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Developmental Biology

ड्रोसोफिला ओसाइट में परमाणु प्रवासन

Published: May 13, 2021 doi: 10.3791/62688
Automatic Translation
1, 1, 1
1Université de Paris, CNRS, Institut Jacques Monod

Summary

ड्रोसोफिलामें, ओसाइट न्यूक्लियस ऊजनजेलिस के दौरान माइक्रोट्यूबुल पर निर्भर प्रवास से गुजरता है। यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसे अंडे के कक्षों पूर्व वीवोपर लाइव इमेजिंग करके माइग्रेशन का पालन करने के लिए विकसित किया गया था। हमारी प्रक्रिया कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बहु-स्थिति 3डी समय-चूक फिल्मों को प्राप्त करने के लिए 12 एच के लिए जीवित अंडे कक्षों का रखरखाव करती है।

Abstract

लाइव सेल इमेजिंग विशेष रूप से सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है जो ऑर्गेनेल आंदोलनों, साइटोस्केलेटन पुनर्व्यवस्थाओं, या कोशिकाओं के भीतर ध्रुवता पैटर्निंग को विनियमित करता है। ओसाइट न्यूक्लियस पोजिशनिंग का अध्ययन करते समय, इस प्रक्रिया की गतिशील घटनाओं को पकड़ने के लिए लाइव-इमेजिंग तकनीकें आवश्यक हैं। ड्रोसोफिला अंडा कक्ष एक बहुकोशिकीय संरचना है और इस घटना का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है क्योंकि इसके बड़े आकार और कई आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता है। ड्रोसोफिला मिड-ऊजीनेसिस के दौरान, नाभिक माइक्रोट्यूबुले-जनित बलों द्वारा मध्यस्थता की गई असममित स्थिति को अपनाने के लिए ओसाइट के भीतर एक केंद्रीय स्थिति से स्थानांतरित हो जाता है। भ्रूण और बाद में वयस्क मक्खी की ध्रुवता कुल्हाड़ियों को निर्धारित करने के लिए नाभिक का यह प्रवास और स्थिति आवश्यक है। इस माइग्रेशन की एक विशेषता यह है कि यह तीन आयामों (3 डी) में होता है, जिससे लाइव इमेजिंग की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, परमाणु प्रवास को विनियमित करने वाले तंत्रों का अध्ययन करने के लिए, हमने विच्छेदित अंडे कक्षों को संस्कृति देने और कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समय-चूक अधिग्रहण द्वारा 12 घंटे के लिए लाइव इमेजिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है । कुल मिलाकर, हमारी स्थितियां हमें लंबे समय तक ड्रोसोफिला अंडे के कक्षों को जीवित रखने की अनुमति देती हैं, जिससे परमाणु प्रवास को पूरा करने को 3 डी में बड़ी संख्या में नमूनों में कल्पना करने में सक्षम बनाया जा सके ।

Introduction

कई वर्षों से ड्रोसोफिला ओसाइट परमाणु प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली के रूप में उभरा है । ड्रोसोफिला ओसाइट एक बहुकोशिकीय संरचना में विकसित होता है जिसे अंडा कक्ष कहा जाता है। अंडे के कक्षों में 16 रोगाणु कोशिकाएं (15 नर्स कोशिकाएं और ओसाइट) शामिल हैं जो कूप दैहिक कोशिकाओं की एक महामारी परत से घिरा हुआ है। अंडा कक्ष विकास को 14 चरणों(चित्रा 1A)में विभाजित किया गया है, जिसके दौरान ओसाइट बढ़ेगा और भ्रूण के प्रारंभिक विकास के लिए आवश्यक भंडार जमा होगा। विकास के दौरान, माइक्रोट्यूबुल पुनर्गठन और मातृ निर्धारकों के असममित परिवहन पर, ऑसाइट एंटेरो-पृष्ठीय और डोरसो-वेंट्रल कुल्हाड़ियों के साथ ध्रुवित होता है। ये अक्ष भ्रूण के बाद की ध्रुवता कुल्हाड़ियों और इस ओसाइट1के निषेचन से उत्पन्न होने वाले वयस्क को निर्धारित करते हैं । ऊजीने के दौरान, नाभिक ओसाइट में असममित स्थिति को अपनाता है। चरण 6 में, नाभिक कोशिका में केंद्रित है। ओसाइट द्वारा प्राप्त होने वाली पीछे की कूप कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित सिग्नल की पहचान किए जाने पर, नाभिक चरण 7(चित्रा 1 बी)2,3में पूर्वकाल और पार्श्व प्लाज्मा झिल्ली के बीच चौराहे की ओर पलायन करता है। इस असममित स्थिति को डोरसो-वेंट्रल अक्ष के निर्धारण को प्रेरित करने की आवश्यकता होती है।

