Summary
Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode simple de croissance, de purification, et de titrage du virus oncolytique de simplex d’herpès pour l’usage préclinique.
Abstract
Les virus oncolytiques (OV), tels que le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV), sont une stratégie de traitement en croissance rapide dans le domaine de l’immunothérapie du cancer. Les VQ, y compris le VSS O, se répliquent sélectivement dans les cellules cancéreuses et les tuent (épargnant les cellules saines/normales) tout en induisant une immunité antitumorale. En raison de ces propriétés uniques, les stratégies de traitement basées sur le vHS OHS sont de plus en plus utilisées pour le traitement du cancer, précliniquement et cliniquement, y compris le talimogene laherparevec (T-Vec) approuvé par la FDA. La croissance, la purification et le titrage sont trois techniques de laboratoire essentielles pour tout OV, y compris les VHSO, avant qu’ils ne puissent être utilisés pour des études expérimentales. Cet article décrit une méthode simple étape par étape pour amplifier l’oHSV en cellules de Vero. À mesure que les vhso se multiplient, ils produisent un effet cytopathique (CPE) dans les cellules vero. Une fois que 90-100% des cellules infectées montrent un CPE, elles sont doucement récoltées, traitées avec de la benzonase et du chlorure de magnésium (MgCl2),filtrées, et soumises à la purification utilisant la méthode de saccharose-gradient. Après purification, le nombre d’oHSV infectieux (désigné comme unités formant plaque ou PPU) est déterminé par un « test de plaque » dans les cellules Vero. Le protocole décrit ici peut être employé pour préparer le stock d’oHSV de haut-titre pour des études in vitro dans la culture cellulaire et les expériences in vivo d’animal.
Introduction
Les virus oncolytiques (VE) sont une forme émergente et unique d’immunothérapie du cancer. Les OV se répliquent sélectivement dans les cellules tumorales et les lysent (épargnant les cellules normales/saines)1 tout en induisant une immunité antitumorale2. Le virus oncolytique de l’herpès simplex (oHSV) est l’un des virus les plus étudiés parmi tous les OVs. Il est le plus avancé dans la clinique, talimogene laherparepvec (T-VEC) étant le premier et le seul OV à recevoir l’approbation de la FDA aux États-Unis pour le traitement du mélanome avancé3. En plus du T-VEC, de nombreux autres oHSVs génétiquement modifiés sont testés précliniquement et cliniquement dans différents types de cancer3,4,5,6,7,8. La biotechnologie avancée actuelle de l’ADN recombinant a encore augmenté la faisabilité de l’ingénierie de nouveaux oHSVs codant pour le(s) transgène(s) thérapeutique(s)3,5. Un système efficace de propagation, de purification et de détermination du titre de l’oHSV est essentiel avant qu’un oHSV (nouvellement développé) puisse être testé pour des études in vitro et in vivo. Cet article décrit une méthode simple étape par étape de croissance de l’oHSV (dans les cellules vero), de purification (par la méthode de gradient de saccharose) et de titrage (par un dosage de plaque de l’oHSV dans les cellules de Vero)(Figure 1). Il peut être facilement adopté dans n’importe quel laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL2) pour obtenir un stock viral de haute qualité pour les études précliniques.
Vero, une lignée cellulaire de rein de singe vert africain, est la lignée cellulaire la plus couramment utilisée pour la propagation de l’oHSV9,10,11,12, 13carles cellules Vero ont une voie de signalisation antivirale d’interférondéfectueuse 14. D’autres lignées cellulaires avec stimulateur inactivé des gènes d’interféron (STING) signalisation peuvent également être utilisés pour la croissance de l’oHSV12,13. Ce protocole utilise des cellules Vero pour la croissance d’oHSV et l’analyse de plaque. Après la propagation, les cellules infectées par le vHSo sont récoltées, lysées et soumises à une purification, dans laquelle les cellules lysées sont d’abord traitées avec de la nucléase benzonase pour dégrader l’ADN de la cellule hôte, empêcher l’agrégation acide nucléique-protéine et réduire la viscosité du lysat cellulaire. Comme l’activation correcte de la benzonase nécessite souventmg2+,1-2 mMMgCl2 est utilisé dans ce protocole15. Les débris de cellules hôtes du lysat de cellules benzonase-traités sont en outre éliminés par filtration en série avant la centrifugation à gradient de saccharose à grande vitesse. Un coussin visqueux de solution de saccharose à 25% aide à assurer un taux de migration plus lent du virus à travers la couche de saccharose, laissant les composants liés à la cellule hôte dans le surnageant, améliorant ainsi la purification et limitant la perte de virus dans la pastille16. L’oHSV purifié est ensuite titré sur les cellules Vero, et les plaques virales sont visualisées par coloration Giemsa17 ou coloration X-gal (pour lacZ codant oHSVs)18.
