Summary
I Drosophilagennemgår oocytkernen mikrotubuleafhængig migration under oogenesis. Her beskriver vi en protokol, der blev udviklet til at følge migrationen ved at udføre live billeddannelse på ægkamre ex-vivo. Vores procedure opretholder ægkamre i live i 12 timer for at erhverve multi-position 3D time-lapse film ved hjælp af spinning-disk confocal mikroskopi.
Abstract
Levende cellebilleddannelse er især nødvendig for at forstå de cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer organelle bevægelser, cytoskeleton omlejringer eller polaritetsmønstre i cellerne. Når man studerer oocytkernepositionering, er live-imaging teknikker afgørende for at fange de dynamiske begivenheder i denne proces. Drosophila ægkammeret er en flercellet struktur og et fremragende modelsystem til at studere dette fænomen på grund af dets store størrelse og tilgængelighed af adskillige genetiske værktøjer. Under Drosophila mid-oogenesis migrerer kernen fra en central position i oocytten for at vedtage en asymmetrisk position medieret af mikrotubule-genererede kræfter. Denne migration og placering af kernen er nødvendig for at bestemme embryoets polaritetsakser og den efterfølgende voksne flue. Et karakteristisk træk ved denne migration er, at den forekommer i tre dimensioner (3D), hvilket skaber en nødvendighed for levende billeddannelse. For at studere de mekanismer, der regulerer nuklear migration, har vi således udviklet en protokol til at dyrke de dissekerede ægkamre og udføre live billeddannelse i 12 timer ved time-lapse-erhvervelser ved hjælp af spinding-disk konfokal mikroskopi. Samlet set giver vores forhold os mulighed for at bevare Drosophila ægkamre i live i lang tid, hvilket gør det muligt at visualisere færdiggørelsen af nuklear migration i et stort antal prøver i 3D.
Introduction
I flere år har Drosophila oocyte vist sig som et modelsystem til at studere nuklear migration. Den Drosophila oocyt udvikler sig i en flercellet struktur kaldet ægget kammer. Æggekamre omfatter 16 kimceller (15 sygeplejerskeceller og oocytten) omgivet af et epitellag af follikulære somatiske celler. Udviklingen af æggekammeret er blevet opdelt i 14 faser (figur 1A), hvor oocyten vil vokse og akkumulere reserver, der er nødvendige for embryoets tidlige udvikling. Under udviklingen, ved mikrotubule reorganisering og asymmetrisk transport af moderlige determinanter, polariserer oocyten langs de antero-dorsale og dorso-ventrale akser. Disse akser bestemmer embryoets efterfølgende polaritetsakser og den voksne som følge af befrugtningen af denne oocyt1. Under oogenesis, vedtager kernen en asymmetrisk position i oocyt. I fase 6 er kernen centreret i cellen. Efter endnu ikke identificeret signal, der udsendes af de bageste follikulære celler, som modtages af oocytten, migrerer kernen mod krydset mellem de forreste og laterale plasmamembraner i fase 7 (Figur 1B)2,3. Denne asymmetriske position er nødvendig for at fremkalde bestemmelsen af dorso-ventral aksen.
Figur 1: Drosophila melanogaster ægkamre. Ovariolen består af at udvikle ægkamre på forskellige stadier. Modning øges langs antero-posterior aksen med germarium på den forreste spids (venstre), hvor kim stamcellen ligger og den ældre fase på den bageste spids (højre). (B) Z-projektion af levende æg kammer ved spinding disk confocal mikroskopi på trin 6 af oogenesis (venstre), hvor kernen er centreret i oocytten. Kernen vil migrere for at indtage en asymmetrisk position på trin 7 (til højre) i kontakt med den forreste plasmamembran (mellem oocytten og sygeplejerskecellen) og den laterale plasmamembran (mellem oocytten og follikulære celler). Denne position vil fremkalde bestemmelsen af dorsalsiden og dermed ægkammerets dorso-ventrale akse. Klik her for at se en større version af dette tal.
