Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Formering af tand- og åndedrætsceller og organer i mikrogravity

Published: May 25, 2021 doi: 10.3791/62690
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1, 1
1Center for Craniofacial Research and Diagnosis, Texas A&M College of Dentistry, 2Department of Stomatology, The Fourth Affiliated Hospital, Harbin Medical University, 3Key Laboratory of Oral Medicine, Guangzhou Insititute of Oral Disease, Stomatology Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

Denne protokol præsenterer en metode til dyrkning og 3D-vækst af ameloblast-lignende celler i mikrogravity for at opretholde deres aflange og polariserede form samt emaljespecifikke proteinekspression. Kulturbetingelser for kulturen af periodontale ingeniørkonstruktioner og lungeorganer i mikrogravitet er også beskrevet.

Abstract

Tyngdekraften er en af de vigtigste determinanter for menneskelig cellefunktion, proliferation, cytoskeletal arkitektur og orientering. Roterende bioreaktorsystemer (RCCS'er) efterligner tabet af tyngdekraften, når det forekommer i rummet, og giver i stedet et mikrogravitetsmiljø gennem kontinuerlig rotation af dyrkede celler eller væv. Disse RCCS'er sikrer en uafbrudt forsyning af næringsstoffer, vækst- og transkriptionsfaktorer og ilt og adresserer nogle af manglerne ved tyngdekraften i ubevægelige 2D (todimensionelle) celle- eller organkulturretter. I denne undersøgelse har vi brugt RCCS'er til at samdyrke cervikale loopceller og tandmasseceller til at blive ameloblaster, til at karakterisere periodontale stamfader / stilladsinteraktioner og til at bestemme effekten af betændelse på lungealveoler. RCCS-miljøerne lettede væksten af ameloblast-lignende celler, fremmede periodontal progenitorproliferation som reaktion på stilladsbelægninger og tillod en vurdering af virkningerne af inflammatoriske ændringer på dyrkede lungealveoler. Dette manuskript opsummerer miljøforholdene, materialerne og trinene undervejs og fremhæver kritiske aspekter og eksperimentelle detaljer. Afslutningsvis er RCCS'er innovative værktøjer til at mestre kulturen og 3D (tredimensionel) vækst af celler in vitro og give mulighed for undersøgelse af cellulære systemer eller interaktioner, der ikke er modtagelige for klassiske 2D-kulturmiljøer.

Introduction

Tyngdekraften påvirker alle aspekter af livet på Jorden, herunder biologien af individuelle celler og deres funktion i organismer. Celler registrerer tyngdekraften gennem mekanoreceptorer og reagerer på ændringer i tyngdekraften ved at omkonfigurere cytoskeletale arkitekturer og ved at ændre celledeling 1,2,3. Andre virkninger af mikrogravitet inkluderer det hydrostatiske tryk i væskefyldte vesikler, sedimentering af organeller og opdriftsdrevet konvektion af flow og varme4. Undersøgelser af effekten af tab af tyngdekraft på humane celler og organer blev oprindeligt udført for at simulere det vægtløse miljø i rummet på astronauter under rumflyvningsmissioner5. I de senere år er disse 3D-bioreaktorteknologier, der oprindeligt blev udviklet af NASA til at simulere mikrogravitet, imidlertid blevet mere og mere relevante som nye tilgange til kulturen af cellepopulationer, der ellers ikke er modtagelige for 2D-kultursystemer.

3D-bioreaktorer simulerer mikrogravitet ved at dyrke celler i suspension og dermed skabe en konstant "frit fald" -effekt. Andre fordele ved de roterende bioreaktorer omfatter manglen på lufteksponering i organkultursystemer, en reduktion i forskydningsspænding og turbulens og en kontinuerlig eksponering for en skiftende forsyning af næringsstoffer. Disse dynamiske betingelser leveret af en Rotary Cell Culture System (RCCS) bioreaktor favoriserer rumlig co-lokalisering og tredimensionel samling af enkeltceller i aggregater 6,7.

Tidligere undersøgelser har vist fordelene ved en roterende bioreaktor til knogleregenerering8, tandkimkultur9 og til dyrkning af humane tandfollikelceller10. Der har også været en rapport, der tyder på, at RCCS forbedrer EOE-celleproliferation og differentiering i ameloblaster11. Imidlertid blev differentierede celler betragtet som ameloblaster baseret på ameloblastinimmunfluorescens og / eller amelogeninekspression alene11 uden at overveje deres aflange morfologi eller polariserede celleform.

