Summary
在 果蝇中，卵母细胞核在形成过程中经历微管依赖性迁移。在这里，我们描述了一个协议，这是开发，以遵循迁移，通过执行现场成像的鸡蛋室 前vive。我们的程序保持卵室活12小时，以获得多位置3D延时电影使用旋转盘共聚焦显微镜。
Abstract
活细胞成像对于了解调节细胞运动、细胞骨架重新排列或细胞内极性模式的细胞和分子机制尤为必要。在研究卵母细胞核定位时，实时成像技术对于捕捉这个过程的动态事件至关重要。 果蝇 卵室是一个多细胞结构和一个很好的模型系统来研究这种现象，因为它的大小和众多的遗传工具可用性。在 嗜血杆菌 中期生成期间，细胞核从卵母细胞内的中心位置迁移，采用由微管生成的力介导的不对称位置。这种细胞核的迁移和定位对于确定胚胎的极性轴和随后的成年苍蝇是必要的。这种迁移的一个特点是，它发生在三个维度（3D），创造了一个活成像的必要性。因此，为了研究调节核迁移的机制，我们制定了一个培养解剖卵室的协议，并利用旋转盘共聚焦显微镜进行12小时的实时成像。总的来说，我们的条件使我们能够长期保存 果蝇 卵室，从而使核迁移的完成能够在大量3D样品中实现。
Introduction
几年来，嗜血性卵母细胞已成为研究核迁移的示范系统。嗜血性卵母细胞在称为卵室的多细胞结构中发育。卵室包括16个生殖细胞（15个护士细胞和卵母细胞），周围环绕着上皮层的卵泡体细胞。卵室发育被细分为14个阶段（图1A），在此期间卵母细胞将生长并积累胚胎早期发育所需的储备。在开发过程中，在微管重组和母体决定因素的不对称传输时，卵母细胞沿着前体和多鼻体轴两极分化。这些轴确定胚胎和成人的后续极性轴产生于这个卵母细胞1的受精。在形成过程中，细胞核在卵母细胞中采用不对称位置。在第6阶段，细胞核以细胞为中心。当卵母细胞接收到的后卵泡细胞发出的尚未识别的信号时，细胞核会在第7阶段（图1B）2、3阶段向前等离子体膜和横向等离子体膜之间的交叉处迁移。此不对称位置需要诱导多索-文特轴的确定。
图1：果蝇黑色素加斯特卵室。（A） 转基因苍蝇的固定卵磷表示Fs（2）Ket-GFP，标记核信封和泛素-PH-RFP，标记等离子体膜。卵变由不同阶段的卵子室组成。成熟度沿着前后轴增加，前尖端（左）的天体和后尖的较旧阶段（右）。（B） 活蛋室的Z-投影，通过旋转盘共聚焦显微镜在卵母细胞的6级（左），其中细胞核以卵母细胞为中心。核将迁移到第7阶段（右）与前血浆膜（卵母细胞和护士细胞之间）和侧向血浆膜（卵母细胞和卵泡细胞之间）接触时采用不对称位置。此位置将诱导经侧的确定，从而诱导蛋室的圆周- 静脉轴。请单击此处查看此图的较大版本。
几十年来，这种核迁移一直通过免疫染色在固定组织上进行研究。这种方法显然证明这个过程依赖于一个密集的微管网络4，5。最近，我们开发了一个协议，提供条件兼容的活成像的卵母细胞在几个小时内，使有可能研究这个过程动态6。
因此，我们首次能够描述，细胞核在迁移过程中具有优先和特征轨迹，一个沿着前等离子膜（APM），另一个沿着卵母细胞的横向等离子膜（LPM）（图2）。这些最新成果强调了实时成像协议在研究核迁移等动态过程时的重要性。
图2：细胞核不同迁移路径的示意图表示。在卵母细胞形成的第6阶段，卵母细胞是一个具有中央核的大细胞。在此阶段，前后极性轴设置与卵母细胞的后/横等离子膜接触卵泡细胞和前血浆膜（黄色）与护士细胞2接触。我们以前曾报告说，细胞核可以沿着前等离子膜（APM），沿着侧质等离子膜（LPM），或通过细胞质（STAD，直接迁移到前额皮层）6。请单击此处查看此图的较大版本。
卵母细胞核迁移是一种大约3h6的现象，到目前为止，触发实际迁移开始的事件还不得而知。用于研究这种机制的蛋白质突变体也会推迟迁移的开始。这些未知变量促使我们获得图像在很长一段时间内（10-12小时）。因此，确保卵母细胞存活是很重要的。随着蛋室的发展，它沿着前后轴从球形拉长到椭圆形。这种拉长是由卵泡细胞的旋转驱动的，卵泡细胞从第1阶段到第8阶段，垂直于前后轴7。此外，卵室周围还环绕着具有脉动特性肌肉的管状护套。其生理功能是将发育中的卵泡连续推向卵管8。为了限制解剖后诱导卵室振荡的运动，我们设计了一个高度为150微米的观测微室（图3A）。这个高度略高于10级和11级的卵泡大小。它大大限制了样品的垂直运动，同时保留了卵室的旋转，从而导致卵泡发育的有限缺陷。然后，我们使用旋转盘共聚焦显微镜对解剖的卵室进行 12 小时的实时成像。在这里，我们描述了我们研究第6阶段和第7阶段之间的卵母细胞核迁移的议定书。
