इस प्रोटोकॉल में, बहु-मॉडल चरण-परिवर्तन पोर्फिरिन बूंदों को संश्लेषित करने और विशेषता के तरीकों को रेखांकित किया गया है।
चरण-परिवर्तन बूंदें अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों का एक वर्ग है जो पर्याप्त ध्वनिक ऊर्जा के अनुप्रयोग के साथ सीटू में इकोजेनिक माइक्रोबबल में परिवर्तित हो सकती है। बूंदें अपने माइक्रोबबल समकक्षों की तुलना में छोटी और अधिक स्थिर होती हैं। हालांकि, पारंपरिक अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट ध्वनिक प्रतिक्रिया माप से परे ट्रैक करने योग्य नहीं हैं, जो कंट्रास्ट एजेंट जैव-वितरण या संचय पूर्व वीवो को मुश्किल बनाता है। शोधकर्ताओं को जैव वितरण का अनुमान लगाने के लिए फ्लोरोसेंट या ऑप्टिकली शोषक साथी नैदानिक कणों पर निर्भर रहना पड़ सकता है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक संघनन विधि का उपयोग करके बहु-मॉडल चरण-परिवर्तन पोर्फिरिन बूंदों को बनाने के लिए विस्तृत कदम उठाना है। पोर्फिरिन अलग-अलग अवशोषण बैंड वाले फ्लोरोसेंट अणु हैं जिन्हें लिपिड पर संयुग्मित किया जा सकता है और बूंदों की बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार करने के लिए बूंदों में शामिल किया जा सकता है, ध्वनिक गुणों को बनाए रखते हुए अधिक मजबूत जैव-वितरण को सक्षम करता है। माइक्रोबबल और बूंद आकार वितरण की जांच करने के लिए अलग-अलग पोर्फिरिन-लिपिड और बेस लिपिड सामग्री के साथ सात फॉर्मूलेशन किए गए थे। पोर्फिरिन युक्त संरचनाओं के अनुकूल लक्षण ों को प्रोटोकॉल में उनके विश्लेषणात्मक बहुमुखी प्रतिभा को प्रदर्शित करने के लिए भी वर्णित किया गया है। आकार घटाने से पता चला है कि बाद गाढ़ा मतलब व्यास १.७२ से २.३८ बार अग्रदूत आबादी से छोटे थे । अवशोषण लक्षण वर्णन से पता चला बरकरार विधानसभाओं में ७०० एनएम का क्यू-बैंड पीक था जबकि बाधित नमूनों में ६७१ एनएम पर एक अवशोषण शिखर था । फ्लोरेसेंस लक्षण वर्णन बरकरार दिखाया 30% पोर्फिरिन-लिपिड विधानसभाओं फ्लोरोसेंटी शमन (>97%), फ्लोरेसेंस वसूली के साथ व्यवधान पर प्राप्त किया गया । ध्वनिक वाष्पीकरण से पता चला है कि पोर्फिरिन की बूंदें कम दबावों पर गैर-इकोजेनिक थीं और पर्याप्त दबावों के साथ इकोजेनिक माइक्रोबबल में परिवर्तित की जा सकती हैं। ये लक्षण पोर्फिरिन बूंदों की क्षमता को दिखाते हैं ताकि वे वीवो या पूर्व वीवोमें डिलीवरी या चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट जैव-वितरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए अवशोषण या फ्लोरेसेंस-आधारित साथी नैदानिक रणनीतियों की आवश्यकता को समाप्त कर सकें।
अल्ट्रासाउंड इमेजिंग चिकित्सा इमेजिंग का एक गैर-आक्रामक, गैर-आयनीकरण रूप है जो ध्वनिक तरंगों का उपयोग करता है। जबकि अल्ट्रासाउंड स्कैनर अधिक पोर्टेबल हैं और वास्तविक समय की छवियां प्रदान कर सकते हैं, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग कम विपरीत से पीड़ित हो सकते हैं, जिससे सोनोग्राफरों के लिए इसी तरह इकोजेनिक रोग सुविधाओं को मज़बूती से अलग करना मुश्किल हो जाता है। इस सीमा का प्रतिकार करने के लिए, संवहनी विपरीत में सुधार करने के लिए मेजबान में माइक्रोबबल इंजेक्शन किया जा सकता है। माइक्रोबबल्स माइक्रोन आकार के गैस से भरे कंट्रास्ट एजेंट होते हैं जो ध्वनिक तरंगों के लिए अत्यधिक इकोजेनिक होते हैं और1,2उन्नत पोत विपरीत प्रदान कर सकते हैं। माइक्रोबबल्स के गोले और गैस कोर को विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए सिलवाया जा सकता है, जैसे इमेजिंग, थ्रोम्बोलिसिस, सेल झिल्ली पारमेबिलाइजेशन, या क्षणिक संवहनी उद्घाटन2।