Ud over den NASA-udviklede roterende vægbeholder (RWV) bioreaktor omfatter andre teknologier til generering af 3D-aggregater fra celler magnetisk levitation, den tilfældige positioneringsmaskine (RPM) og clinostat12. For at opnå magnetisk levitation leviteres celler mærket med magnetiske nanopartikler ved hjælp af en ekstern magnetisk kraft, hvilket resulterer i dannelsen af stilladsfrie 3D-strukturer, der er blevet brugt til biofabrikation af adipocytstrukturer13,14,15. En anden tilgang til simulering af mikrogravitet er dannelsen af multidirektionelle G-kræfter ved at kontrollere samtidig rotation omkring to akser, hvilket resulterer i en annullering af den kumulative tyngdekraftsvektor i midten af en enhed kaldet clinostat16. Når knoglemarvsstamceller blev dyrket i en clinostat, blev ny knogledannelse hæmmet gennem undertrykkelse af osteoblastdifferentiering, hvilket illustrerer en af de dedifferentierende virkninger af mikrogravitet16.

In vitro-systemer til at lette den trofaste ameloblastkultur ville være et stort skridt fremad mod tandemaljevævsteknik17. Desværre har ameloblastskulturen indtil nu været en udfordrende opgave18,19. Indtil videre er fem forskellige ameloblast-lignende cellelinjer blevet rapporteret, herunder musens ameloblast-afstamningscellelinje (ALC), rottetandepitelcellelinjen (HAT-7), musens LS8-cellelinje20, den svine PABSo-E-cellelinje 21 og rotten SF2-24 cellelinje22. Imidlertid har størstedelen af disse celler mistet deres karakteristiske polariserede celleform i 2D-kultur.

I denne undersøgelse har vi henvendt os til et Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) for at lette væksten af ameloblastlignende celler fra cervikal loop-epitelia, der er samdyrket med mesenkymale forfædre og for at overvinde udfordringerne ved 2D-kultursystemer, herunder reduceret strøm af næringsstoffer og cytoskeletale ændringer på grund af tyngdekraften. Derudover har RCCS givet nye muligheder for undersøgelse af celle / stilladsinteraktioner relateret til periodontal vævsteknik og til at undersøge virkningerne af inflammatoriske mediatorer på lungealveolært væv in vitro. Tilsammen fremhæver resultaterne fra disse undersøgelser fordelene ved mikrogravity-baserede rotatoriske kultursystemer til udbredelse af differentieret epitel og til vurdering af miljøvirkninger på celler dyrket in vitro, herunder celle/stilladsinteraktioner og vævets respons på inflammatoriske tilstande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al nødvendig institutionel godkendelse blev opnået for at sikre, at undersøgelsen var i overensstemmelse med TAMU's institutionelle retningslinjer for dyrepleje.

1. Samling og sterilisering af bioreaktorer

  1. Steriliser fire beholdere med højt billedformat (HARV) til bioreaktoren i en autoklave på plastinstrumentcyklussen i 20 minutter ved 121 °C som anbefalet af producenten.
  2. Efter sterilisering samles karrene i en cellekulturhætte ved at stramme skruerne, der følger med bioreaktoren, hvorefter karrene er klar til brug.

2. Stilladser anvendt til bioreaktorens medkultureksperiment

  1. Inkuber stilladserne sammen med cellerne for at give støtte til cellefastgørelse, der er nødvendig for yderligere vækst.
  2. Vælg mellem PGA-baserede stilladser, hydroxyapatitstilladser, grafenplader, gelatineskiver og kollagenbaserede stilladser til samkulturstudier.

3. Cervikal Loop (CL) dissektion og enkeltcelle forberedelse

  1. Ofring af mus ved halshugning efter åndedrætsstop ved CO2 -overdosis.
    BEMÆRK: Alle dyreforsøg er i overensstemmelse med TAMU's institutionelle retningslinjer for dyrepleje.
  2. Dissekere cervikale sløjfer fra 6 dages postnatal (DPN) mus efter en modificeret version af en tidligere offentliggjort protokol23.
    BEMÆRK: I vores undersøgelse er den distale del af livmoderhalssløjfen, der ikke er vist i den tidligere offentliggjorte protokol, inkluderet (figur 3).
    1. Det dissekerede væv vaskes med koldsterilt PBS inden fordøjelsen med collagenasedispase ved 37 °C i 30 minutter.
  3. Opløsningen ledes gennem en 70 μm sterilcellesi og centrifugeres yderligere ved 800 x g i 10 minutter.
  4. Kassér supernatanten. Centrifuger pelleten og vask to gange med kold PBS ved 800 x g. Kassér supernatanten.
  5. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og tilsæt 1 X 105 celler pr. Beholder.

