Summary
该协议提出了一种在微重力下培养和3D生长釉质母细胞样细胞的方法，以保持其细长和极化形状以及牙釉质特异性蛋白质表达。还描述了微重力下牙周工程结构和肺器官培养的培养条件。
Abstract
重力是人体细胞功能、增殖、细胞骨架结构和取向的关键决定因素之一。旋转生物反应器系统（RCCS）模拟在太空中发生的重力损失，而是通过连续旋转培养的细胞或组织来提供微重力环境。这些RCCS确保营养，生长和转录因子以及氧气的不间断供应，并解决了静止的2D（二维）细胞或器官培养皿中重力的一些缺点。在本研究中，我们使用RCCS共培养宫颈环细胞和牙髓细胞成为釉质母细胞，表征牙周祖细胞/支架相互作用，并确定炎症对肺泡的影响。RCCS环境促进了釉母细胞样细胞的生长，促进了牙周祖细胞增殖以响应支架涂层，并允许评估炎症变化对培养的肺泡的影响。这份手稿总结了沿途的环境条件、材料和步骤，并突出了关键方面和实验细节。总之，RCCS是掌握 体外 细胞培养和3D（三维）生长的创新工具，并允许研究不适合经典2D培养环境的细胞系统或相互作用。
Introduction
重力影响地球上生命的方方面面，包括单个细胞的生物学及其在生物体内的功能。细胞通过机械感受器感知重力，并通过重新配置细胞骨架结构和改变细胞分裂来响应重力的变化1，2，3。微重力的其他影响包括流体填充囊泡中的静水压力，细胞器的沉降以及浮力驱动的流动和热量对流4。关于重力损失对人体细胞和器官影响的研究最初是为了模拟太空飞行任务期间宇航员的失重环境5。然而，近年来，这些最初由NASA开发的用于模拟微重力的3D生物反应器技术正变得越来越重要，作为细胞群培养的新方法，否则不适合2D培养系统。
3D生物反应器通过在悬浮液中培养细胞来模拟微重力，从而产生持续的“自由落体”效果。旋转生物反应器的其他优点包括器官培养系统中没有空气暴露，剪切应力和湍流减少，以及持续暴露于不断变化的营养供应中。旋转细胞培养系统（RCCS）生物反应器提供的这些动态条件有利于空间共定位和单细胞聚集体的三维组装6，7。
以前的研究已经证明了旋转生物反应器在骨再生8，牙胚培养9和人类牙囊细胞培养10方面的优势。还有一份报告表明，RCCS增强EOE细胞增殖和分化为釉母细胞11。然而，分化的细胞被认为是基于釉质母细胞蛋白免疫荧光和/或仅釉质生成素表达的釉质母细胞11 ，而不考虑其细长的形态或极化细胞形状。
除了NASA开发的旋转壁容器（RWV）生物反应器外，从细胞生成3D聚集体的其他技术包括磁悬浮，随机定位机（RPM）和clinostat12。为了实现磁悬浮，用磁性纳米颗粒标记的细胞使用外部磁力悬浮，从而形成无支架的3D结构，这些结构已用于脂肪细胞结构的生物制造13，14，15。模拟微重力的另一种方法是通过控制围绕两个轴的同时旋转来产生多向 G 力，从而消除称为 clinostat16 的设备中心的累积重力矢量。当骨髓干细胞在抑溪恒温器中培养时，通过抑制成骨细胞分化来抑制新的骨形成，说明了微重力16的去分化作用之一。
促进釉质母细胞忠实培养的体外系统将为牙釉质组织工程迈出重要一步17。不幸的是，到目前为止，鳞翅目鳞翅目到目前为止，已经报道了五种不同的釉质母细胞样细胞系，包括小鼠釉质母细胞系细胞系（ALC），大鼠牙齿上皮细胞系（HAT-7），小鼠LS8细胞系20，猪PABSo-E细胞系21和大鼠SF2-24细胞系22。然而，这些细胞中的大多数在2D培养中失去了其独特的极化细胞形状。