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Protocol
1) Croissance de l’oHSV
NOTA : Assurer l’approbation du comité de biosécurité de l’établissement avant de travailler avec le VSSO. Cette étude a été menée dans le cadre du Protocole N° 18007 approuvé par le CIB. Maintenir les précautions BSL2 : blanchir toutes les pipettes, pointes, tubes et autres matières qui entrent en contact avec le virus. Vaporisez les gants avec 70% d’alcool isopropylique avant que les mains ne quittent la hotte de culture cellulaire BSL2. Lavez-vous toujours soigneusement les mains à l’eau savonneuse après avoir travaillé avec un virus.
- Le jour -1, ensemencer des cellules Vero à faible passage dans des fioles de20 T-150 cm 2 à une densité de 7-8 × 106 cellules/fiole en milieu cellulaire vero régulier.
REMARQUE : Le milieu vero est préparé en complétant le milieu eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (IFCS). - Le jour 0 (les cellules sont confluentes à 80-90%), ajouter l’inoculum oHSV sur les cellules Vero.
- Préparation du virus inoculum
- Utilisez une multiplicité d’infection (MOI) de 0,01 (MOI peut varier de 0,01 à 0,1 selon la capacité de réplication du virus) pour l’amplification du virus. Utilisez la formule (1) pour calculer la quantité de virus (mL) pour 20 fioles.
Quantité de virus (mL) pour 20 fioles = quantité de virus nécessaire (pfu)/titre du stock de virus (pfu/mL)(1) - Utiliser la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco à haute teneur en glucose, complétée par un IFCS à 1 % pour préparer l’inoculum du virus (7 mL par fiole T-150 cm2, c.-à-d. environ 140 mL pour 20 fioles). Ajouter la quantité requise d’oHSV à 140 mL de solution de DPBS à haute teneur en glucose/1% d’IFCS, vortex pendant 1 min, et garder le mélange prêt pour l’ajout aux cellules Vero.
- Utilisez une multiplicité d’infection (MOI) de 0,01 (MOI peut varier de 0,01 à 0,1 selon la capacité de réplication du virus) pour l’amplification du virus. Utilisez la formule (1) pour calculer la quantité de virus (mL) pour 20 fioles.
- Laver les fioles T-150 cm2x avec du DPBS à haute teneur en glucose complété par un IFCS à 1% (10 mL/lavage). Aspirer le DPBS/IFCS à 1 % et ajouter 7 mL de fiole d’inoculum du virus/T-150 cm2.
- Balancer doucement les fioles pendant 5 min à l’aide d’une bascule à ballon pour une bonne répartition de l’inoculum sur la monocouche Vero, puis incuber les fioles à 37 °C pendant 1,5 à 2 h. Assurez-vous que l’étagère de l’incubateur est de niveau.
- Retirer l’inoculum et ajouter le DMEM complété par 1 % d’IFCS (25 mL/fiole). Incuber les fioles pendant 2-4 jours.
- Préparation du virus inoculum
- Vérifiez quotidiennement les fioles pour 90-100% CPE (voir figure 2).
- Récoltez les cellules vero infectées par le vhso.
- Recueillir le surnageant de culture (~20 mL) de chaque fiole (laisser ~5 mL dans chaque fiole) dans des tubes à centrifuger coniques ou un contenant de support de 50 mL.
- Utilisez un grattoir à cellules pour gratter doucement les cellules du fond des flacons.
REMARQUE: Les cellules doivent rapidement se détacher des flacons. - Ajouter ~15 mL du surnageant de culture (recueilli à l’étape 1.4.1) à chaque fiole (ce qui porte le volume d’environ 20 mL dans chaque fiole, soit 400 mL pour 20 fioles) et laver délicatement le fond des fioles à quelques reprises à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL.
