dimensione di picco a circa 2000 μm) ha iniziato a formarsi. Questo picco secondario non era presente nel campione di microbolle piro-lipidiche allo 0% e più evidente nelle popolazioni pirolipidiche al 40% e al 50%.
La Figura 5 mostra le misure rappresentative di assorbanza del campione di goccioline pirolipidiche al 30%. Il picco del campione intatto in PBS era di 700 nm mentre il campione interrotto in Tritone ha spostato il picco a 671 nm. Ciò ha dimostrato che gli assemblaggi intatti hanno proprietà ottiche diverse rispetto ai singoli componenti lipidici non assemblati.
La Figura 6A mostra misure rappresentative di fluorescenza del campione di microbolle precon condensate mentre la Figura 6B mostra un campione di goccioline post-condensato con il 30% di pirolipidi. Il campione intatto in PBS aveva un picco di fluorescenza a 704 nm mentre la forma interrotta aveva un picco a 674 nm. Sottraendo l'area interrotta sotto la curva con l'area intatta sotto la curva e dividendo la differenza per l'area interrotta sotto la curva si ottiene l'efficienza di spegnimento, che risulta essere rispettivamente del 98,61% e del 98,07% per il campione di microbolle piro-lipidiche al 30% e il campione di goccioline.
Per dimostrare la conversione delle goccioline in microbolle, le goccioline diluite sono state riprese e vaporizzate in un fantasma di flusso a 37 ° C con un sistema ad ultrasuoni. La Figura 7 mostra immagini ecografiche rappresentative del campione di goccioline pirolipidiche al 30% ripreso a diverse pressioni. A basse pressioni (Figura 7A), c'era pochissimo segnale, solo il segnale di fondo dalle bolle d'aria bloccate dalla sintesi dell'agar. Questo perché le goccioline non sono ecogeniche e non disperdono gli ultrasuoni. Ad una potenza leggermente elevata, sono state generate alcune microbolle (Figura 7B) come mostrato dalla comparsa di macchie luminose. Con l'aumentare della pressione, sono state generate più microbolle (Figura 7C e 7D). Ciò ha anche dimostrato che le goccioline non vaporizzano spontaneamente a 37 °C.
Figura 1: Immagini dei passaggi per formare la soluzione pirolipidica al 30%. A)Polvere lipidica più Pyro-SPC in cloroformio. B)Aggiunta la soluzione di dissoluzione. C)Film lipidico essiccato e rivestito sulla parete interna del flaconcino. D)Flaconcino lipidico avvolto in un foglio di alluminio (foglio esterno nastrato per il riutilizzo). E)Soluzione lipidica idratata. F)Soluzione lipidica in flaconcino sierico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Lo scambiatore di gas a 10 collettori. Le valvole a cui si fa riferimento nel protocollo sono etichettate. Vedere File supplementare "Altri protocolli e dati" per istruzioni su come assemblare lo scambiatore di gas. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: A) Le soluzioni lipidiche delle 7 formulazioni (da 0% a 50% Pyro-SPC) in flaconcini campione. Le figure da B a D mostrano le immagini dei passi compiuti per produrre il 30% di goccioline piro-lipidiche. B)Soluzione piroipidica al 30% in un flaconcino campione. C)Post-agitazione. D) 15 min taglia selezionata. E) Partizione inferiore trasferita al flaconcino di decafluorobutano. D)Post-condensa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Dati di dimensionamento coulter counter (CC) dei campioni di microbolle e goccioline selezionati con diverso contenuto di guscio piro lipidico(n = 3). Le linee verdi solide rappresentano le microbolle e le linee ciano tratteggiate rappresentano le goccioline. A) 0% Piro-SPC. B) 1% Piro-SPC. C)10% Piro-SPC. D)20% Piro-SPC. E) 30% Piro-SPC. F)40% Piro-SPC. G) 50% Piro-SPC. H)Le concentrazioni totali osservate di campioni di microbolle e goccioline dal CC in base al contenuto di Pyro-SPC nel guscio. Tutte le barre di errore indicano la deviazione standard. Tutte le misurazioni sono state eseguite utilizzando un'apertura di 10 μm che ha un intervallo di dimensioni da 200 nm a 6000 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Misure rappresentative di assorbanza per spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis) da 300 a 800 nm del campione di goccioline pirolipidiche post-condensato al 30% diluito in PBS e in Tritone all'1%. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 6: Emissione rappresentativa di fluorescenza da 600 a 750 nm eccitata a 410 nm. A) Campione di microbolle piroipidiche precon condensato e preconfezionato in PBS e tritone all'1%. B)Campione di goccioline pirolipidiche post-condensate al 30% in PBS e in Tritone all'1%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Immagini ecografiche rappresentative di un fantasma di flusso di agar a 37 °C prelevate con un trasduttore lineare pre-clinico a 21 MHz in modalità B (vedere Tabella dei materiali). La colonna di sinistra(figure A, C, Ee G)mostra i controlli PBS. La colonna di destra(Figure B, D, Fe H)mostra 20 μL di campione di goccioline pirolipidiche post-condensato al 30% diluito in 50 mL di PBS a 37 °C. Ogni riga rappresenta le pressioni negative di picco a campo libero, che sono state stimate dal lavoro svolto da Sheeran et al.8 I triangoli gialli indicano la profondità di messa a fuoco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Metodo | Agente | Pyro Shell % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| CC | Bolle | [/mL] | (2.76 ± 0.28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1.91 ± 0.22) × 10^10 | (1,47 ± 0,05) × 10^10 | (8,47 ± 0,95) × 10^9 | (9,89 ± 0,15) × 10^9 |
| CC | Bolle | Picco [nm] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| CC | Bolle | Media [nm] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| CC | Bolle | Mediana [nm] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| CC | Goccioline | [/mL] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1,75 ± 0,18) × 10^10 | (1,72 ± 0,13) × 10^10 | (1,09 ± 0,01) × 10^10 | (7.36 ± 0.81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| CC | Goccioline | Picco [nm] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| CC | Goccioline | Media [nm] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| CC | Goccioline | Mediana [nm] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
Tabella 1: Statistiche dei dati di dimensionamento dei campioni di microbolle e goccioline con diverso contenuto di Pyro-SPC da Coulter Counter (CC) (n = 3). Tutti gli errori indicano una deviazione standard.
Informazioni supplementari - Lipid Formula Sheet: Fare clic qui per scaricare questo file.
Informazioni supplementari - Altri protocolli e dati: Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
Dopo aver sommato tutti i componenti lipidici insieme (Fasi 1.2 e 1.4.5, Figura 1A),è stata aggiunta una soluzione di cloroformio e metanolo (e acqua se sono presenti lipidi dell'acido fosfatidico come DSPA) per garantire che i componenti piro-lipidici e non piro lipidici fossero completamente omogeneizzati (Fase 1.5, Figura 1B). Per prevenire la formazione di vescicole lipidiche con composizione lipidica eterogenea, i lipidi disciolti sono stati essiccati e rivestiti all'interno della parete della fiala come un film sottile (Figura 1C). Il rivestimento (Step 1.6) facilita anche l'idratazione (Step da 2.1 a 2.4) in quanto aumenta la superficie del film essiccato. L'essiccazione (Fase 1.6, Figura 1C)e l'aspirazione (Fase 1.8, Figura 1D)sono state fatte per garantire che il cloroformio e il metanolo fossero completamente evaporati poiché queste sostanze chimiche possono interrompere la formazione di microbolle. Mentre il protocollo può essere ridimensionato per rendere i volumi della soluzione lipidica fino a 1 mL, volumi maggiori possono ridurre la variazione da flaconcino a flaconcino. Mentre questo può correre il rischio di degradare il Pyro-SPC mentre non è in uso, la condizione di conservazione della soluzione lipidica (fase da 2.9 a 2.10) aveva lo scopo di ridurre tale rischio. La fase di degasaggio con lo scambiatore di gas (Step 2.9.2, Figura 1F e Figura 2)serve ad eliminare più ossigeno possibile per prevenire l'ossidazione. Non è consigliabile conservare soluzioni lipidiche contenenti porfirina-lipidi mentre i gas atmosferici sono ancora disciolti nella soluzione (Figura 1E).