4. Dental pulpcellekultur og cellelinjeudvidelse

  1. Pladetandmasseceller i en 100 mm vævskulturplade ved passage 4 i en koncentration på 1 x 105.
  2. Forbered medier til kulturen bestående af DMEM højt glukosemedie suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotikum / antimykotisk (P / S).
  3. Når cellerne når 85-90% sammenløb, skal du suge mediet og vaske pladerne to gange med forvarmet PBS.
  4. Efter PBS-vasken tilsættes en forvarmet 0,25% Trypsin-EDTA-opløsning til pladen, og tandmassecelleholdige plader inkuberes ved 37 °C i 3 minutter.
  5. Bekræft celleløsrivelse ved visuel inspektion ved hjælp af et mikroskop.
  6. Saml mediet sammen med cellerne fra dyrkningspladen og overfør via en 25 ml pipette til et 50 ml sterilt konisk rør.
  7. Centrifuger cellerne ved 800 x g i 8 minutter og kassér supernatanten. Resuspender cellerne i friske medier og tæl ved hjælp af et hæmocytometer.
  8. Til samkultur med cervikale loopceller sås tandmassecellerne i bioreaktoren i en koncentration på 1 x 104 pr. Kar.

5. Samdyrkning af cervikale loop/tandmasseceller på et stillads i RCCS-bioreaktoren

  1. Tilsæt begge celletyper, livmoderhalssløjfen og tandmassen til kulturmediet indeholdende keratinocyt SFM-medier med supplerede vækstfaktorer, ekstracellulære matrixproteiner og stilladser.
    BEMÆRK: Vækstfaktorer tilsættes i en koncentration på 0,03 μg / ml knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP 2), 0,03 μg / ml knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP-4), 10 ng / ml human rekombinant fibroblastvækstfaktor (hFGF) og 15 ng / ml epidermal vækstfaktor (hEGF), mens ECM-komponenter omfattede 200 μg / ml Matrigel, 5 μg / ml laminin og 5 μg / ml fibronectin.
  2. Frakkestilladser med en blanding af 500 μL kollagengel beriget med 1 mg LRAP (Leucin-rig amelogeninpeptid) peptid, 1 mg frysetørret tidlig emaljematrix fremstillet af svinetænder24, 5 μg / ml laminin og 5 μg / ml fibronectin.
    BEMÆRK: Dette fungerede bedst for vores eksperimenter.
  3. Efter stilladsbelægning tilsættes både celler og stillads til bioreaktoren, og bioreaktoren fyldes med 10 ml medium pr. Kar.
  4. Luk bioreaktorbeholderens påfyldningsporthætte efter tilsætning af medier, celler og stilladser.
  5. Fastgør de sterile ventiler til sprøjteportene i begyndelsen af forsøget, og hold dem på plads med et dæksel indtil forsøgets afslutning.
  6. Når beholderen er 90% fuld, og påfyldningsportens hætter er lukket og strammet, skal du åbne de sterile ventiler.
  7. Brug to sterile sprøjter (3 ml), hver gang der kræves et medieskift. Fyld den ene sprøjte med frisk medium, mens den anden sprøjte efterlades tom.
  8. Åbn begge sprøjteventiler, og manøvrer forsigtigt boblerne mod den tomme sprøjteport.
  9. Når det friske medium fra den fulde sprøjte er omhyggeligt injiceret i beholderen, skal du fjerne boblerne gennem den tomme sprøjteport.
    BEMÆRK: Denne procedure udføres, indtil alle mikrobobler er fjernet fra karrene.
  10. Luk sprøjteportene med hætter, og kassér sprøjterne i en affaldsbeholder med skarpe genstande.
  11. Fastgør hver beholder til rotatorbasen, og rotatorbasen anbringes i en inkubator med 5% CO2 og 37 °C temperatur.
  12. Tænd for strømmen, og indstil rotationshastigheden til 10,1 o / min.
    BEMÆRK: Juster hastigheden for at sikre, at stilladserne er ophængt uden at røre ved karvæggen.
  13. For medieændring skal du placere karrene i opretstående stilling for at sikre, at cellerne sætter sig i bunden. Åbn sprøjteportene, og tilslut de sterile sprøjter til portene.
  14. Følg den samme procedure ved at aspirere 75% af det ernæringsudtømte medium og injicere frisk medium gennem den anden port.