माइक्रोबबल्स की एक खामी उनके छोटे परिसंचरण आधा जीवन है । उदाहरण के लिए, चिकित्सकीय रूप से उपलब्ध परफ्लुट्रेन लिपिड माइक्रोस्फीयर में केवल 1.3 मिनट3का आधा जीवन होता है। लंबे इमेजिंग सत्रों के लिए, माइक्रोबबल्स के कई इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। माइक्रोबबल्स की एक और खामी उनके बड़े व्यास हैं। जबकि परफ्लुट्रेन लिपिड माइक्रोस्फीयर व्यास में लगभग 1 से 3 माइक्रोन हैं, वेक्यूलेचर में प्रसारित करने के लिए काफी छोटे हैं, वे बहुत बड़े हैं और निष्क्रिय रूप से रुचि के ऊतकों में जमा होते हैं, जैसे कि ट्यूमर4। इन सीमाओं को दूर करने के लिए एक रणनीति गैस-कोर माइक्रोबबल्स को छोटे, तरल-कोर बूंदों5,6में गाढ़ा करना है। जबकि बूंदें उनके तरल राज्य में इकोजेनिक नहीं हैं, उन्हें पर्याप्त रूप से उच्च चोटी नकारात्मक दबाव के साथ अल्ट्रासाउंड के संपर्क में आने पर माइक्रोबबल्स में वाष्पित किया जा सकता है, जो इसके विपरीत प्रदान करने की उनकी क्षमता को फिर से प्राप्त कर सकता है। यह बूंद को एक छोटे तरल-कोर के अधिक अनुकूल फार्माकोकिनेटिक्स का लाभ उठाने की अनुमति देता है, जबकि रासायनिक संरचना4,7को बदलने के बिना और विपरीत प्रदान करने की क्षमता को बनाए रखता है।
डेसफ्लोरोबुटेन गैसीय और तरल राज्यों के बीच चरण-स्थानांतरण के लिए एक आदर्श परफ्लोरोकार्बन यौगिकहै 5,6,7। डेफ्लोरोबुटेन अकेले तापमान में कमी के साथ बूंदों में माइक्रोबबल के संघनन के लिए अनुमति देता है, जबकि कम घने परफ्लोरोकार्बन को अतिरिक्त दबाव5की आवश्यकता होती है। यह सौम्य विधि संघनन केदौरानबुलबुले के विनाश को कम करती है ,8,9. चूंकि उनके कोर तरल हैं, बूंदें गैर-इकोजेनिक और अल्ट्रासाउंड के लिए अदृश्य हैं। हालांकि, पर्याप्त ध्वनिक या थर्मल ऊर्जा के आवेदन के साथ, तरल कोर एक गैसीय राज्य में वापस वाष्पित हो सकते हैं, इकोजेनिक माइक्रोबबल्स8उत्पन्न कर सकते हैं। यह वाष्पीकरण माइक्रोबबल्स को कब और कहां उत्पन्न करना है, इसके नियंत्रण के लिए अनुमति देता है।
जबकि बूंदें निष्क्रिय संचय के लिए उपयोगी होती हैं, सीटू वाष्पीकरण में, या सेल पारमेबिलिटी में सुधार4,बूंदों (और उनके टुकड़े) को छवि या मात्रात्मक पूर्व वीवोनहीं किया जा सकता है। इसलिए, फ्लोरोसेंट4,10, 11,चुंबकीय कण 12, ऑप्टिकली शोषक एजेंट13जैसे मात्रात्मक साथी नैदानिक एजेंट का उपयोग ब्याज के ऊतकों को बूंद वितरण गेज करने के लिए एक एनालॉग के रूप में कियाजाताहै। उदाहरण के लिए, हेलफील्ड एट अल ने माउस अंगों के हिस्टोरोलॉजी छवि क्वांटिफिकेशन के लिए फ्लोरोसेंट नैनो-मोतियों के सह-इंजेक्शन का उपयोग किया क्योंकि बूंदों का फ्लोरोसेंट रूप से4का पता नहीं लगाया जा सकता था। साथी नैदानिक एजेंटों का नुकसान ट्रैक करने योग्य घटक अपने व्यक्तिगत फार्माकोकाइनेटिक प्रोफ़ाइल के आधार पर बूंद से स्वतंत्र रूप से कार्य कर सकता है।
सौभाग्य से, माइक्रोबबल्स और बूंदों के खोल को अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ह्यूयन्ह एट अल ने पोर्फिरिन-लिपिड गोले के साथ अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंटों का प्रदर्शन किया, जो मल्टी-मॉडल माइक्रोबबल्स14बनाते हैं। पोर्फिरिन्स एक ऐसा वर्ग है जो14,15सुगंधित मैक्रोसाइलिक संरचना के साथ कार्बनिक यौगिकों का एक वर्ग है । वे ऑप्टिकल रूप से शोषक, फ्लोरोसेंट होते हैं, और रेडियोथेरेपी, रेडियोन्यूक्लाइड-आधारित इमेजिंग, या धातु आधारित क्वांटिफिकेशन14का पता लगाने के लिए धातुओं की एक विस्तृत विविधता के लिए चेलेटेड किया जा सकता है। पोर्फिरिन का एक उदाहरण पायोफियोफोराइड (पायरो) है। लिपिड पर पायरो को संयोजित करके, माइक्रोबबल्स या बूंदों में पायरो-लिपिड को शामिल करने से उन्हें कई तौर-तरीकों के माध्यम से चित्रित और ट्रैक करने की अनुमति होती है: ध्वनिक रूप से, फ्लोरोसेंटली, और अवशोषण14के माध्यम से। इस मल्टी-मॉडल कंट्रास्ट एजेंट का उपयोग संचय को ट्रैक करने और निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। यह साथी नैदानिक एजेंटों की आवश्यकता को समाप्त कर सकता है क्योंकि मात्रात्मक घटक अब खोल पर संयुग्मित है, जिससे अधिक सटीक वितरण मात्रा16को सक्षम किया जा सकता है।
इसके साथ ही, मल्टी-मॉडल चरण-परिवर्तन पोर्फिरिन बूंदों को बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल रेखांकित किया गया है। चूंकि अल्ट्रासाउंड विरोधाभासों एजेंटों को ब्याज के ऊतकों में दवा वितरण के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि ट्यूमर2,4,अल्ट्रासाउंड से परे उनकी पता लगाने की क्षमता का विस्तार डिलीवरी प्रभावकारिता मात्राकरण के लिए उपयोगी साबित हो सकता है। इन बूंदों का उद्देश्य वीवो मेंनिष्क्रिय संचय में सक्षम ट्रैक करने योग्य अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट प्रदान करना है, सीटू वाष्पीकरण और ध्वनिकी में, और माध्यमिक सेंसरों पर निर्भरता के बिना पूर्व वीवो अंगों से जैव-वितरण या संचय की मात्रा निर्धारित करने की क्षमता के साथ। बायो-डिस्ट्रीब्यूशन सेंसर के रूप में पोर्फिरिन बूंदों की क्षमता को प्रदर्शित करने के लिए लक्षण वर्णन विधियों को भी रेखांकित किया गया है। खोल में पायरो-लिपिड लोडिंग के प्रभाव (मोलर अनुपात से 0% से 50%) पर भी चर्चा की जाती है।
