Summary
I Drosophilagenomgår oocytekärnan mikrotubuleberoende migration under oogenes. Här beskriver vi ett protokoll som utvecklades för att följa migreringen genom att utföra levande avbildning på äggkammare ex-vivo. Vår procedur upprätthåller äggkammare levande i 12 h för att förvärva flerpositions 3D-timelapse-filmer med spinndiskkonfokal mikroskopi.
Abstract
Levande celltomografi är särskilt nödvändigt för att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar organellrörelser, cytoskeletonomorganiseringar eller polaritetsmönster i cellerna. När man studerar oocytkärna positionering, live-imaging tekniker är avgörande för att fånga de dynamiska händelserna i denna process. Drosophila äggkammare är en multicellulär struktur och ett utmärkt modellsystem för att studera detta fenomen på grund av dess stora storlek och tillgänglighet av många genetiska verktyg. Under Drosophila mid-oogenesis migrerar kärnan från en central position inom äggoiden för att anta en asymmetrisk position medierad av mikrotubule-genererade krafter. Denna migration och positionering av kärnan är nödvändiga för att bestämma embryots polaritetsaxlar och den efterföljande vuxna flugan. En egenskap hos denna migrering är att den förekommer i tre dimensioner (3D), vilket skapar en nödvändighet för live-avbildning. För att studera mekanismerna som reglerar nukleär migration har vi därför utvecklat ett protokoll för att odla de dissekerade äggkamrarna och utföra levande avbildning i 12 timmar genom timelapse-förvärv med spinndiskkonfokal mikroskopi. Sammantaget tillåter våra förhållanden oss att bevara Drosophila äggkammare levande under en lång tid, vilket gör det möjligt att slutföra nukleär migration i ett stort antal prover i 3D.
Introduction
I flera år har Drosophila-äggoiden dykt upp som ett modellsystem för att studera nukleär migration. Drosophila oocyte utvecklas i en multicellulär struktur som kallas äggkammaren. Äggkammare omfattar 16 könsceller (15 sjuksköterskeceller och oocyt) omgivna av ett epiteliallager av follikulära somatiska celler. Äggkammarutvecklingen har delats in i 14 steg (figur 1A), under vilken äggcellen kommer att växa och ackumulera reserver som är nödvändiga för embryots tidiga utveckling. Under utvecklingen, vid mikrotubule omorganisering och asymmetrisk transport av moderns bestämningsfaktorer, polariseras oocyten längs antero-dorsala och dorso-ventrala axlar. Dessa axlar bestämmer embryots och den vuxnas efterföljande polaritetsaxlar som härrör från befruktningen av denna oocyt1. Under oogenes antar kärnan en asymmetrisk position i äggcellen. I steg 6 är kärnan centrerad i cellen. Vid en ännu inte identifierad signal som avges av de bakre follikulära cellerna och som tas emot av äggcellen migrerar kärnan mot skärningspunkten mellan de främre och laterala plasmamembranen i steg 7 (figur 1B)2,3. Denna asymmetriska position krävs för att inducera bestämningen av dorso-ventralaxeln.
Figur 1: Drosophila melanogaster äggkammare. (A) Fast ovariole från transgena flugor som uttrycker Fs(2)Ket-GFP som märker de nukleära kuvert och ubi-PH-RFP som märker plasmamembranen. Ovariolen består av att utveckla äggkammare i olika stadier. Mognad ökar längs den antero-bakre axeln med pelargonen vid den främre spetsen (vänster) där bakteriestamcellen bor och det äldre stadiet vid den bakre spetsen (höger). B)Z-projektion av levande äggkammare genom att snurra diskkonfokal mikroskopi i steg 6 av oogenes (vänster), där kärnan är centrerad i äggcellen. Kärnan migrerar för att anta en asymmetrisk position i steg 7 (höger) i kontakt med det främre plasmamembranet (mellan äggcellen och sjuksköterskans cell) och det laterala plasmamembranet (mellan äggcellen och follikulära cellerna). Denna position kommer att inducera bestämningen av dorsala sidan och därmed äggkammarens dorso-ventrala axel. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
I många årtionden har denna nukleära migration studerats på fasta vävnader genom immunostaining. Detta tillvägagångssätt har särskilt gjort det möjligt att visa att denna process beror på ett tätt nätverk av mikrotubuli4,5. Mer nyligen utvecklade vi ett protokoll som erbjuder villkor som är kompatibla med live imaging av äggcellen under flera timmar vilket gör det möjligt att studera denna process dynamiskt6.
