Summary
En Drosophila,el núcleo de ovocitos sufre una migración dependiente de microtúbulos durante la oogénesis. Aquí, describimos un protocolo que se desarrolló para seguir la migración mediante la realización de imágenes en vivo en cámaras de óvulos ex-vivo. Nuestro procedimiento mantiene vivas las cámaras de huevos durante 12 h para adquirir películas de lapso de tiempo 3D multi posición utilizando microscopía confocal de disco giratorio.
Abstract
Las imágenes de células vivas son particularmente necesarias para comprender los mecanismos celulares y moleculares que regulan los movimientos de los orgánulos, los reordenamientos del citoesqueleto o el patrón de polaridad dentro de las células. Al estudiar el posicionamiento del núcleo de ovocitos, las técnicas de imágenes en vivo son esenciales para capturar los eventos dinámicos de este proceso. La cámara de huevos de Drosophila es una estructura multicelular y un excelente sistema modelo para estudiar este fenómeno debido a su gran tamaño y disponibilidad de numerosas herramientas genéticas. Durante la oogénesis media de Drosophila, el núcleo migra desde una posición central dentro del ovocito para adoptar una posición asimétrica mediada por fuerzas generadas por microtúbulos. Esta migración y posicionamiento del núcleo son necesarios para determinar los ejes de polaridad del embrión y la posterior mosca adulta. Una característica de esta migración es que ocurre en tres dimensiones (3D), creando una necesidad de imágenes en vivo. Así, para estudiar los mecanismos que regulan la migración nuclear, hemos desarrollado un protocolo para cultivar las cámaras de óvulos diseccionadas y realizar imágenes en vivo durante 12 h mediante adquisiciones time-lapse mediante microscopía confocal de disco giratorio. En general, nuestras condiciones nos permiten preservar las cámaras de huevos de Drosophila vivas durante un largo período de tiempo, lo que permite visualizar la finalización de la migración nuclear en una gran cantidad de muestras en 3D.
Introduction
Durante varios años, el ovocito Drosophila ha surgido como un sistema modelo para estudiar la migración nuclear. El ovocito Drosophila se desarrolla en una estructura multicelular llamada cámara de óvulos. Las cámaras de óvulos abarcan 16 células germinales (15 células nodriza y el ovocito) rodeadas por una capa epitelial de células somáticas foliculares. El desarrollo de la cámara de óvulos se ha subdividido en 14 etapas(Figura 1A),durante las cuales el ovocito crecerá y acumulará las reservas necesarias para el desarrollo temprano del embrión. Durante el desarrollo, tras la reorganización de los microtúbulos y el transporte asimétrico de los determinantes maternos, el ovocito se polariza a lo largo de los ejes antero-dorsal y dorso-ventral. Estos ejes determinan los ejes de polaridad posteriores del embrión y del adulto derivados de la fecundación de este ovocito1. Durante la oogénesis, el núcleo adopta una posición asimétrica en el ovocito. En la etapa 6, el núcleo está centrado en la célula. Tras una señal aún no identificada emitida por las células foliculares posteriores que es recibida por el ovocito, el núcleo migra hacia la intersección entre las membranas plasmáticas anterior y lateral en la etapa 7(Figura 1B)2,3. Esta posición asimétrica es necesaria para inducir la determinación del eje dorso-ventral.
Figura 1: Cámaras de huevo de Drosophila melanogaster. (A) Ovariole fijo de moscas transgénicas que expresan Fs(2)Ket-GFP que etiqueta las envolturas nucleares y ubi-PH-RFP que marca las membranas plasmáticas. El ovariole se compone de cámaras de huevo en desarrollo en diferentes etapas. La maduración aumenta a lo largo del eje antero-posterior con el germario en la punta anterior (izquierda) donde reside la célula madre germinal y la etapa más antigua en la punta posterior (derecha). (B) Proyección Z de la cámara de huevo vivo mediante microscopía confocal de disco giratorio en la etapa 6 de la oogénesis (izquierda), en la que el núcleo se centra en el ovocito. El núcleo migrará para adoptar una posición asimétrica en la etapa 7 (derecha) en contacto con la membrana plasmática anterior (entre el ovocito y la célula nodriza) y la membrana plasmática lateral (entre el ovocito y las células foliculares). Esta posición inducirá la determinación del lado dorsal y, por lo tanto, del eje dorso-ventral de la cámara de huevos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Durante muchas décadas, esta migración nuclear se ha estudiado en tejidos fijos mediante inmunotinción. Este enfoque ha hecho notablemente posible demostrar que este proceso depende de una densa red de microtúbulos4,5. Más recientemente, desarrollamos un protocolo que ofrece condiciones compatibles con la obtención de imágenes en vivo del ovocito durante varias horas, lo que permite estudiar este proceso dinámicamente6.