सभी लिपिड घटकों को एक साथ जोड़ने के बाद (चरण 1.2 और 1.4.5, चित्रा 1 ए),क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल का एक समाधान (और पानी यदि डीएसपीए जैसे फॉस्फाटिड एसिड लिपिड मौजूद हैं) को यह सुनिश्चित करने के लिए जोड़ा गया था कि पायरो-लिपिड और गैर-पायरो लिपिड घटक पूरी तरह से समरूप थे (चरण 1.5, चित्रा 1B)। विषम लिपिड संरचना के साथ लिपिड वेसिकल्स के गठन को रोकने के लिए, भंग लिपिड को एक पतली फिल्म(चित्रा 1C)के रूप में शीशी की दीवार के इंटीरियर पर सुखा दिया गया था और लेपित किया गया था। कोटिंग (चरण 1.6) हाइड्रेशन (चरण 2.1 से 2.4) को भी आसान बनाता है क्योंकि यह सूखे फिल्म के सतह क्षेत्र को बढ़ाता है। सुखाने (चरण 1.6, चित्रा 1C)और वैक्यूमिंग (चरण 1.8, चित्रा 1D)को सुनिश्चित करने के लिए किया गया था ताकि क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल को पूरी तरह से सुखाया जा सके क्योंकि ये रसायन माइक्रोबबल के गठन को बाधित कर सकते हैं। जबकि प्रोटोकॉल को लिपिड समाधान की मात्रा को 1 एमएल जितना कम बनाने के लिए बढ़ाया जा सकता है, बड़ी मात्रा में शीशी-से-शीशी भिन्नता को कम किया जा सकता है। हालांकि यह उपयोग में नहीं रहते हुए पायरो-SPC अपमानजनक का खतरा चला सकता है, लिपिड समाधान (चरण 2.9 से 2.10) की भंडारण स्थिति उस जोखिम को कम करने के लिए थी। गैस एक्सचेंजर (चरण 2.9.2, चित्रा 1F और चित्रा 2)के साथ डीगैसिंग चरण ऑक्सीकरण को रोकने के लिए जितना संभव हो उतना ऑक्सीजन को खत्म करने का काम करता है। पोर्फिरिन-लिपिड युक्त लिपिड समाधानों को संग्रहीत करने की सिफारिश नहीं की जाती है जबकि वायुमंडलीय गैसें अभी भी समाधान(चित्रा 1E)में भंग हो जाती हैं।
चरण 2.10 में, लिपिड समाधान एक दबाव वाले हेडस्पेस के साथ सीरम शीशी में है, इसी तरह चिकित्सकीय रूप से अनुमोदित अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट परफ्लुट्रेन लिपिड माइक्रोस्फीयर बेचे जाते हैं (चित्र 1एफके समान)। आंतरिक कार्य से पता चला है कि यदि टोपी रबर डाट की तरह एक नरम सामग्री थी तो पायरो-लिपिड की उपस्थिति के साथ यांत्रिक आंदोलन के माध्यम से स्थिर माइक्रोबबल उत्पन्न नहीं किए जा सकते थे। इसलिए, लिपिड समाधान को गैर-रबर फेनोलिक कैप (चरण 4.1 से 4.4, चित्रा 3 ए और 3B)के साथ एक नमूना शीशी में स्थानांतरित कर दिया गया था। जब डेकाफ्लोरोबुटेन गैस को नमूना शीशी (चरण 4.1 से 4.4) में प्रवाहित किया गया था, तो डेंजर डेकाफ्लोरोबुटेन को नमूने शीशी हेडस्पेस में वायुमंडलीय हवा को विस्थापित करना चाहिए। वर्तमान में, यह अज्ञात है कि पायरो-लिपिड रबर डाट के साथ माइक्रोबबल बनाने में असमर्थ क्यों हैं। कोई पायरो-लिपिड के साथ, स्थिर माइक्रोबबल सीधे सीरम शीशियों में रबर डाट4,7के साथ बनाया जा सकता है। इस प्रकार, गैस एक्सचेंजर का उपयोग करके सीरम शीशी को फिर से दबाव बनाने और सीरम शीशी पर फिर से दबाव बनने की सिफारिश की जाती है, फिर सीरम शीशी को गैर-पायरो-लिपिड फॉर्मूलेशन4,5,6,7 (देखें “अन्य प्रोटोकॉल और डेटा” के लिए आंदोलन करते हैं)। सीरम शीशी में यांत्रिक रूप से उत्तेजित करने में सक्षम होने का लाभ हेडस्पेस पर दबाव बनाया जा सकता है और सीरम शीशी को उल्टा करके आकार-चयन किया जा सकता है8। इस प्रोटोकॉल में, 0% पायरो-लिपिड फॉर्मूलेशन को एक नमूना शीशी (चरण 4.1 से 4.4) में स्थानांतरित कर दिया गया था ताकि पायरो-लिपिड शामिल फॉर्मूलेशन के अनुरूप हो। इसके अतिरिक्त, लंबे समय तक एसील लिपिड चेन लंबाई बेहतर वैन डेर वाल्स इंटरैक्शन19के कारण अधिक स्थिर बूंदों में परिणाम देती है। लिपिड शेल संरचना को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध था, सभी लिपिड प्रकारों के लिए 18-एसील चेन लंबाई के आधार पर चुना गया था। DSPE-PEG5K को सभी फॉर्मूलेशन (चरण 1.1) में शामिल किया गया था क्योंकि पॉलीथीन ग्लाइकोल चेन की उपस्थिति प्रतिकारक स्टेक बलों19के माध्यम से संरचनाओं के संयोजन को रोकती है। लिपिड हाइड्रेशन के दौरान, बाथ सोनिकेटर बाथ को 18-एसील चेन लेंथ लिपिड फिल्म 18 को पूरी तरह से तितर-बितर करने के लिए काफी उच्च के रूप में 70 डिग्री सेल्सियस (चरण2.1)के लिए सेट किया गया था। अब एसील चेन लंबाई के लिए, उच्च तापमान की आवश्यकता होगी।