I mange årtier er denne nukleare migration blevet undersøgt på fast væv ved immunostaining. Denne fremgangsmåde har især gjort det muligt at påvise , at denne proces afhænger af et tæt netværk af mikrotubuli4,5. For nylig har vi udviklet en protokol, der tilbyder betingelser, der er kompatible med live billeddannelse af oocyten i flere timer, hvilket gør det muligt at studere denne proces dynamisk6.
Derfor har vi for første gang været i stand til at beskrive, at kernen har præference- og karakteristiske baner under dens migration, en langs den forreste plasmamembran (APM) og en anden langs den laterale plasmamembran (LPM) af oocytten (Figur 2). Disse seneste resultater understreger betydningen af protokoller om live-billeddannelse, når man studerer dynamiske processer såsom nuklear migration.
Figur 2: Skematisk repræsentation af kernens forskellige overflytningsstier. På trin 6 af oogenesen er oocytten en stor celle med en central kerne. På dette stadium indstilles den antero-bageste polaritetsakse med en bageste/lateral plasmamembran af oocyten i kontakt med follikulære celler, og den forreste plasmamembran (i gult) er i kontakt med sygeplejerskecellerne2. Vi har tidligere rapporteret, at kernen kunne migrere enten langs den forreste plasmamembran (APM), langs den laterale plasmamembran (LPM) eller gennem cytoplasmaet (STAD, direkte til den antero-dorsale cortex)6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Oocytkernemigrationen er et fænomen på ca. 3 timerog 6, og indtil videre er den begivenhed, der udløser starten på den faktiske migration, ukendt. Starten af migrationen kan også forsinkes af proteinmutanter, der bruges til at studere denne mekanisme. Disse ukendte variabler motiverede os til at erhverve billeder over lange perioder (10-12 timer). Det er derfor vigtigt at sikre, at oocytterne forbliver i live. Efterhånden som ægkammeret udvikler sig, forlænges det langs antero-posterior-aksen fra en sfærisk til en elliptisk form. Denne forlængelse er drevet af rotationen af follikulære celler, som forekommer fra fase 1 til fase 8, vinkelret på antero-posterior aksen7. Derudover omgiver en rørformet kappe af muskler med pulsatile ejendom æggekamrene. Dens fysiologiske funktion er at skubbe de udviklende follikler mod ovidukten kontinuerligt8. For at begrænse de bevægelser, der fremkalder svingninger i æggekamrene efter deres dissektion, har vi designet et observationsmikrokammer på 150 μm i højden (figur 3A). Denne højde er marginalt højere end størrelsen af en follikel på trin 10 og 11. Den begrænser prøvens lodrette bevægelser betydeligt, samtidig med at æggekammerets rotation bevares, hvilket resulterer i begrænsede fejl i follikeludviklingen. Vi udfører derefter live billeddannelse i 12 timer på dissekeret ægkamre ved multi-position time-lapse erhvervelser ved hjælp af en spinning-disk confocal mikroskop. Her beskriver vi vores protokol for at studere oocytkernens migration mellem fase 6 og 7.
Figur 3: Skematisk repræsentation af observationskammeret. (B) (Nederste visning) En coverlip, der blokerer brønden, forsegles til rutsjebanen med siliciumfedt. (C) (Øverste visning) Dissekerede ovarioler udvikler sig i et billeddiagnostikmedium, der er dækket af en gaspermeabel membran. Halocarbonolie bruges til at stabilisere membranen. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at følge den nukleare migration og præcist vurdere baner i oocytten er der behov for markører for både den nukleare kuvert og plasmamembranen. Med dette mål er der valgt to transgener, der har et højt signal/ støjforhold og ikke falmer i løbet af live billeddannelse. For at mærke plasmamembranen anbefales det at bruge en P[ubi-PH-RFP], der koder pleckstrin-homologidomænet (PH) på human phospholipase C ∂1 (PLC∂1), der er fusioneret med RFP. Dette PH-domæne binder sig til fosforikidET PI(4,5)P2 fordelt langs plasmamembranen i oocyten9. For den nukleare ramme viser P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP proteinfældestammen, hvor GFP indsættes i genet, der omslutter Drosophila ß-importin, et homogent og intenst signal10. Unge fluer (1-2 dage gamle) er placeret i friske hætteglas, der indeholder tørgær 24-48 timer før æggestokkene dissektion.