De ahí que, por primera vez, hayamos podido describir que el núcleo tiene trayectorias preferentes y características durante su migración, una a lo largo de la membrana plasmática anterior (APM) y otra a lo largo de la membrana plasmática lateral (LPM) del ovocito(Figura 2). Estos últimos resultados subrayan la importancia de los protocolos de imágenes en vivo cuando se estudian procesos dinámicos como la migración nuclear.
Figura 2: Representación esquemática de las diferentes rutas de migración del núcleo. En la etapa 6 de la oogénesis, el ovocito es una célula grande con un núcleo central. En esta etapa, el eje de polaridad antero-posterior se establece con una membrana plasmática posterior/lateral del ovocito en contacto con las células foliculares y la membrana plasmática anterior (en amarillo) está en contacto con las células nodriza2. Hemos informado previamente que el núcleo podría migrar a lo largo de la membrana plasmática anterior (APM), a lo largo de la membrana plasmática lateral (LPM), o a través del citoplasma (STAD, directamente a la corteza antero-dorsal)6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La migración del núcleo de ovocitos es un fenómeno de aproximadamente 3 h6, y hasta ahora, se desconoce el evento que desencadena el inicio de la migración real. El inicio de la migración también puede ser retrasado por los mutantes de proteínas utilizados para estudiar este mecanismo. Estas variables desconocidas nos motivaron a adquirir imágenes durante largos períodos de tiempo (10-12 h). Por lo tanto, es importante asegurarse de que los ovocitos permanezcan vivos. A medida que la cámara de huevos se desarrolla, se alarga a lo largo del eje antero-posterior de una forma esférica a una elíptica. Este alargamiento es impulsado por la rotación de las células foliculares, que ocurre desde la etapa 1 hasta la etapa 8, perpendicular al eje antero-posterior7. Además, una hela tubular de músculo con propiedad pulsátil rodea las cámaras de huevos. Su función fisiológica es empujar los folículos en desarrollo hacia el oviducto continuamente8. Con el fin de limitar los movimientos que inducen oscilaciones de las cámaras de huevos después de su disección, diseñamos una microcámara de observación que mide 150 μm de altura(Figura 3A). Esta altura es marginalmente más alta que el tamaño de un folículo en las etapas 10 y 11. Limita considerablemente los movimientos verticales de la muestra al tiempo que preserva la rotación de la cámara de óvulos, lo que resulta en defectos limitados en el desarrollo del folículo. Luego realizamos imágenes en vivo durante 12 h en cámaras de huevos diseccionadas mediante adquisiciones de lapso de tiempo de múltiples posiciones utilizando un microscopio confocal de disco giratorio. Aquí describimos nuestro protocolo para estudiar la migración nuclear de ovocitos entre las etapas 6 y 7.
Figura 3: Representación esquemática de la cámara de observación. (A) (Vista superior) Dimensiones precisas de la corredera de aluminio con las alturas (A') y circunferencias (A'') del pozo perforado en el centro de la diapositiva. (B) (Vista inferior) Un codal que bloquea el pozo se sella a la corredera con grasa de silicio. (C) (Vista superior) Los ovarioles disecados se desarrollan en un medio de imagen que está cubierto por una membrana permeable al gas. El aceite de halocarbono se utiliza para estabilizar la membrana. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para seguir la migración nuclear y evaluar con precisión las trayectorias en el ovocito, se necesitan marcadores tanto para la envoltura nuclear como para la membrana plasmática. Con este objetivo, se han seleccionado dos transgenes que tienen una alta relación señal/ruido y no se desvanecen en el transcurso de las imágenes en vivo. Para etiquetar la membrana plasmática, se recomienda el uso de una P[ubi-PH-RFP] que codifique el dominio de Homología de Pleckstrin (PH) de la Fosfolipasa C Humana ∂1 (PLC∂1) fusionada a RFP. Este dominio PH se une al fosfoinosítido PI(4,5)P2 distribuido a lo largo de la membrana plasmática del ovocito9. Para la envoltura nuclear, la cepa trampa de proteína P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP donde GFP se inserta dentro del gen que codifica la ß-importina de Drosophila muestra una señal homogénea e intensa10. Las moscas jóvenes (1-2 días de edad) se colocan en viales frescos que contienen levadura seca 24-48 h antes de la disección del ovario.