Därför har vi för första gången kunnat beskriva att kärnan har förmånliga och karakteristiska banor under sin migration, en längs det främre plasmamembranet (APM) och en annan längs äggcellens laterala plasmamembran (LPM) i äggcellen (figur 2). Dessa senaste resultat understryker vikten av live-imaging protokoll när man studerar dynamiska processer såsom kärnmigration.
Figur 2: Schematisk representation av kärnans olika migreringsbanor. I steg 6 av oogenesen är oocyten en stor cell med en central kärna. I detta skede ställs den antero-bakre polaritetsaxeln in med ett bakre/laterala plasmamembran av oocytet i kontakt med follikulära celler och det främre plasmamembranet (i gult) är i kontakt med sjuksköterskans celler2. Vi har tidigare rapporterat att kärnan kan migrera antingen längs det främre plasmamembranet (APM), längs det laterala plasmamembranet (LPM), eller genom cytoplasman (STAD, direkt till antero-dorsala cortex)6. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Oocytkärnan migration är ett fenomen på ca 3 h6, och hittills är händelsen som utlöser början av den faktiska migreringen okänd. Starten av migreringen kan också försenas av proteinmutanter som används för att studera denna mekanism. Dessa okända variabler motiverade oss att förvärva bilder under långa tidsperioder (10-12 h). Det är därför viktigt att se till att äggcellerna förblir vid liv. När äggkammaren utvecklas sträcker den sig längs den antero-bakre axeln från en sfärisk till en elliptisk form. Denna förlängning drivs av rotationen av follikulära celler, som uppstår från steg 1 till steg 8, vinkelrätt mot antero-bakre axeln7. Dessutom omger en rörformig muskelstel med pulsatil egenskap äggkamrarna. Dess fysiologiska funktion är att driva de utvecklande folliklarna mot ovidukten kontinuerligt8. För att begränsa de rörelser som inducerar svängningar i äggkamrarna efter deras dissekering konstruerade vi en observationsmikrokammare som mäter 150 μm i höjd (figur 3A). Denna höjd är marginellt högre än storleken på en follikel i steg 10 och 11. Det begränsar avsevärt provets vertikala rörelser samtidigt som äggkammarens rotation bevaras, vilket resulterar i begränsade defekter i follikelutvecklingen. Vi utför sedan live imaging i 12 h på dissekerade äggkammare genom flerpositions timelapse förvärv med hjälp av en spinning-disk confocal mikroskop. Här beskriver vi vårt protokoll för att studera oocyt nukleär migration mellan steg 6 och 7.
Figur 3:Schematisk representation av observationskammaren. (A) (Överst) Exakta dimensioner på aluminiumrutschbanan med höjderna (A') och omkretsarna (A'') på brunnen som borras i mitten av bilden. (B) (Nederkant) Ett täckglas som blockerar brunnen förseglas till diabilden med silikonfett. (C) (Top view) Dissekerade ovarioler utvecklas i ett bildmedium som täcks av ett gaspermeabelt membran. Halokarbonolja används för att stabilisera membranet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
För att följa nukleär migration och exakt bedöma banor i äggcellen behövs markörer för både kärnhöljet och plasmamembranet. Med detta syfte har två transgener som har ett högt signal-/brusförhållande och inte bleknar under loppet av live-avbildning valts. För att märka plasmamembranet rekommenderas användning av en P[ubi-PH-RFP] som kodar pleckstrin Homology (PH) domänen för humanfosfolipas C ∂1 (PLC∂1) som smälts till RFP. Denna PH-domän binder till fosfoinositide PI(4,5)P2 fördelad längs plasmamembranet i äggcellen9. För kärnhöljet visar P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP proteinfälla stam där GFP sätts in i genen kodning Drosophila ß-importin en homogen och intensiv signal10. Unga flugor (1-2 dagar gamla) placeras i färska injektionsflaskar som innehåller torr jäst 24-48 h före äggstocksdesektion.