Til denne live-imaging analyse, en 1 mm tykt stykke aluminium, som er ikke-reaktivt for prøven, er blevet skåret i dimensionerne af en mikroskopi dias. Det har et hul med en diameter på 16 mm i midten af rutsjebanen, der er blevet modboret til 0,85 mm. Denne kontrabore har et hul med en diameter på yderligere 6 mm med en dybde på 150 μm (Figur 3A). En coverlip limes med silikonefedt (inert til prøven) i bunden af aluminiumskammeret (Figur 3B). Efter at prøverne er placeret i den mediumfyldte brønd, placeres en membran, der kan gennemtrænges med O2/CO2-udveksling, over mediet og omgivet af halocarbonolie (Figur 3C).
Til dissektion anbefales det at bruge pincet i rustfrit stål med en spidsdimension på 0,05 x 0,02 mm og nåle med en diameter på 0,20 mm til adskillelse af ovariolerne (Figur 4B, C). De migrerende kerner er afbildet på en roterende disk konfokale inverteret mikroskop CSU-X1 udstyret med et kamera. Billeder med flere positioner blev anskaffet ved tidsforskydning hvert 15. minut ved 24 °C. Et interval på 15 min. gør det muligt at udføre erhvervelser med flere positioner med begrænset fotobleaching af fluorescerende proteiner og fototoksicitet for prøverne. Desuden ville et kortere interval ikke give meget mere informative data til at følge de nukleare baner. Filmene behandles og analyseres via Fiji software11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Billedbehandling medium forberedelse
- Forbered friske medier på brugsdagen. Pipette 200 μL Schneider-medium (indeholdende L-glutamin og 0,40 g/l NaHCO3 suppleret med 10% varmeinaktiveret føtal kalveserum, 100 U/mL penicillin og 100 mg/mL streptomycin).
- Tillæg med 30 μL insulin 10 mg/mL.
- Der tilsættes 4 μL varmeinaktiveret føtalkalveserum.
2. Forberedelse af observationskammer
- Med en pipettespids påføres en lille mængde silikonefedt rundt om hullet på undersiden af det punkterede dias (Figur 4D).
- Placer en 24 x 50 mm coverlip af 0,13-0,16 mm tykkelse.
- Med den brede ende af en pipettespids skal du lægge pres på dækslet for at flade silikonen for at forsegle dækslet og skabe en silikonering indvendig på diaset (Figur 4F, G).
3. Æggestokdissektion
- Bedøve en kvindelig flue af den ønskede fænotype på en CO2 pad.
- Hunnen overføres i 150 μL af billeddiagnostisk medium i en dissekeringsbrønd (Figur 4H).
- Åbn en kvinde ved at gribe sin brystkasse med pincet og klemme ryglivets neglebånd med et andet par pincet.
- Isoler og løsrive par æggestokke, som skal være let synlige ved neglebånd åbning.
- Fjern forsigtigt livmoderen, ovidukten og muskelskeden (Figur 4I).
- Der anbringes en dråbe på 10-15 μL af billeddiagnostisk medium, og der overføres en æggestok i billedkammeret(figur 4J,K).
4. Ægkammer isolation
- For at adskille ovariolerne skal du holde den bageste ende af æggestokken (mod de ældre stadier) med nålen. Drille fra hinanden ovarioler ved omhyggeligt at trække på germarium med en anden nål.
- Fjern den resterende muskelskede på æggekamrene; den ene nål, der holder kappen, og den anden trækker på ovariolen gennem de større kamre (trin 9 eller ældre).
- Lad den uopvarmede ovariol synke og kontakte coverlip.
- Fjern sene stadier og resten af æggestokkene fra mikrokammeret ved hjælp af pincet. Fjern forsigtigt ovariolerne fra de andre med nåle for at lette erhvervelsen (Figur 4L).
5. Observationskammer lukker
- Skær en lille firkant (10 x 10 mm) gennemtrængelig membran(Figur 4M,N).