Figure 1
चित्रा 1: ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर अंडे कक्ष। (ए)ट्रांसजेनिक मक्खियों से फिक्स्ड ओवेरियोल एफएसएस (2) केट-जीएफपी व्यक्त करते हैं जो परमाणु लिफाफे और यूबीआई-पीएच-आरएफपी को लेबल करता है जो प्लाज्मा झिल्ली को लेबल करता है। ओवेरिओल विभिन्न चरणों में अंडे के कक्षों के विकास से बना है। पूर्वकाल टिप (बाएं) पर रोगाणु के साथ पूर्वाचल धुरी के साथ परिपक्वता बढ़ जाती है जहां रोगाणु स्टेम सेल रहता है और पीछे की नोक पर पुराने चरण (दाएं)। (ख)ओजेनेसिस (बाएं) के चरण 6 पर डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा जीवित अंडे के कक्ष का जेड-प्रक्षेपण, जिसमें नाभिक ओसाइट में केंद्रित होता है। नाभिक पूर्वकाल प्लाज्मा झिल्ली (ओसाइट और नर्स सेल के बीच) और पार्श्व प्लाज्मा झिल्ली (ओसाइट और कूप कोशिकाओं के बीच) के संपर्क में चरण 7 (दाएं) पर विषम स्थिति को अपनाने के लिए माइग्रेट करेगा। यह स्थिति पृष्ठीय पक्ष के निर्धारण को प्रेरित करेगी और इस प्रकार, अंडे के कक्ष की डोरसो-वेंट्रल धुरी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कई दशकों से इस परमाणु प्रवास का अध्ययन इम्यूनोदाता द्वारा तय ऊतकों पर किया जाता रहा है । इस दृष्टिकोण ने यह प्रदर्शित करना संभव बना दिया है कि यह प्रक्रिया माइक्रोट्यूबल्स4,5के सघन नेटवर्क पर निर्भर करती है । हाल ही में, हमने कई घंटों के दौरान ओसाइट के लाइव इमेजिंग के साथ संगत स्थितियों की पेशकश करने वाला एक प्रोटोकॉल विकसित किया जिससे इस प्रक्रिया का गतिशील रूप से अध्ययन करना संभव होसके 6।

इसलिए, पहली बार, हम यह वर्णन करने में सक्षम रहे हैं कि नाभिक के प्रवास के दौरान तरजीही और विशिष्ट प्रक्षेप पथ हैं, एक पूर्वकाल प्लाज्मा झिल्ली (एपीएम) के साथ और दूसरा ओसाइट(चित्रा 2)के पार्श्व प्लाज्मा झिल्ली (एलपीएम) के साथ। ये नवीनतम परिणाम परमाणु प्रवासन जैसी गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करते समय लाइव-इमेजिंग प्रोटोकॉल के महत्व को रेखांकित करते हैं ।

Figure 2
चित्रा 2:नाभिक के विभिन्न प्रवास पथों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। ऊजेनेसिस के चरण 6 में, ओसाइट एक केंद्रीय नाभिक के साथ एक बड़ी कोशिका है। इस स्तर पर, पूर्व-पीछे ध्रुवीयता धुरी कूप कोशिकाओं के संपर्क में ओसाइट के पीछे/पार्श्व प्लाज्मा झिल्ली के साथ सेट की जाती है और पूर्वकाल प्लाज्मा झिल्ली (पीले रंग में) नर्स कोशिकाओं2के संपर्क में है। हमने पहले बताया है कि नाभिक या तो पूर्वकाल प्लाज्मा झिल्ली (एपीएम) के साथ, पार्श्व प्लाज्मा झिल्ली (एलपीएम) के साथ, या साइटोप्लाज्म (एआरटीएडी, सीधे एंटेरो-पृष्ठीय प्रांतस्था)6के माध्यम से स्थानांतरित हो सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ओसाइट न्यूक्लियस माइग्रेशन लगभग 3 एच6की घटना है, और अब तक, वास्तविक माइग्रेशन की शुरुआत को ट्रिगर करने वाली घटना अज्ञात है। माइग्रेशन की शुरुआत में इस तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन म्यूटेंट द्वारा भी देरी की जा सकती है। इन अज्ञात चर हमें लंबे समय तक (10-12 घंटे) से अधिक छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रेरित किया । इसलिए यह सुनिश्चित करना जरूरी है कि ओसाइट्स जिंदा रहें । जैसे ही अंडा कक्ष विकसित होता है, यह एक गोलाकार से अण्डाकार आकार तक एंटेरो-पीछे की धुरी के साथ बढ़ जाता है। यह विस्तार कूप कोशिकाओं के घूर्णन से प्रेरित होता है, जो चरण 1 से चरण 8 तक होता है, लंबवत से एंटीरो-पीछे की धुरी7तक। इसके अलावा, स्पंदन संपत्ति के साथ मांसपेशियों की एक ट्यूबलर म्यान अंडे के कक्षों को घेरे हुए है। इसका शारीरिक कार्य विकासशील रोम को लगातार8की ओर धकेलना है । उनके विच्छेदन के बाद अंडे कक्षों के दोलनों को प्रेरित करने वाले आंदोलनों को सीमित करने के लिए, हमने ऊंचाई में 150 माइक्रोमीटर(चित्र 3 ए)को मापने वाला एक अवलोकन माइक्रो-चैंबर तैयार किया। यह ऊंचाई 10 और 11 चरणों में एक कूप के आकार से मामूली अधिक है । यह अंडे के कक्ष के घूर्णन को संरक्षित करते हुए नमूने के ऊर्ध्वाधर आंदोलनों को काफी सीमित करता है, जिसके परिणामस्वरूप कूप विकास में सीमित दोष होते हैं। हम तो एक कताई डिस्क कंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर बहु स्थिति समय चूक अधिग्रहण द्वारा विच्छेदित अंडे कक्षों पर 12 घंटे के लिए लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं । यहां हम चरणों 6 और 7 के बीच oocyte परमाणु प्रवास का अध्ययन करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Figure 3
चित्रा 3:अवलोकन कक्ष का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ए)(शीर्ष दृश्य) एल्यूमीनियम स्लाइड के सटीक आयामों को ऊंचाइयों (ए') और स्लाइड के बीच में अच्छी तरह से ड्रिल किए गए परिधि (ए') के साथ। (ख)(नीचे देखें) कुएं को अवरुद्ध करने वाला एक कवरस्लिप सिलिकॉन तेल के साथ स्लाइड करने के लिए सील किया जाता है । (ग)(टॉप व्यू) विच्छेदित ओवरियोल्स एक इमेजिंग माध्यम में विकसित होते हैं जो गैस पारमी योग्य झिल्ली से ढका होता है। झिल्ली को स्थिर करने के लिए हेलोकार्बन तेल का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