उच्च पायरो-लिपिड लोडिंग ऑप्टिकल रूप से अवशोषित और फ्लोरेसेपिंग घटकों की एकाग्रता में वृद्धि करेगी, जो कुछ अनुप्रयोगों के लिए वांछित हो सकता है जो अधिकतम पोर्फिरिन लोडिंग से लाभान्वित होते हैं। हालांकि, जैसे-जैसे पायरो-लिपिड सामग्री बढ़ी, नमूदार बूंद एकाग्रता में कमी आई और व्यास बढ़ गए(चित्र 4 और तालिका 1)। यह ऑप्टिकल फ्लोरेसेंस और अवशोषण गुणों बनाम बूंद एकाग्रता और व्यास के बीच एक व्यापार-बंद दिखाता है। शोधकर्ताओं के लिए है कि छोटे टपका हुआ जहाजों के माध्यम से वीवो संचय में के लिए छोटे व्यास को प्राथमिकता चाहिए या यदि बूंदों की एक उच्च एकाग्रता इंजेक्शन की जरूरत है, बढ़ती Pyro-लिपिड लोडिंग बूंदी डिमीटर में वृद्धि या बूंद एकाग्रता में कमी के लायक नहीं हो सकता है । यदि उच्च बूंद सांद्रता और/या छोटी बूंद व्यास सर्वोपरि हैं, तो इसी तरह के आकार के साथी नैदानिक एजेंटों पर पायरो-लिपिड के बजाय विचार किया जाना चाहिए । जबकि 1% पायरो-लिपिड बूंदों के परिणामस्वरूप एकाग्रता में कमी या आकार में वृद्धि नहीं हुई, 1% पायरो-लिपिड लोडिंग ऊतक पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंटी से यथोचित रूप से पता लगाने योग्य होने के लिए बहुत कम हो सकती है। हालांकि, पोर्फिरिन मोइज़िटी का लचीलापन कार्यात्मकता के लिए कई विकल्प प्रदान करता है जो कम एकाग्रता वाले अनुप्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त मात्राकरण के वैकल्पिक साधन प्रदान करेगा। उदाहरण के लिए, पायरो-लिपिड को पोसिटन उत्सर्जन टोमोग्राफी इमेजिंग और गामा गिनती20के लिए तांबे-64 के साथ या बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके ट्रेस-मेटल क्वांटिफिकेशन के लिए पैलेडियम के साथ या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग14के लिए मैंगनीज के साथ किया जा सकता है।
जबकि कुछ प्रयोगों के लिए केवल बूंद समाधान की एक छोटी मात्रा की आवश्यकता हो सकती है, 1.85 एमएल नमूना शीशी को भरने के लिए लिपिड समाधान के 1 एमएल की आवश्यकता होती है। Goertz एट अल का प्रदर्शन किया है कि हैंडलिंग, हेडस्पेस दबाव, तरल से गैस अनुपात में परिवर्तन, और यहां तक कि शीशी आकार सभी माइक्रोबबल आबादी को प्रभावित कर सकते हैं17। आंदोलन और आकार-चयन के दौरान शीशी का तापमान आकार वितरण को भी प्रभावित कर सकता है। इसलिए, अंतिम उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित तरीकों के लिए, बूंदों को बनाते समय जितना संभव हो उतना सुसंगत होना महत्वपूर्ण है। बिना खोली बूंदों को फ्रीज किया जा सकता है (-20 डिग्री सेल्सियस) और भविष्य के उपयोग के लिए बाद में गल सकता है लेकिन यह आकार की आबादी को प्रभावित करेगा।
आंदोलन प्रक्रिया जो माइक्रोबबल्स में लिपिड समाधान को सक्रिय करती है, एक रूपात्मक सजातीय आबादी (चरण 4.6) का उत्पादन नहीं करती है; बल्कि, नमूना माइक्रोबबल्स, मल्टीलैमलर वेसिकल्स, लिपोसोम्स, और मिसेल्स18, 21,22से भरा हुआ है । जबकि माइक्रोबबल आकार माइक्रोन और नैनोमीटर रेंज का विस्तार करते हैं, अन्य संरचनाएं काफी हद तक 800 एनएम 23से नीचे हैं। उपयोग की जाने वाली आकार तकनीकें इन विभिन्न संरचनाओं के बीच अंतर नहीं करती हैं, और इस प्रकार उत्तेजित माइक्रोबबल नमूने (चरण 4.6, चित्रा 3 सी)और बाद में संघनित बूंद नमूने (चरण 4.14, चित्रा 3F)को मिश्रण के रूप में माना जाना चाहिए। अल्ट्रासाउंड-असंवेदनशील विधानसभाओं (मल्टीलैमलर वेसिकल्स, लिपोसोम्स और मिसेल्स) की संभावना संघनन के बाद संरक्षित है और आकार में परिवर्तन नहीं होगा क्योंकि उनके पास चरण-परिवर्तनीय कोर नहीं हैं। चूंकि कल्टर काउंटर इन विभिन्न सुप्रामोलेक्यूलर विधानसभाओं के बीच अंतर नहीं कर सकता है, इसलिए संघनन के बाद जनसंख्या आकार में बदलाव की व्याख्या इस धारणा के साथ की जानी चाहिए कि नैनोस्केल संरचनाओं का कुछ अनुपात अचरज है और उस आकार के क्षेत्र में देखी गई आबादी में योगदान देता है। इसके अतिरिक्त, ये संरचनाएं इन नमूनों के स्पेक्ट्रोस्कोपिक और फ्लोरोसेंट हस्ताक्षरों में योगदान देती हैं14। मिकेल, लिपोसोम/वेसिकल्स और बूंदों के फ्लोरेसेंस और अवशोषण हस्ताक्षर सभी समान हैं, जिनमें फ्लोरेसेंस की उनकी डिग्री14को बुझाने की है । इस प्रकार, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि आंकड़े 3C से 3F में विधानसभाओं का मिश्रण है, चित्रा 4,पीबीएस पतला नमूना चित्रा 5में, और पीबीएस चित्रा 6में नमूना पतला ।