6. Lungeorganforberedelse og bioreaktorbaseret kultur

BEMÆRK: E15 vildtype museunger blev brugt til fremstilling af lungeorganer.

  1. Dissekere lungevævet efter aflivning af en gravid hunmus med CO2 -kvælning.
    1. Når døden er bekræftet efter kvælning ved cervikal dislokation, skal du bruge en skalpel til at udsætte brysthulen. Fjern derefter hvalpene fra livmoderen og afliv ved halshugning.
  2. Efter aflivning skal du forberede brysthulen ved at åbne den med en skalpel for at lokalisere lungerne. Vask små segmenter af lungevæv med sterilt PBS og læg det på en forsteriliseret membran i 2 timer med organkulturmedium i en inkubator indeholdende 5% CO2 og 37 °C temperatur.
  3. Når lungevævet er fastgjort til membranen i en 2D-organkulturplade, overføres prøverne til bioreaktorbeholderen.
  4. Forbered medierne på kultur.
    BEMÆRK: Kontrol-DMEM-højglukosemediet indeholder 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% antibiotikaopløsning (P / S) (penicillin, 100 U / ml, streptomycin, 50 μg / ml) og 100 μg / ml ascorbinsyre (AA), og til induktion af inflammatoriske tilstande suppleres kontrolmedium med 5 ng / ml IL-6 protein.
  5. Udfør lungekultureksperimentet i 10 dage med et medieskift hver 48. time i bioreaktoren som beskrevet ovenfor.

7. Belagt stillads med human periodontal ligament (hPDL) cellekultur

  1. Kultur humane periodontale ledbåndsceller.
    BEMÆRK: Cellerne isoleres og dyrkes i vores laboratorium i henhold til protokollen, der tidligere er offentliggjort25.
  2. Belæg kollagenstilladsskiverne med 30 μL PBS til kontrolgruppen og neuropeptidgalanin (GAL) i en koncentration på 10-8 natten over.
  3. Frø humane PDL-celler på kontrol- og GAL-belagt stillads i 2 timer ved 37 ° C i en kulturplade, og overfør cellefrøstilladserne til et bioreaktorbeholder som nævnt ovenfor.
  4. Kultur cellefrøstilladserne i 14 dage i bioreaktoren, inden stilladserne høstes til analyse.

8. Rengøring og vedligeholdelse af bioreaktorer

  1. Når stilladserne/cellerne er høstet fra bioreaktoren, fjernes sprøjteportene fra beholderen.
    BEMÆRK: Skruerne omkring karrene tages af, og karret vaskes forsigtigt med sæbevand.
  2. Skyl beholderne med rent vand og stram skruerne igen.
  3. Opbevar beholderne efter autoklavering indtil næste brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bioreaktorens indvendige kammer giver cellerne et miljø til at sprede sig og differentiere, fastgøres til et stillads eller samles for at danne væv som samlinger. Hvert HARV-fartøj rummer op til 10 ml medium og letter en konstant cirkulation af næringsstoffer, så hver celle har en fremragende chance for at overleve. Figur 1A illustrerer fastgørelsen af sprøjteportene til beholderens forplade, hvor sterile one-stop-ventiler er fastgjort. Disse ventiler fungerer som dørvogtere til kulturkammeret. Medium skift kræver, at stophaneventilen åbnes for at lette fastgørelsen af en steril sprøjte indeholdende frisk medium. Mikrogravitetsmiljøet i bioreaktoren gør det muligt for celler at fastgøre sig til stilladset i karret uden forudgående såning på stilladserne. Stilladset (figur 1B og 1C) placeret i bioreaktoren roterer kontinuerligt, hvilket gør det muligt for celler at fastgøre til stilladsoverflader og danne cytoskeletale netværk. Oxygenatormembranen i bunden af karpladen (figur 1B) giver mulighed for kontinuerlig gasudveksling for at forbedre celleoverlevelse og levetid.