För denna levande avbildningsanalys har en 1 mm tjock bit aluminium, som inte är reaktiv för provet, skurits i dimensionerna av en mikroskopibild. Den har ett hål med diametern 16 mm i mitten av diabilden som har kontraborerats till 0,85 mm. Denna räknare har ytterligare ett hål med diametern 6 mm med ett djup på 150 μm (figur 3A). Ett täckglas limmas med silikonfett (inert för provet) längst ner i aluminiumkammaren (Figur 3B). Efter att proverna placerats i den medelfyllda brunnen placeras ettmembransom är genomsläppligt till O 2 /CO2-utbytet över mediet och omges av halokarbonolja (figur 3C).
För dissekeringen rekommenderas att använda rostfria tångar med en spetsdimension på 0,05 x 0,02 mm och nålar med diametern 0,20 mm för separation av ovariolerna(figur 4B,C). De migrerande kärnorna avbildas på ett konvertiskt inverterat mikroskop med spinnskiva som är utrustat med en kamera. Flerpositionsbilder förvärvades genom timelapse var 15: e minut vid 24 °C. Ett intervall på 15 minuter gör det möjligt att utföra flerpositionsförvärv med begränsad fotoblekning av fluorescerande proteiner och fototoxicitet för proverna. Dessutom skulle ett kortare intervall inte ge mycket mer informativa uppgifter för att följa kärnkraftsbanorna. Filmerna bearbetas och analyseras via Fiji programvara11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av bildmedium
- Förbered nya medier på användningsdagen. Pipett 200 μL Schneider medium (innehållande L-glutamin och 0,40 g/L NaHCO3 kompletterad med 10% värmeinaktiverat fosterkalvserum, 100 U/ml penicillin och 100 mg/ml streptomycin).
- Tillägg med 30 μL insulin 10 mg/ml.
- Tillsätt 4 μL värmeinaktiverat fosterkalvserum.
2. Förberedelse av observationskammare
- Applicera en liten mängd silikonfett runt hålet på undersidan av den punkterade diabilden ( Figur 4D ) med enpipettspets.
- Placera ett 24 x 50 mm täckslip med en tjocklek av 0,13-0,16 mm.
- Med den breda änden av en pipettspets, tryck på täckslipet för att platta silikonet för att försegla täcket och skapa en silikonringsinredning på bilden (Figur 4F, G).
3. Äggstocks dissekering
- Bedöva en kvinnlig fluga av önskad fenotyp på en CO2-dyna.
- Överför honan i 150 μL av bildmediet i en dissekeringsbrunn (figur 4H).
- Öppna en kvinna genom att ta tag i bröstkorgen med tång och nypa dorsal buken nagelband med ett andra par tång.
- Isolera och lossa äggstockarna, som bör vara lätt synliga vid nagelbandsöppningen.
- Ta försiktigt bort livmodern, ovidukten och muskelsymanten (Figur 4I).
- Placera en droppe på 10-15 μL av bildmediet och överför en äggstock i bildkammaren (figur 4J,K).
4. Isolering av äggkammare
- För att separera ovariolerna, håll den bakre änden av äggstocken (mot de äldre stadierna) med nålen. Reta isär ovariolerna genom att försiktigt dra i pelargonen med en annan nål.
- Ta bort den återstående muskelsyttan på äggkamrarna; en nål som håller mantlan och den andra drar på ovariolen genom de större kamrarna (steg 9 eller äldre).
- Låt den ouppvärmda ovariolen sjunka och kontakta täcket.
- Ta bort sena stadier och resten av äggstockarna från mikrokammaren med hjälp av tång. Distansera försiktigt ovariolerna från de andra med nålar för att underlätta förvärvet (Figur 4L).
5. Stängning av observationskammare
- Kapa en liten kvadrat (10 x 10 mm) genomsläppligt membran(bild 4M,N).
- Applicera försiktigt membranet ovanpå bildmediet för att driva ut luftbubblor (figur 4O).
- Täta kammaren med ett tunt lager halokarbonolja runt brunnen på membranets kontur (Figur 4P,Q).
6. Bildbehandling
- Placera bilduppställningen på glidhållaren på det inverterade mikroskopet med hjälp av ett 40x-mål (HCX PL Apo, 1.25NA, oljesänkning).
- Leta reda på och spara positioner i olika steg 6-oocyter där kärnan är redo att migrera.
- Sätt upp lasern på 488 och 561 nm. Med en uppmätt uteffekt på 150 mW, använd 30% av lasereffekten respektive 300 ms respektive 500 ms exponering.