आकार-चयन और संघनन से पहले और संघनन (चरण 4.9) से पहले, गैर-उछाल वाले बुलबुले को गैर-प्रसन्न करने वाली विधानसभाओं से अलग करने के लिए माइक्रोबबल नमूने को अपकेंद्री करके गैर-बुलबुले विधानसभाओं को खत्म करना संभव है जैसा कि फेशिटन एट अल द्वारा वर्णित है।21 सेपरेशन की डिग्री को स्पिन बल और अवधि को समायोजित करके नियंत्रित किया जा सकता है। हालांकि, इस तरह के आकार-अलग नमूनों के माइक्रोबबल संघनन के प्रयोगों से पता चला है कि आकार अलगाव प्रक्रियाओं का उपयोग करके चुने गए बड़े अग्रदूत माइक्रोबबल आबादी का उपयोग करके बड़ी बूंदें मिलीं (पोस्ट-काता बुलबुला और बूंद आकार के लिए “अन्य प्रोटोकॉल और डेटा” चरण S5 देखें)। चूंकि इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पादित बूंदों का एक इच्छित आवेदन माइक्रोबबल4, 8कीतुलना में उनके छोटे आकार के कारण निष्क्रिय अपव्यवहार और संचय के लिए एक मंच है, इसलिए बूंदआबादीजो यथासंभव छोटी है वांछित थी। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल ने उत्तेजित माइक्रोबबल नमूनों का उपयोग किया जो अपकेंद्रित्र के माध्यम से आकार-अलग नहीं थे, भले ही इसका मतलब अल्ट्रासाउंड-असंवेदनशील माइकेल, लिपोसोम्स और वेसिकल्स अंतिम समाधान में मौजूद थे। इसका मतलब यह है कि जैव वितरण के लिए मात्राकरण प्रक्रियाओं इंजेक्शन संरचनाओं के सभी के लिए संकेत प्राप्त होगा और सिर्फ बूंदों तक ही सीमित नहीं हैं । हालांकि, चूंकि ये इसी तरह के आकार की संरचनाएं मुख्य रूप से आकार से तय होने वाले निष्क्रिय तंत्र के माध्यम से जमा होती हैं, इसलिए यह संदेह नहीं है कि यदि इस मंच का उपयोग वीवो मेंकिया जाना है तो इसे मुख्य निष्कर्ष ों को बदलना चाहिए, हालांकि इन सभी पहलुओं पर व्यक्तिगत रूप से विचार किया जाना चाहिए जिस संदर्भ में मंच का उपयोग किया जा सकता है। अल्ट्रासाउंड के साथ और बिना प्रयोगात्मक हथियारों का उपयोग करके परीक्षण यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि यह अल्ट्रासाउंड-संवेदनशील बूंदें हैं जो जैव-वितरण में किसी भी परिवर्तन के लिए जिम्मेदार हैं, क्योंकि समाधान में केवल परफ्लोरोकार्बन कोर असेंबली अल्ट्रासाउंड का जवाब देगी।
आंदोलन के बाद, शीशी को 15 मिनट के लिए विश्राम दिया गया और शीशी(चित्रा 3सी बनाम 3 डी)में एक विभाजन देखा गया। उछाल के माध्यम से आकार-चयन एक सक्रिय माइक्रोबबल समाधान8,17से बड़ी संरचनाओं/बुलबुले को नष्ट करने का एक सरल तरीका है। इस मामले में, 5 माइक्रोन से अधिक व्यास वाले कणों को ज्यादातर आकार-चयन(चित्र 4) केबाद हटा दिया गया था। आकार-चयन की सीमा को आकार-चयन17की अवधि को नियंत्रित करके ट्यून किया जा सकता है। शीरन एट अल ने दिखाया है कि आकार-चयन नहीं करने से उत्पन्न माइक्रोबबल्स हो सकते हैं जो वाक्यूल्चर 8 को ऑक्सीलेडकरतेहैं।
परफ्लोरोकार्बन्स को जैविक रूप से निष्क्रिय होने का लाभ होता है7. जबकि डेकाफ्लोरोबुटेन का उबलते बिंदु -1.7 डिग्री सेल्सियस है, शरीर के तापमान से ऊपर, बूंदों को 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 7B)के संपर्क में आने पर तुरंत वाष्पित नहीं किया जाता है। चूंकि बूंदें 37 डिग्री सेल्सियस पर मेटा-स्थिर होती हैं, इसलिए बूंदों को माइक्रोबबल्स7,9में वाष्पित करने के लिए अतिरिक्त ध्वनिक ऊर्जा की आवश्यकता होती है। पॉप्रोस्की एट अल ने दबाव22के माध्यम से संघनित पोर्फिरिन बूंदों का प्रदर्शन किया है। यह कम घने परफ्लोरोकार्बन का उपयोग करते समय एक व्यवहार्य और यहां तक कि आवश्यक विधि है लेकिन उच्च दबाव इस प्रक्रिया में कुछ बुलबुले को नष्ट कर सकता है। ऑक्टाफ्लोरोप्रोपेन (सी3एफ8)में -36.7 डिग्री सेल्सियस का उबलता बिंदु होता है, इसलिए बूंद संघनन के लिए ठंडा और दबाव दोनों की आवश्यकता होती है। हालांकि, हल्का परफ्लोरोकार्बन कम स्थिर बूंदों की ओर जाता है। डोडेकैफ्लोरोपेनटेन (सी5एफ12) 28डिग्री सेल्सियस के उबलते बिंदु के साथ अधिक स्थिर बूंदों का कारण बन सकता है। हालांकि, यह कमरे के तापमान पर एक तरल है और वाष्पीकरण के लिए मजबूत ध्वनिक ऊर्जा की आवश्यकता होगी। इस प्रकार, अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट की युक्त गैस के विकल्प को अपने निर्माण के मापदंडों के अलावा अपने इच्छित जैविक आवेदन की स्थितियों पर विचार करना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, संघनन के लिए आइसोप्रोपैनॉल स्नान -15 से -17 डिग्री सेल्सियस (चरण 4.7.1 और चरण 4.13) के लिए निर्धारित किया गया था, जबकि अन्य प्रोटोकॉल का उपयोग -10 डिग्री सेल्सियस 5,6। यहां तक कि एक आम डेकाफ्लोरोबुटेन कोर के साथ, संघनन तापमान एक्सपिएपिएंट संरचना, कुल लिपिड एकाग्रता और लिपिड शेल संरचना के आधार पर भिन्न हो सकता है। यदि अन्य योगों का उपयोग कर रहे हैं, तो समाधान को फ्रीज किए बिना उचित बूंद संघनन सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
चूंकि बूंदें अपने माइक्रोबबल अग्रदूत 7 की तुलना में छोटी और अधिक स्थिर होती हैं , इसलिए वे कुछ ट्यूमर प्रकार 4 ,24जैसे कुछ ऊतकों में बहिष्ती होने के लिए निष्क्रिय संचय तंत्र का बेहतर लाभ उठा सकती हैं । फ्लोरोसेंट, ऑप्टिकली शोषक, और पता लगाने के ध्वनिक तरीकों केसाथ,तेज की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक ही सूत्रीकरण का उपयोग करना संभव है। इसके अतिरिक्त, इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि क्या बूंदों का ध्वनिक वाष्पीकरण निष्क्रिय स्तर16से परे वितरित एजेंट अंश में सुधार कर सकता है। इंजेक्शन के बाद ऊतकों और ब्याज के अंगों में एजेंट जैव वितरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पायरो-लिपिड बूंदों की एक ज्ञात मात्रा जानवर में इंजेक्ट की जानी चाहिए, नियंत्रण सेट के आधार पर अल्ट्रासाउंड लागू किया जा सकता है या नहीं लगाया जा सकता है, जानवर को पूर्व-निर्दिष्ट समय-बिंदु का त्याग किया जाना चाहिए, और अंगों को हटाया जाना चाहिए और तौला जाना चाहिए। अंगों को ऊतक को डीसेलुलराइज करने के लिए सर्फेक्टेंट (डिटर्जेंट) में समरूप, फ़िल्टर किया जाना चाहिए, और पायरो संकेतों के आधार पर प्रति अंग द्रव्यमान इंजेक्शन खुराक प्रतिशत प्राप्त करने के लिए फ्लोरेसेंस या यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए। चरण 5.4.5(चित्रा 5)और चरण 5.5.5(चित्रा 6),ट्राइटन एक्स-100 सर्फेक्टेंट (डिटर्जेंट) का उपयोग नमूनों को बाधित करने के लिए किया गया था क्योंकि यह 410 एनएम पर गैर-फ्लोरोसेंट है और इसकी अवशोषण तरंगदैर्ध्य पायरो के साथ ओवरलैप नहीं होता है।
माइक्रोबबल्स को यूवी-विस अवशोषण के साथ विशेषता नहीं थी। चूंकि यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोप का लेजर स्रोत डिटेक्टर के समानांतर है, इसलिए कोई भी बड़े बुलबुले डिटेक्टर से प्रकाश को तितर-बितर कर सकते हैं, जिससे वे अधिक ऑप्टिकली शोषक14दिखाई देते हैं। यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के विपरीत, फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का डिटेक्टर है/डिटेक्टर के साथ हस्तक्षेप करने से स्रोत को रोकने के लिए लेजर स्रोत के लिए लंबवत होना चाहिए । यूवी-विस का उपयोग अक्षुण्ण और बाधित बूंद नमूनों (चरण 5.4, चित्र 5)के अवशोषण को निर्धारित करने के लिए किया गया था। 300 से 800 एनएम को सोरो-लिपिड के दो मुख्य अवशोषण बैंड, सोरेट बैंड (340 से 500 एनएम) और क्यू-बैंड (640 से 730 एनएम) के रूप में अवशोषण तरंगदैर्ध्य के रूप में चुना गया था, जो इस सीमा14के भीतर आते हैं। जब एक बूंद (या अन्य सुप्रामोलेकुलर संरचनाओं) में इकट्ठा होता है, तो पायरो-लिपिड की क्यू-बैंड चोटी को लाल-671 एनएम से 700 एनएम(चित्रा 5)में स्थानांतरित कर दिया जाता है। जब इस सुप्रामोलेक्यूलर संरचना को ट्राइटन जैसे सर्फेक्टेंट द्वारा बाधित किया जाता है, तो चोटी 671 एनएम14, 15में वापस आजातीहै। इस बदलाव के आधार पर यह बताना संभव है कि पायरो-लिपिड इकट्ठे अवस्था में हैं या बाधित अवस्था में । समय के साथ विधानसभाओं के क्षय का अनुमान लगाने के लिए दो चोटियों के अनुपात का उपयोग किया जा सकता है।
फ्लोरेसेंस मापन (चरण 5.5, चित्र 6)के लिए 410 एनएम की एक उत्तेजन तरंगदैर्ध्य को चुना गया था क्योंकि यह असेंबल किए गए पायरो-लिपिड14के लिए सोरेट बैंड पीक से मेल खाती है। 600 से 800 एनएम तक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य सीमा को पीबीएस में अक्षुण्ण विधानसभाओं की चोटियों के रूप में चुना गया था और ट्राइटन में बाधित पायरो-लिपिड इस सीमा के भीतर निहित हैं। फ्लोरेसेंस में बदलाव और वृद्धि(चित्रा 6)बरकरार (पीबीएस में 704 एनएम) और बाधित (ट्राइटन में 674 एनएम) नमूने संरचना-प्रेरित शमन के कारण हुए। इकट्ठे रूप में, पायरो-लिपिड अणुओं को एक साथ बारीकी से पैक किया गया था ताकि उत्पन्न फोटॉन पास के पायरो-लिपिड अणुओं द्वारा अवशोषित हो गए। यह अक्षुण्ण बनाम बाधित शमन दक्षता में स्पष्ट है । इस प्रकार, 1% ट्राइटन एक्स-100 जैसे सर्फेक्टेंट (डिटर्जेंट) में नमूनों को पतला करना आवश्यक है ताकि बुझाने और जैव-वितरण क्वांटिफिकेशन14के लिए सिग्नल को अधिकतम किया जा सके।
सादगी के लिए, एक ही रैखिक सरणी अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर का उपयोग वाष्पीकरण और छवि दोनों (चरण 6.5 और 6.7, चित्र 7)दोनों के लिए किया गया था। यह अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर (सामग्री की तालिका) बूंदों को वाष्पित करने के लिए आवश्यक चरम नकारात्मक दबावों तक पहुंचने में सक्षम था8। एक नल से deionized पानी के साथ एक टैंक भरने गैसों कि पानी में भंग हो उत्पन्न करता है (चरण ६.१) । वाष्पीकरण और इमेजिंग के साथ पानी में घुलित गैसों से हस्तक्षेप को कम करने के लिए, पानी को टैंक में 24 घंटे के लिए विश्राम दिया गया था ताकि पानी में गैसों को वायुमंडल (चरण 6.1) के साथ बराबरी करने की अनुमति दी जा सके। वैकल्पिक रूप से, डिएकाइज्ड पानी को पर्याप्त आकार के, सील करने योग्य कंटेनर के साथ डेगास किया जा सकता है जो पर्याप्त रूप से शक्तिशाली वैक्यूम से जुड़ा हुआ है। अल्ट्रासाउंड छवियों का प्रदर्शन माइक्रोबबल सफलतापूर्वक गाढ़ा के रूप में बूंदों अप्राप्य थे/ यह केवल उच्च उत्पादन दबाव पर था कि बूंदों को नमूदार, इकोजेनिक माइक्रोबबल्स(चित्रा 7D,7F, 7H)में वाष्पित किया गया था। जबकि बाद गाढ़ा बूंद नमूने में मिसेल और लिपोसोम/वेसिकल्स होते हैं, ये असेंबली गैर-इकोजेनिक होती हैं और केवल बूंदें इकोजेनिक माइक्रोबबल्स में वाष्पीकरण कर सकती हैं । बेसलाइन इमेज(आंकड़े 7A, 7C, 7E, 7G) स्थापितकरने के लिए प्रेत के माध्यम से एक पीबीएस नियंत्रण प्रवाहित किया गया था। जैसे-जैसे पीबीएस में दबाव बढ़ा, कोई कंट्रास्ट उत्पन्न नहीं हुआ। यह संकेत दिया है कि ट्रांसड्यूसर से उच्च दबाव अकेले पानी आधारित माध्यम में सहज कैविटेशन का उत्पादन नहीं कर सकता है, और इस प्रकार अन्य सभी उत्पन्न विपरीत अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंट को नियोजित किया जा सकता है। यदि आउटपुट दबाव बहुत अधिक है, तो उत्पन्न माइक्रोबबल नष्ट हो सकते हैं। दबाव को बढ़ाने और उत्पन्न विपरीत को देखकर, इष्टतम दबाव8पाया जा सकता है। बूंदों के आधे जीवन का परिसंचरण बूंदों को वाष्पित करके इसी तरह से निर्धारित किया जा सकता है और समय7के साथ उत्पन्न विपरीत को देख रहे हैं।
संक्षेप में, अलग-अलग पायरो-लिपिड सामग्री के साथ बहु-मॉडल चरण-परिवर्तन बूंदों को संघनन विधि के साथ बनाया गया था। आकार देने से पता चला है कि पायरो-लिपिड लोडिंग और माइक्रोबबल/बूंद एकाग्रता के बीच एक व्यापार बंद था । लक्षण वर्णन से पता चला है कि अवशोषण और फ्लोरेसेंस दोनों में अक्षुण्ण और बाधित रूपों में अंतर थे। अल्ट्रासाउंड इमेजिंग से पता चला कि बूंदें ३७ डिग्री सेल्सियस पर गैर-इकोजेनिक थीं और पर्याप्त दबावों पर इकोजेनिक माइक्रोबबल्स में वैप्रिजनल थीं । लक्षण ों ने पायरो-लिपिड बूंदों के लिए बूंदों जैव-वितरण या संचय परीक्षणों के लिए साथी नैदानिक एजेंटों को बदलने की क्षमता भी दिखाई। भविष्य का काम इन-सॉल्यूशन वाष्पीकरण थ्रेसहोल्ड, इन-सॉल्यूशन स्थिरता और नग्न चूहों में वीवो परिसंचरण अवधि की जांच करेगा।
The authors have nothing to disclose.