Para este ensayo de imágenes en vivo, se ha cortado una pieza de aluminio de 1 mm de espesor, que no es reactiva para la muestra, en las dimensiones de una diapositiva de microscopía. Tiene un orificio de 16 mm de diámetro en el centro de la corredera que ha sido contraborrado a 0,85 mm. Este contrabordo tiene un orificio adicional de 6 mm de diámetro con una profundidad de 150 μm (Figura 3A). Un coverslip se pega con grasa de silicona (inerte para la muestra) en la parte inferior de la cámara de aluminio(Figura 3B). Después de colocar las muestras en el pozo lleno de medio, se coloca una membrana permeable al intercambio de O2/ CO2 sobre el medio y rodeada de aceite de halocarbono(Figura 3C).
Para la disección, se recomienda utilizar fórceps de acero inoxidable con una dimensión de punta de 0.05 x 0.02 mm, y agujas de 0.20 mm de diámetro para la separación de los ovarioles(Figura 4B,C). Los núcleos migratorios se capturan en un microscopio invertido confocal de disco giratorio CSU-X1 equipado con una cámara. Las imágenes multi-posición fueron adquiridas por time-lapse cada 15 min a 24 °C. Un intervalo de 15 minutos permite realizar adquisiciones multi-posición con fotobleaching limitado de las proteínas fluorescentes y fototoxicidad para las muestras. Además, un intervalo más corto no proporcionaría datos mucho más informativos para seguir las trayectorias nucleares. Las películas se procesan y analizan a través del software Fiji11.
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Protocol
1. Preparación del medio de imagen
- Prepare medios frescos el día de su uso. Pipeta 200 μL de medio Schneider (que contiene L-glutamina y 0,40 g/L de NaHCO3 complementada con suero de ternero fetal inactivado al 10% por calor, 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina).
- Suplemento con 30 μL de insulina 10 mg/ml.
- Añadir 4 μL de suero fetal de ternero inactivado por calor.
2. Preparación de la cámara de observación
- Con una punta de pipeta, aplique una pequeña cantidad de grasa de silicona alrededor del orificio en la parte inferior de la diapositiva perforada(Figura 4D).
- Coloque un capa de cubierta de 24 x 50 mm de espesor de 0,13-0,16 mm.
- Con el extremo ancho de una punta de pipeta, aplique presión sobre el cubrebocas para aplanar la silicona con el fin de sellar el lape y crear un anillo de silicona interior a la diapositiva(Figura 4F,G).
3. Disección ováica
- Anestesiar una mosca hembra del fenotipo deseado en una almohadilla de CO2.
- Transferir la hembra en 150 μL del medio de imagen en un pozo de disección (Figura 4H).
- Abra una hembra agarrando su tórax con fórceps y pellizcando la cutícula dorsal del abdomen con un segundo par de fórceps.
- Aísle y separe el par de ovarios, que deben ser fácilmente visibles al abrir la cutícula.
- Retire cuidadosamente el útero, el oviducto y la hera muscular(Figura 4I).
- Coloque una gota de 10-15 μL del medio de imagen y transfiera un ovario en la cámara de imagen (Figura 4J,K).
4. Aislamiento de la cámara de huevos
- Para separar los ovarioles, sostenga el extremo posterior del ovario (hacia las etapas más antiguas) con la aguja. Separe los ovarioles tirando cuidadosamente del germario con otra aguja.
- Retire la hela muscular restante en las cámaras de huevos; una aguja que sostiene la hela y la otra tira del ovario a través de las cámaras más grandes (etapa 9 o anterior).
- Permita que el ovariole desenvainado se hunda y entre en contacto con la cubierta.
- Retire las etapas tardías y el resto de los ovarios de la microcámara con la ayuda de pórceps. Distancia cuidadosamente los ovarioles de los demás con agujas para facilitar la adquisición (Figura 4L).