- Sätt upp experimentet. Ta en tidsfördröjning på 12 timmar med intervallet 15 min-41 sektioner med ett intervall på 1 μm centrerat på kärnan.
OBS: Enligt exponeringstiden som beskrivs ovan möjliggör denna inställning förvärv av en position på cirka 45 s. Eftersom det finns en fördröjning på grund av positionsbyte, rekommenderas att sätta högst 12 positioner under dessa förhållanden.
7. Bildanalys
- Bearbeta filmerna på programvaran Fiji, använd plug-in Orthogonal-vyn och spåra manuellt kärnorna.
Bild 4:Steg för steg mikrokammarmonteringsbilder. A,B,C) Förberedelse av de nödvändiga verktygen: dissekering av brunnsplatta, tång, nålar, bildmedier, silikonfett, genomsläppligt membran och aluminiumrutschbanan. D)Applicering av silikonfettet på baksidan av aluminiumrutschbanan med pipettspets. (E) Ett glaslock limmas på silikonfettet för att skapa kammarens botten. Jagär inte så bra på att setill att det finns en Tryckapplikation på täckglaset med den bredare änden av en pipettspets för att skapa en fog inuti kammaren. Jaganser att detta är en mycket bra 1000-0. Dissekering av flugorovaries i bildmedierna. J)Pipetting av en droppe bildmedier i mikrokammaren. Jagär inte så bra på att se vad som är bra. Separation av ovariolerna i mikrokammaren med hjälp av nålar. - Jagär ledsen för dethär. Genomsläppligt membran skuren i en 10 x 10 mm kvadrat och placera över mediets droppe i mikrokammaren. (P,Q) Tätning av mikrokammaren med halokarbonolja. Exemplen är redo att avbildas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före migreringen är kärnan dynamisk och svänger runt en central position under en period som definieras som förmigrering. Dessa små rörelser återspeglar en balans mellan att trycka och dra krafter som upprätthåller jämvikt i mitten av äggcellen. Genom att kvantifiera kärnornas banor har vi visat att APM- och LPM-banorna hade liknande proportioner. Vi definierar banans natur genom den första kontakten mellan kärnan och plasmamembranet6. Således når kärnan antingen APM eller LPM innan den glider längs den, för att nå sin slutliga position i skärningspunkten mellan de två plasmamembranen (Figur 5,Filmer1-2). Dessutom har vi visat att distinkta signaler gynnar var och en av banorna. Till exempel möjliggör centromerna som är grupperade mellan kärnan och det bakre membranet i äggcellen APM-banan. Omvänt stöder den mikrotubule-associerade proteinet (MAP) Mushroom Body Defect (Mud), som ligger asymmetriskt till kärnhöljet, en bana längs LPM6. Dessutom påverkar utarmningen av antingen centrosomer eller lera kärnornas migrationshastighet jämfört med den vilda typen kontext6.
Figur 5: Representativa bilder av oocytkärnans migration genom levande mikroskopi. (A) Utvalda ramar extraherade från timelapse Film 1 som visar nukleär migration av oocytkärnan i en äggkammare av vild typ som uttrycker kärnhöljets markör (Fs(2)KetGFP) och plasmamembranmarkören (ubi-PH-RFP). (B) Utvalda ramar från film 2 (den beskurna versionen av film 1)med fokus på äggcellen. Tid (i h:min) i förhållande till början av tidsfördröjningen anges högst upp i varje vald bildruta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Oocyt- och äggkammartillväxten är tecken på korrekt utveckling, som är väl synliga i timelapse-inspelningar (figur 5). Tvärtom är membrandeformiteter oorganiserade follikulära celler, hämmade celler och krympta atomkärnor de första tecknen på döende äggkammare (Figur 6, Film 3-4). Vid observationen av dessa degenerativa äggkammare kan nukleirörelserna inte längre utnyttjas för analys. Vanligtvis observerar vi inte någon degenererad oocyt före 8 h avbildning (figur 6A) och de sällsynta fallen av tidig degenerering beror på problem under dissekerings- eller monteringsstegen (Figur 6B). Vi anser att 50% av äggcellerna fortfarande lever efter 10 h avbildning.