Remarque : Ne pas pipet vigoureusement. Visez à garder toutes les cellules intactes. - Recueillir les cellules (+ milieu) dans des tubes à centrifuger coniques de 50 mL sur de la glace (utiliser 8 tubes pour contenir 400 mL de cellules récoltées dans 20 flacons).
- Faire tourner les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
- Ajouter 1,25 mL (50 %) de tampon antivirus (VB) et 1,25 mL (50 %) de surnageant de culture (recueilli à l’étape 1.4.1) dans chaque tube de centrifugation et re-suspendre soigneusement chaque pastille. Transférer les cellules remises en suspension de huit tubes à centrifuger de 50 mL vers un tube de centrifugation conique de 50 mL.
Remarque : Reportez-vous à la préparation de la solution VB dans le tableau 1. Filtrer-stériliser la solution VB à l’aide d’un filtre de stérilisation de milieu. Utiliser 0,5 mL de VB + 0,5 mL de surnageant par fiole T-150 cm2 pour la re-suspension, c’est-à-dire pour 20 fioles (20 mL), utiliser 10 mL de VB et 10 mL de surnageant de culture. - Congeler les cellules re-suspendues à l’aide de glace carbonique/éthanol à 100 % et les conserver à -80 °C.
2) Purification de l’oHSV
- Gel instantané (dans la glace carbonique et 100% éthanol)/dégel (dans un bain d’eau chaude à 37 °C) les cellules suivies d’une sonication au bain-marie pendant 1 min pendant un total de 3 cycles pour assurer une lyse appropriée des cellules pour libérer le virus dans le surnageant.
REMARQUE: Effectuez une sonication pendant 1 min en utilisant une puissance de 40 kHz et 120 V. Si un sonicateur accordable n’est pas disponible, utilisez un sonicateur de bain d’eau à ultrasons. Prenez une aliquote de 50 μL pour le titrage à la section 3, ce qui aidera à déterminer laquelle des étapes suivantes est responsable de la perte potentielle du virus pendant la procédure de purification. - Traiter le lysat cellulaire avec de la benzonase nucléase (175 unités/mL) + 2 mMMgCl2 (1 M stock = 2 μL/mL), du vortex et incuber pendant 30 min à 37 °C. Placez le tube sur de la glace et effectuez les étapes suivantes à 4 °C.
- Pelleter les débris cellulaires par centrifugation à basse vitesse.
- Faire tourner le lysat cellulaire à 300 g pendant 10 min.
- Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (remettre en suspension le granulé cellulaire dans 0,5 mL de VB, le désigner comme granulé-1 et le stocker à 4 °C pour l’utiliser à l’étape 2.3.5; voir figure 1).
- Faire tourner à nouveau le surnageant (obtenu à l’étape 2.3.2) à 500 g pendant 10 min.
- Recueillir le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (remettre en suspension le granulé cellulaire dans 0,5 mL de VB, le désigner comme granulé 2 et le stocker à 4 °C pour l’utiliser à l’étape 2.3.5; voir figure 1).
- Mélanger le granulé-1 en suspension (à partir de 2.3.2) et le granulé-2 (à partir du point 2.3.4) dans un nouveau tube à centrifuger de 1,7 mL, un vortex/sonique (bain d’eau) 2x, et tourner à 400 g pendant 10 min. Prélever le surnageant et le combiner avec le surnageant obtenu à l’étape 2.3.4 ; voir figure 1).
REMARQUE: Effectuez la sonication pendant 1 min en utilisant une puissance de 40 kHz, 120 V pour empêcher l’agrégation virale avant la procédure de filtration à l’étape 2.4. Prendre une aliquote de 50 μL du surnageant combiné pour le titrage à la section 3.
- Filtrer le surnageant combiné (~21 mL, c.-à-d. 20 mL de 1.4.6, 0,5 mL de 2.3.2 et 0,5 mL de 2.3.4) en utilisant la méthode de filtration en 3 étapes suivante.