图3：观察室的示意图表示。（A） （上视图） 铝滑梯的精确尺寸与在滑梯中间钻的井的高度 （A'） 和周长 （A'） 。（B） （下视图） 封堵油井的盖片用硅润滑脂密封在滑梯上。（C） （上图） 解剖的卵巢在气体渗透膜覆盖的成像介质中发展。光环碳油用于稳定膜。请单击此处查看此图的较大版本。
为了跟踪核迁移并精确评估卵母细胞的轨迹，需要核包络和等离子体膜的标记。为此，选择了两个信号/噪声比高且不会在实时成像过程中褪色的转基因基因。为了标记等离子膜，建议使用 P[ubi-PH-RFP] 对人类磷脂酶C ∂（PLC∂1）的普莱克斯特林同源（PH）域进行编码。此 PH 域与沿卵母细胞9的等离子膜分布的磷酸二肽 PI （4，5）P2 结合。对于核包络 ， P [ PPT - un1 ] Fs （ 2 ） Ket - GFP 蛋白陷阱菌株，其中 GFP 入编码的基因中 ， Drosophila+ - 进口显示一个同质和强烈的信号10 。幼蝇（1-2天大）在卵巢解剖前被放置在含有干酵母24-48小时的新鲜小瓶中。
对于这种实时成像检测，一块1毫米厚的铝片，对样品没有反应，已被切成显微镜滑梯的尺寸。滑梯中央有一个直径为16毫米的孔，该孔已被反向到0.85毫米。这个计数器有一个直径为6毫米的孔，深度为150μm（图3A）。盖片粘在铝室底部的硅胶油脂（样品惰性）（图3B）。将样品放入中等填充井中后，将渗透到O2/CO2交换的膜放在中型油上，周围是卤化碳油（图3C）。
对于解剖，建议使用尖端尺寸为 0.05 x 0.02 mm 的不锈钢钳子和直径为 0.20 mm 的针头进行卵巢分离（图 4B，C）。迁移核在装有摄像头的旋转盘反向显微镜 CSU-X1 上成像。在 24 °C 下每 15 分钟通过延时获取多位置图像。 15 分钟的间隔允许进行多位置采集，对荧光蛋白的光照漂烁有限，并且样品的光毒性有限。此外，较短的间隔不会提供更多的信息数据来跟踪核轨迹。电影是通过斐济软件11处理和分析。
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Protocol
1. 成像介质制备
- 在使用当天准备新的媒体。皮佩特 200 μL 施耐德介质 （含 L-麸质胺和 0.40 g/L 的 NaHCO3 辅以 10% 热灭活胎儿小腿血清， 100 U/mL 青霉素， 和 100 毫克/毫升链霉素）.
- 补充 30 μL 胰岛素 10 毫克/毫升。
- 加入4微升热灭活胎儿小腿血清。
2. 观察室准备
- 使用移液器尖端，在穿刺滑梯底部的孔周围涂抹少量硅胶润滑脂（图 4D）。
- 放置 24 x 50 mm 的覆盖唇，厚度为 0.13-0.16 mm。
- 使用移液器尖端的宽端，对盖唇施加压力，将硅胶压平，以密封盖片，并在滑梯上形成硅胶环内部（图 4F，G）。
3. 卵巢解剖
- 在 CO2 垫上麻醉所需表型的雌性苍蝇。
- 将女性在150微升的成像介质中移植到解剖井中（图4H）。
- 用钳子抓住一个女性的胸腔，用第二对钳子捏住腹角质层。
- 分离和分离对卵巢，这应该很容易看到角质层打开。
- 小心切除子宫、卵管和肌肉护套（图4I）。
- 放置10-15μL的成像介质，并在成像室中转移一个卵巢（图4J，K）。
4. 鸡蛋室隔离
- 要分离卵巢，用针头握住卵巢的后端（朝向较旧的阶段）。用另一根针小心地拉着天葵，把卵巢分开。
- 取出蛋室上剩余的肌肉护套;一根针拿着护套，另一根针穿过较大的房间（第9阶段或更长的阶段）。
- 让未护套的奥瓦里奥尔下沉并接触盖唇。
- 在钳子的帮助下，将晚期和卵巢的其他部分从显微室中取出。小心地用针头将卵巢与其他小血管距离，以方便获取（图4L）。
5. 观察室关闭
- 切一小块（10×10毫米）的渗透膜（图4M，N）。
- 小心地将膜涂在成像介质上以排出任何气泡（图4O）。
- 在膜轮廓上，在油井周围用一层薄薄的卤化碳油密封腔室（图4P，Q）。
6. 成像
- 使用 40 倍目标（HCX PL Apo，1.25NA，油浸入）将成像设置放在倒置显微镜的滑动支架上。