Forskellige stilladser blev testet for at identificere det stillads, der var mest kompatibelt med cellerne. Stilladset i figur 2A og 2B er et grafenark bestående af 75% grafen og 25% PLG (polymælkeglykolid). Dette elektrisk ledende stillads bruges ofte til celler, der kan kræve elektrisk stimulering, såsom skeletmuskelceller26. I vores undersøgelser overgik kollagenstilladset alle andre undersøgelser, der blev testet med hensyn til biokompatibilitet, fremme af vævsvækst og cellulær differentiering. Den specialiserede porøse overflade af dette kollagenbaserede stillads (figur 2C og 2D) gør det muligt for cellerne og næringsstofferne at strømme gennem stilladset, hvilket øger området med cellefastgørelse og celleproliferation.

Placeringen af livmoderhalssløjfen i forhold til musens underkæbe er illustreret i figur 3A og 3B. For at forberede musefortænder cervikale loopceller blev en skeleteret museunderkæbe dissekeret, og den distale del af den nedre musefortænder blev udsat. Den præcise placering af den resekterede livmoderhalssløjfe er afgrænset i 6 dage efter fødslen musefortænder (figur 3B), mens en lignende region i en voksen skeleteret museunderkæbe er angivet som reference i figur 3A til orienteringsformål. Arealet af den tilsvarende cervikale sløjfe i den voksne skeleterede (figur 3A) og den 6 dpn frisklavede musefortænder er indrammet af to brudte linjer (figur 3A og B). Tandprotesen af hemi mandibles består af tre mandibulære molarer og en kontinuerligt voksende fortand, mens cervikal loop celle niche består af en blandet cellepopulation involveret i emaljedannelse såsom det indre emaljeepitel, ydre emaljeepitel, stellate reticulum og stratum intermedium19.

Figur 4 fokuserer på den vellykkede differentiering af livmoderhalssløjfecellerne i aflange, polariserede, emaljeproteinudskillende ameloblastlignende celler. Dataene afslørede, at vellykket differentiering af aflange, polariserede, emaljeproteinudskillende ameloblastlignende celler kræver samkultur af livmoderhalssløjfecellerne med mesenkymale stamceller såsom tandmassestamceller. Kulturerede celler blev forsynet med et skræddersyet mikromiljø som beskrevet i trin 3 i protokollen, hvilket resulterede i dannelsen af polariserede celler med kernen i den ene ende og en lang cellulær proces i den anden27, et typisk kendetegn ved ameloblaster (figur 4A). Anvendelse af medier alene og uden vækstfaktorer og/eller stilladsbelægning resulterede i cervikale loopceller, der udskilte vigtige emaljeproteiner, men ikke forlængede eller polariserede (figur 4B).

Galaninbelagte og ikke-belagte kollagenstilladser blev anbragt i en bioreaktor med hPDL-celler i fjorten dage i en bioreaktor. Cellerne overlevede en to-ugers kulturperiode i 3D-kultursystemet, og den galaninbelagte stilladsgruppe viste en signifikant højere spredningshastighed (figur 5B) sammenlignet med kontrolgruppen, der indeholdt ubelagte stilladser (figur 5A). Cellerne i den eksperimentelle gruppe viste også et signifikant højere niveau af ekstracellulær matrix indeholdende bindevævsfibre sammenlignet med kontrollen.

Bioreaktormiljøet viste sig at være vellykket for væksten af lungesegmenter i et 3D-mikrogravitetsmiljø (figur 6). Til denne undersøgelse blev lungevævssegmenter høstet fra E15-mus (figur 6C) anbragt på en nitrocellulosemembran i en organkulturskål i to timer. Efter den første vævsbinding til membranen blev lungevævs-/nitrocellulær membrankomposit anbragt i bioreaktorbeholderen og blev dyrket med succes i 10 dage (figur 6A). For at studere virkningerne af inflammatoriske tilstande på lungevævsvækst resulterede tilsætning af IL-6 til kulturmediet i typiske inflammationsassocierede ændringer i alveolær morfologi svarende til dem, der ses in vivo (figur 6B).