परमाणु प्रवास का पालन करने और ओसाइट में प्रक्षेप पथ का सटीक आकलन करने के लिए, परमाणु लिफाफे और प्लाज्मा झिल्ली दोनों के लिए मार्कर की आवश्यकता है । इस उद्देश्य के साथ, दो ट्रांसजीन जिनका उच्च संकेत/शोर अनुपात है और लाइव इमेजिंग के दौरान फीका नहीं है, का चयन किया गया है । प्लाज्मा झिल्ली को लेबल करने के लिए, एक पी [यूबीआई-पीएच-आरएफपी] का उपयोग जो आरएफपी के लिए जुड़े मानव फॉस्फोलिपेज सी ∂1 (पीएलसी∂1) के प्लेक्ट्रिन होमोलॉजी (पीएच) डोमेन को एन्कोड करता है। यह पीएच डोमेन ओसाइट 9 की प्लाज्मा झिल्ली के साथ वितरित फॉस्फोनोसिटाइडपीआई (4,5)पी 2 से बांधता है। परमाणु लिफाफे के लिए, पी [पीपीटी-un1] Fs (2) केट-जीएफपी प्रोटीन-ट्रैप तनाव जहां जीएफपी को जीन एन्कोडिंग के भीतर डाला जाता है ड्रोसोफिला एस-इम्पोर्टिन एक सजातीय और एक गहन संकेत10प्रदर्शित करता है । युवा मक्खियों (1-2 दिन पुराने) को अंडाशय विच्छेदन से पहले शुष्क खमीर 24-48 घंटे वाली ताजा शीशियों में रखा जाता है।

इस लाइव इमेजिंग परख के लिए, एल्यूमीनियम का एक 1 मिमी मोटा टुकड़ा है, जो नमूने के लिए अट्रैक्टिव है, को माइक्रोस्कोपी स्लाइड के आयामों में काट दिया गया है। इसमें स्लाइड के केंद्र में 16 मिमी व्यास का छेद है जिसे 0.85 मिमी तक काउंटर किया गया है। इस काउंटरबोर में 150 माइक्रोन(चित्रा 3 ए)की गहराई के साथ एक अतिरिक्त 6 मिमी व्यास छेद है। एल्यूमीनियम कक्ष(चित्रा 3B)के तल पर एक कवरस्लिप सिलिकॉन तेल (नमूने के लिए निष्क्रिय) से चिपका हुआ है। नमूनों को मध्यम-भरे कुएं में रखने के बाद, ओ2/सीओ 2एक्सचेंज के लिए पार की गई एक झिल्ली को मध्यम पर रखाजाता है और हेलोकार्बन तेल(चित्रा 3सी)से घिरा हुआ है।