- Prélever 21 mL du surnageant à l’aide d’une seringue de 10 mL (5-7 mL à chaque fois pour faciliter le passage à travers le filtre) et le faire passer à travers un filtre à membrane stérile de 5 μm de difluorure de polyvinylidène (PVDF) placé sur un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (étiqueté tube 1).
- Ajouter 1 mL de VB à un tube de centrifugeuse conique de 50 mL vidé au point 2.4.1 (pour recueillir la quantité infime restante de surnageant viré), vortex, et passer à travers le même filtre PVDF de 5 μm placé sur le TUBE 1 (portant le total à 22 mL de filtrat). Passez à l’étape 2.4.2.
- Prélever 22 mL du filtrat du TUBE 1 (comme au point 2.4.1) et le faire passer à travers un filtre à membrane stérile à ester de cellulose mixte (ECM) de 0,8 μm placé sur un nouveau tube à centrifugeuse conique de 50 mL (étiqueté tube 2).
- Ajouter 1 mL de VB au TUBE 1 vidé à l’étape 2.4.2, vortex, et le faire passer à travers le même filtre MCE de 0,8 μm placé sur le TUBE 2 (portant le total à 23 mL de filtrat). Passez à l’étape 2.4.3.
- Prélever 23 mL de filtrat du TUBE 2 (comme au point 2.4.1) et le faire passer à travers un filtre PVDF stérile de 0,45 μm placé sur un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (étiqueté tube 3).
- Ajouter 1 mL de VB au TUBE 2 vidé à l’étape 2.4.3, vortex, et le faire passer à travers le même filtre PVDF de 0,45 μm placé sur le TUBE 3 (portant le total à 24 mL de filtrat).
NOTA : Prendre une partie aliquote de 50 μL du filtrat pour le titrage à la section 3.
- Ajouter 1 mL de VB au TUBE 2 vidé à l’étape 2.4.3, vortex, et le faire passer à travers le même filtre PVDF de 0,45 μm placé sur le TUBE 3 (portant le total à 24 mL de filtrat).
- Prélever 21 mL du surnageant à l’aide d’une seringue de 10 mL (5-7 mL à chaque fois pour faciliter le passage à travers le filtre) et le faire passer à travers un filtre à membrane stérile de 5 μm de difluorure de polyvinylidène (PVDF) placé sur un nouveau tube de centrifugation conique de 50 mL (étiqueté tube 1).
- Centrifugation à grande vitesse utilisant la méthode du gradient de saccharose
REMARQUE: Un rotor F13-14x50cy à angle fixe a été utilisé dans ce protocole. Le rotor et la centrifugeuse doivent être à 4 °C avant de procéder aux étapes suivantes.- Ajouter 10 mL d’une solution de saccharose à 25 % glacée et filtrée stérile (préparée en dissolvant 25 g de poudre de saccharose dans 100 mL de la solution saline équilibrée de Hank) dans un nouveau tube de centrifugeuse conique de 50 mL.
- Ajouter lentement (3 mL/min) 24 mL du filtrat du virus (obtenu à l’étape 2.4.3.1) au-dessus de la couche de saccharose. Prenez soin de maintenir des couches séparées du filtrat de virus et de la solution de saccharose.
REMARQUE: Jusqu’à 30 mL de la couche virale peuvent être ajoutés sur 10 mL de la solution de saccharose. - Centrifuger le tube pendant 90 min à 22 620 g à 4 °C.
- Retirer le surnageant et la couche de saccharose du tube de centrifugation conique de 50 mL.
REMARQUE: Le culot de virus doit être blanchâtre. Prendre une aliquote de 50 μL du surnageant et une aliquote de 50 μL de la couche de saccharose pour le titrage à la section 3.
- Re-suspendre le culot dans une solution de glycérol/PBS à 10 %.
- Ajouter 1 mL de glycérol stérile à 10 % (dilué dans du PBS) au tube de centrifugation conique de 50 mL pour couvrir la pastille.
NOTA : La quantité du mélange en suspension peut varier (par exemple 0,8 à 1,2 mL) en fonction de la taille de la pastille. Un volume plus petit donnerait une concentration plus élevée de virus. - Placer le tube de centrifugation conique de 50 mL sur de la glace pendant 2-4 h. Pendant cette période, soniquez/vortex la pastille toutes les 15 minutes pendant 30 s pour aider à déloger/re-suspendre la pastille.