在本研究中，我们转向旋转细胞培养生物反应器系统（RCCS），以促进与间充质祖细胞共培养的宫颈环上皮的釉母细胞样细胞的生长，并克服2D培养系统的挑战，包括营养物质流动减少和重力引起的细胞骨架变化。此外，RCCS为研究与牙周组织工程相关的细胞/支架相互作用以及检查炎症介质对体 外肺泡组织的影响提供了新的途径。总之，这些研究的结果强调了基于微重力的旋转培养系统在分化上皮的繁殖和评估环境对 体外生长细胞的影响方面的益处，包括细胞/支架相互作用和组织对炎症状况的反应。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
获得了所有必要的机构批准，以确保该研究符合TAMU机构动物护理指南。
1. 生物反应器组装和灭菌
- 按照制造商的建议，在塑料仪器循环的高压釜中对生物反应器的四个高纵横比容器（HARV）进行灭菌20分钟。
- 灭菌后，通过拧紧生物反应器随附的螺钉将容器组装在细胞培养罩中，然后容器即可使用。
2. 用于生物反应器共培养实验的支架
- 将支架与细胞一起孵育，为进一步生长所需的细胞附着提供支持。
- 在基于 PGA 的支架、羟基磷灰石支架、石墨烯片、明胶盘和基于胶原蛋白的支架中进行选择，以进行共培养研究。
3. 颈环（CL）解剖和单细胞制备
- 在CO2 过量呼吸骤停后通过斩首处死小鼠。
注意：所有动物研究均符合TAMU机构动物护理指南。 - 按照先前发表的方案的修改版本解剖出生后6天（DPN）小鼠的宫颈环23。
注意：在我们的研究中，包括先前发布的方案中未显示的颈椎袢的远端部分（图3）。- 在用胶原酶分散酶在37°C消化30分钟之前，用冷无菌PBS清洗解剖组织。
- 将溶液通过70μm无菌细胞过滤器，并以800× g 进一步离心10分钟。
- 弃去上清液。离心沉淀并用冷PBS以800× g洗涤两次。弃去上清液。
- 使用血细胞计数器计数细胞，并在每容器中加入1 X 105 个细胞。
4. 牙髓细胞培养和细胞系扩增
- 将牙髓细胞铺在100mm组织培养板中，在第4代以1 x 105的浓度。
- 准备培养基，包括DMEM高葡萄糖培养基，补充有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素/抗真菌剂（P / S）。
- 当细胞达到85-90%汇合时，吸出培养基并用预热的PBS洗涤板两次。
- PBS洗涤后，向平板中加入预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并将含有牙髓细胞的平板在37°C孵育3分钟。
- 通过使用显微镜的目视检查确认细胞脱离。
- 从培养板中收集培养基和细胞，并通过 25 mL 移液器转移到 50 mL 无菌锥形管中。
- 将细胞以800× g 离心8分钟，弃去上清液。将细胞重悬于新鲜培养基中并使用血细胞计数器计数。
- 为了与宫颈环细胞共培养，在生物反应器中以每容器1 x 104 的浓度接种牙髓细胞。
5. 在 RCCS 生物反应器内的支架上共培养宫颈环/牙髓细胞
- 将两种细胞类型、宫颈环和牙髓添加到含有补充生长因子、细胞外基质蛋白和支架的角质形成细胞SFM培养基的培养基中。
注意：生长因子以0.03μg/ mL骨形态发生蛋白2（BMP 2），0.03μg/ mL骨形态发生蛋白4（BMP-4），10ng / mL人重组成纤维细胞生长因子（hFGF）和15ng / mL表皮生长因子（hEGF）的浓度添加，而ECM组分包括200μg/ mL基质凝胶，5μg/ mL层粘连蛋白和5μg/ mL纤连蛋白。 - 用富含 1 mg LRAP（富含亮氨酸的釉质生成素肽）肽的 500 μL 胶原蛋白凝胶、1 mg 由猪牙24 制备的冻干早期珐琅质基质、5 μg/mL 层粘连蛋白和 5 μg/mL 纤连蛋白的混合物涂覆支架。