लेखक तकनीकी चर्चाओं के लिए गैस एक्सचेंजर और डॉ मिफी होक यान चेंग के निर्माण में मदद करने के लिए डॉ ब्रैंडन हेलफील्ड का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । लेखकों को निम्नलिखित धन स्रोतों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं: ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति, स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों, टेरी फॉक्स अनुसंधान संस्थान, और राजकुमारी मार्गरेट कैंसर फाउंडेशन ।
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-5000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880220 | Also known as "DSPE-PEG5K" |
1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 855775 | Also known as "DSPC" |
Aluminum Foil | Any brand | ||
Aluminum Seals, Tear-Off | VWR | 16171-840 | Standard Aluminum, 13 mm outer diameter |
Bath Sonicator | Any brand | Capable of sonicating and heating up to 70 °C, | |
Bio-Stor Screw Cap Vials | National Scientific | BS20NABP | Plastic, 2 mL Skirted, with O-ring |
Borosilicate glass clear serum vials | VWR | 16171-285 | 3 mL, 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter |
Borosilicate Glass Sample Vial with Phenolic Screw Cap | VWR | 66011-020 | 1.85 mL, Short Form Style, 12 mm outer diameter, 35 mm height, 8-425 cap size |
Borosilicate Glass Vial with Screw-On cap | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
Chloroform | Any brand | ||
Coulter Counter Elctrolyte Diluent | Any brand | Compatible with Coulter Counter | |
Decafluorobutane (C4F10) | FluoroMed | 355-25-9 | |
Deionized Water | Any brand | ||
Dry Ice (Carbon Dioxide) | Any brand | ||
Dynamic Light Scattering (DLS) Particle Analyzer | Any brand | Capable of temperature control | |
E-Z Crimper, 13 mm | Wheaton | W225302 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
E-Z Decapper, 13 mm | Wheaton | W225352 | 13 mm Standard Aluminum Seals |
Fluorescent Spectrophotometer | Any brand | Capable of 400 to 600 excitation and 300 to 800 nm emission detection, detector perpendicular to laser source | |
Fluorescent Spectrophotometer Compatible Cuvette | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm, all four sides are optical windows | |
Gas Exchanger | Made in-house | Refer to Supplementary Information – "Other Protocols and Data" for assembly instructions. | |
Glass syringes | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
GLWR Custom Aperture Tube 10 um | Beckman Coulter | B42812 | 10 µm aperture, compatible with Beckman Coulter MultiSizer 4e |
Glycerol | Any brand | ||
Insulated Styrofaom containers with lids | Any brand | ||
Isopropanol | Any brand | ||
Lyophilization-Style Rubber Stoppers | VWR | 71000-060 | 7 mm inner mouth diameter, 13 mm outer mouth diameter, 2-leg, Chlorobutyl |
Membrane Diaphram Vacuum Pump | Sartorius Stedim | 16694-1-60-06 | Adjustable pressure |
Metal Tongs | Any brand | ||
Methanol | Any brand | ||
MS250 21 MHz Linear Array Ultrasound Transducer | VisualSonics | 21 MHz, Capable of B-mode and non-linear imaging. | |
MultiSizer 4e | Beckman Coulter | Capable of sizing from 0.2µm to 6 µm | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 567-0010 | Polyethersulfone (PES) membrane, 0.1μm pore size, 1000 mL volume. As Isoton II is non-sterile, can use Filter units multiple times |
Needles, Conventional | BD | 305176 | 20 gauge, 1.5 inch length |
Nitrogen Gas | Any brand | Make sure there are regulator valves and tubes to direct the flow. Setup will be dependend on brand and source. | |
Parafilm | Any brand | Called "wax film" in the protocol. | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Any brand | 1X, 7.4 pH | |
Pipette | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
Pipette Tips | Any brand | Sizes will depend on desired volumes | |
Plastic Syringes | Any brand | 1 mL, 3 mL, and 30 mL. With Luer Lock connections | |
Polyethersulfone (PES) Membrane Filter | Any brand | 0.2 µm pore size | |
Propylene Glycol | Any brand | ||
Pyropheophorbide conjugated 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine | Made in-house | Also known as "Pyro-SPC". Refer to "Supplementary Information – Other Protocols and Data" for synthesis. | |
Thermometer | Any brand | (-20 to 100 °C) | |
Triton X-100 | Any brand | Also known as "2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol" | |
Ultrapure Water | Any brand | Type 1 Purity | |
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer | Any brand | Capable of absorbance from 300 to 800 nm, at least 0.5 nm resolution | |
Ultraviolet–Visible (UV-Vis) Spectrophotometer Compatible Cuvette, 1 cm Path Length | Any brand | Can hold at least 2 mL, capable of 300 to 800 nm | |
Vacuum Desiccator | Any brand | ||
Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform | VisualSonics | Pre-clinical ultrasound imaging system | |
Vialmix | Bristol-Myers-Squibb | Called "mechanical agitator" in the protocol. Agitates for 45 s. | |
Vortex Mixer | Any brand |