Figur 6: Representativa bilder av degenerationen av en äggkammare under levande avbildning. (A) Utvalda ramar extraherade från timelapse Film 3 som visar degenerationen av en äggkammare av vild typ efter 8 timmar, som uttrycker kärnhöljets markör (Fs(2)KetGFP) och plasmamembranmarkören (ubi-PH-RFP). (B) Utvalda ramar som extraherats från film 4 och som visar snabb degenerering av en äggkammare av vild typ. Sådan tidig degenerering är karakteristisk för ett problem under dissekerings- eller monteringsstegen. Tid (i h:min) i förhållande till början av tidsfördröjningen anges högst upp i varje vald bildruta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Överdrivna rörelser kan vara ytterligare ett problem som resulterar i oanvändbara data och ytterligare analys, eftersom äggkamrarna inte kommer att förbli i den bildade ramen. För att kringgå detta problem använder vi ett 40x-mål som ger en adekvat observationsram och tillåter rörelser i äggkamrarna längs x-y-planet samtidigt som vi ger tillräckligt med upplösning för en kvalitativ bedömning av migrationsvägen som tas av oocytekärnan. För att begränsa effekterna av överdrivna rörelser i z-axeln och för att hålla oocyten inom z-stackens räckvidd utför vi z-sektioner över 40 μm stack (41 sektioner 1 μm ifrån varandra), medan steg-6-äggcell har en storlek på 20 μm.
Film 1: Representativ film av en äggkammare av vild typ som uttrycker bådekärnhöljemarkören ( Fs(2)Ket-GFP) och plasmamembranmarkören (ubi-PH-RFP). I det här exemplet kontaktar oocytekärnan det främre membranet först och glider längs det för att nå antero-dorsalhörnan. Den förfallna tiden för tidsfördröjningen anges i h:min i videons övre vänstra hörn. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 2: Beskuren version av film 1, med fokus på äggcellen. Den förfallna tiden för tidsfördröjningen anges i h:min i videons övre vänstra hörn. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 3: Representativ film av en äggkammare av vild typ som uttrycker bådekärnhöljemarkören ( Fs(2)Ket-GFP) och plasmamembranmarkören (ubi-PH-RFP). I det här exemplet börjar äggkammaren degenerera vid 8:45 h innan nukleusmigrationen slutförs. Den förfallna tiden för tidsfördröjningen anges i h:min i videons övre vänstra hörn. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Film 4: Representativ film om tidig degenerering av en äggkammare av vild typ som uttrycker bådekärnhöljemarkören ( Fs(2)Ket-GFP) och plasmamembranmarkören (ubi-PH-RFP). Den förfallna tiden för tidsfördröjningen anges i h:min i videons övre vänstra hörn. Klicka här för att ladda ner den här filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Andra protokoll beskriver hur man förbereder och odlar Drosophila äggkammare ex vivo för live-imaging assay12,13. Nyheten med detta protokoll är användningen av en bildkammare konstruerad med hjälp av en ihålig aluminiumrutschbana, ett täckglas och ett O2/ CO2 genomsläppligt membran. Den största fördelen med denna uppsättning är att begränsa rörelsen i Z utan att utöva tryck på provet. Således kan äggcellen fortfarande röra sig fritt, och det är därför först används 40x-målet och för det andra förvärvas z-staplar längs 40 μm, medan äggcellen är cirka 20 μm höjd i steg 6.
Även om detta protokoll är relativt enkelt är varje steg avgörande för analysen. Beredningen av mikrokammaren, det genomsläppliga membranet och tätningen av kammaren är nödvändiga för att möjliggöra gasutbyte och förhindra torkning av bildmediet och därmed proverna. Att skada äggkammaren äventyrar dess överlevnad, så känsliga och exakta dissektionstekniker är av största vikt. Dessutom måste muskelhyddet avlägsnas helt eftersom återstående bitar av denna struktur kommer att resultera i oönskade äggkammarerörelser.
Aluminium, förutom dess säkerhet för provet, har valts för sin styrka, hållbarhet och underlättande rengöring. Andra material har ännu inte undersökts under dessa förhållanden. Användningen av plast med utvecklingen av 3D-skrivare är frestande; Man måste dock vara mycket exakt med att skapa ett hål med en höjd av 150 μm.