注意：这对我们的实验效果最好。 - 支架涂层后，将细胞和支架添加到生物反应器中，并在每容器中填充 10 mL 培养基。
- 加入培养基、细胞和支架后，关闭生物反应器容器的填充口盖。
- 在实验开始时将无菌瓣膜连接到注射器端口，并用盖子将它们保持在适当的位置，直到实验结束。
- 一旦容器装满 90% 并且填充口盖关闭并拧紧，打开无菌阀。
- 每次需要更换培养基时使用两个无菌注射器 （3 mL）。用新鲜培养基填充一个注射器，而另一个注射器是空的。
- 打开两个注射器阀门，轻轻地将气泡移向空注射器端口。
- 一旦将来自整个注射器的新鲜培养基小心地注入容器中，通过空注射器端口去除气泡。
注意：执行此过程，直到从容器中去除所有微气泡。 - 用盖子关闭注射器端口，并将注射器丢弃在锐器废物容器中。
- 将每个容器连接到旋转器底座，并将旋转器底座置于温度为5%CO2 和37°C的培养箱中。
- 打开电源并将转速设置为 10.1 rpm。
注意：调整速度以确保脚手架悬挂而不接触容器壁。 - 对于培养基更换，将血管直立放置，以确保细胞沉淀在底部。打开注射器端口并将无菌注射器连接到端口。
- 遵循相同的程序，吸出75%的营养耗尽培养基并通过另一个端口注入新鲜培养基。
6. 肺器官制备和基于生物反应器的培养
注意：E15野生型小鼠幼崽用于制备肺器官。
- 对患有CO2 窒息的怀孕雌性小鼠实施安乐死后解剖肺组织。
- 一旦颈椎脱位窒息后确认死亡，使用手术刀暴露胸腔。此后，将幼崽从子宫中取出并通过斩首实施安乐死。
- 安乐死后，用手术刀打开胸腔以定位肺部，从而准备胸腔。用无菌PBS洗涤肺组织的微小片段，并将其置于预灭菌的膜上2小时，在含有5%CO2 和37°C温度的培养箱中用器官培养基。
- 一旦肺组织附着在2D器官培养板中的膜上，将样品转移到生物反应器容器中。
- 为文化准备媒体。
注意：对照DMEM高葡萄糖培养基含有10%胎牛血清（FBS），1%抗生素溶液（P / S）（青霉素，100U / mL，链霉素，50μg/ mL）和100μg/ mL抗坏血酸（AA），为了诱导炎症状况，对照培养基补充5ng / mL IL-6蛋白。 - 如上所述，在生物反应器中每48小时更换一次培养基进行10天的肺培养实验。
7. 人牙周韧带 （hPDL） 细胞培养涂层支架
- 培养人牙周韧带细胞。
注意：根据先前发表的方案，在我们的实验室中分离和培养细胞25。 - 用 30 μL PBS 涂覆胶原支架盘，用于对照组和神经肽甘丙素 （GAL），浓度为 10-8 过夜。
- 在对照和GAL包被支架上接种人PDL细胞在37°C培养板中2小时，并将细胞接种支架转移到如上所述的生物反应器容器中。
- 在收获支架进行分析之前，在生物反应器中培养细胞接种支架14天。
8. 生物反应器的清洁和维护
- 从生物反应器中收获支架/细胞后，从容器中取出注射器端口。
注意：取下容器周围的螺钉，并用肥皂水轻轻清洗容器。 - 用清水冲洗容器并再次拧紧螺钉。
- 高压灭菌后将容器存放到下次使用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
生物反应器的内室为细胞增殖和分化、附着在支架上或聚集形成类似组件的组织提供了环境。每个 HARV 容器可容纳多达 10 mL 的培养基，并促进营养物质的持续循环，使每个细胞都有极好的存活机会。图1A说明了注射器端口与连接无菌一站式阀的容器前板上的连接。这些阀门充当培养室的守门人。介质更换需要打开截止旋塞阀，以方便连接含有新鲜培养基的无菌注射器。生物反应器内的微重力环境允许细胞附着在容器内的支架上，而无需事先接种到支架上。放置在生物反应器中的支架（图1B和1C）连续旋转，允许细胞附着在支架表面并形成细胞骨架网络。容器板底部的氧合器膜（图1B）允许连续的气体交换，以提高细胞存活率和寿命。