- Påfør forsigtigt membranen oven på billedmediet for at udvise luftbobler (Figur 4O).
- Hermetisk forsegle kammeret med et tyndt lag halocarbonolie omkring brønden på membranens kontur (Figur 4P, Q).
6. Billedbehandling
- Sæt billedopsætningen på diasholderen på det omvendte mikroskop ved hjælp af et 40x mål (HCX PL Apo, 1.25NA, oliesænkning).
- Find og gem positioner i forskellige fase 6 oocytter, hvor kernen er klar til at migrere.
- Opsæt laserne 488 og 561 nm. Brug henholdsvis 30 % af lasereffekten og 300 ms og 500 ms med en målt udgangslasereffekt på 150 mW.
- Opsætning af eksperimentet. Tag en tidsforskydning på 12 timer med intervallet 15 min-41 sektioner med et interval på 1 μm centreret på kernen.
BEMÆRK: I henhold til den eksponeringstid, der er beskrevet ovenfor, giver denne indstilling mulighed for erhvervelse af en position på omkring 45 s. Da der er en forsinkelse på grund af positionsskift, anbefales det at indstille maksimalt 12 positioner under disse forhold.
7. Billedanalyse
- Behandl filmene på softwaren Fiji ved hjælp af plug-in Orthogonal-visningen, og spor kernerne manuelt.
Figur 4:Trinvise monteringsbilleder fra mikrokammer. (A,B,C) Forberedelse af de nødvendige værktøjer: dissekering godt plade, pincet, nåle, billeddannelse medier, silicium fedt, gennemtrængelig membran, og aluminium dias. (D) Påføring af siliciumfedtet bag på aluminiumsskredningen med en pipettespids. (E) En glasovertræk er limet på siliciumfedtet for at skabe bunden af kammeret. (F,G) Trykpåføring på coverlipet med den bredere ende af en pipettespids for at skabe en samling inde i kammeret. (H,I) Dissektion af flue æggestokkene i billedbehandling medier. (J) Pipering af en dråbe billeddiabende medier i mikrokammeret. (K,L) Adskillelse af ovariolerne i mikrokammeret ved hjælp af nåle. (M,N,O) Gennemtrængelig membran skåret i en 10 x 10 mm firkant og placere over dråben af mediet i mikro-kammeret. (P,Q) Forsegling af mikrokammeret med halocarbonolie. Prøverne er klar til at blive afbildet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før overflytningen er kernen dynamisk og svinger rundt om en central position i en periode, der defineres som præmigrering. Disse små bevægelser afspejler en balance mellem at skubbe og trække kræfter, der opretholder ligevægt i midten af oocyten. Ved at kvantificere kernernes baner har vi vist, at APM- og LPM-forløbene havde lignende proportioner. Vi definerer arten af banen ved den første kontakt mellem kernen og plasmamembranen6. Kernen når således enten APM eller LPM, før den glider langs den, for at nå sin endelige position ved skæringspunktet mellem de to plasmamembraner (Figur 5,Film1-2). Desuden har vi vist, at forskellige signaler favoriserer hver af de baner. For eksempel gør centrosomerne, der er grupperet mellem kernen og oocyttens bageste membran, det muligt for APM-banen. Omvendt understøtter det mikrotubule-associerede protein (MAP) Mushroom Body Defect (Mud), som er placeret asymmetrisk til den nukleare kuvert, en bane langs LPM6. Desuden påvirker udtømningen af enten centrosomer eller mudder kernens migrationshastighed sammenlignet med den vilde type kontekst6.