Nyligen har Huynh och kollegor utvecklat en bildteknik anpassad till Drosophila germarium baserat på hydrogel14. Huruvida detta kan anpassas till steg 6 i oogenes är fortfarande att testa. Specifikt är det inte känt om rörelser som follikelrotation kan uppstå i hydrogelsystemet. Dessa rotationsrörelser är nödvändiga för förlängningen av äggkammaren och därmed normal utveckling.
Andra protokoll har använt halokarbonolja för att följa oocytekärnamigration15,16. Oljans optiska egenskaper och det bildmedium som används i vårt protokoll är mycket olika. Speciellt har Schneider-mediet maximalt ljusabsorption för våglängder runt 450 nm. Därför observerar vi ett högre signal-/brusförhållande med olja. Halokarbonoljan minskar dock kraftigt oocytöverlevnaden till 1-2 h, vilket begränsar förmågan att följa hela flyttningen av kärnan, särskilt i genetiska sammanhang där denna migration störs. Med detta nuvarande protokoll tillåter bildmediet en lång överlevnad av äggkammaren så att vi kan utföra timelapse-inspelning upp till 12 h. Således maximerar vi vår chans att fånga hela migreringsprocessen.
Med hjälp av våra nuvarande parametrar kan vi bara utföra högst 12 positioner för tidsfördröjningen. I genomsnitt är en tredjedel av de bildade kärnorna livskraftiga och kan analyseras. För att förbättra effektiviteten kan ett snurrande diskmikroskop utrustat med ett system med dubbla kameror, som skulle möjliggöra förvärv av båda våglängderna samtidigt, användas för att påskynda förvärvstiden och därmed öka antalet positioner.
Eftersom denna mikrokammare gör det möjligt att odla de dissekerade äggkamrarna under en relativt lång tid, kan dess användning utvidgas till att omfatta studier av andra dynamiska mekanismer för drosophila oogenes som måste bedömas ex vivo (t.ex. cytoplasmisk streaming i äggcellen, follikelrotation, follikelceller morphogenesis, etc.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi är oerhört tacksamma mot Jean-Antoine Lepesant och Nicolas Tissot som ursprungligen utvecklade protokollet och delade några grafiska element i figur 3 med oss. Vi tackar Fanny Roland-Gosselin som tog bilderna på figur 4. Vi tackar också andra labbmedlemmar för hjälpsamma diskussioner som bidrog till förbättringen av denna teknik och Nathaniel Henneman för hans kommentarer som hjälpte till att förbättra detta manuskript. Vi erkänner ImagoSeine kärnanläggningen vid institutet Jacques Monod, medlem av France-BioImaging (ANR-10-INBS-04). Maëlys Loh stöds av ett doktorandstipendium från det franska forskningsministeriet (MESRI). Antoine Guichet och Fred Bernard stöddes av ARC (Grant PJA20181208148), Association des Entreprises contre le Cancer (Grant Gefluc 2020 #221366) och av ett Emergence-bidrag från IdEx Université de Paris (ANR-18-IDEX-0001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetize CO2 pad | Dutscher | 789060 | Anesthetize flies |
| Coverslip (24x50 mm) | Knittel Glass | VD12450Y100A | Observation-chamber preparation |
| Forceps Dumont #5 | Carl Roth | K342.1 | Dissection |
| Stainless steel needles | Entosphinx | 20 | Dissection |
| Heat-inactivated fetal calf serum | SIGMA-ALDRICH | F7524 | Imaging medium |
| Insulin solution bovine pancreas | SIGMA-ALDRICH | 10516 - 5ml | Imaging medium |
| Penicilin/Streptomycin solution | SIGMA-ALDRICH | P0781 | Imaging medium |
| Permeable membrane | Leica | 11521746 | Observation-chamber preparation |
| Schneider Medium | Pan Biotech | P04-91500 | Imaging medium |
| Silicon grease | BECKMAN COULTER | 335148 | Observation-chamber preparation |
| Spinning disk confocal | Zeiss | CSU-X1 | Nuclear migration observation |
| Voltalef oil 10S | VWR | 24627 - 188 | Observation-chamber preparation |
References
- Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).
- Roth, S., Lynch, J. A. Symmetry breaking during drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891 (2009).
- Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. Nucleus positioning within Drosophila egg chamber. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).
- Januschke, J., et al. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).
- Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168 (2017).
- Cetera, M., Horne-Badovinac, S. Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).
- Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte. Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).
- Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa. Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).
- Chanet, S., Huynh, J. R. Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells. Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).
- Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis. Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).
- Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).