测试了各种支架，以确定与细胞最兼容的支架。图2A和2B中的支架是由75%石墨烯和25%PLG（聚乳糖醇化物）组成的石墨烯片。这种导电支架经常用于可能需要电刺激的细胞，例如骨骼肌细胞26。在我们的研究中，胶原蛋白支架在生物相容性、促进组织生长和细胞分化方面超过了所有其他测试研究。这种基于胶原蛋白的支架的特殊多孔表面（图2C和2D）允许细胞和营养物质在整个支架中流动，从而增加细胞附着和细胞增殖的面积。
颈环相对于小鼠下颌骨的位置如图3A和3B所示。为了制备小鼠门牙颈环细胞，解剖骨骼化的小鼠下颌骨，并暴露小鼠下切牙的最远端。在出生后6天的小鼠门牙中划定了切除的颈袢的精确位置（图3B），而在图3A中提供了成年骨骼化小鼠下颌骨中的类似区域作为参考，用于定向目的。成人骨骼化（图3A）和6 dpn新鲜制备的小鼠门牙中相应的颈环区域由两条虚线（图3A和B）构成。半下颌骨的牙列由三颗下颌磨牙和一个不断生长的门牙组成，而颈袢细胞壁龛由参与牙釉质形成的混合细胞群组成，例如内牙釉质上皮、外牙釉质上皮、星状网和介质间层19。
图4侧重于宫颈环细胞成功分化为细长的、极化的、分泌釉质母细胞样细胞的牙釉质蛋白。数据显示，分泌釉质母细胞样细胞的细长、极化、牙釉质蛋白的成功分化需要宫颈环细胞与间充质干细胞（如牙髓干细胞）共培养。如协议步骤3中所述，为培养的细胞提供量身定制的微环境，导致形成极化细胞，一端是细胞核，另一端是长细胞过程27，这是釉质母细胞的典型特征（图4A）。单独应用培养基，没有生长因子和/或支架涂层，导致宫颈环细胞分泌关键的牙釉质蛋白，但不伸长或极化（图4B）。
将加拉宁包被和未包被的胶原蛋白支架置于生物反应器中具有hPDL细胞的生物反应器中十四天。细胞在3D培养系统中存活了两周的培养期，与含有未包被支架的对照组相比，甘丙素包被支架组表现出显着更高的增殖率（图5B）（图5A）。与对照组相比，实验组中的细胞还显示出含有结缔组织纤维的细胞外基质水平显着更高。
生物反应器环境被证明在3D微重力环境中成功生长肺段（图6）。在这项研究中，将从E15小鼠（图6C）收获的肺组织段放置在器官培养皿中的硝酸纤维素膜上两个小时。在初始组织附着到膜上后，将肺组织/硝质细胞膜复合材料置于生物反应器容器中并成功培养10天（图6A）。为了研究炎症条件对肺组织生长的影响，将IL-6添加到培养基中会导致与 体内 相似的肺泡形态的典型炎症相关变化（图6B）。
图1.生物反应器容器的组件。 图1显示了生物反应器容器的关键部件及其在预组装阶段的位置。（A）反应器室、注射器端口和支架的相对位置。（B）前板（透明盖）和背板（白色板被氧合器膜覆盖）的半开位置。脚手架位于前板和背板之间的中心。黑色石墨烯支架（C）说明了支架如何放置在血管内并用作细胞增殖，分化和形成细胞网络的支撑。 请点击此处查看此图的大图。
图2.本研究中测试的脚手架的代表性插图。 为我们的生物反应器研究测试了五个支架，其中两个示例在这里展示。（A，B）代表测试釉质母细胞样细胞生长的石墨烯支架，而（C，D）代表我们基于生物反应器的细胞培养研究中最成功的胶原蛋白支架。请注意胶原蛋白支架（C，D）的多孔结构与石墨烯支架（A，B）中表面浮雕的平行阵列。（A，C）是从垂直视角拍摄的宏观照片，而（B，D）则以45°角成像。 请点击此处查看此图的大图。