Figur 5: Repræsentative billeder af oocytkernens migration ved levende billeddiagnostikmikroskopi. (A) Udvalgte rammer udvundet af time-lapse Movie 1, der viser den nukleare migration af oocytkernen i et ægkammer af vild type, der udtrykker den nukleare kuvertmarkør (Fs(2)KetGFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP). (B) Udvalgte billeder fra Movie 2 (den beskårne version af Movie 1) med fokus på oocyt. Tid (i h:min) i forhold til begyndelsen af tidsforskydningen angives øverst i hver valgt ramme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Væksten i oocyt og ægkammeret er tegn på korrekt udvikling, som er let synlige i time-lapse-optagelser (Figur 5). Tværtimod er membrandeformiteter uorganiserede follikulære celler, forkrøblede celler og indskrumpede kerner de første tegn på døende ægkamre (Figur 6, Film 3-4). Ved observationen af disse degenerative ægkamre kan kernebevægelserne ikke længere udnyttes til analyse. Normalt observerer vi ikke nogen degenereret oocyt før 8 timers billeddannelse (Figur 6A), og de sjældne tilfælde af tidlig degeneration skyldes problemer under dissektions- eller monteringstrinnene (Figur 6B). Vi mener, at 50% af oocytter stadig er i live efter 10 timers billeddannelse.
Figur 6: Repræsentative billeder af degenerationen af et ægkammer under levende billeddannelse. (A) Udvalgte rammer udvundet af time-lapse Movie 3, der viser degenerationen af et vildt ægkammer efter 8 timer, hvori den nukleare kuvertmarkør (Fs(2)KetGFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP) udtrykkes. (B) Udvalgte rammer udvundet fra Movie 4 viser den hurtige degeneration af en vild type æg kammer. En sådan tidlig degeneration er karakteristisk for et problem under dissektion eller monteringstrin. Tid (i h:min) i forhold til begyndelsen af tidsforskydningen angives øverst i hver valgt ramme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Overdreven bevægelser kan være et yderligere problem, der resulterer i ubrugelige data og yderligere analyse, da æggekamrene ikke forbliver i den afbildede ramme. For at omgå dette problem bruger vi et 40x mål, der giver en passende observationsramme og tillader flytninger af ægkamrene langs x-y-flyet, samtidig med at vi giver tilstrækkelig opløsning til en kvalitativ vurdering af migrerende vej taget af oocytkernen. For at begrænse virkningerne af for store bevægelser i z-aksen og for at holde oocyten inden for z-stakkens rækkevidde udfører vi desuden z-sektioner over 40 μm stak (41 sektioner 1 μm fra hinanden), mens fase-6 oocyt har en størrelse på 20 μm.
Film 1: Repræsentativ film af et ægkammer af vild type, der udtrykker både den nukleare kuvertmarkør (Fs(2)Ket-GFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP). I dette eksempel kontakter oocytkernen først den forreste membran og glider langs den for at nå det antero-dorsale hjørne. Den forløbne tid af tidsforskydningen er angivet i h:min. i øverste venstre hjørne af videoen. Klik her for at downloade denne film.
Film 2: Beskåret version af Movie 1, med fokus på oocyt. Den forløbne tid af tidsforskydningen er angivet i h:min. i øverste venstre hjørne af videoen. Klik her for at downloade denne film.
Film 3: Repræsentativ film af et ægkammer af vild type, der udtrykker både den nukleare kuvertmarkør (Fs(2)Ket-GFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP). I dette eksempel begynder ægkammeret at degenerere kl. 8:45, før kernens migration er afsluttet. Den forløbne tid af tidsforskydningen er angivet i h:min. i øverste venstre hjørne af videoen. Klik her for at downloade denne film.
Film 4: Repræsentativ film om tidlig degeneration af et ægkammer af vild type, der udtrykker både den nukleare kuvertmarkør (Fs(2)Ket-GFP) og plasmamembranmarkøren (ubi-PH-RFP). Den forløbne tid af tidsforskydningen er angivet i h:min. i øverste venstre hjørne af videoen. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Andre protokoller beskriver, hvordan man forbereder og kultur Drosophila æg kamre ex vivo for live-imaging assay12,13. Nyheden i denne protokol er brugen af et billedkammer konstrueret ved hjælp af en udhulet aluminium dias, en coverlip, og en O2/ CO2 gennemtrængelig membran. Den største fordel ved dette set-up er at begrænse bevægelsen i Z uden at lægge pres på prøven. Således kan oocyten stadig bevæge sig frit, og derfor anvendes først 40x-målet, og for det andet erhverves z-stakke langs 40 μm, mens oocyten er omkring 20 μm højde på trin 6.