- Recueillir la pastille en suspension (1 mL de glycérol à 10% / PBS + la taille de la pastille amènera le volume total à ~ 1,3 mL) dans un tube de microcentrifugation de 2 mL. [Facultatif : Ajouter un autre 0,3 mL de glycérol/PBS à 10 % au même tube de centrifugation conique de 50 mL pour recueillir la quantité de trace restante de la pastille, pipet de haut en bas, et combiner avec la pastille re-suspendue à l’étape 2.6.3 pour porter le volume total à ~1,6 mL.]
- Si la suspension à l’étape 2.6.3 est trouble ou trouble (due à des débris cellulaires), centrifuger le tube à 500 g pendant 10 min, transférer le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 2 mL et passer à l’étape 2.6.4.
- Prendre une aliquote de 50 μL pour le titrage du vHS OHS à la section 3. Aliquote le reste de la solution (250 μL/aliquote) dans des tubes de microcentrifugation stériles avec bouchons à vis (bien scellés pour le stockage à long terme), congélation instantanée et conservation à -80 °C jusqu’à l’utilisation (prête pour des études expérimentales une fois le titre de l’oHSV déterminé).
NOTA : Toutes les matières qui entrent en contact avec le virus doivent être blanchies ou traitées par rayonnement ultraviolet avant d’être retirées de la hotte ou éliminées.
- Ajouter 1 mL de glycérol stérile à 10 % (dilué dans du PBS) au tube de centrifugation conique de 50 mL pour couvrir la pastille.
3. Titrage du vHS OHSV et dosage de la plaque
- Semences 1,7-1,8 x 105 cellules vero/puits dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits en milieu cellulaire vero (DMEM avec 10% IFCS; voir étape 1.1).
REMARQUE: Assurez-vous que les cellules sont réparties de manière homogène dans tout le puits; ne faites pas tourbillonner la plaque, ce qui peut provoquer une accumulation de cellules au milieu des puits. Pour éviter de tourbillonner, basculez lentement la plaque à la main verticalement, puis horizontalement, puis placez doucement la plaque dans l’incubateur. - Le lendemain (quand les cellules atteignent 70-80% confluence), aspirez le milieu de culture, et ajoutez 1 mL/puits de PBS de haut-glucose complété avec 1% IFCS. Laisser la plaque dans la hotte de culture cellulaire jusqu’à ce que l’étape 3.3 soit terminée.
- Diluer le virus en série dans des tubes de polypropylène de 5 mL à l’aide de PBS/IFCS à 1 %(figure 3).
NOTA : Utiliser la partie aliquote de 50 μL recueillie à l’étape 2.6.4 pour la dilution en série. Dans le1er tube (dilution 10-3), ajouter 2 μL du virus en 1998 μL de PBS/1 % IFCS, vortex. Dans le 2ième tube (dilution 10-5), prendre 10 μL du 1er tube dans 990 μL de PBS/1% IFCS, vortex. Dans le3ème tube (dilution 10-6), prendre 100 μL du 2ème tube dans 900 μL de PBS/1% IFCS, vortex; poursuivre cette dilution sérielle 10 fois jusqu’à une dilution de 10à 9. Voir les détails dans Figure 3. - Aspirer pbs/1% IFCS, et ajouter 0,7 mL/puits du virus dilué en série (à partir de10-5 à 10-9) aux cellules vero.
REMARQUE: Ne laissez pas les cellules sécher. - Balancer doucement la plaque sur une bascule pendant 5 min à température ambiante (pour assurer une distribution homogène de l’inoculum du virus).
- Incuber la plaque pendant 1,5 h à 37 °C.
REMARQUE: Pendant cette période d’incubation, préparer une dilution de 1:1000 de l’immunoglobuline humaine G (IgG) dans le DMEM complété par un IFCS à 1%. Pour une plaque de 6 puits, préparer 12,5 mL de sorte que 2 mL/puits puissent être utilisés à l’étape 3.7. Ajuster la dilution pour tenir compte des variations de lot dans les IgG humaines. - Retirer l’inoculum du virus des puits et ajouter 2 mL/puits d’IgG humaine à 0,1 % (pour neutraliser l’oHSV dans le milieu de culture et prévenir la formation de plaques secondaires) dans du DMEM complété par 1 % d’IFCS. Incuber la plaque à 37 °C pendant 3-4 jours.