图3.颈环准备。 A中的骨架化成年小鼠下颌骨展示了用于为釉母细胞样细胞培养和分化准备细胞生态位的颈环区域。该宏观图还说明了解剖标志物的位置，包括几乎跨越整个下颌长度的持续生长的门牙（inc），第一下颌磨牙（m1）以及下颌骨的角度，冠状突和下颌髁的位置。该骨骼制剂用作（B）中制备的颈环区域的解剖学方向。参考点包括下颌骨（mand），牙组织（DP），下颌骨的角度（角度）和宫颈环的位置（CL），从中收获用于我们的釉质细胞生物反应器研究的细胞。虚线表示骨化成人下颌骨 （A） 和 6 dpn 新解剖下颌骨 （B） 中准备用于颈环夹层的下颌窗的前部和远端部分。 请点击此处查看此图的大图。
图4.使用3D共培养方法生成釉母细胞样细胞。 （A）在合适的微环境中成功分化与牙髓干细胞共培养的宫颈环细胞的釉质母细胞样细胞。所得细胞群由长而细长的极化细胞组成，具有分泌牙釉质基质蛋白的能力。这些细胞的一端有一个细胞核（nucl）和一个细胞过程（proc），类似于在另一端真正的釉母细胞中观察到的Tomes过程（A）。（B）说明了对照组细胞群，这些细胞也受到共培养条件，但培养基不含生长因子或分化剂，导致圆形细胞不能代表典型的釉质母细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图5.具有涂层和未涂层支架表面的单细胞牙周祖细胞 （pdl） 群体的长期 3D 培养。与暴露于非涂层支架（A）的对照组细胞相比，支架涂层导致在甘丙素涂层支架（B）上培养的细胞中的hPDL细胞增殖率增加。与对照组相比，实验组的细胞也分泌了更多含有结缔组织纤维的细胞外基质（B与A）。请点击此处查看此图的大图。
图6.生物反应器中的肺组织培养。（A）将E15肺组织段在生物反应器中的硝酸纤维素膜上培养十天。（B）E15肺组织段与（A）相似，但通过向培养基（B）中添加IL-6而受到炎症条件。（C）用H&E染色的新鲜解剖的E15肺组织的石蜡切片.在比较（A）和（C）时注意肺泡I型和II型细胞形态的相似性。请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在微重力下细胞生长方案的关键步骤包括生物反应器，支架，用于3D培养的细胞以及作为诱导细胞分化手段的支架涂层。我们研究中使用的生物反应器类型包括RCCS-4生物反应器，这是NASA开发的原始旋转细胞培养系统（RCCS）旋转圆柱形组织培养装置的最新修改，用于在模拟微重力下生长细胞。这种RCCS-4环境提供了极低的剪切应力，从而增强了传质并改善了培养性能。这个版本的生物反应器允许同时使用四个容器进行四个不同的实验。RCCS-4生物反应器配备了高纵横比（HARV）容器，这确保了简单直接的培养条件，并为我们的研究提供了足够数量的细胞。
我们方法的第二个关键组成部分是脚手架，因为它们为浮动单元提供了模板来附着和形成组件。虽然由于坏死核心的形成，支架在2D培养中的使用受到限制，但旋转生物反应器中增强的扩散，氧气和营养流提高了支架作为细胞组件繁殖载体的适用性28，29。在本研究中，我们探讨了五种类型的支架的功效，聚乳酸-共乙醇酸（PLGA）支架，胶原和多孔支架，石墨烯支架，以及明胶盘和水化磷灰石盘。此外，我们将膜从肺器官预培养环境转移到生物反应器中，并将培养的肺段连接到其上。其中，胶原蛋白支架成为我们研究中最有利的支架，可能是由于其胶原蛋白成分和多孔结构。PLGA支架产生了活细胞，而其他三个支架在我们手中则不太有利。原始肺器官培养系统的硝酸纤维素膜被证明是另一种有效的支架，因为它在转移到3D生物反应器环境后成功地保持了培养肺的完整性。