Figure 1
Figur 1. Komponenter i en bioreaktorbeholder. Figur 1 illustrerer nøglekomponenter i en bioreaktorbeholder og deres placering på et præmonteringsstadium. (A) Relativ placering af reaktorkammeret, sprøjteportene og stilladset. (B) Halvåben position af forpladen (klart dæksel) og bagpladen (hvid plade dækket af oxygenatormembran). Stilladset er placeret i midten mellem for- og bagplade. Det sortfarvede grafenstillads (C) illustrerer, hvordan et stillads placeres i karret og bruges som støtte for cellerne til at sprede, differentiere og danne et mobilnetværk. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Repræsentative illustrationer af stilladser testet i denne undersøgelse. Fem stilladser blev testet til vores bioreaktorundersøgelser, hvoraf to eksempler præsenteres her. (A, B) repræsenterer grafenstilladset testet for ameloblastlignende cellevækst, mens (C, D) repræsenterer kollagenstilladset, der er mest vellykket for vores bioreaktorbaserede cellekulturstudier. Bemærk den porøse struktur af kollagenstillads (C,D) versus det parallelle array af overfladeprægninger i grafenstilladset (A,B). (A,C) er makrografer taget fra et vinkelret perspektiv, mens (B,D) blev afbildet i en vinkel på 45°. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Forberedelse af cervikal loop. Den skeleterede voksne museunderkæbe i A demonstrerer det cervikale loopområde, der bruges til at forberede cellenichen til ameloblast-lignende cellekultur og differentiering. Denne makrograf illustrerer også placeringen af anatomiske markører, herunder den kontinuerligt voksende fortænder (inc), der spænder over næsten hele mandibulærlængden, den første mandibulære molar (m1) sammen med mandiblens vinkel, coronoidprocessen og placeringen af mandibulær kondyle. Dette skeletpræparat tjener som en anatomisk orientering for livmoderhalssløjfeområdet fremstillet i (B). Referencepunkter omfatter mandibulær knogle (mand), dental papillavæv (DP), mandiblens vinkel (vinkel) og placeringen af livmoderhalssløjfen (CL), hvorfra cellerne til vores ameloblast bioreaktorundersøgelser blev høstet. Den brudte linje angiver den forreste og distale del af det fenestrerede mandibulære vindue forberedt til cervikal loop dissektion i den skeleterede voksne mandible (A) og i 6 dpn frisk dissekeret underkæbe (B). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Generering af ameloblast-lignende celler ved hjælp af en 3D-samkulturtilgang. (A) Vellykket differentiering af ameloblast-lignende celler fra cervikale loopceller samdyrket med tandpulpstamceller i et passende mikromiljø. Den resulterende cellepopulation bestod af lange, aflange, polariserede celler med evnen til at udskille emaljematrixproteiner. Disse celler indeholdt en kerne i den ene ende (nucl) og en cellulær proces (proc), der lignede Tomes-processen som observeret i ægte ameloblaster i den anden ende (A). (B) illustrerer en population af kontrolgruppeceller, der også blev udsat for samkulturbetingelser, men med medier fri for vækstfaktorer eller differentieringsmidler, hvilket resulterer i afrundede celler, der ikke er repræsentative for typiske ameloblaster. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. Langvarig 3D-kultur af en enkeltcelle periodontal stamfader (pdl) befolkning med belagte og ikke-belagte stilladsoverflader. Stilladsbelægning resulterede i en stigning i hPDL-celleproliferationshastigheden i celler dyrket på det galaninbelagte stillads (B) sammenlignet med kontrolgruppecellerne udsat for et ikke-belagt stillads (A). Cellerne fra den eksperimentelle gruppe udskilte også mere ekstracellulær matrix indeholdende bindevævsfibre sammenlignet med kontrolgruppen (B versus A). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6. Lungevævskultur i en bioreaktor. (A) E15 lungevævssegmenter dyrket på en nitrocellulosemembran i en bioreaktor i ti dage. (B) E15 lungevævssegmenter svarende til (A), men udsat for inflammatoriske tilstande ved at tilføje IL-6 til mediet (B). (C) Paraffinsektion af et frisk dissekeret E15-lungevæv farvet med H&E. Bemærk ligheder i alveolær type I og type II-cellemorfologier, når du sammenligner (A) og (C). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin i protokollen for vækst af celler i mikrogravitet inkluderer bioreaktoren, stilladset, cellerne, der anvendes til 3D-kultur, og stilladsbelægningen som et middel til at inducere celledifferentiering. Den type bioreaktor, der anvendes i vores undersøgelser, omfatter RCCS-4 bioreaktoren, en nylig ændring af det originale Rotary Cell Culture System (RCCS) roterende cylindrisk vævskulturenhed udviklet af NASA til at dyrke celler i simuleret mikrogravitet. Dette RCCS-4-miljø giver ekstremt lave forskydningsspændinger, hvilket forbedrer masseoverførslen og forbedrer kulturens ydeevne. Denne version af bioreaktoren tillod samtidig anvendelse af fire kar til fire forskellige eksperimenter på samme tid. RCCS-4 bioreaktoren var udstyret med HARV-kar (High Aspect Ratio), som sikrede enkle og ligetil dyrkningsbetingelser med et tilstrækkeligt antal celler til vores undersøgelser.