विच्छेदन के लिए, 0.05 x 0.02 मिमी के टिप आयाम के साथ स्टेनलेस स्टील संदंश का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, और ओवरियोल्स(चित्रा 4B,सी)के पृथक्करण के लिए 0.20 मिमी व्यास सुई। माइग्रेट करने वाले नाभिक को कैमरे से लैस कताई-डिस्क कॉन्फोकल उल्टे माइक्रोस्कोप सीएसयू-एक्स1 पर चित्रित किया जाता है। बहु-स्थिति छवियों को 24 डिग्री सेल्सियस पर हर 15 मिनट में समय-चूक द्वारा प्राप्त किया गया था। 15 मिनट के अंतराल में नमूनों के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन और फोटोटॉक्सिकिटी के सीमित फोटोब्लैचिंग के साथ बहु-स्थिति अधिग्रहण करने की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, एक छोटा अंतराल परमाणु प्रक्षेप पथ का पालन करने के लिए बहुत अधिक जानकारीपूर्ण डेटा प्रदान नहीं करेगा । फिल्मों को फिजी सॉफ्टवेयर11 के माध्यम से संसाधित और विश्लेषण किया जाता है।

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Protocol

1. इमेजिंग मध्यम तैयारी

  1. उपयोग के दिन ताजा मीडिया तैयार करें। श्नाइडर माध्यम के पिपेट 200 माइक्रोन (एल-ग्लूटामाइन और 0.40 ग्राम/एल ऑफ नाएचसीओ3 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण बछड़े सीरम, पेनिसिलिन के 100 यू/एमएल, और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 मिलीग्राम/एमएल के साथ पूरित होता है।)
  2. इंसुलिन के 30 माइक्रोन के साथ पूरक 10 मिलीग्राम/एमएल।
  3. गर्मी में निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम के 4 माइक्रोन जोड़ें।

2. ऑब्जर्वेशन-चैंबर की तैयारी

  1. एक पिपेट टिप के साथ, पंचर स्लाइड(चित्रा 4D)के नीचे छेद के चारों ओर सिलिकॉन तेल की एक छोटी राशि लागू करें।
  2. 0.13-0.16 मिमी मोटाई के 24 x 50 मिमी कवरलिप की स्थिति।
  3. एक पिपेट टिप के व्यापक अंत के साथ, कवरस्लिप को सील करने और स्लाइड(चित्रा 4F,जी)में सिलिकॉन रिंग इंटीरियर बनाने के लिए सिलिकॉन को समतल करने के लिए कवरस्लिप पर दबाव लागू करें।

3. अंडाशय विच्छेदन

  1. एक सीओ2 पैड पर वांछित फेनोटाइप की एक मादा फ्लाई एनेस्थेटाइज करें।
  2. इमेजिंग माध्यम के 150 माइक्रोन में मादा को विच्छेदन कुएं(चित्रा 4H)में स्थानांतरित करें।
  3. एक मादा को संदंश के साथ अपने छाती को पकड़कर खोलें और पृष्ठीय पेट क्यूटिकल को संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ पिंचिंग करें।
  4. अंडाशय की जोड़ी को अलग और अलग करें, जो क्यूटिकल ओपनिंग पर आसानी से दिखाई देना चाहिए।
  5. ध्यान से गर्भाशय, अंडाशय, और मांसपेशियों की म्यान(चित्रा 4I)को हटा दें।
  6. इमेजिंग माध्यम के 10-15 माइक्रोन की एक बूंद रखें और इमेजिंग चैंबर(चित्रा 4J,K) में एक अंडाशय को स्थानांतरितकरें।

4. अंडा चैंबर अलगाव

  1. अंडाशय को अलग करने के लिए, अंडाशय के पीछे के छोर (पुराने चरणों की ओर) को सुई से पकड़ें। एक और सुई के साथ अंकुरित पर ध्यान से खींच कर अंडाशय को अलग करें।
  2. अंडे के कक्षों पर शेष मांसपेशी म्यान निकालें; एक सुई म्यान पकड़े और दूसरे बड़े कक्षों (चरण 9 या पुराने) के माध्यम से ovariole पर खींच ।
  3. अनशीथेड ओवेयोल को सिंक करने और कवरस्लिप से संपर्क करने की अनुमति दें।
  4. देर से चरणों और अंडाशय के बाकी संदंश की मदद से माइक्रो-चैंबर से निकालें। अधिग्रहण(चित्रा 4L)को सुविधाजनक बनाने के लिए सुइयों के साथ दूसरों से अंडाशय को सावधानीपूर्वक दूरी दें।

5. ऑब्जर्वेशन चैंबर बंद

  1. पारमी झिल्ली(चित्रा 4M,N) के एक छोटे वर्ग (10 x10मिमी) को काटें।
  2. किसी भी हवा के बुलबुले(चित्रा 4O)को निष्कासित करने के लिए इमेजिंग माध्यम के शीर्ष पर झिल्ली को ध्यान से लागू करें।
  3. हर्मेटिकली झिल्ली के समोच्च पर कुएं के चारों ओर हेलोकार्बन तेल की एक पतली परत के साथ कक्ष को सील करें(चित्रा 4P,क्यू)।