5. Cierre de la cámara de observación
- Cortar un pequeño cuadrado (10 x 10 mm) de membrana permeable (Figura 4M,N).
- Aplique cuidadosamente la membrana en la parte superior del medio de imagen para expulsar cualquier burbuja de aire (Figura 4O).
- Sellar herméticamente la cámara con una fina capa de aceite de halocarbono alrededor del pozo en el contorno de la membrana (Figura 4P,Q).
6. Imágenes
- Coloque la configuración de imágenes en el soporte deslizante del microscopio invertido utilizando un objetivo 40x (HCX PL Apo, 1.25NA, inmersión en aceite).
- Localice y guarde posiciones de diferentes ovocitos en estadio 6 en los que el núcleo está listo para migrar.
- Configure los láseres de 488 y 561 nm. Con una potencia láser de salida medida de 150 mW, utilice el 30% de la potencia del láser y la exposición de 300 ms y 500 ms, respectivamente.
- Configura el experimento. Tome un lapso de tiempo de 12 h con el intervalo de 15 min-41 secciones con un intervalo de 1 μm centrado en el núcleo.
NOTA: De acuerdo con el tiempo de exposición descrito anteriormente, este ajuste permite la adquisición de una posición en alrededor de 45 s. Dado que hay un retraso debido al cambio de posición, se recomienda establecer un máximo de 12 posiciones en estas condiciones.
7. Análisis de imágenes
- Procese las películas en el software Fiji, utilizando la vista ortogonal del plug-in y realice un seguimiento manual de los núcleos.
Figura 4: Imágenes de montaje paso a paso de microcámaras. (A,B,C) Preparación de las herramientas necesarias: placa de pozo de disección, torceps, agujas, medios de imagen, grasa de silicio, membrana permeable y el portaobjetos de aluminio. (D) Aplicación de la grasa de silicio en la parte posterior de la corredera de aluminio con una punta de pipeta. (E) Una cubierta de vidrio se pega en la grasa de silicio para crear la parte inferior de la cámara. (F,G) Aplicación de presión en la cubierta con la extremidad más ancha de la punta de una pipeta para crear una articulación dentro de la cámara. (H,I) Disección de los ovarios de la mosca en los medios de imagen. (J) Pipeteo de una gota de medios de imagen en la microcámara. (K,L) Separación de los ovarioles en la microcámara mediante agujas. (M,N,O) Membrana permeable cortada en un cuadrado de 10 x 10 mm y colocándola sobre la gota del medio en la microcámara. (P,Q) Sellado de la microcámara con aceite de halocarbono. Las muestras están listas para ser fotografiada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Antes de la migración, el núcleo es dinámico y oscila alrededor de una posición central durante un período definido como pre-migración. Estos pequeños movimientos reflejan un equilibrio de fuerzas de empuje y tracción que mantienen el equilibrio en el medio del ovocito. Al cuantificar las trayectorias de los núcleos, hemos demostrado que las trayectorias APM y LPM tenían proporciones similares. Definimos la naturaleza de la trayectoria por el primer contacto entre el núcleo y la membrana plasmática6. Por lo tanto, el núcleo alcanza el APM o el LPM antes de deslizarse a lo largo de él, para alcanzar su posición final en la intersección de las dos membranas plasmáticas (Figura 5,Películas 1-2). Además, hemos demostrado que distintas señales favorecen cada una de las trayectorias. Por ejemplo, los centrosomas agrupados entre el núcleo y la membrana posterior del ovocito permiten la trayectoria APM. Por el contrario, el defecto corporal del hongo (lodo) de la proteína asociada a microtúbulos (MAP), que se encuentra asimétricamente en la envoltura nuclear, soporta una trayectoria a lo largo del LPM6. Además, el agotamiento de los centrosomas o del lodo afecta a la velocidad de migración del núcleo en comparación con el contexto de tipo salvaje6.