Selvom denne protokol er relativt enkel, er hvert trin kritisk for analysen. Forberedelsen af mikrokammeret, den gennemtrængelige membran og forseglingen af kammeret er afgørende for at muliggøre gasudveksling og forhindre tørring af billeddiagnostiske medium og derfor prøverne. Skader æggekammeret kompromitterer dets overlevelse, så delikate og præcise dissektionsteknikker er altafgørende. Derudover skal den muskuløse kappe fjernes helt, da de resterende stykker af denne struktur vil resultere i uønsket ægkammerbevægelse.
Aluminium, ud over sin sikkerhed for prøven, er blevet valgt for sin styrke, holdbarhed, og den nemme rengøring. Andre materialer er endnu ikke blevet undersøgt under disse forhold. Brugen af plast med udviklingen af 3D-printer er fristende; Man skal dog være meget præcis med at skabe et hul med en højde på 150 μm.
For nylig har Huynh og kolleger udviklet en billeddannelsesteknik tilpasset Drosophila germarium baseret på hydrogel14. Hvorvidt dette kan tilpasses fase 6 i oogenesis er endnu ikke afprøvet. Specifikt vides det ikke, om bevægelser som rotation af folliklen kan forekomme i hydrogelsystemet. Disse rotationsbevægelser er afgørende for forlængelsen af ægkammeret og dermed normal udvikling.
Andre protokoller har brugt halocarbonolie til at følge oocytkernemation15,16. De optiske egenskaber af olie og billeddiagnostiske medium, der anvendes i vores protokol er meget forskellige. Især Schneider-mediet har maksimalt lysabsorption for bølgelængder omkring 450 nm. Derfor observerer vi et højere signal/støjforhold med olie. Halocarbonolien reducerer imidlertid oocytoverlevelser til 1-2 timer, hvilket begrænser evnen til at følge hele kernens migration, især i genetiske sammenhænge, hvor denne migration forstyrres. Med denne nuværende protokol tillader billedmediet en lang overlevelse af ægkammer, så vi kan udføre time-lapse-optagelse op til 12 timer. Således maksimerer vi vores chance for at fange hele migreringsprocessen.
Ved hjælp af vores nuværende parametre kan vi kun udføre maksimalt 12 positioner for tidsforskydningen. I gennemsnit er en tredjedel af de afbildede kerner levedygtige og kan analyseres. For at forbedre effektiviteten kan et spindeskrkop udstyret med et dobbelt kamerasystem, som ville gøre det muligt at erhverve begge bølgelængder på samme tid, bruges til at fremskynde anskaffelsestiden og dermed øge antallet af positioner.
Da dette mikrokammer gør det muligt at dyrke de dissekerede ægkamre i en relativt lang periode, kan dets anvendelse desuden udvides til at omfatte undersøgelse af andre dynamiske mekanismer til drosophila oogenese, der skal vurderes ex vivo (f.eks. cytoplasmisk streaming i oocyt, follikelrotation, follikelceller morfogenese osv.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi er meget taknemmelige over for Jean-Antoine Lepesant og Nicolas Tissot, som oprindeligt udviklede protokollen og delte nogle grafiske elementer i figur 3 med os. Vi takker Fanny Roland-Gosselin, der tog billeder af figur 4. Vi takker også andre laboratoriemedlemmer for nyttige diskussioner, der bidrog til forbedringen af denne teknik og Nathaniel Henneman for hans kommentarer, der hjalp med at forbedre dette manuskript. Vi anerkender ImagoSeine kernefaciliteten for instituttet Jacques Monod, medlem af Frankrig-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh støttes af et ph.d.-stipendium fra det franske forskningsministerium (MESRI). Antoine Guichet og Fred Bernard blev støttet af ARC (Grant PJA20181208148), Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) og af et Emergence-tilskud fra IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 - 188 | Observation-chamber preparation |
References
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A. Symmetry breaking during drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).
- Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. Nucleus positioning within Drosophila egg chamber. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).
- Januschke, J., et al. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Cetera, M., Horne-Badovinac, S. Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).
- Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte. Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).
- Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa. Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).
- Chanet, S., Huynh, J. R. Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells. Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).
- Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis. Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).
- Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).