Nella fase 2.10, la soluzione lipidica si trova in una fiala sierica con uno spazio di testa pressurizzato, simile a come vengono vendute le microsfere lipidiche perflutren dell'agente di contrasto ad ultrasuoni clinicamente approvato (simile alla Figura 1F). Il lavoro interno ha dimostrato che le microbolle stabili non potrebbero essere generate tramite agitazione meccanica con la presenza di pirolipidi se il cappuccio fosse un materiale morbido come il tappo di gomma. Pertanto, la soluzione lipidica è stata trasferita in un flaconcino campione con un cappuccio fenolico non in gomma (Fasi da 4.1 a 4.4, Figura 3A e 3B). Quando il gas decafluorobutano è stato fatto fluire nel flaconcino del campione (passaggi da 4.1 a 4.4), il decafluorobutano più denso deve spostare l'aria atmosferica nello spazio di testa del flaconcino del campione. Attualmente, non è noto il motivo per cui i pirolipidi non sono in grado di formare microbolle con tappi di gomma. Senza pirolipidi, le microbolle stabili possono essere prodotte direttamente nelle fiale di siero con tappi di gomma4,7. Pertanto, si consiglia di utilizzare lo scambiatore di gas per degasare e ri-pressurizzare il flaconcino di siero, quindi agitare il flaconcino di siero stesso per formulazioni non piro-lipidiche4,5,6,7 (vedere "Altri protocolli e dati"). Il vantaggio di poter agitare meccanicamente nella fiala di siero è che lo spazio di testa può essere pressurizzato e la selezione delle dimensioni può essere effettuata invertendo la fiala del siero capovolta8. In questo protocollo, la formulazione pirolipidici allo 0% è stata trasferita in una fiala campione (passi da 4.1 a 4.4) per essere coerente con le formulazioni che contenevano pirolipidi. Inoltre, lunghezze più lunghe della catena lipidica acilico si traducono in goccioline più stabili a causa di migliori interazioni di van der Waals19. La composizione del guscio lipidico è stata scelta in base a ciò che era disponibile in commercio, lunghezza della catena a 18 acilici per tutti i tipi di lipidi. DSPE-PEG5K è stato incorporato in tutta la formulazione (Step 1.1) in quanto la presenza delle catene di polietilenglicole impedisce la coalescenza delle strutture tramite forze steriche repulsive19. Durante l'idratazione lipidica, il bagno sonicatore del bagno è stato impostato a 70 °C (Step 2.1) come abbastanza alto da disperdere completamente il film lipidico di lunghezza della catena 18-acilica18. Per le lunghezze della catena acilico più lunghe, saranno necessarie temperature più elevate.
Un carico piro-lipidico più elevato aumenterebbe la concentrazione di componenti che assorbono otticamente e fluorescenti, che possono essere desiderati per alcune applicazioni che beneficiano del carico massimizzato della porfirina. Tuttavia, con l'aumentare del contenuto di pirolipidi, la concentrazione di goccioline osservabili è diminuita e i diametri sono aumentati (Figura 4 e Tabella 1). Ciò illustra un compromesso tra fluorescenza ottica e proprietà di assorbanza rispetto alla concentrazione e al diametro delle goccioline. Per i ricercatori che devono dare la priorità a piccoli diametri per l'accumulo in vivo attraverso piccoli vasi che perdono o se è necessario iniettare un'alta concentrazione di goccioline, aumentare il carico piro-lipidico potrebbe non valere l'aumento del dimetro delle goccioline o la diminuzione della concentrazione di goccioline. Se alte concentrazioni di goccioline e/o piccoli diametri di goccioline sono fondamentali, devono essere considerati agenti diagnostici di accompagnamento di dimensioni simili al posto dei pirolipidi. Mentre l'1% di goccioline piro-lipidiche non ha provocato una diminuzione della concentrazione o un aumento delle dimensioni, il carico piro-lipidico dell'1% può essere troppo basso per essere ragionevolmente rilevabile dal fondo del tessuto fluorescente. Tuttavia, la flessibilità della porzione di porfirina offre molteplici opzioni per la funzionalizzazione che impartiranno mezzi alternativi di quantificazione più adatti per applicazioni a bassa concentrazione. Ad esempio, i piro-lipidi possono essere chelati con rame-64 per l'imaging tomografico ad emissione di positoni e il conteggio gamma20, o con palladio per la quantificazione di tracce di metalli usando la spettrometria di massa, o con manganese per la risonanza magnetica14.
Mentre alcuni esperimenti possono richiedere solo un piccolo volume della soluzione di goccioline, è necessario 1 mL della soluzione lipidica per riempire il flaconcino del campione da 1,85 mL. Goertz et al. hanno dimostrato che i cambiamenti nella manipolazione, nella pressione dello spazio di testa, nel rapporto liquido-gas e persino nella forma della fiala possono influenzare le popolazioni di microbolle17. La temperatura del flaconcino durante l'agitazione e la selezione delle dimensioni possono anche influenzare la distribuzione delle dimensioni. Pertanto, per i metodi ottimizzati dall'utente finale, è fondamentale essere il più coerenti possibile quando si effettuano goccioline. Le goccioline non spese possono essere congelate (-20 °C) e scongelate in seguito per un uso futuro, ma ciò influenzerà le popolazioni di dimensioni.
La procedura di agitazione che attiva una soluzione lipidica in microbolle non produce una popolazione morfologicamente omogenea (Step 4.6); piuttosto, il campione è pieno di microbolle, vescicole multilamellari, liposomi e micelle18,21,22. Mentre le dimensioni delle microbolle coprono la gamma di micron e nanometri, le altre strutture sono in gran parte inferiori a 800 nm 23. Le tecniche di dimensionamento utilizzate non distinguono tra queste varie strutture, e quindi i campioni di microbolle post-agitate (Fase 4.6, Figura 3C) e i campioni di goccioline post-condensate (Fase 4.14, Figura 3F) devono essere assunti come miscele. Gli assemblaggi insensibili agli ultrasuoni (vescicole multilamellari, liposomi e micelle) sono probabilmente conservati dopo la condensazione e non cambieranno dimensione in quanto non hanno nuclei a cambiamento di fase. Poiché il contatore di Coulter non è in grado di distinguere tra questi diversi assemblaggi supramolecolari, lo spostamento delle dimensioni della popolazione dopo la condensazione dovrebbe essere interpretato con l'ipotesi che una parte delle strutture su scala nanometrica siano inconvertibili e contribuiscano alla popolazione osservata in quella regione dimensionale. Inoltre, queste strutture contribuiscono alle firme spettroscopiche e fluorescenti di questi campioni14. Le firme di fluorescenza e assorbanza di micelle, liposomi / vescicole e goccioline sono tutte simili, incluso il loro grado di tempra di fluorescenza14. Pertanto, è importante considerare che esiste una miscela di assiemi nelle figure da 3C a 3F, figura 4, il campione diluito PBS in figura 5e il campione diluito PBS in figura 6.
Dopo la selezione delle dimensioni e prima della condensazione (Fase 4.9), è possibile eliminare gli assemblaggi non a bolle centrifugando il campione di microbolle per separare le bolle galleggianti dagli assemblaggi non galleggianti come descritto da Feshitan et al.21 Il grado di separazione può essere controllato regolando la forza di rotazione e la durata. Tuttavia, esperimenti di condensazione di microbolle di tali campioni isolati in dimensioni hanno rivelato che l'utilizzo delle popolazioni di microbolle precursori più grandi selezionate utilizzando procedure di isolamento delle dimensioni ha prodotto goccioline più grandi (vedere "Altri protocolli e dati" Fase S5 per il dimensionamento post-filato di bolle e goccioline). Poiché un'applicazione prevista di goccioline prodotte con questo protocollo è una piattaforma per lo stravaso passivo e l'accumulo a causa delle loro piccole dimensioni rispetto alle microbolle4,8, sono state desiderate popolazioni di goccioline che sono il più piccole possibile. Pertanto, questo protocollo utilizzava campioni di microbolle post-agitati che non erano isolati per dimensioni tramite centrifugazione, anche se ciò significava che micelle insensibili agli ultrasuoni, liposomi e vescicole erano presenti nella soluzione finale. Ciò implica che le procedure di quantificazione per la biodispressione deriveranno il segnale per tutte le strutture iniettate e non sono limitate alle sole goccioline. Tuttavia, poiché queste strutture di dimensioni simili molto probabilmente si accumulano tramite un meccanismo passivo che è principalmente dettato dalle dimensioni, non si sospetta che ciò dovrebbe cambiare le principali inferenze che possono essere fatte se questa piattaforma deve essere utilizzata in vivo, anche se tutti questi aspetti dovrebbero essere considerati individualmente a seconda del contesto in cui la piattaforma può essere utilizzata. I test che utilizzano bracci sperimentali con e senza ultrasuoni possono essere eseguiti per garantire che siano le goccioline sensibili agli ultrasuoni a essere responsabili di eventuali cambiamenti nella biodis distribuzione, poiché solo gli assemblaggi del nucleo di perfluorocarburi nella soluzione risponderanno agli ultrasuoni.
Dopo l'agitazione, la fiala è stata riposata per 15 minuti ed è stata osservata una partizione nella fiala (Figura 3C contro 3D). La selezione delle dimensioni tramite galleggiabilità è un metodo semplice per eliminare le strutture/bolle più grandi da unasoluzionedi microbolle attivata 8,17. In questo caso, le particelle con diametri superiori a 5 μm sono state per lo più rimosse dopo la selezione delle dimensioni (Figura 4). L'estensione della selezione delle dimensioni può essere regolata controllando la durata della selezione delle dimensioni17. Sheeran et al. hanno dimostrato che la non selezione delle dimensioni può provocare microbolle generate che occludonola vascolarizzazione 8.
I perfluorocarburi hanno il vantaggio di essere biologicamente inerti7. Mentre il punto di ebollizione del decafluorobutano è -1,7 °C, al di sopra della temperatura corporea, le goccioline non vaporizzano immediatamente se esposte a 37 °C (Figura 7B). Poiché le goccioline sono meta-stabili a 37 °C, è necessaria ulteriore energia acustica per vaporizzare le goccioline in microbolle7,9. Poprosky et al. hanno dimostrato goccioline di porfirina condensate tramite pressurizzazione22. Questo è un metodo praticabile e persino essenziale quando si utilizzano perfluorocarburi meno densi, ma le alte pressioni possono distruggere alcune bolle nel processo. L'ottafluoropropano (C3F8) ha un punto di ebollizione di -36,7 ° C, quindi è necessario sia il raffreddamento che la pressurizzazione per la condensazione delle goccioline. Tuttavia, il perfluorocarburo più leggero porta a goccioline meno stabili. Il dodecafluoropentano (C5F12) può portare a goccioline più stabili con un punto di ebollizione di 28 °C. Tuttavia, è un liquido a temperatura ambiente e avrà bisogno di energie acustiche più forti per vaporizzare. Pertanto, la scelta del gas contenente l'agente di contrasto ad ultrasuoni dovrebbe considerare le condizioni della sua applicazione biologica prevista oltre ai parametri della sua fabbricazione. In questo protocollo, il bagno di isopropanolo per condensazione è stato impostato a -15 a -17 °C (Step 4.7.1 e Step 4.13) mentre altri protocolli hanno utilizzato -10 °C 5,6. Anche con un nucleo di decafluorobutano comune, la temperatura di condensazione può variare a seconda della composizione dell'eccipiente, della concentrazione lipidica totale e della composizione del guscio lipidico. Se si utilizzano altre formulazioni, potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione per garantire una corretta condensa delle goccioline senza causare il congelamento della soluzione.