REMARQUE: Les plaques claires se forment généralement en 3 jours. - Plaques de fixation et de coloration
- Retirez le surnageant et fixez les cellules dans du méthanol pur (1 mL/puits) pendant 5 min. Retirez le méthanol et laissez les plaques sécher à l’air.
- Diluer la tache de Giemsa (1:5) avec de l’eau désionisée et ajouter 1 mL de la tache de Giemsa diluée par puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 10-15 min.
- Enlevez la tache, rincez à l’eau du robinet et laissez les plaques sécher à l’air.
- Comptez les plaques à l’aide d’un microscope à dissection.
- Facultatif pour les vHS o avec expression lacZ :
- Retirez le surnageant et fixez les cellules avec du glutaraldéhyde à 0,2% froid / 2% de paraformaldéhyde pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.
- Retirez la solution fixatrice et lavez les cellules 3x avec du PBS.
- Ajouter une solution X-gal aux cellules (1 mL/puits) et incuber la plaque à 37 °C pendant 2 h.
REMARQUE: La tache X-gal doit être préparée fraîchement le jour de la coloration; le stockage à long terme peut entraîner une décoloration de la couleur. Voir la préparation de la solution X-gal dans le tableau 1. - Retirez la tache X-gal et lavez la plaque avec de l’eau du robinet pendant 1 min.
- Contre-coloration avec solution rouge neutre (1 mL/puits) pendant 2 min à température ambiante.
NOTA: Voir préparation de la solution rouge neutre dans le tableau 1. - Laver l’assiette avec de l’eau du robinet pendant 1 min; laisser sécher les plaques à l’air.
- Comptez les plaques bleues à l’aide d’un microscope à dissection (Figure 4).
- Calculer le titre à l’aide de la formule (2)
Titre en pfu/mL (unités formant plaque) = Nombre de plaques/0,7 mL facteur de dilution × (2)
REMARQUE: Par exemple, si 25 plaques sont trouvées dans le puits de dilution10 -9, le titre est de 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/mL. Il s’agit du titre final oHSV des aliquotes préparées à l’étape 2.6.4.
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Representative Results
Un bref aperçu de l’ensemble du protocole est représenté à la figure 1,qui représente les étapes critiques impliquées dans la croissance, la purification et le titrage de l’oHSV. Les CPE dans les cellules Vero peuvent être détectées dès 4 h après l’infection par le VHS19. La figure 2 montre l’ŒP dans les cellules Vero à trois moments différents suivant l’infection par le VHSO. Le niveau du CPE augmente au fil du temps. Dans ce protocole, on observe habituellement 90-100% CPE dans les 48 h de l’inoculation de bas-MOI oHSV (qui est le meilleur moment pour récolter des cellules pour la purification). Cependant, cela peut prendre jusqu’à 4 jours en fonction du MOI oHSV inoculé à l’étape 1.2 et/ou du potentiel de réplication de l’oHSV. Au-delà de cette période, les cellules avec CPE peuvent être lysées, conduisant à la libération du virus dans le surnageant. Ainsi, pour obtenir un titre viral élevé, il est essentiel de récolter les cellules CPE-affectées quand elles sont intactes. Un autre facteur important qui contribue au titre final du virus est le nombre ou la taille des flacons de culture tissulaire utilisés pour l’amplification du vHSo. La figure 3 représente le processus de dilution en série (10-3 à 10-9) d’un stock de virus donné (obtenu à l’étape 2.6.4) nécessaire à la détermination du titre par l’essai de plaque. Pour les vHS o avec expression lacZ, les plaques virales peuvent être visualisées par coloration X-gal (Figure 4). Dans ce protocole, on a utilisé 20 fioles de culture tissulaire T-150 cm2, pour lesquelles on peut s’attendre à 1,3-1,6 mL de stock d’oHSV avec un titre de 1 ×10 10 pfu/mL.