6. इमेजिंग

  1. इमेजिंग सेट-अप को 40x उद्देश्य (एचसीएक्स पीएल एपीओ, 1.25NA, तेल विसर्जन) का उपयोग करके उल्टे माइक्रोस्कोप के स्लाइड धारक पर रखें।
  2. विभिन्न चरण 6 ओसाइट्स की स्थिति का पता लगाएं और बचाएं जिसमें नाभिक माइग्रेट करने के लिए तैयार है।
  3. सेट-अप 488 और 561 एनएम लेजर। 150 मिलियनW की मापी गई आउटपुट लेजर पावर के साथ, लेजर पावर का 30% और क्रमशः 300 एमएस और 500 एमएस एक्सपोजर का उपयोग करें।
  4. प्रयोग को सेट-अप करें। नाभिक पर केंद्रित 1 माइक्रोन के अंतराल के साथ 15 मिनट-41 वर्गों के अंतराल के साथ 12 घंटे की समय-चूक लें।
    नोट: ऊपर वर्णित एक्सपोजर समय के अनुसार, यह सेटिंग लगभग 45 एस में एक स्थिति के अधिग्रहण की अनुमति देती है। चूंकि स्थिति बदलने के कारण देरी होती है, इसलिए इन स्थितियों में अधिकतम 12 पदों को निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है ।

7. छवि विश्लेषण

  1. प्लग-इन ऑर्थोगोनल व्यू का उपयोग करके सॉफ्टवेयर फिजी पर फिल्मों को संसाधित करें और नाभिक को मैन्युअल रूप से ट्रैक करें।

Figure 4
चित्रा 4:कदम से कदम माइक्रो चैंबर बढ़ते चित्र । (A,B,C) आवश्यक उपकरणों की तैयारी: अच्छी तरह से प्लेट, संदंश, सुई, इमेजिंग मीडिया, सिलिकॉन तेल, पारम झिल्ली, और एल्यूमीनियम स्लाइड विच्छेदन। (घ)एक पिपेट टिप के साथ एल्यूमीनियम स्लाइड के पीछे सिलिकॉन तेल का आवेदन। (ई)एक ग्लास कवरलिप कक्ष के नीचे बनाने के लिए सिलिकॉन तेल पर चिपका हुआ है। (एफ,जी) कक्ष के अंदर एक संयुक्त बनाने के लिए एक पिपेट टिप के व्यापक छोर के साथ कवरस्लिप पर दबाव आवेदन। (एच,I) इमेजिंग मीडिया में मक्खी अंडाशय का विच्छेदन। (जम्मू)माइक्रो-चैंबर में इमेजिंग मीडिया की एक बूंद की पिपटिंग । (K,L) सुइयों का उपयोग करके सूक्ष्म कक्ष में अंडाशय का पृथक्करण। (एम,एन,ओ) पारमी योग्य झिल्ली 10 x 10 मिमी वर्ग में कटौती और सूक्ष्म कक्ष में माध्यम की बूंद पर रखकर। (P,Q) हेलोकार्बन तेल के साथ माइक्रो-चैंबर की सीलिंग। नमूनों को इमेज करने की तैयारी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

माइग्रेशन से पहले, नाभिक गतिशील होता है और पूर्व-प्रवास के रूप में परिभाषित अवधि के दौरान केंद्रीय स्थिति के चारों ओर दोलन करता है। ये छोटे आंदोलन उन ताकतों को आगे बढ़ाने और खींचने का संतुलन दर्शाते हैं जो ओसाइट के बीच में संतुलन बनाए रखते हैं। नाभिक के प्रक्षेप-पथ की मात्रा निर्धारित करके, हमने यह दर्शाया है कि एपीएम और एलपीएम प्रक्षेप पथ में समान अनुपात थे । हम नाभिक और प्लाज्मा झिल्ली6के बीच पहले संपर्क से प्रक्षेपवक्र की प्रकृति को परिभाषित करते हैं । इस प्रकार, नाभिक इसके साथ फिसलने से पहले या तो एपीएम या एलपीएम तक पहुंचता है, दो प्लाज्मा झिल्ली (चित्रा 5, सिनेमा 1-2)के चौराहे परअपनीअंतिम स्थिति तक पहुंचने के लिए । इसके अलावा, हमने दिखाया है कि अलग संकेतों प्रक्षेप पथ में से प्रत्येक एहसान । उदाहरण के लिए, नाभिक और ओसाइट की पीछे की झिल्ली के बीच संकुल सेंट्रोसोम एपीएम प्रक्षेपवक्र को सक्षम करते हैं। इसके विपरीत, माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन (एमएपी) मशरूम बॉडी डिफेक्ट (कीचड़), जो परमाणु लिफाफे के लिए विषम रूप से स्थित है, एलपीएम6के साथ एक प्रक्षेपवक्र का समर्थन करता है । इसके अलावा, या तो सेंट्रोसोम या कीचड़ की कमी जंगली प्रकार के संदर्भ6की तुलना में नाभिक के प्रवास की गति को प्रभावित करती है ।