Figura 5: Imágenes representativas de la migración del núcleo de ovocitos por microscopía de imágenes en vivo. (A) Fotogramas seleccionados extraídos de time-lapse Película 1 que muestra la migración nuclear del núcleo de ovocitos de una cámara de huevos de tipo salvaje que expresa el marcador de envoltura nuclear (Fs(2)KetGFP) y el marcador de membrana plasmática (ubi-PH-RFP). (B) Fotogramas seleccionados de la película 2 (la versión recortada de la película 1) centrándose en el ovocito. El tiempo (en h:min) relativo al comienzo del lapso de tiempo se indica en la parte superior de cada fotograma seleccionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los crecimientos de ovocitos y cámaras de huevos son signos de desarrollo correcto, que son fácilmente visibles en los registros de lapso de tiempo(Figura 5). Por el contrario, las deformidades de la membrana de las células foliculares desorganizadas, las células atrofiadas y los núcleos encogidos son los primeros signos de cámaras de óvulos moribundas(Figura 6, Película 3-4). Tras la observación de estas cámaras degenerativas de huevos, los movimientos de los núcleos ya no son explotables para el análisis. Por lo general, no observamos ningún ovocito degenerado antes de las 8 h de la imagen(Figura 6A)y los casos raros de degeneración temprana se deben a problemas durante los pasos de disección o montaje(Figura 6B). Consideramos que el 50% de los ovocitos siguen vivos después de 10 h de imagen.
Figura 6: Imágenes representativas de la degeneración de una cámara de huevos durante la obtención de imágenes en vivo. (A) Fotogramas seleccionados extraídos de time-lapse Película 3 que muestra la degeneración de una cámara de huevos de tipo salvaje después de 8 h, expresando el marcador de envoltura nuclear (Fs (2) KetGFP) y el marcador de membrana plasmática (ubi-PH-RFP). (B) Fotogramas seleccionados extraídos de la película 4 que muestran la rápida degeneración de una cámara de huevos de tipo salvaje. Tal degeneración temprana es característica de un problema durante la disección o los pasos de montaje. El tiempo (en h:min) relativo al comienzo del lapso de tiempo se indica en la parte superior de cada fotograma seleccionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los movimientos excesivos podrían ser un problema adicional que resulte en datos inutilizables y análisis adicionales, ya que las cámaras de huevos no permanecerán en el marco de la imagen. Para eludir este problema, utilizamos un objetivo 40x que proporciona un marco de observación adecuado y permite los movimientos de las cámaras de huevos a lo largo del plano x-y, al tiempo que proporciona suficiente resolución para una evaluación cualitativa de la ruta migratoria tomada por el núcleo de ovocitos. Además, para limitar los efectos de los movimientos excesivos en el eje z y para mantener el ovocito dentro del rango de la pila z, realizamos secciones z sobre la pila de 40 μm (41 secciones separadas por 1 μm), mientras que el ovocito en etapa 6 tiene un tamaño de 20 μm.
Película 1: Película representativa de una cámara de huevos de tipo salvaje que expresa tanto el marcador de envoltura nuclear (Fs(2)Ket-GFP) como el marcador de membrana plasmática (ubi-PH-RFP). En este ejemplo, el núcleo del ovocito entra en contacto primero con la membrana anterior y se desliza a lo largo de ella para llegar a la esquina antero-dorsal. El tiempo transcurrido del lapso de tiempo se indica en h:min en la esquina superior izquierda del vídeo. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 2: Versión recortada de la Película 1, centrada en el ovocito. El tiempo transcurrido del lapso de tiempo se indica en h:min en la esquina superior izquierda del vídeo. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 3: Película representativa de una cámara de huevos de tipo salvaje que expresa tanto el marcador de envoltura nuclear (Fs(2)Ket-GFP) como el marcador de membrana plasmática (ubi-PH-RFP). En este ejemplo, la cámara de huevos comienza a degenerar a las 8:45 h antes de completar la migración del núcleo. El tiempo transcurrido del lapso de tiempo se indica en h:min en la esquina superior izquierda del vídeo. Haga clic aquí para descargar esta película.
Película 4: Película representativa de la degeneración temprana de una cámara de huevos de tipo salvaje que expresa tanto el marcador de envoltura nuclear (Fs(2)Ket-GFP) como el marcador de membrana plasmática (ubi-PH-RFP). El tiempo transcurrido del lapso de tiempo se indica en h:min en la esquina superior izquierda del vídeo. Haga clic aquí para descargar esta película.
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Discussion
Otros protocolos describen cómo preparar y cultivar cámaras de huevos de Drosophila ex vivo para el ensayo de imágenes en vivo12,13. La novedad de este protocolo es el uso de una cámara de imagen construida con una corredera de aluminio ahuecado, un coverslip y una membrana permeable A O2/ CO2. La principal ventaja de esta configuración es limitar el movimiento en Z sin ejercer presión sobre la muestra. Por lo tanto, el ovocito aún puede moverse libremente, y es por eso que primero, se usa el objetivo 40x y segundo, se adquieren pilas z a lo largo de 40 μm, mientras que el ovocito tiene alrededor de 20 μm de altura en la etapa 6.
Aunque este protocolo es relativamente simple, cada paso es crítico para el ensayo. La preparación de la microcámara, la membrana permeable y el sellado de la cámara son esenciales para permitir el intercambio de gases y evitar el secado del medio de imagen y, por lo tanto, de las muestras. Dañar la cámara de huevos compromete su supervivencia, por lo que las técnicas de disección delicadas y precisas son primordiales. Además, la vaia muscular debe eliminarse por completo, ya que las piezas restantes de esta estructura darán como resultado un movimiento no deseado de la cámara de huevos.
El aluminio, además de su seguridad para la muestra, ha sido elegido por su resistencia, durabilidad y facilidad de limpieza. Otros materiales aún no han sido investigados en estas condiciones. El uso del plástico con el desarrollo de la impresora 3D es tentador; sin embargo, uno debe ser muy preciso con la creación de un agujero con una altura de 150 μm.
Recientemente, Huynh y sus colegas han desarrollado una técnica de imagen adaptada a Drosophila germarium basada en hidrogel14. Queda por probar si esto se puede adaptar o no a la etapa 6 en la oogénesis. Específicamente, no se sabe si movimientos como la rotación del folículo pueden ocurrir en el sistema de hidrogel. Estos movimientos de rotación son esenciales para el alargamiento de la cámara de huevos y, por lo tanto, para el desarrollo normal.
Otros protocolos han utilizado aceite de halocarbono para seguir la migración del núcleo deovocitos 15,16. Las propiedades ópticas del aceite y el medio de imagen utilizado en nuestro protocolo son muy diferentes. Especialmente, el medio Schneider tiene un máximo de absorción de luz para longitudes de onda de alrededor de 450 nm. Por lo tanto, observamos una mayor relación señal/ruido con el aceite. Sin embargo, el aceite de halocarbono reduce en gran medida la supervivencia de los ovocitos a 1-2 h, lo que limita la capacidad de seguir toda la migración del núcleo, particularmente en contextos genéticos donde esta migración se ve perturbada. Con este protocolo actual, el medio de imagen permite una larga supervivencia de la cámara de huevos permitiéndonos realizar grabaciones time-lapse de hasta 12 h. Por lo tanto, maximizamos nuestra oportunidad de capturar todo el proceso de migración.
Usando nuestros parámetros actuales, solo podemos realizar un máximo de 12 posiciones para el lapso de tiempo. En promedio, un tercio de los núcleos fotografiados son viables y pueden ser analizados. Para mejorar la eficiencia, se puede utilizar un microscopio de disco giratorio equipado con un sistema de cámara dual, que permitiría adquisiciones de ambas longitudes de onda al mismo tiempo, para acelerar el tiempo de adquisición y, por lo tanto, aumentar el número de posiciones.
Además, como esta microcámara permite cultivar las cámaras de óvulos diseccionadas durante un período de tiempo relativamente largo, su uso puede extenderse al estudio de otros mecanismos dinámicos de la oogénesis de drosophila que deben evaluarse ex vivo (por ejemplo, flujo citoplasmático en el ovocito, rotación del folículo, morfogénesis de las células del folículo, etc.).
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Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Estamos extremadamente agradecidos a Jean-Antoine Lepesant y Nicolas Tissot que originalmente desarrollaron el protocolo y compartieron algunos elementos gráficos de la Figura 3 con nosotros. Agradecemos a Fanny Roland-Gosselin que tomó las fotos de la Figura 4. También agradecemos a otros miembros del laboratorio por las útiles discusiones que contribuyeron a la mejora de esta técnica y a Nathaniel Henneman por sus comentarios que ayudaron a mejorar este manuscrito. Reconocemos la instalación central de ImagoSeine del Instituto Jacques Monod, miembro de France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh cuenta con el apoyo de una beca de doctorado del Ministerio de Investigación de Francia (MESRI). Antoine Guichet y Fred Bernard fueron apoyados por la ARC (Grant PJA20181208148), la Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) y por una beca Emergence de IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 - 188 | Observation-chamber preparation |
References
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