Figure 1: Présentation schématique des principales étapes impliquées dans la croissance, la purification et l’analyse de la plaque de l’oHSV. Abréviations : oHSV = virus oncolytique de l’herpès simplex; CPE = effet cytopathique; VB = Tampon de virus; HBSS = Solution saline équilibrée de Hank; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Effet cytopathique dans les cellules vero après une infection par le vhso. Des cellules de Vero ont été inoculées avec le codage d’oHSV pour mCherry (montré dans la fluorescence rouge) à un MOI de 0,01 et irfées (grossissement de 10x) à l’infection de poteau-virus de 36, 48, et 72 h. Le CPE est identifié par l’arrondissement des cellules infectées par l’oHSV (indiquées par des flèches noires). Barres d’échelle = 200 μm. Abréviation : oHSV = virus oncolytique de l’herpès simplex. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Dilution en série d’un stock d’oHSV pour les essais de plaque. Voir aussi l’étape 3.3 du protocole. Abréviation : oHSV = virus oncolytique de l’herpès simplex. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Image représentative de plaques tachées de X-gal à 72 h après l’infection par le VHSO. Surnageants de culture cellulaire infectés par le VHSO non dilués (puits supérieur) et dilués (1:10; puits inférieur) ajoutés aux cellules Vero (confluents à 70-80 %), suivis du protocole de coloration X-gal décrit à la section 3.8.5 (à l’exclusion de la contre-coloration avec du rouge neutre). Des images représentatives d’une plaque virale colorée par X-gal (à partir du panneau de gauche) sont présentées dans les panneaux du milieu (4x; barres d’échelle = 1000 μm) et de droite (10x; barres d’échelle = 200 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Solution Composition | |
| Préparation de la mémoire tampon antivirus | quantité |
| 1 M Chlorure de sodium | 15 mL |
| 1 M Tris-chlorhydrate | 3 mL |
| Eau purifiée | 132 mL |
| ajuster le pH à 6,8 | |
| Préparation d’une solution X-gal (~6,5 mL pour une plaque de 6 puits) | |
| Ferricyanure de potassium 250 mM | 130 μL |
| Ferrocyanure de potassium de 250 mM | 130 μL |
| 1 M Chlorure de magnésium | 13 μL |
| X-gal pré-dissous (20 mg/mL) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) | 162,5 μL |
| Pbs | 6064,5 μL |
| Préparation d’une solution rouge neutre pour une plaque de 6 puits | |
| Solution rouge neutre | 100 μL |
| méthanol | 1 mL |
| Eau purifiée | 7 mL |
Tableau 1 : Composition de la solution.
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Discussion
Le protocole commence par la croissance de l’oHSV dans les cellules Vero à faible passage. La confluence de la monocouche de cellules Vero devrait être d’environ 80% au moment de l’inoculation du virus, car les cellules envahies par la prolifération peuvent développer des structures fibreuses serrées qui peuvent réduire l’entrée de l’oHSV dans les cellules vero20. Une fois que 90-100% CPE est observé, le surnageant de culture est retiré, les cellules sont récoltées, remises en suspension dans VB / surnageant (voir étape 1.4.6), congelées en pression et stockées à -80 ° C pour une purification ultérieure. Blaho et ses collègues ont utilisé une méthode légèrement différente de récolte et de stockage des cellules Vero infectées. Par exemple, les fioles contenant les cellules et les milieux de culture (complétées par 1 % d’albumine sérique bovine et le PBS avec du potassium) sont initialement conservées à -80 °C pendant au moins 15 min, suivies d’un lent réchauffement des fioles à température ambiante. Les cellules sont ensuite récoltées, mélangées avec du lait stérile, et conservées à -80°C jusqu’à la purification20. Dans ce cas, le lait stérile agit comme un stabilisant, et il a été démontré que le titre d’un stock de virus est considérablement plus élevé lorsqu’il est stocké dans du lait / milieu stérile que dans un milieu seul20. Cependant, dans une autre étude, une comparaison directe entre différents stabilisants (y compris le lait stérile) utilisés pour le stockage de plusieurs herpèsvirus à -80 °C n’a pas montré d’impact significatif sur les titres finaux du virus21. Ici, le culot cellulaire a été re-suspendu dans VB constitué avec tris-tampon salin (pH 6,8) et 10% glycérol comme stabilisateur de stockage, ce qui donne généralement un titre de virus élevé (comme décrit à l’étape 3.10) pour les études expérimentales.