En anden kritisk komponent i vores tilgang er stilladserne, da de giver skabeloner til flydende celler til at fastgøre og danne samlinger. Mens brugen af stilladser i 2D-kultur er begrænset på grund af dannelsen af nekrotiske kerner, forbedrer den forbedrede diffusion, ilt og næringsstofstrøm i en roterende bioreaktor stilladsernes anvendelighed som bærere til udbredelse af cellesamlinger28,29. I denne undersøgelse undersøgte vi effekten af fem typer stilladser, poly(mælke-co-glykolsyre (PLGA) stilladser, et kollagen- og porøst stillads, et grafenstillads samt en gelatineskive og en hydrodroxyapatitskive. Derudover overførte vi membranen fra lungeorganets prækulturmiljø til bioreaktoren med det dyrkede lungesegment fastgjort til det. Blandt disse fremstod kollagenstilladset som det mest gunstige stillads i vores studier, muligvis på grund af dets kollagensammensætning og porøse struktur. PLGA-stilladset blev givet levedygtige celler, mens de tre andre stilladser var mindre gunstige i vores hænder. Nitrocellulosemembranen i det oprindelige lungeorgankultursystem viste sig at være et andet effektivt stillads, da det med succes opretholdt integriteten af den dyrkede lunge efter overførsel til 3D-bioreaktormiljøet.

En tredje kritisk komponent i vores strategi er de typer celler, der bruges til at så fartøjet. Til vores amelogeneseundersøgelser stolede vi på cervikale loopceller fremstillet af de kontinuerligt voksende musefortænder, der blev dyrket sammen med tandmasseceller. Cervikale loopceller blev valgt som kilde til de oprindelige emaljeorganforfædre, der løbende fornyes i gnaverfortænderne. Musen eller rottefortænderne er en bemærkelsesværdig kilde til stam- og stamceller, der fortsætter med at eksistere i hele dyrets liv, mens cellerne i emaljeorganet genopfyldes til kontinuerlig udbrud og amelogenese23,30. Både periodontale stamceller og tandmasseceller blev brugt som co-kulturcellekilder. Anvendelsen af mesenkymale co-kulturcellepopulationer til vellykket dyrkning af epitelceller er veletableret31,32. I vores undersøgelser var tandmasseceller mere effektive til at inducere ameloblastdifferentiering end periodontale ledbåndsforfædre, selvom begge baseret på deres mesenkymale egenskaber er egnede som odontogene og mesenkymale cokulturkandidater. Når de anvendes mod amelogenese, kan tandmasseceller som det naturlige modstykke til odontogent epitel under tandudvikling have udløst de passende epitel-mesenkymale interaktioner, der er egnede til induktion af terminal ameloblastdifferentiering33,34. Til undersøgelse af stilladsinteraktioner til periodontal vævsteknik var periodontale forfædre imidlertid ideelt egnede, da de giver anledning til fuldt differentierede periodontale ledbåndsfibroblaster25,35. Endelig var vi afhængige af dissekerede embryonale murinlungesegmenter til dyrkning af lungeorganer i et bioreaktormiljø. Procedurer til dyrkning af embryonale lungeorganer i organkulturretter er beskrevet tidligere36, og en række todimensionelle cellekulturmodeller, der kombinerer lungeepitelceller med vaskulære eller glatte muskelceller, er blevet undersøgt37,38,39. I denne undersøgelse opretholdt 3D-bioreaktormodellen et robust niveau af sekretion af overfladeaktive stoffer, samtidig med at integriteten af kernen i den dyrkede vævsblok blev bevaret, hvilket gjorde denne model velegnet til undersøgelse af miljøeffekter på lungevævets integritet.

Det fjerde væsentlige aspekt af vores model er anvendelsen af celletypespecifikke belægninger på stilladsoverfladerne for at udløse ameloblast-lignende celledifferentiering. Specifikt opstod komponenter som LRAP og emaljematrix som vigtige medvirkende faktorer til ameloblast-lignende celledifferentiering, da mangel på belægning med LRAP og indledende emaljematrix forbød dannelsen af aflange og polariserede celler. Sammen giver belægningen af stilladsoverflader et kraftfuldt værktøj til at fremme den vævsspecifikke differentiering af komplekse organer i bioreaktorer.