Figure 5
चित्रा 5:लाइव इमेजिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा ओसाइट नाभिक के प्रवास की प्रतिनिधि छवियां । (A)समय-चूक फिल्म से निकाले गए चयनित फ्रेम 1 एक जंगली प्रकार के अंडे के कक्ष के ओसाइट नाभिक के परमाणु प्रवास को दिखाते हुए परमाणु लिफाफा मार्कर(Fs (2) केटीजीएफपी)और प्लाज्मा झिल्ली मार्कर(यूबीआई-पीएच-आरएफपी)व्यक्त करते हैं । (ख) फिल्म 2 से चयनित फ्रेम (मूवी 1का क्रॉप्ड वर्जन) ओसाइट पर फोकस करते हुए । समय की शुरुआत के सापेक्ष समय (एच: न्यूनतम में) प्रत्येक चयनित फ्रेम के शीर्ष पर इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ओसाइट और अंडे के चैंबर की वृद्धि सही विकास के संकेत हैं, जो समय-चूक रिकॉर्डिंग(चित्रा 5)में आसानी से दिखाई देती हैं। इसके विपरीत, झिल्ली विकृति अव्यवस्थित कूप कोशिकाओं, अवरुद्ध कोशिकाओं, और सिकुड़े हुए नाभिक मरने वाले अंडे के कक्षों(चित्रा 6, मूवी 3-4)के पहले संकेत हैं। इन अपक्षयी अंडे कक्षों के अवलोकन पर, नाभिक आंदोलनों अब विश्लेषण के लिए शोषण योग्य नहीं हैं। आमतौर पर, हम इमेजिंग(चित्रा 6 ए)के 8 घंटे से पहले किसी भी विकृत ओसाइट का पालन नहीं करते हैं और प्रारंभिक पतन के दुर्लभ मामले विच्छेदन या बढ़ते कदमों(चित्रा 6B)के दौरान समस्याओं के कारण होते हैं। हम मानते हैं कि इमेजिंग के 10 एच के बाद 50% ओसाइट्स अभी भी जीवित हैं।

Figure 6
चित्रा 6:लाइव इमेजिंग के दौरान एक अंडे के कक्ष के पतन की प्रतिनिधि छवियां । (A)समय-चूक फिल्म 3 से निकाले गए चयनित फ्रेम 8 घंटे के बाद एक जंगली प्रकार के अंडे के कक्ष के पतन को दिखाते हुए, परमाणु लिफाफा मार्कर(एफएस (2) केटीजीएफपी)और प्लाज्मा झिल्ली मार्कर(यूबीआई-पीएच-आरएफपी)को व्यक्त करते हैं । (ख) मूवी 4 से निकाले गए चुनिंदा फ्रेम एक जंगली प्रकार के अंडे के चैंबर के तेजी से पतन को दिखाते हैं । इस तरह के प्रारंभिक पतन विच्छेदन या बढ़ते कदमों के दौरान एक समस्या की विशेषता है। समय की शुरुआत के सापेक्ष समय (एच: न्यूनतम में) प्रत्येक चयनित फ्रेम के शीर्ष पर इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अत्यधिक आंदोलनों एक अतिरिक्त अनुपयोगी डेटा और आगे विश्लेषण में जिसके परिणामस्वरूप मुद्दा हो सकता है, के रूप में अंडा कक्षों छवि फ्रेम में नहीं रहेगा । इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, हम एक 40x उद्देश्य का उपयोग करते हैं जो अवलोकन का एक पर्याप्त फ्रेम प्रदान करता है और एक्स-वाई विमान के साथ अंडे के कक्षों के आंदोलनों की अनुमति देता है, जबकि ओसाइट नाभिक द्वारा उठाए गए प्रवासी पथ के गुणात्मक मूल्यांकन के लिए पर्याप्त समाधान प्रदान करता है। इसके अलावा, जेड-एक्सिस में अत्यधिक आंदोलनों के प्रभाव को सीमित करने के लिए और जेड-स्टैक की सीमा के भीतर ओसाइट रखने के लिए, हम 40 माइक्रोन स्टैक (41 वर्गों 1 माइक्रोन के अलावा) पर जेड-सेक्शन करते हैं, जबकि चरण-6 ओसाइट का आकार 20 माइक्रोन का होता है।