- 定位和保存核准备迁移的不同阶段 6 卵母细胞的位置。
- 设置 488 和 561 nm 激光器。测量输出的激光功率为150mW，分别使用30%的激光功率和300ms和500ms的曝光。
- 设置实验。以12小时为间隔，间隔为15分钟-41节，间隔为1微米，以核为中心。
注：根据上述曝光时间，此设置允许在 45 s 左右获得一个位置。由于位置更改导致延迟，建议在这些条件下设置最多 12 个职位。
7. 图像分析
- 使用插入式正交视图处理软件斐济上的电影，并手动跟踪原子核。
图4：一步一步的微室安装图片。 （A，B，C）准备所需的工具：解剖井板、钳子、针头、成像介质、硅润滑脂、透水膜和铝滑梯。（D） 用移液器尖端在铝滑梯背面涂上硅润滑脂。（E） 玻璃盖唇粘在硅润滑脂上，以创建腔室底部。（F，G）在盖唇上施加压力，用移液器尖端的宽四肢在腔室内创建一个关节。（H，I）成像介质中苍蝇卵巢的解剖。（J） 在微室中滴入一滴成像介质。（K， L）用针头分离微室中的卵巢。（M，N，O）渗透膜切成10×10毫米的正方形，并放置在微室的介质下降。（P，Q）用卤化碳油密封微型室。样品已准备好成像。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Representative Results
在迁移之前，核是动态的，在定义为迁移前的期间围绕中心位置振荡。这些小动作反映了在卵母细胞中间保持平衡的推拉力的平衡。通过量化核的轨迹，我们已经表明，APM和LPM轨迹具有类似的比例。我们通过细胞核与等离子膜6之间的第一次接触来定义轨迹的性质。因此，核到达APM或LPM，然后沿着它滑动，达到其在两个等离子膜交叉口的最终位置（图5，电影1-2）。此外，我们已经表明，不同的线索有利于每一个轨迹。例如，聚集在细胞核和卵母细胞后膜之间的中心体使 APM 轨迹成为可能。相反，微管相关蛋白（MAP）蘑菇体缺陷（Mud），它位于不对称的核包络，支持沿LPM6的轨迹。此外，中心体或泥浆的耗竭会影响核的迁移速度与野生类型上下文6相比。
图5：通过活成像显微镜对卵母细胞核迁移的代表性图像。 （A） 从延时 电影1 中提取的选定帧，显示表达核包络标记（Fs（2）KetGFP）和等离子膜标记（ubi-PH-RFP）的野生卵母细胞核的核迁移。（B） 电影 2 中的选定帧 （ 电影 1的裁剪版本 ） 专注于卵母细胞。时间（以 h：min 为限）相对于延时开始的时间指示在每个选定帧的顶部。 请单击此处查看此图的较大版本。
卵母细胞和卵室生长是正确发育的迹象，在延时记录中很容易看到（图5）。相反，膜畸形混乱的卵泡细胞，发育迟缓的细胞和收缩的细胞核是死亡卵室的最初迹象（图6，电影3-4）。观察这些退化卵室后，细胞核运动不再可进行分析。通常，我们不会在8小时成像（图6A）前观察到任何退化的卵母细胞，而早期退化的罕见病例是由于解剖或安装步骤（图6B）期间的问题造成的。我们认为，50%的卵母细胞在10小时的成像后仍然存活。
图6：现场成像过程中蛋室退化的代表性图像。（A ）从延时电影3中提取的选定帧，显示8小时后野生型蛋室的退化，表示核包络标记（Fs（2）KetGFP）和等离子膜标记（ubi-PH-RFP）。（B） 从电影4中提取的精选帧显示野生类型蛋室的快速退化。这种早期退化是解剖或安装步骤过程中问题的特征。时间（以 h：min 为限）相对于延时开始的时间指示在每个选定帧的顶部。请单击此处查看此图的较大版本。
过度运动可能是导致无法使用的数据和进一步分析的另一个问题，因为蛋室不会保留在成像框架中。为了规避这个问题，我们使用40倍的目标，提供一个适当的观察框架，并允许沿x-y平面的卵室运动，同时提供足够的分辨率，以定性评估由卵母细胞核采取的迁移路径。此外，为了限制 z 轴中过度运动的影响，为了将卵母细胞保持在 z 堆栈范围内，我们执行 40 μm 堆栈（相距 41 节 1 μm）的 z 节，而阶段 6 卵母细胞的大小为 20 μm。
电影1：一个野生型蛋室的代表电影，既表示核信封标记（Fs（2）Ket-GFP）和等离子膜标记（ubi-PH-RFP）。在此示例中，卵母细胞核首先接触前膜，并沿着前膜滑动以到达前体多面体角。延时时间在视频左上角的 h：min 中表示。请点击这里下载这部电影。