Poiché le goccioline sono più piccole e più stabili del loro precursore di microbolle7,possono sfruttare meglio i meccanismi di accumulo passivo per stravasare in alcuni tessuti di interesse, come l'aumento della permeabilità e dell'effetto di ritenzione di alcuni tipi di tumore4,24. Con metodi di rilevamento fluorescenti, otticamente assorbenti e acustici14, è possibile utilizzare una singola formulazione per quantificare l'assorbimento. Inoltre, questa piattaforma può essere utilizzata per indagare se la vaporizzazione acustica delle goccioline può migliorare la frazione dell'agente erogato oltre i livelli passivi16. Per quantificare la biodisponima dell'agente nei tessuti e negli organi di interesse dopo l'iniezione, una quantità nota di goccioline pirolipidiche deve essere iniettata nell'animale, gli ultrasuoni possono o non possono essere applicati a seconda del set di controllo, l'animale deve essere sacrificato un punto temporale pre-specificato e gli organi devono essere rimossi e pesati. Gli organi devono essere omogeneizzati, filtrati, diluiti in tensioattivo (detergente) per decellularizzare il tessuto e quantificati con spettroscopia a fluorescenza o UV-Vis per ottenere percentuali di dose iniettate per massa d'organo in base ai segnali Pyro. Per il passo 5.4.5 (Figura 5) e il passo 5.5.5 (Figura 6), è stato utilizzato il tensioattivo Triton X-100 (detergente) per interrompere i campioni in quanto non è fluorescente a 410 nm e le sue lunghezze d'onda di assorbanza non si sovrappongono a pyro.
Le microbolle non erano caratterizzate da assorbanza UV-Vis. Poiché la sorgente laser dello spettroscopio UV-Vis è parallela al rivelatore, qualsiasi bolla di grandi dimensioni potrebbe disperdere la luce dal rivelatore, facendole apparire più otticamente assorbenti14. A differenza dello spettrofotometro UV-Vis, il rivelatore dello spettrofotometro a fluorescenza è/dovrebbe essere perpendicolare alla sorgente laser per evitare che la sorgente interferisca con il rivelatore. UV-Vis è stato utilizzato per quantificare l'assorbanza dei campioni di goccioline intatti e interrotti (Fase 5.4, Figura 5). Da 300 a 800 nm sono state scelte come lunghezze d'onda di assorbanza in quanto le due principali bande di assorbanza dei piroi lipidi, la banda di Soret (da 340 a 500 nm) e la banda Q (da 640 a 730 nm), rientrano in questo intervallo14. Quando assemblato in una goccia (o in altre strutture supramolecolari), il picco in banda Q del pirolipidio viene spostato verso il rosso da 671 nm a 700 nm (Figura 5). Quando questa struttura supramolecolare viene interrotta da un tensioattivo come Tritone, il picco torna a 671 nm14,15. Sulla base di questo spostamento, è possibile dire se i piro-lipidi sono in uno stato assemblato o in uno stato interrotto. Il rapporto tra i due picchi può essere utilizzato per stimare il decadimento degli assiemi nel tempo.
Per le misure di fluorescenza (Step 5.5, Figura 6), è stata scelta una lunghezza d'onda di eccitazione di 410 nm in quanto corrisponde al picco della banda di Soret per il piro-lipide14non assemblato. È stato selezionato un intervallo di lunghezze d'onda di emissione da 600 a 800 nm poiché i picchi degli assemblaggi intatti in PBS e i pirolipidi interrotti in Triton sono contenuti in questo intervallo. Lo spostamento e l'aumento della fluorescenza (Figura 6) tra i campioni intatti (704 nm in PBS) e interrotti (674 nm in Triton) si sono verificati a causa della tempra indotta dalla struttura. Nella forma assemblata, le molecole piro-lipidiche erano impacchettate strettamente insieme in modo che i fotoni generati fossero assorbiti dalle molecole piro-lipidiche vicine. Ciò è evidente nell'efficienza di spegnimento intatta rispetto a quella interrotta. Pertanto, è necessario diluire i campioni in tensioattivi (detergenti) come 1% Triton X-100 per alleviare la tempra e massimizzare il segnale per la quantificazione della biodistribuendozione14.