Det mest betydningsfulde aspekt af denne undersøgelse var evnen til at genoprette den karakteristiske aflange og polariserede celleform af ameloblaster. Dette resultat er en unik fordel ved 3D-bioreaktorsystemet i forhold til begrænsningerne i 2D-kultursystemer, der stærkt afrundede emalje-organafledte celler. Dette resultat giver yderligere dokumentation til fordel for anvendelse af bioreaktorteknologier ved dyrkning af celler, der er uforenelige med andre kulturteknologier40. Vi tilskriver succesen med ameloblast-cokulturstudierne flere unikke egenskaber ved det rotatoriske bioreaktorsystem, herunder kontinuerlig tilførsel af næringsstoffer, vækst- og transkriptionsfaktorer og ilt samt individuelle cellers evne til at aggregere og danne sociale interaktioner mellem celler af forskellige slægter og udviklingsstadier. Mens undersøgelserne lykkedes at dyrke aflange, polariserede og amelogeninudskillende ameloblast-lignende celler, forbliver de ameloblast-lignende celler, der dyrkes her, isoleret, og den naturlige kontinuitet i ameloblastcellerækken gik tabt. I fremtidige applikationer kan ameloblast-lignende celler dyrket med denne teknologi bruges til emaljevævstekniske applikationer eller som en eksperimentel model til at rekapitulere aspekter af tandamelogenese.

Afslutningsvis opstod 3D-bioreaktoren som et vellykket miljø for udbredelse af cervikal loop / dental pulp-co-kulturer til ameloblaster, til vækst af periodontale ledbåndsforfædre i belagte stilladser og til dyrkning af hele lungeorganer. Baseret på disse data vil bioreaktorbaserede teknologier sandsynligvis fremstå som vigtige køretøjer til avanceret vævsteknik eller teststrategier inden for områder som tandemalje, periodontal og lungeforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Undersøgelser blev generøst støttet af tilskud fra National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 og R01-DE027930).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-antimycotic ThermoFisher Scientfic 15240096
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4544
BGJb Fitton-Jackson Modification media ThermoFisher Scientfic 12591
BIOST PGA scaffold Synthecon Custom Available from the company through a custom order
BMP-2 R&D Systems 355-BM
BMP-4 R&D Systems 314-BP
DMEM Media Sigma Aldrich D6429-500mL
FBS ThermoFisher Scientfic 16140071
Fibricol Advanced Biomatrix 5133-20mL
Fibronectin Corning 354008
Galanin Sigma Aldrich G-0278
Gelatin disc Advanced Biomatrix CytoForm 500
Graphene sheets Advanced Biomatrix CytoForm 300
hEGF Peprotech AF-100-15
hFGF ThermoFisher Scientfic AA1-155
Hydroxyapatite disc Advanced Biomatrix CytoForm 200
Il-6 protein PeproTech 200-06
Keratinocyte SFM media (1X) ThermoFisher Scientfic 17005042
Laminin Corning 354259
LRAP peptide Peptide 2.0 Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT
PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL
PLEAWPATDKTKREEVD
Matrigel Corning 354234
Millipore Nitrocellulose membrane Merck Millipore AABP04700
RCCS Bioreactor Synthecon RCCS 4HD
SpongeCol Advanced Biomatrix 5135-25EA
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock Smiths Medical MX5-61L
Syringes with needle 3cc McKESSON 16-SN3C211
Trypsin EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientfic 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
  2. Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
  3. Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
  4. Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
  5. Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
  6. Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
  7. Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
  8. Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
  9. Sun, F. -y, Wang, X. -m, Li, X. -y An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
  10. Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
  11. Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
  12. Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
  13. Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
  14. Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
  15. Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
  16. Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
  17. Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
  18. Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
  19. Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
  20. Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
  21. DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
  22. Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
  23. Au - Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
  24. Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
  25. Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
  26. Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
  27. Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
  28. Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
  29. Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
  30. Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
  31. Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
  32. Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
  33. Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
  34. Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
  35. Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
  36. Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
  37. Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
  38. Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
  39. Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
  40. Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).

Tags

Bioengineering udgave 171
Formering af tand- og åndedrætsceller og organer i mikrogravity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pandya, M., Ma, W., Lyu, H., Luan,… More

Pandya, M., Ma, W., Lyu, H., Luan, X., Diekwisch, T. G. H. Propagation of Dental and Respiratory Cells and Organs in Microgravity. J. Vis. Exp. (171), e62690, doi:10.3791/62690 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter