Summary
In diesem Protokoll werden Methoden zur Synthese und Charakterisierung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen beschrieben.
Abstract
Phasenwechseltröpfchen sind eine Klasse von Ultraschallkontrastmitteln, die sich bei Anwendung ausreichender akustischer Energie in echogene Mikroblasen in situ umwandeln können. Tröpfchen sind kleiner und stabiler als ihre Mikroblasen-Gegenstücke. Herkömmliche Ultraschallkontrastmittel sind jedoch nicht über akustische Rückkopplungsmessungen hinaus verfolgbar, was die Quantifizierung der Bioverteilung oder Akkumulation von Kontrastmitteln ex vivo erschwert. Forscher müssen sich möglicherweise auf fluoreszierende oder optisch absorbierende diagnostische Begleitpartikel verlassen, um auf die Bioverteilung zu schließen. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Schritte zur Erstellung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen mit einer Kondensationsmethode detailliert zu beschreiben. Porphyrine sind fluoreszierende Moleküle mit unterschiedlichen Absorptionsbändern, die auf Lipide konjugiert und in Tröpfchen eingebaut werden können, um die Vielseitigkeit der Tröpfchen zu erweitern und eine robustere Bioverteilung zu ermöglichen und gleichzeitig die akustischen Eigenschaften beizubehalten. Sieben Formulierungen mit unterschiedlichen Porphyrin-Lipid- und Basenlipidgehalten wurden hergestellt, um Mikroblasen- und Tröpfchengrößenverteilungen zu untersuchen. Charakterisierungen, die für porphyrinhaltige Strukturen geeignet sind, werden ebenfalls im Protokoll beschrieben, um ihre analytische Vielseitigkeit in lösungshaltig zu demonstrieren. Die Dimensionierung zeigte, dass die nachkondensierten mittleren Durchmesser 1,72 bis 2,38 Mal kleiner waren als die Vorläuferpopulationen. Die Absorptionscharakterisierung zeigte, dass intakte Baugruppen einen Q-Band-Peak von 700 nm aufwiesen, während gestörte Proben einen Absorptionspeak bei 671 nm aufwiesen. Die Fluoreszenzcharakterisierung zeigte, dass intakte 30% Porphyrin-Lipid-Anordnungen fluoreszierend abgeschreckt wurden (>97%), wobei die Fluoreszenzrückgewinnung bei Störung erreicht wurde. Die akustische Verdampfung zeigte, dass Porphyrintröpfchen bei niedrigeren Drücken nicht echogen waren und bei ausreichenden Drücken in echogene Mikroblasen umgewandelt werden konnten. Diese Charakterisierungen zeigen das Potenzial für Porphyrintröpfchen, die Notwendigkeit von Absorptions- oder fluoreszenzbasierten begleitenden diagnostischen Strategien zur Quantifizierung der Bioverteilung von Ultraschallkontrastmitteln für die Verabreichung oder therapeutische Anwendungen in vivo oder ex vivozu eliminieren.
Introduction
Ultraschallbildgebung ist eine nicht-invasive, nichtionisierende Form der medizinischen Bildgebung, die akustische Wellen nutzt. Während Ultraschallgeräte tragbarer sind und Echtzeitbilder liefern können, kann die Ultraschallbildgebung unter einem geringen Kontrast leiden, was es für Sonographen schwierig macht, ähnlich echogene pathologische Merkmale zuverlässig zu unterscheiden. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, können Mikroblasen in den Wirt injiziert werden, um den Gefäßkontrast zu verbessern. Mikroblasen sind mikrometergroße gasgefüllte Kontrastmittel, die sehr echogen zu akustischen Wellen sind und einen verbesserten Gefäßkontrast1,2bieten können. Die Schalen und Gaskerne von Mikroblasen können für verschiedene Anwendungen wie Bildgebung, Thrombolyse, Zellmembranpermeabilisierung oder transiente Gefäßöffnung angepasst werden2.
Ein Nachteil von Mikroblasen ist ihre kurze Zirkulationshalbwertszeiten. Zum Beispiel haben klinisch verfügbare Perflutren-Lipid-Mikrosphären nur eine Halbwertszeit von 1,3 Minuten3. Für lange Bildgebungssitzungen sind mehrere Injektionen von Mikroblasen erforderlich. Ein weiterer Nachteil von Mikroblasen sind ihre großen Durchmesser. Während Perflutren-Lipid-Mikrosphären etwa 1 bis 3 μm Durchmesser haben, klein genug, um in Gefäßen zu zirkulieren, sind sie zu groß, um zu extravasieren und sich passiv in interessanten Geweben wie Tumorenanzusammeln 4. Eine Strategie, um diese Einschränkungen zu überwinden, besteht darin, die Gaskern-Mikroblasen zu kleineren Flüssigkerntröpfchen zu kondensieren5,6. Während Tröpfchen in ihrem flüssigen Zustand nicht echogen sind, können sie bei Ultraschall mit ausreichend hohem Spitzenunterdruck zu Mikroblasen verdampft werden, wodurch ihre Fähigkeit, Kontrast zu liefern, wiedererlangt wird. Dies ermöglicht es dem Tröpfchen, die günstigere Pharmakokinetik eines kleinen Flüssigkeitskerns zu nutzen, während die Fähigkeit erhalten bleibt, Kontrast zu liefern, wenn er insoniert ist und ohne die chemische Zusammensetzung zu verändern4,7.
Decafluorbutan ist eine ideale Perfluorkohlenstoffverbindung zur Phasenverschiebung zwischen gasförmigen und flüssigenZuständen5,6,7. Decafluorbutan ermöglicht die Kondensation von Mikroblasen zu Tröpfchen mit Temperaturreduktion allein, während weniger dichte Perfluorkohlenwasserstoffe eine zusätzliche Druckbeauftauung erfordern5. Dieses schonende Verfahren minimiert die Zerstörung von Blasen während der Kondensation7,8,9. Da ihre Kerne flüssig sind, sind Tröpfchen nicht echogen und für Ultraschall unsichtbar. Bei Anwendung ausreichender akustischer oder thermischer Energie können die Flüssigkeitskerne jedoch wieder in einen gasförmigen Zustand verdampfen und echogene Mikroblasen erzeugen8. Diese Verdampfung ermöglicht die Kontrolle darüber, wann und wo Mikroblasen erzeugt werden sollen.
Während Tröpfchen für die passive Akkumulation, In-situ-Verdampfung oder Verbesserung der Zellpermeabilität4nützlich sind, können Tröpfchen (und ihre Fragmente) ex vivonicht abgebildet oder quantifiziert werden. Daher werden quantifizierbare Begleitdiagnostika, wie fluoreszierende4,10,11,magnetische Partikel12,optisch absorbierende Mittel13,als Analogon verwendet, um die Tröpfchenabgabe an gewebe von Interesse zu messen. Zum Beispiel verwendeten Helfield et al. eine Co-Injektion von fluoreszierenden Nanoperlen zur histologischen Bildquantifizierung von Mausorganen, da Tröpfchen nicht fluoreszierend nachgewiesen werden konnten4. Der Nachteil von Begleitdiagnostika besteht darin, dass die verfolgbare Komponente abhängig von ihrem individuellen pharmakokinetischen Profil unabhängig vom Tröpfchen wirken kann.
Glücklicherweise kann die Hülle aus Mikroblasen und Tröpfchen angepasst werden. Zum Beispiel demonstrierten Huynh et al. Ultraschallkontrastmittel mit Porphyrin-Lipid-Schalen, wodurch multimodale Mikroblasen erzeugt wurden14. Porphyrine sind eine Klasse organischer Verbindungen mit einer aromatischen Makrozyllstruktur14,15. Sie sind optisch absorbierend, fluoreszierend und können zu einer Vielzahl von Metallen für die Strahlentherapie, radionuklidbasierte Bildgebung oder spurenmetallbasierte Quantifizierung chelatisiert werden14. Ein Beispiel für Porphyrin ist Pyropheophorbid (Pyro). Durch die Konjugation von Pyro auf Lipide und die Einarbeitung von Pyro-Lipiden in Mikroblasen oder Tröpfchen können sie durch mehrere Modalitäten abgebildet und verfolgt werden: akustisch, fluoreszierend und durch Absorption14. Dieses multimodale Kontrastmittel könnte verwendet werden, um die Akkumulation zu verfolgen und zu quantifizieren. Dies könnte die Notwendigkeit von Begleitdiagnostika eliminieren, da die quantifizierbare Komponente jetzt auf die Schale konjugiert ist, was eine genauere Lieferquantifizierung ermöglicht16.
Hierin wird ein Protokoll zur Erstellung multimodaler Phasenwechsel-Porphyrintröpfchen beschrieben. Da Ultraschallkontrastmittel als Plattform für die Verabreichung von Medikamenten an interessante Gewebe wie Tumore2,4verwendet werden können, könnte sich die Erweiterung ihrer Nachweisbarkeit über den Ultraschall hinaus als nützlich für die Quantifizierung der Wirksamkeit der Verabreichung erweisen. Der Zweck dieser Tröpfchen besteht darin, verfolgbare Ultraschallkontrastmittel bereitzustellen, die in der Lage sind, passive Akkumulation in vivo, In-situ-Verdampfung und Akustik zu erzeugen und die Bioverteilung oder Akkumulation von Ex-vivo-Organen zu quantifizieren, ohne auf sekundäre Sensoren angewiesen zu sein. Charakterisierungsmethoden werden auch beschrieben, um das Potenzial von Porphyrintröpfchen als Bioverteilungssensoren aufzuzeigen. Die Auswirkungen der Pyro-Lipid-Belastung in der Schale (0% bis 50% durch molares Verhältnis) werden ebenfalls diskutiert.
Protocol
1. Dehydrierte Lipidfilme
- Berechnen Sie die Massen jeder der benötigten Schalenkomponenten (siehe Zusatzdatei "Lipid Formula Sheet").
HINWEIS: Für dieses Protokoll ist die Schalenzusammensetzung: 10 molare % 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglykol)-5000] Ammoniumsalz (DSPE-PEG5K), x molare % Pyropheophorbid konjugiertes 1-Stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholin (Pyro-SPC) und (90 - x)molare % 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phospopholin (DSPC). Die Menge an Pyro-SPC wird über 7 Schalenzusammensetzungen variiert (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Überprüfen Sie das Molekulargewicht von DSPE-PEG5K auf der Vorratsflasche.- Skalieren Sie das Protokoll auf ein beliebiges Lipidvolumen mit einem Mindestvolumen von 1 ml. Für dieses Protokoll wurde für alle Formulierungen ein Gesamtlipidvolumen von 10 ml mit einer Gesamtlipidkonzentration von 1 mg pro ml verwendet. Die Hilfsstofflösung ist: 10% Propylenglykol, 10% Glycerin und 80% Phosphatpuffersalzlösung (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v / v / v) (siehe Schritt 2.3 und "Lipid Formula Sheet").
HINWEIS: Das Syntheseprotokoll von Pyrolipiden ist in der Ergänzungsdatei "Andere Protokolle und Daten" Schritte S1 bis S1.19 beschrieben, die von der Arbeit von Zheng et al.15modifiziert wurde.
- Skalieren Sie das Protokoll auf ein beliebiges Lipidvolumen mit einem Mindestvolumen von 1 ml. Für dieses Protokoll wurde für alle Formulierungen ein Gesamtlipidvolumen von 10 ml mit einer Gesamtlipidkonzentration von 1 mg pro ml verwendet. Die Hilfsstofflösung ist: 10% Propylenglykol, 10% Glycerin und 80% Phosphatpuffersalzlösung (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v / v / v) (siehe Schritt 2.3 und "Lipid Formula Sheet").
- Anhand der berechneten Massen (siehe Schritt 1.1 und "Lipid Formula Sheet") werden die einzelnen Nicht-Pyro-Lipide abgewogen und auf eine ausreichend große Borosilikatglasfläschchen mit Schraubverschluss übertragen.
- Verschließen Sie die Durchstechflasche, beschriften Sie die Kappe und die Durchstechflasche und bedecken Sie den Boden und die Wände der Lipidfläschchen mit Aluminiumfolie. Diese Durchstechflasche wird für den Rest des Protokolls als "Lipid-Fläschchen" bezeichnet. Lagern Sie das LipidFläschchen in einem kühlen, trockenen, dunklen Bereich.
- Wenn die Formulierung Pyro-SPC enthält, lösen Sie 10 mg Pyro-SPC-Trockenfilm (siehe "Andere Protokolle und Daten") in 1 ml Chloroform. Wirbel für 5 s, messen Sie die Absorption und berechnen Sie das geeignete Volumen, das der Lipid-Durchstechflasche hinzugefügt werden soll.
VORSICHT:Chloroform ist gesundheitsgefährdend, reizend und giftig. Tragen Sie einen schützenden Labormantel, Augenschutz, Handschuhe und vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen.
HINWEIS: Da Pyro-SPC lichtempfindlich ist, reduzieren Sie die Lichter im Arbeitsbereich nach Möglichkeit beim Umgang mit Pyro-SPC. Bewahren Sie Pyro-SPC versiegelt und abgedeckt auf, wenn Sie es nicht verwenden.- Stellen Sie es auf dem ultraviolett-sichtbaren Spektralphotometer so ein, dass es die Absorption aus einem Wellenlängenbereich von 800 nm bis 300 nm mit Schritten von 0,5 nm misst und eine Baseline mit 2000 μL reinem Methanol in einer kompatiblen 1 cm Pfadlängenküvette misst.
VORSICHT:Methanol ist gesundheitsgefährdend, reizend, giftig und brennbar. Tragen Sie einen schützenden Labormantel, Augenschutz, Handschuhe und vermeiden Sie das Einatmen von Dämpfen. Von Funken und Hitze fernhalten. - 2 μL pyro-SPC in Chloroform in 2000 μL Methanol und Wirbel für 30 s hinzufügen. In eine saubere, kompatible 1 cm Küvette überführen und die Absorption messen. Passen Sie diesen Verdünnungsfaktor an, wenn die Absorption bei 667 nm außerhalb des Absorptionsbereichs des ultraviolett sichtbaren Spektralphotometers liegt.
HINWEIS: Verwenden Sie beim Übertragen von Chloroform oder Methanol eine saubere Glasspritze oder eine Verdrängerpipette anstelle einer mechanischen Pipette, um eine bessere Genauigkeit zu erzielen. - Wiederholen Sie Schritt 1.4.2 noch zwei weitere Male, um dreifache Absorptionswerte zu erhalten.
- Mittelung der Absorptionsspitzenwerte bei 667 nm und Berechnung des Volumens von Pyro-SPC in Chloroform, das für die Lipidfläschchen14,15benötigtwird,mit der folgenden Gleichung:
wobei V das Volumen von Pyro-SPC in Chloroform ist, m die erforderliche Masse von Pyro-SPC (siehe Schritt 1.1 und "Lipid Formula Sheet"), M das Molekulargewicht von Pyro-SPC bei 1040,317 g·mol-1, A die gemittelte Absorptionsstärke bei 667 nm, d der Verdünnungsfaktor basierend auf Methanol und Pyro-SPC in Chloroformvolumina (Schritt 1.4.2), L ist die Küvettenweglänge bei 1 cm, und ε ist 667 nm molarer Dämpfungskoeffizient von Pyro-SPC bei 45000 L·mol-1·cm-1.
HINWEIS: Der Nenner der Gleichung ist das Beer-Lambert-Gesetz, das die Konzentration eines Analyten in Lösung mit der gemessenen optischen Absorption über eine Entfernung in Beziehung setzt. - Fügen Sie das berechnete Volumen von Pyro-SPC in Chloroform aus dem vorherigen Schritt mit einer Reinglasspritze in die Lipid-Durchstechflasche hinzu (Abbildung 1A) und bedecken Sie dann die Durchstechflasche.
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt nur die 30% Pyro-Lipid-Formulierung. - Wenn Pyro-SPC in Chloroform übrig bleibt: Entkappen Sie in einem Abzug die Pyro-SPC + Chloroform-Durchstechflasche aus Schritt 1.4, neigen Sie die Durchstechflasche teilweise zur Seite und strömen Sie kontinuierlich Stickstoffgas so sanft wie möglich in die Pyro-SPC / Chloroform-Durchstechflasche. Drehen Sie die Durchstechflasche, um die Chloroform mit dem Stickstoffgasstrom auszutrocknen und den Pyro-SPC gleichmäßig auf die Innenwand der Durchstechflasche zu beschichten, während sie trocknet. Stellen Sie sicher, dass keine Spritzer gemacht werden und keine lösung herausfällt.
- Sobald der Pyro-SPC-Lipidfilm trocken erscheint und auf die Wand der Durchstechflasche aufgezogen ist, schalten Sie den Stickstoffgasstrom aus. Verschließen Sie die Durchstechflasche, verschließen Sie den Hals der Durchstechflasche mit Wachsfolie und lagern Sie die Durchstechflasche bei -20 °C und im Dunkeln.
- Stellen Sie es auf dem ultraviolett-sichtbaren Spektralphotometer so ein, dass es die Absorption aus einem Wellenlängenbereich von 800 nm bis 300 nm mit Schritten von 0,5 nm misst und eine Baseline mit 2000 μL reinem Methanol in einer kompatiblen 1 cm Pfadlängenküvette misst.
- Bereiten Sie eine Lösung aus 90% Chloroform und 10% Methanol (% v / v) vor und fügen Sie 5 ml davon in die Lipid-Durchstechflasche hinzu. Die Lipid-Durchstechflasche verschließen und vorsichtig schwenken, um den Inhalt zu homogenisieren (Abbildung 1B).
HINWEIS: Wenn die Formulierung Phosphatidsäurelipide (wie 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphat-Natriumsalz (DSPA)) enthält, fügen Sie stattdessen 60% Chloroform, 32% Methanol und 8% doppelt entionisiertes Wasser (% v / v / v) zur Lipid-Durchstechflasche hinzu. Ein intensiveres Wirbeln kann notwendig sein, um den Lipidgehalt vollständig aufzulösen. - Entkappen Sie in einem Abzug die Lipid-Durchstechflasche, neigen Sie die Lipid-Durchstechflasche teilweise zur Seite und strömen Sie kontinuierlich Stickstoffgas so sanft wie möglich in die Lipid-Durchstechflasche. Drehen Sie die Lipid-Durchstechflasche, um die Lösung mit dem Stickstoffgasstrom auszutrocknen, und beschichten Sie den Lipidfilm gleichmäßig auf die Innenwand der Lipid-Durchstechflasche, während sie trocknet. Stellen Sie sicher, dass keine Spritzer gemacht werden und keine lösung herausfällt.
- Sobald die Lipide trocken erscheinen und auf die Innenwände der Lipidfläschchen beschichtet sind (Abbildung 1C), schalten Sie den Stickstoffgasstrom aus, bedecken Sie den Boden und die Wand der Lipidfläschchen mit Aluminiumfolie und bedecken Sie die obere Öffnung mit Aluminiumfolie, die mit einigen Löchern gestochen wird, mit einer Nadel zum Entlüften (Abbildung 1D).
- Beschriften und legen Sie die abgedeckte Lipidfläschchen in einen Vakuumaussauger und lassen Sie die Lipide mindestens 24 h, aber nicht mehr als 72 h weiter trocknen.
HINWEIS: Das Protokoll kann später nach 24 bis 72 h wieder aufgenommen werden.
2. Lipidhydratation
- Füllen Sie einen Badschallator mit Wasser und erhitzen Sie ihn auf 70 °C. Schalten Sie die Beschallung ein, um das Wasser zu mischen.
ACHTUNG:Das Wasser und der Ultraschallator sind bei hohen Temperaturen. Vermeiden Sie es, das Wasser und den Ultraschall zu berühren. Tragen Sie Augenschutz, einen schützenden Laborkittel und Schutzhandschuhe. - Sobald der Badbeschallungsator 70 °C erreicht hat, entfernen Sie die Lipidfläschchen aus dem Vakuumaussauger. Reduzieren Sie die Lichter im Arbeitsbereich, wenn möglich.
- Bereiten Sie eine Hilfsstofflösung aus 10% Propylenglykol, 10% Glycerin, 80% PBS (% v / v / v) vor und fügen Sie 10 ml davon in die Lipidfläschchen hinzu (siehe Schritt 1.1.1 und "Lipid Formula Sheet").
HINWEIS: Wenn Sie eine Standard-Luftverdrängungspipette verwenden, sollten Sie beim Umgang mit viskosen Lösungsmitteln wie Propylenglykol und Glycerin vorsichtig sein. Saugen und tauchen Sie das Volumen langsam ab und warten Sie, bis das Restvolumen den Boden der Pipettenspitze erreicht hat. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit nicht an der Außenseite der Pipettenspitze haften, wenn Sie Volumina durch langsames Bewegen übertragen. - Verschließen Sie die Lipidfläschchen, entfernen Sie die Aluminiumabdeckung und schwenken Sie die Durchstechflasche vorsichtig im Badbeschallungsator für 15 Minuten, während die Beschallung eingeschaltet ist, um die Lipide aufzulösen. Stellen Sie sicher, dass sich der Hals des LipidFläschchens über dem Wasser befindet. Überprüfen Sie gelegentlich, ob die Durchstechflaschenkappe sicher verschlossen ist.
- Gelegentlich das LipidFläschchen aus dem Wasserbad nehmen. Halten Sie es kurz an die Leuchte, um zu überprüfen, ob der Inhalt vollständig aufgelöst ist (Abbildung 1E).
- Wenn der Inhalt der Lipidfläschchen nicht homogenisiert ist, entfernen Sie die Lipidfläschchen aus dem Badschallator. Sichern Sie die Kappe, schwenken Sie sie aggressiver und bringen Sie sie zum Badschallator zurück.
- Entfernen Sie die Lipid-Durchstechflasche aus dem Badbeschallungsator, und schalten Sie den Badbeschallungsator aus. Trocknen Sie die Lipid-Fläschchen außen mit Papiertüchern und beschriften Sie die Lipid-Durchstechflasche neu.
- Decken Sie die Lipid-Durchstechflasche mit Aluminiumfolie ab und kühlen Sie die Lipid-Durchstechflasche bei Raumtemperatur in einem kühlen, dunklen, trockenen Bereich für 10 Minuten.
- Aliquot die Lipid-Fläschchen Inhalt: ca. 2 mL der Lipidlösung in 3 mL Borosilikatglas klare Serumfläschchen (7 mm innen Munddurchmesser, 13 mm äußerer Munddurchmesser).
HINWEIS: Einige Protokolle können 1,5 ml Lipidlösung in der 3-ml-Durchstechflasche7verwenden. - Schließen Sie die Serumfläschchen mit grauen Chlorbutylkautschukstopfen im Stil der Lyophilisierung (7 mm Mundinnendurchmesser, 13 mm Außenmunddurchmesser) ab und befestigen Sie den Gummistopfen mit abreißenden Aluminiumdichtungen (13 mm Außenmunddurchmesser) und einem Crimper(Abbildung 1F).
- Vakuumieren, entgasen und drücken Sie die Lipidlösung in jeder der Serumfläschchen4,5,7 (Abbildung 2).
HINWEIS: Unter "Andere Protokolle und Daten" finden Sie Anweisungen zum Zusammenbau des Gasaustauschers und weitere Details.- Schließen Sie jedes Ventil zwischen und einschließlich Druckventil A und Gasflaschenventil (Abbildung 2). Schließen Sie die Serumfläschchen an die Verteilernadeln an, öffnen Sie dann die entsprechenden Verteilerventile, öffnen Sie dann das Vakuumventil A und das Vakuumventil B und saugen Sie bei -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) für 5 minuten, um atmosphärische Luft zu entfernen. Saugen Sie keine Flüssigkeit ab (siehe "Andere Protokolle und Daten" Schritte S3 bis S3.1.5).
ACHTUNG:Die Vakuumpumpe kann bei falscher Handhabung platzen. Verwenden Sie die Vakuumpumpe nicht mit organischen, sauren oder basischen Chemikalien. - Halten Sie bei eingeschaltetem Vakuum ein Serumfläschchen (um zu verhindern, dass es schwingt) und klopfen Sie schnell mit einem Stift oder Marker darauf, um zu entgasen. Klopfen Sie weiter, bis sich keine Blasen bilden und sich keine Blasen in der Durchstechflasche befinden. Lassen Sie KEINE Flüssigkeit aussaugen. Halten Sie das Tippen bei Bedarf an. Wiederholen Sie den Vorgang für alle angeschlossenen Serumfläschchen. Schließen Sie nach der Entgasung aller Serumfläschchen Vakuumventil A und Vakuumventil B und SCHALTEN Sie die Vakuumpumpe aus (siehe "Andere Protokolle und Daten" Schritte S3.2 bis S3.2.3).
- Wenn die Serumdurchstechflasche noch mit der Nadel verbunden ist und die Vakuumpumpe ausgeschaltet ist, drehen Sie langsam das Gasflaschenventil 1/16 bis 1/8 (ca. 22,5 bis 45 ° der vollen Umdrehung) gegen den Uhrzeigersinn, um sich teilweise zu öffnen, öffnen Sie dann das T-Handle-Ventil und drehen Sie langsam das Luftreglerventil im Uhrzeigersinn auf 3 psi (20,7 kPa) Spurweite. Öffnen Sie dann Druckventil A und Druckventil B (siehe "Andere Protokolle und Daten" Schritte S3.3 bis S3.3.21).
ACHTUNG:Die Decafluorbutan-Gasflasche steht unter Druck und kann beim Erhitzen explodieren. Vor Hitze und Stößen schützen. Decafluorbutangas kann Sauerstoffverdrängung und Ersticken verursachen. Tragen Sie den richtigen Augenschutz und Griff in einem Abzug. Bei falscher Handhabung ist es möglich, die Gasflasche zu saugen, was zu einer schnellen Druckentzugs- und Implosion führen kann. Das Öffnen des Gasflaschenventils mehr als 1/8 Umdrehung kann den Luftregler beschädigen. - Nach 30 s Druckbeaufschlagung (Messgerät sollte immer noch 3 psi (20,7 kPa) anzeigen), schließen Sie alle Manifold Valves mit Serumfläschchen, trennen Sie die Serumfläschchen, manteln Sie die Nadeln und SCHLIEßEN Sie das Gasflaschenventil.
- Entlasten Sie den aufgebauten Druck, indem Sie ein einzelnes Verteilerventil teilweise öffnen, bis die Luftreglernadel in ihre Ruheposition gelangt. Schließen Sie dann alles zwischen und einschließlich der Krümmerventile und des T-Handles.
- Schließen Sie jedes Ventil zwischen und einschließlich Druckventil A und Gasflaschenventil (Abbildung 2). Schließen Sie die Serumfläschchen an die Verteilernadeln an, öffnen Sie dann die entsprechenden Verteilerventile, öffnen Sie dann das Vakuumventil A und das Vakuumventil B und saugen Sie bei -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) für 5 minuten, um atmosphärische Luft zu entfernen. Saugen Sie keine Flüssigkeit ab (siehe "Andere Protokolle und Daten" Schritte S3 bis S3.1.5).
- Serumfläschchen etikettieren und bei 4 °C und im Dunkeln lagern. Stellen Sie sicher, dass alle Gasaustauscherventile geschlossen sind und die Vakuumpumpe anschließend ausgeschaltet ist.
HINWEIS: Das Serum sollte in diesem Zustand bis zu 4 Monate stabil sein. In diesem Schritt kann das Protokoll später, nach höchstens 4 Monaten, wieder aufgenommen werden.
3. Decafluorbutan-Fläschchen
- Mit sauberen, leeren 3 mL Borosilikatglas-Klarserumfläschchen (7 mm Mundinnendurchmesser, 13 mm Außenmunddurchmesser) verschließen Sie diese mit grauen Chlorbutylgummi-Stopfen im Lyophilisierungsstil (7 mm Mundinnendurchmesser, 13 mm Außenmunddurchmesser) und befestigen den Gummistopfen mit abreißenden Aluminiumdichtungen (13 mm Außenmunddurchmesser) und einem Crimper4. 7,8.
- Folgen Sie Schritt 2.9.1, um die atmosphärische Luft abzusaugen (siehe "Andere Protokolle und Daten" Schritte S3.1 bis S3.1.5).
- Überspringen Sie die Entgasung und führen Sie die Schritte 2.9.3 bis 2.9.5 aus, um die Durchstechflasche erneut unter Druck zu halten (siehe "Andere Protokolle und Daten" Schritte S3.3 bis S3.3.21).
- Die Decafluorbutan-Fläschchen etikettieren und bei 4 °C und im Dunkeln lagern. Stellen Sie sicher, dass alle Gasaustauscherventile geschlossen sind und die Vakuumpumpe anschließend ausgeschaltet ist.
HINWEIS: Serumfläschchen, die mit Decafluorbutangas gefüllt sind, werden für die Tröpfchenkondensation benötigt. Sie sollten in diesem Zustand bis zu 4 Monate stabil sein. In diesem Schritt kann das Protokoll später, nach höchstens 4 Monaten, wieder aufgenommen werden.
4. Tröpfchenbildung
- Entfernen Sie eine hydratisierte Lipidlösung in der Serumdurchstechflasche (aus Schritt 2.10) aus dem Kühlschrank.
- Entfernen Sie mit einem Decapper die Aluminiumdichtung auf der Serumdurchstechflasche und übertragen Sie 1 ml der Lipidlösung auf eine 1,85 ml Borosilikatglas-Probenfläschchen (mit einem phenolischen Schraubverschluss), indem Sie die Lipidlösung die Innenwand hinunterfließen lassen. Erstellen Sie keine Blasen.
- Wenn sich in der Serumfläschchen noch eine Lipidlösung befindet, führen Sie die Schritte 2.9 bis 2.10 aus, um die Serumfläschchen zur Lagerung zu entgasen und erneut unter Druck zu halten (siehe "Andere Protokolle und Daten" Schritte S3 bis S3.3.21).
- Mit der 1,85-ml-Probendurchstechflasche können Sie mithilfe des Gasaustauschers vorsichtig Decafluorbutangas in den Kopfraum der Probenfläschchen einfließen lassen (siehe Abbildung 2 für die spezifischen Ventilnamen).
- Stellen Sie sicher, dass alle Ventile am Gasaustauscher ordnungsgemäß geschlossen und die Pumpe ausgeschaltet ist.
ACHTUNG:Bei falscher Durchführung ist es möglich, die Gasflasche abzusaugen, was zu einer schnellen Dekompression und Implosion führt. - Öffnen Sie ein Verteilerventil und entfernen Sie vorsichtig die entsprechende Nadel aus dem Verteiler.
ACHTUNG:Scharfer Gegenstand, Kontakt / Piercing vermeiden. - Öffnen Sie Druckventil A und Druckventil B und drehen Sie das Gasflaschenventil 1/16 auf 1/8 (ca. 22,5 bis 45 ° der vollen Umdrehung) gegen den Uhrzeigersinn, um das T-Handle-Ventil teilweise zu öffnen und dann zu öffnen.
ACHTUNG:Öffnen Sie das Gasflaschenventil nicht mehr als dies, da dies zu Schäden am Luftregler führen könnte. - Entkappen Sie die Probendurchstechflasche mit der Lipidlösung und bewegen Sie sie so, dass sich die Manifold-Nadel über der Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle in der Durchstechflasche befindet. Halten Sie die Durchstechflasche dort.
-
Drehen Sie das Luftreglerventil LANGSAM im Uhrzeigersinn, bis sich die Luftreglernadel leicht aus ihrer Ruheposition bewegt und Perfluorkohlenstoffgas sanft aus der Verteilernadel fließt. Lassen Sie das Perfluorkohlenstoffgas 30 s lang sanft in den Kopfraum der Durchstechflasche fließen. Erstellen Sie keine Blasen. Stellen Sie bei Bedarf das Luftreglerventil ein.
HINWEIS: Die Flüssigkeit-Luft-Schnittstelle sollte durch den Decafluorbutan-Gasstrom leicht gestört werden. Da das System jetzt geöffnet ist, kann das Luftreglermessgerät den Druck nicht richtig ablesen. - Nach 30 s die Probenfläschchen vorsichtig und schnell verschließen, ohne die Durchstechflasche zu sehr zu bewegen.
- Schließen Sie das Gasflaschenventil (im Uhrzeigersinn), das T-Handle-Ventil, das Luftreglerventil (gegen den Uhrzeigersinn), das Druckventil A, das Druckventil B und das Verteilerventil.
- Manteln Sie die Nadel vorsichtig um.
- Beschriften Sie die Probenfläschchen und versiegeln Sie den Hals mit Wachsfolie im Uhrzeigersinn(Abbildung 3A und 3B).
HINWEIS: Die Abbildungen 3B bis 3F zeigen nur die 30% Pyro-Lipid-Formulierung.
- Stellen Sie sicher, dass alle Ventile am Gasaustauscher ordnungsgemäß geschlossen und die Pumpe ausgeschaltet ist.
- Lagern Sie die Probenfläschchen im Dunkeln und bei 4 °C für mindestens 10 min oder bis zu 24 h.
HINWEIS: In diesem Schritt kann das Protokoll später, höchstens 24 Stunden, wieder aufgenommen werden. - Legen Sie etwa 100 g Trockeneis (Kohlendioxid) in einen isolierten Behälter und legen Sie normales Eis in einen anderen isolierten Behälter. Holen Sie sich die in Schritt 3 genannten vorbereiteten Decafluorbutan-Serumfläschchen, zwei 3,81 cm (1,5 Zoll) 20-Gauge-Nadeln, eine 1-ml-Kunststoffspritze (den Kolben vor Gebrauch lösen), einen 200-ml-Behälter, eine Metallzange und ein Thermometer (-20 bis 100 °C).
HINWEIS: Wenn Sie nur Mikroblasen herstellen, sind Isopropanol, Trockeneis und Eis nicht erforderlich. - Legen Sie die Probendurchstechflasche mit der Lipidlösung in das mechanische Rührwerk und rühren Sie für 45 s (Abbildung 3C).
- Stellen Sie nach dem mechanischen Rühren die Probendurchstechflasche rechts nach oben, abgeschirmt vor Licht, und starten Sie einen 15-minütigen Countdown, um die Durchstechflasche abzukühlen und die Größe auszuwählen - wählen Sie die Mikroblasen8,17.
- Wenn der 15-minütige Countdown 10 Minuten erreicht hat (5 Minuten noch auf dem Countdown), füllen Sie einen Behälter mit etwa 200 ml Isopropanol und kühlen Sie ihn mit Trockeneis mit einer Metallzange auf -20 °C ab.
HINWEIS: Die Zieltemperatur beträgt -15 bis -17 °C, aber das Isopropanol erwärmt sich während der Handhabung der Mikroblasen.
ACHTUNG:Isopropanol ist brennbar. Von Hitze und Funken fernhalten. Trockeneis kann Hautschäden verursachen. Griff mit Zange. Tragen Sie Handschuhe, Augenschutz und einen schützenden Laborkittel.
- Wenn der 15-minütige Countdown 10 Minuten erreicht hat (5 Minuten noch auf dem Countdown), füllen Sie einen Behälter mit etwa 200 ml Isopropanol und kühlen Sie ihn mit Trockeneis mit einer Metallzange auf -20 °C ab.
- Nachdem die Mikroblasen 15 Minuten lang die Größe ausgewählt haben, suchen Sie in der Beispielfläschchen nach der größesgewählten Partition (Abbildung 3D).
- Halten Sie die Probendurchstechflasche rechts nach oben, entkappen Sie die Probendurchstechflasche vorsichtig und ziehen Sie etwa 0,7 ml der unteren Trennwand mit einer 1,5-Zoll-20-Gauge-Nadel, die an einer 1-ml-Kunststoffspritze befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass keine der obersten Partitionen zurückgezogen wird. Bewegen Sie die Spritze nicht, um Lufteinschlüsse zu entfernen.
- Führen Sie eine andere 20-Gauge-Nadel in eine Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche ein (halten Sie die Nadel in der Nähe der Oberseite der Serumdurchstechflasche), um die Nadel / Spritze zu entlüften, und führen Sie dann die Nadel / Spritze mit den von der Größe ausgewählten Mikroblasen ein.
- Übertragen Sie langsam die von der Größe ausgewählten Mikroblasen. Neigen Sie die Durchstechflasche und winkeln Sie die Spritze an, damit die Flüssigkeit die Innenwand der Decafluorbutan-Serumdurchstechflasche hinuntergleiten kann.
- Sobald die gesamte von der Größe ausgewählte Mikroblasenlösung übertragen wurde, entfernen Sie die Nadel mit der Spritze, halten Sie die Entlüftungsnadel jedoch ein, um den Unterdruck zu entlasten (Abbildung 3E).
- Wenn Sie nur von der Größe ausgewählte Mikroblasen erstellen, hören Sie hier auf. Halten Sie die Entlüftungsnadel in und in der Nähe der Oberseite. Bewahren Sie die Durchstechflasche im Dunkeln und bei Raumtemperatur auf.
- Fügen Sie dem Isopropanolbad kleine Mengen Trockeneis oder Isopropanol bei Raumtemperatur hinzu, um sicherzustellen, dass die Badtemperatur zwischen -15 und -17 °C liegt.
- Legen Sie die Serumfläschchen mit der 20-Gauge-Entlüftungsnadel in der Nähe der Oberseite der Serumdurchstechflasche in das Isopropanolbad, halten Sie den Mikroblasenspiegel unter dem Niveau des Isopropanols, aber des Fläschchenhalses darüber und schwenken Sie die Serumfläschchen zeitweise für 2 Minuten, um die Mikroblasen zu kondensieren.
HINWEIS: Dieser Schritt wurde von der Arbeit von Sheeran et al.6 modifiziert.- Verwirbeln Sie die Serumfläschchen nicht kontinuierlich im Isopropanol und lassen Sie die Lösung nicht einfrieren. Etwa 5 s schwenken und die Serumfläschchen aus dem Isopropanol heben. Überprüfen Sie die Eiskeimbildung und setzen Sie das Wirbeln in Isopropanol fort. Wenn sich Eisbildung abnäht, schwenken Sie die Serumfläschchen in der Luft, bis sie sich auflöst.
- Nach der 2-minütigen Kondensation die Serumdurchstechflasche aus dem Isopropanolbad entfernen und die Entlüftungsnadel entfernen.
HINWEIS: Die Mikroblasen sollten zu Tröpfchen kondensiert worden sein, wie die Änderung der Transluzenz zeigt(Abbildung 3E gegenüber Abbildung 3F für die 30% Pyro-Lipid-Formulierung). - Wischen Sie die Serumdurchstechflasche ab, beschriften Sie sie und legen Sie sie auf normales Eis in einem dunklen, isolierten Behälter, bis sie einsatzbereit ist. Ungeöffnete (intakte Aluminiumdichtung) Tröpfchen sollten in diesem Zustand bis zu 6 h stabil sein, solange das geschmolzene Eis bei Bedarf ausgetauscht wird.
- Wenn Sie gebrauchsfertig sind, entfernen Sie die Aluminiumdichtung mit dem Decapper. Tröpfchen (auch offene Fläschchen) auf Eis und im Dunkeln aufbewahren, während Sie sie nicht verwenden. Bewahren Sie mikrobläschen im Dunkeln und bei Raumtemperatur auf.
5. Morphologische und optische Charakterisierung
- 1% Triton zubereiten durch: 5 mL Triton X-100 in 500 mL PBS (1x, pH 7,4) zugeben und mit einem magnetischen Rührstab homogen bis homogen14 umrühren.
HINWEIS: Triton X-100 sehr viskos. Wenn Sie eine Standard-Luftverdrängungspipette verwenden, sollten Sie bei der Handhabung vorsichtig sein. Saugen und tauchen Sie das Volumen langsam ab und warten Sie, bis das Restvolumen den Boden der Pipette erreicht hat. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit nicht an der Außenseite der Pipettenspitze haften, wenn Sie Volumina durch langsames Bewegen übertragen. - Tröpfchen vorbereiten (Schritt 4). Wenn auch Mikroblasen charakterisiert werden, sammeln Sie vor der Kondensation ein kleines Volumen der von der Größe ausgewählten Mikroblasen (Schritt 4.9).
- Dimensionieren Sie die Mikroblasen oder Tröpfchen auf einem Coulter Counter (CC) von 0,2 bis 6 μm, um Größenverteilungen und Konzentrationen zu erhalten (Abbildung 4).
- Füllen Sie eine saubere 20-ml-Küvette mit 10 ml CC-Elektrolyt, der durch einen 0,2 μm Porenpolyethersulfon-Membranfilter filtriert wurde. Messen Sie es auf dem CC mit drei Läufen, um eine Baseline zu erhalten.
- Im selben CC-Elektrolyten 5 μL Mikroblasen- oder Tröpfchenprobe hinzufügen und vorsichtig mischen.
HINWEIS: Je nachdem, wie konzentriert die Probe ist, können 2 bis 20 μL Probe hinzugefügt werden. - Führen Sie die Probe auf dem CC (3 Durchläufe) aus, subtrahieren Sie die gemittelte Baseline und berechnen Sie die Größenverteilung und Konzentration (Anzahl pro ml).
- Messung der Tröpfchenabsorption mit UV-Vis-Spektroskopie (Abbildung 5).
HINWEIS: Abbildung 5 zeigt nur die 30% Pyro-Lipid-Formulierung.- Stellen Sie auf dem UV-Vis-Spektralphotometer die Absorptionsmessung auf Wellenlängen von 800 nm bis 300 nm mit Schritten von 0,5 nm ein und aktivieren Sie die Baseline-Korrektur.
- Führen Sie mit einer sauberen 1 cm langen Küvette, die mit PBS gefüllt ist, eine Basislinienmessung durch. Stellen Sie sicher, dass das Volumen hoch genug ist, um den Spektroskop-Strahlengang zu schneiden.
- Die Pyro-Lipidtröpfchen in PBS verdünnen (empfohlen 2 μL bis 500 μL Tröpfchen in 2000 μL Verdünnungsstoff) und durch Pipettieren mischen.
HINWEIS: Wirbeln Sie NICHT, sonst werden die Baugruppen zerstört. - Die verdünnten Tröpfchen in eine gereinigte Küvette geben und die Absorption messen. Ändern Sie die Verdünnungen bei Bedarf.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.4.1 bis 5.4.4, verwenden Sie jedoch 1 % Triton anstelle von PBS. Nach der Verdünnung die Probe vor der Messung für 30 s in eine verschließbare/verschlossene Durchstechflasche und einen Wirbel überführen.
- Messen Sie die Fluoreszenz von Mikroblasen oder Tröpfchen (Abbildung 6).
HINWEIS: Abbildung 6 zeigt nur die 30% Pyro-Lipid-Formulierung.- Stellen Sie auf dem Fluoreszenzspektrophotometer die Anregungswellenlänge auf 410 nm und den Emissionswellenlängenbereich von 600 bis 750 nm mit 1 nm Schritten ein.
- Messen Sie die Fluoreszenz des PBS-Verdünnungsmittels, um eine Basislinie mit einer Küvette zu erhalten, die mit dem Fluoreszenzspektrophotometer kompatibel ist.
- Verdünnen Sie die Pyro-Lipid-Mikroblasen oder -tröpfchen in PBS (empfohlen 0,5 μL bis 10 μL Tröpfchen in 2000 μL Verdünnungsstoff) und mischen Sie sie durch Pipettieren.
HINWEIS: Wirbeln Sie NICHT, sonst werden die Baugruppen zerstört. - Die verdünnte Probe wird in die gereinigte, grundierte Küvette überführen und die Fluoreszenz messen. Ändern Sie die Verdünnungen bei Bedarf und vermeiden Sie eine Signalsättigung.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.5.1 bis 5.5.4, verwenden Sie jedoch 1 % Triton anstelle von PBS. Nach der Verdünnung in 1% Triton wird die verdünnte Probe vor der Messung für 30 s in eine verschließbare/verschlossene Durchstechflasche und einen Wirbel gegeben. Fügen Sie genügend Volumen hinzu, um sicherzustellen, dass sich die durch Wirbel erzeugten Blasen über dem Laserpfad befinden.
HINWEIS: Das Fluoreszenzsignal der Probe in Triton ist aufgrund von Fluoreszenzentrenkung viel höher als in PBS (Abbildung 6).
6. Verdampfungsbildgebung
- Füllen Sie einen entsprechend großen Wassertank mit entionisiertem Wasser und lassen Sie ihn 24 Stunden ruhen, um die Gase im Wasser mit der Atmosphäre in Einzug zu halten.
- Tröpfchen vorbereiten und bis zum Gebrauch auf Eis und im Dunkeln aufbewahren.
- Machen Sie ein Strömungsphantomrohr aus 2% Agar, wie von Pellow et al.18 beschrieben Tauchen Sie das Phantom in einen auf 37 °C beheizten Wassertank.
- ERWÄRMEN SIE PBS auf 37 °C und fließen Sie durch das Phantom.
- Mit einem präklinischen Ultraschallsystem und einem linearen Array-Wandler mit 21 MHz (siehe Materialtabelle)richten Sie die Ansicht auf das Strömungsphantom aus, stellen Sie es auf B-Mode-Bildgebung ein, stellen Sie die Ausgangsdrücke ein und nehmen Sie Videos oder Bilder auf, um Baselines bei jedem Druck zu erfassen.
- 20 μL des Tröpfchens in 50 ml 37 °C PBS verdünnen und vorsichtig mischen. Die Lösung in eine 30-ml-Kunststoffspritze überführen und die Lösung durch das Agarphantom drücken.
- Bei gleicher Ausrichtung wie in Schritt 6.5 erhöhen Sie die Ausgangsdrücke, bis eine Verdampfung beobachtet wird (helle Flecken im Phantom, siehe Abbildung 7).
HINWEIS: Abbildung 7 zeigt die 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe. Dieser kommerziell erhältliche lineare 21-MHz-Array-Wandler ist in der Lage, Tröpfchen sowohl abbilden als auch verdampfen zu können.
Representative Results
Vorkondensierte, größensele selected Microbubble-Proben (n = 3) und postkondensierte Tröpfchenproben ( n = 3)wurden auf einem Coulter Counter (CC) mit einer 10 μm-Öffnung dimensioniert. Eine Einschränkung der 10 μm-Öffnung besteht darin, dass partikel kleiner als 200 nm nicht gemessen werden können, was die mittlere Größe und Konzentration verzerren kann. Abbildung 4 zeigt die Größendaten für jede der Formulierungen mit Pyrolipidgehalt. Tabelle 1 zeigt Statistiken basierend auf den Größendaten. Unter Verwendung eines Verhältnisses von vor- und nachkondensierten mittleren Durchmessern zeigten die Ergebnisse, dass die 0% Pyro-Lipid-Formulierung mit 1,72 ± 0,02 die kleinste mittlere Durchmesserverschiebung aufwies. Die 50% Pyro-Lipid-Formulierung hatte mit 2,38 ± 0,08 den größten mittleren Durchmesser. Die 1%ige Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe hatte die höchste beobachtete Konzentration bei (2,71 ± 0,13) × 1010 /ml, während die 40%ige Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe die niedrigste beobachtete Konzentration bei (7,36 ± 0,81) × 109 /ml aufweist. Größendaten zeigten, dass die 10% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe mit 261 ± 13 nm das kleinste Peakdimeter hatte, während die 50% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe mit 390 ± 55 nm die größte hatte. Im Allgemeinen nahm mit zunehmendem Pyro-Lipidgehalt die Konzentration ab und der mittlere Durchmesser nahm zu. Da die nachkondensierten Proben auf der Vorläufer-Mikroblasenprobe basieren, trat der Trend für beide Arten von Ultraschallkontrastmitteln auf. Als der Pyro-Lipidgehalt zunahm, begann sich eine Mikroblasen-Subpopulation (mit einer Spitzengröße von etwa 2000 μm) zu bilden. Dieser sekundäre Peak war in der 0% Pyro-Lipid-Mikroblasenprobe nicht vorhanden und am deutlichsten in den 40% und 50% Pyro-Lipid-Populationen.
Abbildung 5 zeigt repräsentative Absorptionsmessungen der 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe. Der Peak der intakten Probe in PBS betrug 700 nm, während die gestörte Probe in Triton den Peak auf 671 nm verschob. Dabei zeigte sich, dass die intakten Baugruppen im Vergleich zu den einzelnen, unmontierten Lipidkomponenten unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen.
Abbildung 6A zeigt repräsentative Fluoreszenzmessungen der vorkondensierten Mikroblasenprobe, während Abbildung 6B eine nachkondensierte Tröpfchenprobe mit 30% Pyrolipid zeigt. Die intakte Probe in PBS hatte einen Fluoreszenzpeak bei 704 nm, während die gestörte Form einen Peak bei 674 nm aufweist. Subtrahiert man den gestörten Bereich unter der Kurve mit dem intakten Bereich unter der Kurve und dividiert man die Differenz durch den gestörten Bereich unter der Kurve, ergibt sich die Quenching-Effizienz, die für die 30% Pyro-Lipid-Mikroblasenprobe bzw. Tröpfchenprobe 98,61% bzw. 98,07% beträgt.
Um zu demonstrieren, dass Tröpfchen in Mikroblasen umgewandelt werden, wurden verdünnte Tröpfchen abgebildet und in einem 37 °C Strömungsphantom mit einem Ultraschallsystem verdampft. Abbildung 7 zeigt repräsentative Ultraschallbilder der 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe, die bei unterschiedlichen Drücken aufgenommen wurde. Bei niedrigen Drücken (Abbildung 7A) gab es sehr wenig Signal, nur Hintergrundsignal von Luftblasen, die von der Agarsynthese klebten. Dies liegt daran, dass Tröpfchen nicht echogen sind und keinen Ultraschall streuen. Bei einer etwas hohen Leistung wurden einige Mikroblasen erzeugt (Abbildung 7B), wie das Auftreten von hellen Flecken zeigt. Mit zunehmendem Druck wurden mehr Mikroblasen erzeugt (Abbildung 7C und 7D). Dabei zeigte sich auch, dass die Tröpfchen bei 37 °C nicht spontan verdampfen.
Abbildung 1: Bilder der Schritte zur Bildung der 30% igen Pyrolipidlösung. A)Lipidpulver plus Pyro-SPC in Chloroform. B) Lösung zum Auflösen hinzugefügt. C)Lipidfilm getrocknet und auf die Innenwand der Durchstechflasche beschichtet. D)Lipid-Durchstechflasche mit Aluminiumfolie umwickelt (Außenfolie zur Wiederverwendung geklebt). E)Hydratisierte Lipidlösung. F)Lipidlösung in Serumfläschchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Der Gasaustauscher mit 10 Verteilern. Die Ventile, auf die im Protokoll verwiesen wird, sind beschriftet. Anweisungen zum Zusammenbau des Gasaustauschers finden Sie in der Zusatzdatei "Andere Protokolle und Daten". Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: A) Die Lipidlösungen der 7 Formulierungen (0% bis 50% Pyro-SPC) in Probenfläschchen. Die Abbildungen B bis D zeigen Bilder der Schritte, die unternommen wurden, um 30% Pyro-Lipid-Tröpfchen herzustellen. B)30% ige Pyro-Lipid-Lösung in einer Probendurchstechflasche. C) Nach der Agitation. D) 15 min Größe ausgewählt. E) Untere Trennwand auf Decafluorbutan-Durchstechflasche übertragen. D) Nachkondensation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Coulter Counter (CC) Größendaten der von der Größe ausgewählten Mikroblasen- und Tröpfchenproben mit unterschiedlichem Pyrolipidschalengehalt(n = 3). Die durchgezogenen grünen Linien stellen Mikroblasen und die gepunkteten Cyanlinien Tröpfchen dar. A) 0% Pyro-SPC. B)1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D)20% Pyro-SPC. E)30% Pyro-SPC. F)40% Pyro-SPC. G)50% Pyro-SPC. H)Die insgesamt beobachteten Konzentrationen von Mikroblasen- und Tröpfchenproben aus dem CC basierend auf dem Pyro-SPC-Gehalt in der Schale. Alle Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Alle Messungen wurden mit einer 10 μm Apertur durchgeführt, die einen Größenbereich von 200 nm bis 6000 nm aufweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Spektroskopie-Absorptionsmessungen von 300 bis 800 nm der nachkondensierten 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe, verdünnt in PBS und in 1% Triton. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Repräsentative Fluoreszenzemission von 600 bis 750 nm angeregt bei 410 nm. A)Größengewählte, vorkondensierte 30% Pyro-Lipid-Mikroblasenprobe in PBS und in 1% Triton. B)Nachkondensierte 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe in PBS und in 1% Triton. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Repräsentative Ultraschallbilder eines 37 °C Agar-Strömungsphantoms, aufgenommen mit einem präklinischen 21-MHz-Linear-Array-Wandler im B-Modus (siehe Materialtabelle). Die linke Spalte (Abbildungen A, C, E, & G) zeigt PBS-Steuerelemente. Die rechte Spalte (Abbildungen B, D, F, & H) zeigt 20 μL nachkondensierte 30% Pyro-Lipid-Tröpfchenprobe, verdünnt in 50 ml 37 °C PBS. Jede Zeile repräsentiert Freifeld-Spitzennegpressumdrücke, die aus der Arbeit von Sheeran et al. geschätzt wurden8 Die gelben Dreiecke zeigen die Fokustiefe an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Methode | Agent | Pyro Schale % | 0 | 1 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 |
| CC | Blasen | Konz. [/mL] | (2,76 ± 0,28) × 10^10 | (3.04 ± 0.15) × 10^10 | (2.02 ± 0.11) × 10^10 | (1,91 ± 0,22) × 10^10 | (1.47 ± 0.05) × 10^10 | (8,47 ± 0,95) × 10^9 | (9.89 ± 0.15) × 10^9 |
| CC | Blasen | Peak [nm] | 329 ± 6 | 297 ± 15 | 305 ± 21 | 273 ± 14 | 310 ± 40 | 266 ± 33 | 393 ± 89 |
| CC | Blasen | Mittelwert [nm] | 609 ± 2 | 603 ± 15 | 635 ± 6 | 690 ± 8 | 812 ± 1 | 935 ± 22 | 950 ± 55 |
| CC | Blasen | Median [nm] | 450 ± 6 | 421 ± 6 | 414 ± 6 | 432 ± 5 | 490 ± 2 | 596 ± 37 | 695 ± 41 |
| CC | Tröpfchen | Konz. [/mL] | (2.18 ± 0.07) × 10^10 | (2.71 ± 0.13) × 10^10 | (1.75 ± 0.18) × 10^10 | (1,72 ± 0,13) × 10^10 | (1.09 ± 0.01) × 10^10 | (7.36 ± 0.81) × 10^9 | (7.38 ± 0.28) × 10^9 |
| CC | Tröpfchen | Peak [nm] | 292 ± 0 | 297 ± 17 | 261 ± 13 | 280 ± 9 | 268 ± 17 | 287 ± 38 | 390 ± 55 |
| CC | Tröpfchen | Mittelwert [nm] | 353 ± 5 | 350 ± 5 | 347 ± 1 | 347 ± 4 | 397 ± 1 | 399 ± 6 | 400 ± 7 |
| CC | Tröpfchen | Median [nm] | 318 ± 4 | 318 ± 4 | 310 ± 1 | 315 ± 2 | 340 ± 0 | 367 ± 5 | 370 ± 9 |
Tabelle 1: Größendatenstatistik der Mikroblasen- und Tröpfchenproben mit unterschiedlichem Pyro-SPC-Gehalt von Coulter Counter (CC) (n = 3). Alle Fehler weisen auf eine Standardabweichung hin.
Ergänzende Informationen - Lipid Formula Sheet: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Informationen - Andere Protokolle und Daten: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Nach Addition aller Lipidkomponenten (Schritte 1.2 und 1.4.5, Abbildung 1A)wurde eine Lösung von Chloroform und Methanol (und Wasser, wenn Phosphatidsäurelipide wie DSPA vorhanden sind) zugegeben, um sicherzustellen, dass die Pyro-Lipid- und Nicht-Pyro-Lipidkomponenten vollständig homogenisiert waren (Schritt 1.5, Abbildung 1B). Um die Bildung von Lipidvesikeln mit heterogener Lipidzusammensetzung zu verhindern, wurden die gelösten Lipide getrocknet und als dünner Film auf das Innere der Wand der Durchstechflasche aufbeschichtet (Abbildung 1C). Die Beschichtung (Schritt 1.6) erleichtert auch die Hydratation (Schritt 2.1 bis 2.4), da sie die Oberfläche des getrockneten Films vergrößert. Die Trocknung (Schritt 1.6, Abbildung 1C)und das Staubsaugen (Schritt 1.8, Abbildung 1D)wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Chloroform und das Methanol vollständig verdampft sind, da diese Chemikalien die Bildung von Mikroblasen stören können. Während das Protokoll verkleinert werden kann, um Lipidlösungsvolumina von nur 1 ml zu erreichen, können größere Volumina die Variation von Fläschchen zu Durchstechflaschen reduzieren. Während dies das Risiko bergen kann, den Pyro-SPC bei Nichtgebrauch abzubauen, sollte der Lagerzustand der Lipidlösung (Schritt 2.9 bis 2.10) dieses Risiko verringern. Der Entgasungsschritt mit dem Gasaustauscher (Schritt 2.9.2, Abbildung 1F und Abbildung 2) dient dazu, so viel Sauerstoff wie möglich zu eliminieren, um eine Oxidation zu verhindern. Es wird nicht empfohlen, Lipidlösungen zu lagern, die Porphyrin-Lipide enthalten, während atmosphärische Gase noch in der Lösung gelöst sind (Abbildung 1E).
In Schritt 2.10 befindet sich die Lipidlösung in einer Serumdurchstechflasche mit einem unter Druck stehenden Kopfraum, ähnlich wie das klinisch zugelassene Ultraschallkontrastmittel Perflutren Lipidmikrosphären verkauft wird (ähnlich Abbildung 1F). Interne Arbeiten haben gezeigt, dass stabile Mikroblasen nicht durch mechanisches Rühren mit pyro-lipiden erzeugt werden können, wenn die Kappe ein weiches Material wie der Gummistopfen ist. Daher wurde die Lipidlösung in eine Probendurchstechflasche mit einer nicht gummiartigen Phenolkappe überführt (Schritte 4.1 bis 4.4, Abbildung 3A und 3B). Wenn das Decafluorbutangas in die Probendurchstechflasche (Schritte 4.1 bis 4.4) geflossen ist, sollte das dichtere Decafluorbutan die atmosphärische Luft im Kopfraum der Probenfläschchen verdrängen. Derzeit ist nicht bekannt, warum Pyro-Lipide keine Mikroblasen mit Gummistopfen bilden können. Ohne Pyro-Lipide können stabile Mikrobläschen direkt in den Serumfläschchen mit Gummistopfen hergestellt werden4,7. Daher wird empfohlen, den Gasaustauscher zu verwenden, um die Serumfläschchen zu entgasen und erneut unter Druck zu halten und dann die Serumfläschchen selbst für Nicht-Pyro-Lipid-Formulierungen4,5,6,7 zurühren (siehe "Andere Protokolle und Daten"). Der Vorteil der mechanischen Rühren in der Serumfläschchen besteht darin, dass der Kopfraum unter Druck stehen kann und die Größenauswahl durch Umkehren der Serumdurchstechflasche auf den Kopf gestellt werden kann8. In diesem Protokoll wurde die 0%ige Pyro-Lipid-Formulierung in eine Probendurchstechflasche (Schritte 4.1 bis 4.4) übertragen, um mit den Formulierungen übereinzusässen, die Pyro-Lipide enthielten. Darüber hinaus führen längere Acyllipidkettenlängen aufgrund besserer Van-der-Waals-Wechselwirkungen zu stabileren Tröpfchen19. Die Zusammensetzung der Lipidschale wurde auf der Grundlage der im Handel erhältlichen 18-Acyl-Kettenlänge für alle Lipidtypen ausgewählt. DSPE-PEG5K wurde in alle Formulierungen (Schritt 1.1) eingebaut, da das Vorhandensein der Polyethylenglykolketten das Zusammenwachsen von Strukturen durch abstoßende sterische Kräfte verhindert19. Während der Lipidhydratation wurde das Badbeschallungsbad auf 70 °C (Schritt 2.1) so hoch eingestellt, dass der 18-Acyl-Kettenlängen-Lipidfilm18vollständig dispergiert werden konnte. Für längere Acylkettenlängen sind höhere Temperaturen erforderlich.
Eine höhere Pyrolipidbelastung würde die Konzentration optisch absorbierender und fluoreszierender Komponenten erhöhen, was für bestimmte Anwendungen, die von einer maximierten Porphyrinbelastung profitieren, wünschenswert sein kann. Mit zunehmendem Pyrolipidgehalt nahm jedoch die beobachtbare Tröpfchenkonzentration ab und die Durchmesser nahmen zu (Abbildung 4 und Tabelle 1). Dies veranschaulicht einen Kompromiss zwischen optischen Fluoreszenz- und Absorptionseigenschaften gegenüber Tröpfchenkonzentration und -durchmesser. Für Forscher, die kleine Durchmesser für die In-vivo-Akkumulation durch kleine undichte Gefäße priorisieren müssen oder wenn eine hohe Konzentration von Tröpfchen injiziert werden muss, ist eine Erhöhung der Pyrolipidbelastung möglicherweise nicht die Erhöhung des Tröpfchendimeters oder die Abnahme der Tröpfchenkonzentration wert. Wenn hohe Tröpfchenkonzentrationen und/oder kleine Tröpfchendurchmesser von größter Bedeutung sind, sollten anstelle von Pyrolipiden ähnlich große Begleitdiagnostika in Betracht gezogen werden. Während 1% Pyro-Lipid-Tröpfchen nicht zu einer Abnahme der Konzentration oder Vergrößerung führten, kann 1% Pyro-Lipid-Belastung zu niedrig sein, um aus dem Gewebehintergrund fluoreszierend nachweisbar zu sein. Die Flexibilität des Porphyrin-Anteils bietet jedoch mehrere Optionen für die Funktionalisierung, die alternative Quantifizierungsmittel bieten, die für Anwendungen mit niedriger Konzentration besser geeignet sind. Zum Beispiel können Pyro-Lipide mit Kupfer-64 für die Positon-Emissions-Tomographie und Gammazählung20oder mit Palladium für die Spurenmetallquantifizierung mittels Massenspektrometrie oder mit Mangan für die Magnetresonanztomographie14chelatisiert werden.
Während einige Experimente möglicherweise nur ein kleines Volumen der Tröpfchenlösung erfordern, wird 1 ml der Lipidlösung benötigt, um die 1,85 ml Probendurchstechflasche zu füllen. Goertz et al. zeigten, dass Änderungen der Handhabung, des Kopfraumdrucks, des Flüssigkeits-Gas-Verhältnisses und sogar der Form der Durchstechflasche alle Mikroblasenpopulationen beeinflussen können17. Die Fläschchentemperatur während des Rührens und der Größenauswahl kann auch die Größenverteilung beeinflussen. Daher ist es für die vom Endbenutzer optimierten Methoden wichtig, bei der Tröpfchenherstellung so konsistent wie möglich zu sein. Ungeöffnete Tröpfchen können eingefroren (-20 ° C) und später für die zukünftige Verwendung aufgetaut werden, dies wirkt sich jedoch auf die Größenpopulationen aus.
Das Agitationsverfahren, bei dem eine Lipidlösung in Mikroblasen aktiviert wird, erzeugt keine morphologisch homogene Population (Schritt 4.6); Vielmehr ist die Probe mit Mikroblasen, multilamellaren Vesikeln, Liposomen und Mizellengefüllt 18,21,22. Während Mikroblasengrößen den Mikrometer- und Nanometerbereich umfassen, liegen die anderen Strukturen weitgehend unter 800 nm 23. Die verwendeten Größentechniken unterscheiden nicht zwischen diesen verschiedenen Strukturen, so dass die nachrührten Mikroblasenproben (Schritt 4.6, Abbildung 3C)und die nachkondensierten Tröpfchenproben (Schritt 4.14, Abbildung 3F) als Mischungen angenommen werden müssen. Die ultraschallempfindlichen Anordnungen (multilamellare Vesikel, Liposomen und Mizellen) sind wahrscheinlich nach der Kondensation konserviert und ändern ihre Größe nicht, da sie keine phasenwechselbaren Kerne haben. Da der Coulter Counter nicht zwischen diesen verschiedenen supramolekularen Anordnungen unterscheiden kann, sollte die Verschiebung der Populationsgröße nach kondensation mit der Annahme interpretiert werden, dass ein teil der nanoskaligen Strukturen nicht konvertierbar ist und zur beobachteten Population in dieser Größenregion beiträgt. Zusätzlich tragen diese Strukturen zu den spektroskopischen und fluoreszierenden Signaturen dieser Probenbei 14. Die Fluoreszenz- und Absorptionssignaturen von Mizellen, Liposomen/Vesikeln und Tröpfchen sind alle ähnlich, einschließlich ihres Grades der Fluoreszenzabschreckung14. Daher ist es wichtig zu berücksichtigen, dass es eine Mischung von Baugruppen in den Abbildungen 3C bis 3F, Abbildung 4, der PBS-verdünnten Probe in Abbildung 5und der PBS-verdünnten Probe in Abbildung 6gibt.
Nach der Größenauswahl und vor der Kondensation (Schritt 4.9) ist es möglich, die Nicht-Blasen-Baugruppen zu eliminieren, indem die Mikroblasenprobe zentrifugiert wird, um die auftriebsfähigen Blasen von den nicht auftriebsfähigen Baugruppen zu trennen, wie von Feshitan et al.beschrieben. 21 Der Grad der Trennung kann durch Einstellung der Spinkraft und -dauer gesteuert werden. Experimente zur Mikroblasenkondensation solcher größenisolierten Proben ergaben jedoch, dass die Verwendung der größeren Vorläufer-Mikroblasenpopulationen, die mit Größenisolationsverfahren ausgewählt wurden, größere Tröpfchen ergab (siehe "Andere Protokolle und Daten" Schritt S5 für die Dimensionierung von blasen und Tröpfchen nachgesponnen). Da eine beabsichtigte Anwendung von Tröpfchen, die mit diesem Protokoll hergestellt werden, aufgrund ihrer geringen Größe im Vergleich zu Mikroblasen4,8eine Plattform für passive Extravasation und Akkumulation ist, wurden möglichst kleine Tröpfchenpopulationen gewünscht. So verwendete dieses Protokoll post-agitierte Mikroblasenproben, die nicht durch Zentrifugation größenisoliert wurden, auch wenn dies bedeutete, dass ultraschallunempfindliche Mizellen, Liposomen und Vesikel in der vorhanden waren. Dies bedeutet, dass Quantifizierungsverfahren für die Bioverteilung Signale für alle injizierten Strukturen ableiten und nicht nur auf die Tröpfchen beschränkt sind. Da sich diese ähnlich großen Strukturen jedoch höchstwahrscheinlich über einen passiven Mechanismus ansammeln, der in erster Linie von der Größe diktiert wird, wird nicht vermutet, dass dies die wichtigsten Rückschlüsse ändern sollte, die gemacht werden können, wenn diese Plattform in vivoverwendet werden soll, obwohl alle diese Aspekte je nach Kontext, in dem die Plattform verwendet werden kann, individuell betrachtet werden sollten. Tests mit Experimentellenarmen mit und ohne Ultraschall können durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die ultraschallempfindlichen Tröpfchen für Änderungen der Bioverteilung verantwortlich sind, da nur die Perfluorkohlenstoff-Kernanordnungen in der Lösung auf Ultraschall reagieren.
Nach dem Rühren wurde die Durchstechflasche 15 Minuten lang ruhen und eine Trennwand in der Durchstechflasche beobachtet (Abbildung 3C versus 3D). Die Größenauswahl über Auftrieb ist eine einfache Methode, um die größeren Strukturen/Blasen aus einer aktivierten Mikroblasenlösung8,17zuentfernen. In diesem Fall wurden Partikel mit Durchmessern größer als 5 μm meist nach Größenauswahl entfernt (Abbildung 4). Der Umfang der Größenauswahl kann durch Steuern der Dauer der Größenauswahl17eingestellt werden. Sheeran et al. haben gezeigt, dass keine Größenauswahl zu erzeugten Mikroblasen führen kann, die vaskulatureverschließen 8.
Perfluorkohlenwasserstoffe haben den Vorteil, dass sie biologisch inertsind 7. Während der Siedepunkt von Decafluorbutan -1,7 °C über der Körpertemperatur liegt, verdampfen die Tröpfchen nicht sofort, wenn sie 37 °C ausgesetzt werden (Abbildung 7B). Da die Tröpfchen bei 37 °C metastabil sind, wird zusätzliche akustische Energie benötigt, um die Tröpfchen zu Mikroblasen zu verdampfen7,9. Poprosky et al. haben Porphyrintröpfchen nachgewiesen, die durch Druckbeaufschlagung kondensiert wurden22. Dies ist eine praktikable und sogar essentielle Methode, wenn weniger dichte Perfluorkohlenwasserstoffe verwendet werden, aber hohe Drücke können dabei einige Blasen zerstören. Octafluorpropan(C3F8)hat einen Siedepunkt von -36,7 °C, so dass sowohl Kühlung als auch Druckbeaufigung für die Tröpfchenkondensation erforderlich ist. Der leichtere Perfluorkohlenstoff führt jedoch zu weniger stabilen Tröpfchen. Dodecafluoropentan(C5F12)kann zu stabileren Tröpfchen mit einem Siedepunkt von 28 °C führen. Es ist jedoch eine Flüssigkeit bei Raumtemperatur und benötigt stärkere akustische Energien, um zu verdampfen. Daher sollte bei der Wahl des enthaltenden Gases des Ultraschallkontrastmittels neben den Parametern seiner Herstellung auch die Bedingungen seiner beabsichtigten biologischen Anwendung berücksichtigt werden. In diesem Protokoll wurde das Isopropanolbad für die Kondensation auf -15 bis -17 °C eingestellt (Schritt 4.7.1 und Schritt 4.13), während andere Protokolle -10 °C 5,6verwendeten. Selbst bei einem gemeinsamen Decafluorbutankern kann die Kondensationstemperatur je nach Zusammensetzung des Hilfsstoffs, Gesamtlipidkonzentration und Lipidschalenzusammensetzung variieren. Bei Verwendung anderer Formulierungen kann eine Optimierung erforderlich sein, um eine ordnungsgemäße Tröpfchenkondensation zu gewährleisten, ohne dass die Lösung gefriert.
Da die Tröpfchen kleiner und stabiler sind als ihr Mikroblasenvorläufer7, können sie passive Akkumulationsmechanismen besser nutzen, um in bestimmte Gewebe von Interesse zu extravasieren, wie die erhöhte Permeabilität und Retentionswirkung bestimmter Tumortypen4,24. Mit fluoreszierenden, optisch absorbierenden und akustischen Nachweismethoden14ist es möglich, eine einzige Formulierung zur Quantifizierung der Aufnahme zu verwenden. Darüber hinaus kann diese Plattform verwendet werden, um zu untersuchen, ob die akustische Verdampfung von Tröpfchen die Zugeführte Wirkstofffraktion über die passiven Ebenen hinaus verbessern kann16. Um die Bioverteilung des Wirkstoffs in Geweben und Organen von Interesse nach der Injektion zu quantifizieren, sollte eine bekannte Menge an Pyro-Lipidtröpfchen in das Tier injiziert werden, Ultraschall kann je nach Kontrollsatz angewendet werden oder nicht, das Tier sollte zu einem vorher festgelegten Zeitpunkt geopfert werden und die Organe sollten entfernt und gewogen werden. Die Organe sollten homogenisiert, filtriert, in Tensid (Reinigungsmittel) verdünnt werden, um das Gewebe zu dezellularisieren, und mit Fluoreszenz- oder UV-Vis-Spektroskopie quantifiziert werden, um injizierte Dosisprozentsätze pro Organmasse basierend auf den Pyrosignalen zu erhalten. Für Schritt 5.4.5 (Abbildung 5) und Schritt 5.5.5 (Abbildung 6) wurde Triton X-100 Tensid (Reinigungsmittel) verwendet, um die Proben zu stören, da es bei 410 nm nicht fluoreszierend ist und seine Absorptionswellenlängen sich nicht mit pyros überlappen.
Mikroblasen wurden nicht mit UV-Vis-Absorption charakterisiert. Da die Laserquelle des UV-Vis-Spektroskops parallel zum Detektor ist, könnten alle großen Blasen Licht vom Detektor wegstreuen, wodurch sie optisch absorbierender erscheinen14. Im Gegensatz zum UV-Vis-Spektralphotometer ist/sollte der Detektor des Fluoreszenzspektrophotometers senkrecht zur Laserquelle stehen, um zu verhindern, dass die Quelle den Detektor stört. UV-Vis wurde verwendet, um die Absorption der intakten und gestörten Tröpfchenproben zu quantifizieren (Schritt 5.4, Abbildung 5). Als Absorptionswellenlängen wurden 300 bis 800 nm gewählt, da die beiden Hauptabsorptionsbänder des Pyrolipids, das Soret-Band (340 bis 500 nm) und das Q-Band (640 bis 730 nm), in diesen Bereichfallen 14. Wenn es zu einem Tröpfchen (oder anderen supramolekularen Strukturen) zusammengesetzt wird, wird der Q-Band-Peak von Pyro-Lipid von 671 nm auf 700 nm rot verschoben(Abbildung 5). Wenn diese supramolekulare Struktur durch ein Tensid wie Triton gestört wird, verschiebt sich der Peak zurück auf 671 nm14,15. Anhand dieser Verschiebung lässt sich feststellen, ob sich die Pyrolipide in einem zusammengesetzten Zustand oder in einem gestörten Zustand befinden. Das Verhältnis der beiden Peaks kann verwendet werden, um den Zerfall der Baugruppen im Laufe der Zeit abzuschätzen.
Für die Fluoreszenzmessungen (Schritt 5.5, Abbildung 6)wurde eine Anregungswellenlänge von 410 nm gewählt, da sie dem Soret-Bandpeak für unmontiertes Pyrolipid14entspricht. Es wurde ein Emissionswellenlängenbereich von 600 bis 800 nm gewählt, da die Peaks der intakten Baugruppen in PBS und gestörte Pyrolipide in Triton in diesem Bereich enthalten sind. Die Verschiebung und Zunahme der Fluoreszenz (Abbildung 6) zwischen den intakten (704 nm in PBS) und gestörten (674 nm in Triton) Proben trat aufgrund strukturinduzierter Abschreckung auf. In der zusammengesetzten Form wurden die Pyro-Lipidmoleküle eng zusammengepackt, so dass erzeugte Photonen von nahe gelegenen Pyro-Lipidmolekülen absorbiert wurden. Dies zeigt sich in der intakten versus gestörten Abschreckeffizienz. Daher ist es notwendig, Proben in Tensid (Reinigungsmittel) wie 1% Triton X-100 zu verdünnen, um das Abschrecken zu entlasten und das Signal für die Bioverteilungsquantifizierung zu maximieren14.
Der Einfachheit halber wurde derselbe lineare Array-Ultraschallwandler sowohl zum Verdampfen als auch zum Abbilden verwendet (Schritte 6.5 und 6.7, Abbildung 7). Dieser Ultraschallwandler (Table of Materials) war in der Lage, die notwendigen Spitzennegpressdrücke zu erreichen, die zum Verdampfen von Tröpfchen erforderlich waren8. Beim Befüllen eines Tanks mit entionisiertem Wasser aus einem Wasserhahn entstehen Gase, die sich im Wasser auflösen (Schritt 6.1). Um Störungen durch die gelösten Gase im Wasser durch Verdampfung und Bildgebung zu minimieren, wurde das Wasser für 24 h im Tank ruhen, damit sich die Gase im Wasser mit der Atmosphäre ausgleichen konnten (Schritt 6.1). Alternativ kann das entionisierte Wasser mit einem ausreichend großen, verschließbaren Behälter entgast werden, der mit einem ausreichend starken Vakuum verbunden ist. Die Ultraschallbilder zeigten, dass die Mikroblasen erfolgreich kondensiert wurden, da die Tröpfchen bei niedrigen Drücken nicht beobachtbar / nicht echogen waren (Abbildung 7B). Erst bei höheren Ausgangsdrücken verdampften die Tröpfchen zu beobachtbaren, echogenen Mikroblasen (Abbildung 7D, 7F, 7H). Während die postkondensierte Tröpfchenprobe Mizellen und Liposomen/ Vesikel enthält, sind diese Anordnungen nicht echogen und nur Tröpfchen können zu echogenen Mikroblasen verdampfen. Eine PBS-Steuerung wurde durch das Phantom geflossen, um Basisbilder zu erstellen (Abbildungen 7A, 7C, 7E, 7G). Als der Druck im PBS zunahm, wurde kein Kontrast erzeugt. Dies deutete darauf hin, dass die hohen Drücke des Wandlers in einem wasserbasierten Medium allein keine spontane Kavitation erzeugen konnten und somit alle anderen erzeugten Kontraste auf das verwendete Ultraschallkontrastmittel zurückzuführen waren. Ist der Ausgangsdruck zu hoch, können erzeugte Mikroblasen zerstört werden. Durch inkrementelle Erhöhung des Drucks und Beobachtung des erzeugten Kontrastes kann der optimale Druck gefunden werden8. Die Zirkulationshalbwertszeit der Tröpfchen kann auf ähnliche Weise bestimmt werden, indem die Tröpfchen in bestimmten Zeitintervallen verdampft und der im Laufe der Zeit erzeugte Kontrast beobachtet wird7.
Zusammenfassend wurden mit dem Kondensationsverfahren multimodale Phasenwechseltröpfchen mit unterschiedlichem Pyrolipidgehalt erzeugt. Die Dimensionierung zeigte, dass es einen Kompromiss zwischen pyrolipider Belastung und Mikroblasen-/Tröpfchenkonzentration gab. Charakterisierungen zeigten, dass es Unterschiede in intakten und gestörten Formen sowohl in der Absorption als auch in der Fluoreszenz gab. Ultraschallaufnahmen zeigten, dass Tröpfchen bei 37 °C nicht echogen waren und bei ausreichendem Druck in echogene Mikroblasen verdampfbar waren. Charakterisierungen zeigten auch das Potenzial von Pyro-Lipid-Tröpfchen, begleitende diagnostische Mittel für Tröpfchen-Bioverteilungs- oder Akkumulationstests zu ersetzen. Zukünftige Arbeiten werden Verdampfungsschwellen in Lösung, Stabilität in Lösung und In-vivo-Zirkulationsdauer bei nackten Mäusen untersuchen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Brandon Helfield für die Unterstützung beim Bau des Gasaustauschers und Dr. Miffy Hok Yan Cheng für technische Diskussionen. Die Autoren danken den folgenden Finanzierungsquellen: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute und Princess Margaret Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
| 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
| Aluminum Foil | Any brand | ||
| Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
| Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
| Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
| Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
| Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
| Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Chloroform | Any brand | ||
| Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
| Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
| Deionized Water | Any brand | ||
| Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
| Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
| E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
| Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
| Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
| Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information - "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
| Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
| Glycerol | Any brand | ||
| Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
| Isopropanol | Any brand | ||
| Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
| Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
| Metal Tongs | Any brand | ||
| Methanol | Any brand | ||
| MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
| MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
| Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
| Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
| Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
| Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
| Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
| Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
| Propylene Glycol | Any brand | ||
| Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information - Other Protocols and Data" for synthesis. | |
| Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
| Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
| Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
| Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
| Vacuum Desiccator | Any brand | ||
| Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
| Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
| Vortex Mixer | Any brand |
References
- Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
- Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
- Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891 (2020).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
- Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
- Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
- Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
- Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
- Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246 (2017).
- Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
- Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
- Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
- Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
- Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376 (2007).
- Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001 (2018).
- Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
- Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
- Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
- Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).