फिल्म 1: एक जंगली प्रकार के अंडे चैंबर के प्रतिनिधि फिल्म दोनों परमाणु लिफाफा मार्कर(Fs (2) Ket-GFP)और प्लाज्मा झिल्ली मार्कर(ubi-पीएच-RFP)व्यक्त । इस उदाहरण में, ओसाइट नाभिक पूर्वकाल झिल्ली से संपर्क करता है और एंटेरो-पृष्ठीय कोने तक पहुंचने के लिए इसके साथ स्लाइड करता है। समय-चूक का बीता हुआ समय वीडियो के ऊपरी-बाएं कोने में एच:मिन में इंगित किया गया है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 2: फिल्म 1 का क्रॉप संस्करण, ओसाइट पर ध्यान केंद्रित करना। समय-चूक का बीता हुआ समय वीडियो के ऊपरी-बाएं कोने में एच:मिन में इंगित किया गया है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 3: एक जंगली प्रकार के अंडे चैंबर के प्रतिनिधि फिल्म दोनों परमाणु लिफाफा मार्कर(Fs (2) कीट-GFP)और प्लाज्मा झिल्ली मार्कर(ubi-पीएच-RFP)व्यक्त करते हैं । इस उदाहरण में, अंडा कक्ष नाभिक प्रवास के पूरा होने से पहले 8:45 घंटे पर पतित करने के लिए शुरू होता है । समय-चूक का बीता हुआ समय वीडियो के ऊपरी-बाएं कोने में एच:मिन में इंगित किया गया है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

फिल्म 4: एक जंगली प्रकार के अंडे कक्ष के प्रारंभिक पतन की प्रतिनिधि फिल्म दोनों परमाणु लिफाफा मार्कर(Fs (2) केत-GFP)और प्लाज्मा झिल्ली मार्कर(ubi-PH-RFP)व्यक्त करते हैं । समय-चूक का बीता हुआ समय वीडियो के ऊपरी-बाएं कोने में एच:मिन में इंगित किया गया है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

अन्य प्रोटोकॉल ों में वर्णन किया गया है कि ड्रोसोफिला अंडे के कक्षों को लाइव-इमेजिंग परख12, 13के लिए तैयार और संस्कृति कैसे तैयार कियाजाए। इस प्रोटोकॉल की नवीनता एक खोखले एल्यूमीनियम स्लाइड, एक कवरस्लिप, और एक ओ2/सीओ2 पारमीय झिल्ली का उपयोग कर निर्मित एक इमेजिंग चैंबर का उपयोग है । इस सेट-अप का मुख्य लाभ नमूने पर दबाव डाले बिना जेड में आंदोलन को सीमित करना है। इस प्रकार, ओसाइट अभी भी स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित हो सकता है, और यही कारण है कि पहले, 40x उद्देश्य का उपयोग किया जाता है और दूसरा, जेड-स्टैक 40 माइक्रोन के साथ अधिग्रहीत किए जाते हैं, जबकि ओसाइट चरण 6 पर लगभग 20 माइक्रोन ऊंचाई है।

हालांकि यह प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है, प्रत्येक चरण परख के लिए महत्वपूर्ण है। माइक्रो-चैंबर की तैयारी, पारम करने योग्य झिल्ली, और कक्ष की सीलिंग गैस विनिमय की अनुमति देने और इमेजिंग माध्यम के सूखने को रोकने के लिए आवश्यक है और इसलिए, नमूने। अंडे चैंबर को नुकसान पहुंचाना अपने अस्तित्व से समझौता करता है, इसलिए नाजुक और सटीक विच्छेदन तकनीकें सर्वोपरि हैं । इसके अतिरिक्त, मांसपेशियों म्यान को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए क्योंकि इस संरचना के शेष टुकड़े अवांछित अंडा कक्ष आंदोलन में परिणाम देंगे।

एल्यूमीनियम, नमूना के लिए अपनी सुरक्षा के अलावा, अपनी ताकत, स्थायित्व, और सफाई की आसानी के लिए चुना गया है । इन परिस्थितियों में अन्य सामग्रियों की अभी तक जांच नहीं की गई है । 3 डी प्रिंटर के विकास के साथ प्लास्टिक का उपयोग आकर्षक है; हालांकि, 150 माइक्रोन की ऊंचाई के साथ एक छेद बनाने के साथ एक बहुत सटीक होना चाहिए।

हाल ही में, हुयन्ह और सहयोगियों ने हाइड्रोजेल14के आधार पर ड्रोसोफिला जर्मेरियम के अनुकूल एक इमेजिंग तकनीक विकसित की है। चाहे या नहीं यह oogenesis में 6 चरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है परीक्षण किया जाना बाकी है । विशेष रूप से, यह ज्ञात नहीं है कि कूप के रोटेशन जैसे आंदोलन हाइड्रोगेल प्रणाली में हो सकते हैं या नहीं। ये रोटेशन आंदोलन अंडे के कक्ष के विस्तार के लिए आवश्यक हैं और इसलिए, सामान्य विकास।