电影2：电影1的裁剪版本，聚焦卵母细胞。 延时时间在视频左上角的 h：min 中表示。 请点击这里下载这部电影。
电影3：一个野生型蛋室的代表电影，表达核信封标记（Fs（2）凯特-GFP）和等离子膜标记（ubi-PH-RFP）。在此示例中，蛋室在完成核迁移之前，在 8：45 h 开始退化。延时时间在视频左上角的 h：min 中表示。请点击这里下载这部电影。
电影4：代表电影早期退化的野生型蛋室表示核信封标记（Fs（2）凯特-GFP）和等离子膜标记（ubi-PH-RFP）。延时时间在视频左上角的 h：min 中表示。请点击这里下载这部电影。
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Discussion
其他协议描述如何准备和培养果蝇卵室前活体活成像检测12，13。此协议的新颖性是使用使用空心铝滑梯、覆盖滑梯和 O2/CO 2渗透膜构建的成像室。此设置的主要优点是限制 Z 中的移动，而不会对样品施加压力。因此，卵母细胞仍然可以自由移动，这就是为什么首先，使用40倍的目标，第二，z堆栈沿40μm获得，而卵母细胞是大约20μm的高度在第6阶段。
虽然此协议相对简单，但每个步骤对检测都至关重要。微室、透膜和腔室密封的制备对于允许气体交换和防止成像介质以及因此而使样品干燥至关重要。破坏卵室会损害其生存，因此精密和精确的解剖技术至关重要。此外，肌肉护套必须完全去除，因为这种结构的剩余部分将导致不需要的卵室运动。
铝，除了其安全性的样品，已被选择的强度，耐用性和清洁的方便性。在这些条件下，尚未对其他材料进行调查。随着3D打印机的开发，塑料的使用是诱人的：然而，创建一个高度为 150 μm 的孔时必须非常精确。
最近，Huynh和他的同事已经开发出一种基于水凝胶14的适应果蝇天葵的成像技术。这是否可以适应第6阶段的发生还有待测试。具体来说，尚不清楚在水凝胶系统中是否可能发生卵泡旋转等运动。这些旋转运动对于延长卵室，从而促进正常发育至关重要。
其他协议已经使用卤碳油跟随卵母细胞核迁移15，16。我们协议中使用的石油和成像介质的光学特性非常不同。特别是施耐德介质的最大光吸收波长约为450纳米。因此，我们观察到较高的信号/噪声比与油。然而，光环碳油大大降低了卵母细胞的存活率到1-2小时，这限制了跟踪细胞核整体迁移的能力，尤其是在这种迁移受到干扰的遗传环境中。有了此当前协议，成像介质允许蛋室的长生存，使我们能够执行长达 12 小时的延时记录。因此，我们最大限度地利用了捕获整个迁移过程的机会。
使用我们当前的参数，我们最多只能执行 12 个延时位置。平均而言，三分之一的成像核是可行的，可以进行分析。为了提高效率，可使用配备双摄像头系统的纺纱盘显微镜，同时可同时采集两个波长，从而加快采集时间，从而增加位置数量。
此外，由于这个微室允许在相对较长的时间内培养解剖的卵室，因此其用途可以扩展到研究需要评估 的 卵巢造血的其他动态机制（例如，卵母细胞中的细胞质流、卵泡旋转、卵泡细胞形态形成等）。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们非常感谢让-安托万·莱佩桑特和尼古拉斯·蒂索，他们最初开发了协议，并与我们分享了图3的一些图形元素。我们感谢范妮·罗兰-戈塞林，他拍摄了图4的照片。我们还感谢其他实验室成员的有益讨论，这些讨论有助于改进这项技术，纳撒尼尔·亨尼曼的评论帮助改进了这份手稿。我们感谢法国生物成像（ANR-10-INBS-04）成员雅克·莫诺德研究所的ImagoSeine核心设施。Maélys Loh 得到了法国研究部 （MESRI） 的博士奖学金的支持。安托万·吉切特和弗雷德·伯纳德得到了ARC（授予PJA20181208148）、癌症企业协会（2020年#221366授予Gefluc）和巴黎IdEx大学（ANR-18-IDEX-0001）的新兴赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 - 188 | Observation-chamber preparation |
References
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