Per semplicità, lo stesso trasduttore ad ultrasuoni ad array lineare è stato utilizzato sia per vaporizzare che per l'immagine (Passi 6.5 e 6.7, Figura 7). Questo trasduttore ad ultrasuoni (Table of Materials) era in grado di raggiungere le pressioni negative di picco necessarie per vaporizzare le goccioline8. Riempire un serbatoio con acqua deionizzata da un rubinetto genera gas che si dissolvono nell'acqua (Passo 6.1). Per ridurre al minimo l'interferenza dei gas disciolti nell'acqua con la vaporizzazione e l'imaging, l'acqua è stata riposata per 24 ore nel serbatoio per consentire ai gas nell'acqua di equilibrarsi con l'atmosfera (fase 6.1). In alternativa, l'acqua deionizzata può essere degassata con un contenitore sigillabile di dimensioni sufficientemente dimensionato collegato a un vuoto sufficientemente potente. Le immagini ad ultrasuoni hanno dimostrato che le microbolle sono state condensate con successo poiché le goccioline erano inosservabili / non ecogeniche a basse pressioni (Figura 7B). Fu solo a pressioni di uscita più elevate che le goccioline vaporizzarono in microbolle ecogeniche osservabili (Figura 7D, 7F, 7H). Mentre il campione di goccioline post-condensato contiene micelle e liposomi / vescicole, questi assemblaggi non sono ecogenici e solo le goccioline possono vaporizzare in microbolle ecogeniche. Un controllo PBS è stato fatto scorrere attraverso il fantasma per stabilire immagini di base (Figure 7A, 7C, 7E, 7G). Con l'aumentare della pressione nel PBS, non è stato generato alcun contrasto. Ciò indicava che le alte pressioni del trasduttore non potevano produrre cavitazione spontanea in un mezzo a base d'acqua da solo, e quindi tutti gli altri contrasti generati potevano essere attribuiti all'agente di contrasto ad ultrasuoni impiegato. Se la pressione di uscita è troppo alta, le microbolle generate possono essere distrutte. Aumentando in modo incrementale la pressione e osservando il contrasto generato, la pressione ottimale può essere trovata8. L'emivita di circolazione delle goccioline può essere determinata in modo simile vaporizzando le goccioline sono determinati intervalli di tempo e osservando il contrasto generato nel tempo7.
In sintesi, con il metodo di condensazione sono state create goccioline multimodali a cambiamento di fase con contenuto piro-lipidico variabile. Il dimensionamento ha mostrato che c'era un compromesso tra il carico piro-lipidico e la concentrazione di microbolle / goccioline. Le caratterizzazioni hanno mostrato che c'erano differenze nelle forme intatte e interrotte sia nell'assorbanza che nella fluorescenza. L'imaging ad ultrasuoni ha mostrato che le goccioline non erano ecogeniche a 37 °C ed erano vaporizzabili in microbolle ecogeniche a pressioni sufficienti. Le caratterizzazioni hanno anche mostrato il potenziale delle goccioline piro-lipidiche per sostituire gli agenti diagnostici di accompagnamento per la biodispressione delle goccioline o i test di accumulo. Il lavoro futuro studierà le soglie di vaporizzazione in soluzione, la stabilità in soluzione e le durate di circolazione in vivo nei topi nudi.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Brandon Helfield per aver contribuito a costruire lo scambiatore di gas e il Dr. Miffy Hok Yan Cheng per le discussioni tecniche. Gli autori desiderano ringraziare le seguenti fonti di finanziamento: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute e Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
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