我们策略的第三个关键组成部分是用于接种血管的细胞类型。对于我们的釉质发生研究，我们依赖于由与牙髓细胞共培养的不断生长的小鼠门牙制备的宫颈环细胞。选择宫颈袢细胞作为原始牙釉质器官祖细胞的来源，这些祖细胞在啮齿动物门牙中不断更新。小鼠或大鼠门牙是干细胞和祖细胞的显着来源，在动物的整个生命周期中继续存在，而牙釉质器官的细胞被补充以进行连续喷发和釉质生成23，30。牙周祖细胞和牙髓细胞均用作共培养细胞来源。使用间充质共培养细胞群成功培养上皮细胞是公认的31，32。在我们的研究中，牙髓细胞在诱导成釉母细胞分化方面比牙周韧带祖细胞更有效，尽管基于它们的间充质特征，两者都适合作为牙源性和间充质共培养候选者。当应用于釉质生成时，牙髓细胞作为牙齿发育过程中牙源性上皮的天然对应物可能触发了适合诱导终末釉母细胞分化的适当的上皮-间充质相互作用33，34。然而，对于牙周组织工程的支架相互作用的研究，牙周祖细胞非常适合，因为它们会产生完全分化的牙周韧带成纤维细胞25，35。最后，为了在生物反应器环境中培养肺器官，我们依赖于解剖的胚胎鼠肺段。在器官培养皿中培养胚胎肺器官的程序已在前面描述36，并且已经探索了许多将肺上皮细胞与血管或平滑肌细胞相结合的二维细胞培养模型37，38，39。在本研究中，3D生物反应器模型保持了稳定的表面活性剂分泌水平，同时保持了培养组织块核心的完整性，使该模型适用于研究环境对肺组织完整性的影响。
我们模型的第四个重要方面是在支架表面上应用细胞类型特异性涂层以触发釉质母细胞样细胞分化。具体来说，LRAP和牙釉质基质等成分成为导致釉母细胞样细胞分化的关键因素，因为缺乏LRAP涂层和初始牙釉质基质阻止了细长和极化细胞的形成。总之，支架表面的涂层为促进生物反应器中复杂器官的组织特异性分化提供了强大的工具。
这项研究最重要的方面是能够恢复釉母细胞独特的细长和极化细胞形状。这一结果是3D生物反应器系统相对于高度圆润的牙釉质器官衍生细胞的2D培养系统的局限性的独特优势。这一结果为在培养与其他培养技术不相容的细胞时使用生物反应器技术的好处提供了进一步的证据40。我们将成色母细胞共培养研究的成功归因于旋转生物反应器的几个独特属性，包括营养物质、生长和转录因子以及氧气的持续供应，以及单个细胞聚集和形成不同谱系和发育阶段细胞之间的社会相互作用的能力。虽然这些研究成功地生长了细长、极化和釉质生成素分泌釉质母细胞样细胞，但这里生长的釉质母细胞样细胞仍然处于孤立状态，并且失去了釉质母细胞行的自然连续性。在未来的应用中，用该技术生长的釉质母细胞样细胞可用于牙釉质组织工程应用或作为实验模型来概括牙齿釉质生成的各个方面。
总之，3D生物反应器成为宫颈袢/牙髓共培养物繁殖到釉质母细胞，涂层支架中牙周韧带祖细胞生长以及整个肺器官培养的成功环境。基于这些数据，基于生物反应器的技术很可能成为牙釉质、牙周和肺部研究等领域先进组织工程或测试策略的重要载体。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
研究得到了国家牙科和颅面研究所（UG3-DE028869和R01-DE027930）的慷慨资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -y, Wang, X. -m, Li, X. -y An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au - Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