अन्य प्रोटोकॉलों में15 , 16के ऊसाइट नाभिक प्रवास का पालन करने के लिए हेलोकार्बन तेल का उपयोग कियागयाहै । हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाले तेल के ऑप्टिकल गुण और इमेजिंग मीडियम बहुत अलग हैं। विशेष रूप से, श्नाइडर माध्यम में 450 एनएम के आसपास तरंगदैर्ध्य के लिए अधिकतम प्रकाश अवशोषण होता है। इसलिए, हम तेल के साथ एक उच्च संकेत/शोर अनुपात का पालन करते हैं । हालांकि, हेलोकार्बन तेल 1-2 घंटे तक ओसाइट अस्तित्व को बहुत कम कर देता है, जो नाभिक के पूरे प्रवास का पालन करने की क्षमता को सीमित करता है, विशेष रूप से आनुवंशिक संदर्भों में जहां यह माइग्रेशन परेशान होता है। इस वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, इमेजिंग माध्यम अंडे के चैंबर के एक लंबे अस्तित्व की अनुमति देता है जिससे हमें 12 घंटे तक समय-चूक रिकॉर्डिंग करने की अनुमति देता है। इस प्रकार, हम पूरी माइग्रेशन प्रक्रिया को कैप्चर करने का मौका अधिकतम करते हैं।

हमारे वर्तमान मापदंडों का उपयोग करके, हम केवल समय-चूक के लिए अधिकतम 12 पदों का प्रदर्शन कर सकते हैं। औसतन, चित्रित नाभिक का एक तिहाई व्यवहार्य है और इसका विश्लेषण किया जा सकता है। दक्षता में सुधार करने के लिए, एक दोहरी कैमरा प्रणाली से लैस एक कताई-डिस्क माइक्रोस्कोप, जो एक ही समय में दोनों तरंगदैर्ध्य के अधिग्रहण की अनुमति देगा, अधिग्रहण के समय को गति देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस प्रकार, पदों की संख्या में वृद्धि।

इसके अलावा, जैसा कि यह सूक्ष्म कक्ष अपेक्षाकृत लंबी अवधि के लिए विच्छेदित अंडे कक्षों को संस्कृति प्रदान करता है, इसका उपयोग ड्रोसोफिला ऊजेनेसिस के अन्य गतिशील तंत्रों के अध्ययन में बढ़ाया जा सकता है जिन्हें पूर्व वीवो (उदाहरण के लिए, ओसाइट, कूप रोटेशन, कूप कोशिकाओं मॉर्फोजेनेसिस आदि में साइटोप्लाज्मिक स्ट्रीमिंग) का मूल्यांकन करने की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम जीन-एंटोनी लेपसेंट और निकोलस टिसोट के बेहद आभारी हैं जिन्होंने मूल रूप से प्रोटोकॉल विकसित किया और हमारे साथ चित्र 3 के कुछ चित्रमय तत्वों को साझा किया। हम फैनी रोलैंड-गॉसेलिन का शुक्रिया अदा करते हैं जिन्होंने फिगर 4 की तस्वीरें लीं । हम अन्य प्रयोगशाला सदस्यों को भी सहायक चर्चाओं के लिए धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस तकनीक के सुधार में योगदान दिया और नथानिएल हेनेमैन ने अपनी टिप्पणियों के लिए इस पांडुलिपि को बेहतर बनाने में मदद की। हम इंस्टीट्यूट जैक्स मोनोड की इमागोसैन कोर सुविधा को स्वीकार करते हैं, फ्रांस-बायोइमेजिंग (एएनआर-10-आईएनबीएस-04) के सदस्य। Maëlys Loh फ्रांस के अनुसंधान मंत्रालय (MESRI) से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित है । एंटोनी गुइशे और फ्रेड बर्नार्ड को एआरसी (ग्रांट PJA20181208148), एसोसिएशन डेस एंट्रेप्रिस कॉन्ट्रोवर्सी ले कैंसर (ग्रांट गेफ्लूक 2020 #221366) और IdEx Université de पेरिस (ANR-18-IDEX-0001) से उद्भव अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetize CO2 pad Dutscher 789060 Anesthetize flies
Coverslip (24x50 mm) Knittel Glass VD12450Y100A Observation-chamber preparation
Forceps Dumont #5 Carl Roth K342.1 Dissection
Stainless steel needles Entosphinx 20 Dissection
Heat-inactivated fetal calf serum SIGMA-ALDRICH F7524 Imaging medium
Insulin solution bovine pancreas SIGMA-ALDRICH 10516 - 5ml Imaging medium
Penicilin/Streptomycin solution SIGMA-ALDRICH P0781 Imaging medium
Permeable membrane Leica 11521746 Observation-chamber preparation
Schneider Medium Pan Biotech P04-91500 Imaging medium
Silicon grease BECKMAN COULTER 335148 Observation-chamber preparation
Spinning disk confocal Zeiss CSU-X1 Nuclear migration observation
Voltalef oil 10S VWR 24627 - 188 Observation-chamber preparation

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 171 परमाणु प्रवास नाभिक स्थिति ड्रोसोफिला,ओसाइट माइक्रोट्यूबल्स लाइव इमेजिंग
<em>ड्रोसोफिला</em> ओसाइट में परमाणु प्रवासन
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Loh, M., Guichet, A., Bernard, F.… More

Loh, M., Guichet, A., Bernard, F. Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte. J. Vis. Exp. (171), e62688, doi:10.3791/62688 (2021).

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