Il est essentiel d’enlever tous les composants cellulaires et médiatiques de la pastille re-suspendue pour obtenir un stock de virus de haute qualité. L’élimination des particules non virales est cruciale pour éviter les réactions immunitaires potentielles lors d’expériences in vivo. Plusieurs procédés de purification des virus ont été décrits dont la centrifugation22,les différentes méthodes de gradient23,la filtration24,et la chromatographie d’affinité25. Bien que ce protocole soit basé sur la centrifugation à grande vitesse à l’aide d’une méthode de saccharose-gradient, une variété d’autres méthodes de gradient ont été utilisées par d’autres, telles que l’iodixanol11,26,Percoll27et Ficoll-Nycodenz23. Ces méthodes de gradient séparent le virus par densité et nécessitent l’isolement de la bande du gradient, au lieu du coussin de saccharose où le virus est enrobé. La méthode du gradient de saccharose offre une approche douce pour séparer les particules virales car elle minimise le risque de perturber les protéines de l’enveloppe virale tout en conservant l’infectiosité virale. Malgré ces avantages, l’osmolarité élevée de la solution concentrée de saccharose pourrait déshydrater les particules virales ; par conséquent, la méthode de gradient d’iodixanol a été développée pour surmonter cet inconvénient. Cependant, la méthode du gradient d’iodixanol nécessite une ultracentrifugation et la collecte de la bande de virion. D’autres facteurs doivent être pris en compte lors de la purification de l’oHSV sont la vitesse et le moment de la centrifugation et le choix du tampon anti-virus utilisé pour le stockage à long terme. Ce protocole a la limitation que la pureté de l’oHSV n’est pas confirmée ; cependant, un nombre élevé de particules virales fonctionnelles ont été trouvées dans un stock donné purifié d’oHSV par titrage sur des cellules Vero (voir section 3).
l’oHSV forme des plaques sur les cellules vero (Figure 4). Les plaques virales peuvent être identifiées par coloration Giemsa, qui est une méthode facile et pratique. Giemsa tache les cellules Vero, laissant les plaques virales transparentes ou vides qui peuvent être facilement visualisées (œil nu) et comptées à l’aide d’un microscope de dissection. Alors que la superposition du milieu avec de l’agarose ou de la méthylcellulose est couramment utilisée lors de la formation de la plaque (à l’étape 3.7) pour prévenir la propagation du virus et des infections secondaires et des queues de plaque28,l’utilisation d’IgG humaines pour neutraliser l’oHSV dans le surnageant de culture est plus facile et plus pratique. Pour les vHSo exprimant lacZ,les plaques peuvent être visualisées par coloration X-gal(figure 4),tandis que la microscopie fluorescente est utilisée pour les protéines fluorescentes (c’est-à-dire les protéines fluorescentes vertes) exprimant les vHSo18. D’autres tests pour détecter les cellules infectées par le vhso comprennent l’immuno-histochimie ou la fluorescence avec des anticorps spécifiques au vhso29 ou le balayage au laser d’anticorps conjugués au fluorophore proche infrarouge30.
Il y a des mesures critiques qui doivent être suivies pour obtenir un bon stock de virus telles que le maintien de la stérilité pour prévenir la contamination microbienne (bactéries, levures ou moisissures) et les cellules Vero saines. Comme l’enveloppe de l’oHSV est extrêmement thermosensible20,le stock d’oHSV doit être manipulé dans un cryoprotecteur tel que le glycérol à 10%. Dans l’ensemble, ce protocole peut être facilement utilisé et pratiqué en laboratoire, mais peut ne pas être utile pour la production de virus à grande échelle.
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Disclosures
SDR est co-inventeur de brevets relatifs aux virus oncolytiques de l’herpès simplex, détenus et gérés par l’Université de Georgetown et le Massachusetts General Hospital, qui ont reçu des redevances d’Amgen et d’ActiVec Inc. et fait partie du conseil consultatif scientifique de EG 427. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
La recherche dans le laboratoire Saha a été financée en partie par des fonds du DOD (W81XWH-20-1-0702) et de la Fondation Dodge Jones-Abilene. Samuel D. Rabkin et Melissa R.M. Humphrey ont été partiellement soutenus par les NIH (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
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