Summary
Dit protocol presenteert een methode voor de kweek en 3D-groei van ameloblastachtige cellen in microzwaartekracht om hun langwerpige en gepolariseerde vorm en glazuurspecifieke eiwitexpressie te behouden. Kweekomstandigheden voor de kweek van parodontale engineeringconstructies en longorganen in microzwaartekracht worden ook beschreven.
Abstract
Zwaartekracht is een van de belangrijkste determinanten van menselijke celfunctie, proliferatie, cytoskeletale architectuur en oriëntatie. Roterende bioreactorsystemen (RCCSs) bootsen het verlies van zwaartekracht na zoals het in de ruimte optreedt en bieden in plaats daarvan een microzwaartekrachtomgeving door continue rotatie van gekweekte cellen of weefsels. Deze RCCS'en zorgen voor een ononderbroken toevoer van voedingsstoffen, groei- en transcriptiefactoren en zuurstof, en pakken enkele van de tekortkomingen van zwaartekrachten in onbeweeglijke 2D (tweedimensionale) cel- of orgaancultuurschotels aan. In de huidige studie hebben we RCS'en gebruikt om cervicale luscellen en tandpulpcellen te cokweken om ameloblasten te worden, om parodontale voorloper / steigerinteracties te karakteriseren en om het effect van ontsteking op longblaasjes te bepalen. De RCCS-omgevingen vergemakkelijkten de groei van ameloblastachtige cellen, bevorderden parodontale voorloperproliferatie als reactie op steigercoatings en maakten een beoordeling mogelijk van de effecten van inflammatoire veranderingen op gekweekte longblaasjes. Dit manuscript vat de omgevingsomstandigheden, materialen en stappen onderweg samen en belicht kritieke aspecten en experimentele details. Kortom, RCCS'en zijn innovatieve hulpmiddelen om de cultuur en 3D (driedimensionale) groei van cellen in vitro onder de knie te krijgen en om de studie van cellulaire systemen of interacties mogelijk te maken die niet vatbaar zijn voor klassieke 2D-cultuuromgevingen.
Introduction
Zwaartekracht beïnvloedt alle aspecten van het leven op aarde, inclusief de biologie van individuele cellen en hun functie binnen organismen. Cellen voelen zwaartekracht door middel van mechanoreceptoren en reageren op veranderingen in de zwaartekracht door cytoskeletale architecturen opnieuw te configureren en door de celdelingte veranderen 1,2,3. Andere effecten van microzwaartekracht zijn de hydrostatische druk in met vloeistof gevulde blaasjes, sedimentatie van organellen en door drijfvermogen aangedreven convectie van stroming en warmte4. Studies naar het effect van verlies van zwaartekracht op menselijke cellen en organen werden oorspronkelijk uitgevoerd om de gewichtloze omgeving van de ruimte op astronauten tijdens ruimtevluchtmissies te simuleren5. In de afgelopen jaren worden deze 3D-bioreactortechnologieën die oorspronkelijk door NASA zijn ontwikkeld om microzwaartekracht te simuleren, echter steeds relevanter als nieuwe benaderingen voor de cultuur van celpopulaties die anders niet vatbaar zijn voor 2D-cultuursystemen.
3D-bioreactoren simuleren microzwaartekracht door cellen in suspensie te laten groeien en zo een constant "vrije val" -effect te creëren. Andere voordelen van de roterende bioreactoren zijn het gebrek aan blootstelling aan lucht in orgaankweeksystemen, een vermindering van schuifspanning en turbulentie en een continue blootstelling aan een veranderende toevoer van voedingsstoffen. Deze dynamische omstandigheden die worden geboden door een rotary cell culture system (RCCS) bioreactor bevorderen ruimtelijke co-lokalisatie en driedimensionale assemblage van enkele cellen tot aggregaten 6,7.
Eerdere studies hebben de voordelen aangetoond van een roterende bioreactor voor botregeneratie8, tandkiemcultuur9 en voor de kweek van menselijke tandheelkundige follikelcellen10. Er is ook een rapport dat suggereert dat RCCS de proliferatie en differentiatie van EOE-cellen in ameloblastenverbetert 11. Gedifferentieerde cellen werden echter beschouwd als ameloblasten op basis van ameloblastine-immunofluorescentie en / of amelogenine-expressie alleen11 zonder rekening te houden met hun langwerpige morfologie of gepolariseerde celvorm.
Naast de door NASA ontwikkelde rotating wall vessels (RWV) bioreactor, omvatten andere technologieën om 3D-aggregaten uit cellen te genereren magnetische levitatie, de random positioning machine (RPM) en de clinostat12. Om magnetische levitatie te bereiken, worden cellen gelabeld met magnetische nanodeeltjes zweven met behulp van een externe magnetische kracht, wat resulteert in de vorming van steigervrije 3D-structuren die zijn gebruikt voor de biofabricage van adipocytenstructuren 13,14,15. Een andere benadering om microzwaartekracht te simuleren is het genereren van multidirectionele G-krachten door gelijktijdige rotatie over twee assen te regelen, wat resulteert in een annulering van de cumulatieve zwaartekrachtvector in het midden van een apparaat genaamd clinostat16. Wanneer beenmergstamcellen werden gekweekt in een clinostat, werd nieuwe botvorming geremd door de onderdrukking van osteoblastdifferentiatie, wat een van de dedifferentiërende effecten van microzwaartekracht illustreert16.
In vitro systemen om de trouwe kweek van ameloblasten te vergemakkelijken, zouden een belangrijke stap voorwaarts zijn in de richting van tandglazuur tissue engineering17. Helaas is de cultuur van ameloblasten tot op heden een uitdagende onderneming geweest18,19. Tot nu toe zijn vijf verschillende ameloblastachtige cellijnen gemeld, waaronder de muis ameloblast-lijn cellijn (ALC), de rat tandheelkundige epitheelcellijn (HAT-7), de muis LS8 cellijn20, het varkensPABSo-E cellijn21 en de rat SF2-24 cellijn22. De meerderheid van deze cellen heeft echter hun kenmerkende gepolariseerde celvorm verloren in 2D-cultuur.
In de huidige studie hebben we ons gewend tot een Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) om de groei van ameloblastachtige cellen uit cervicale lus epithelia samen gekweekt met mesenchymale voorlopers te vergemakkelijken en om de uitdagingen van 2D-kweeksystemen te overwinnen, waaronder verminderde stroom van voedingsstoffen en cytoskeletale veranderingen als gevolg van zwaartekracht. Daarnaast heeft de RCCS nieuwe wegen geboden voor de studie van cel/scaffold interacties gerelateerd aan parodontale weefselmanipulatie en om de effecten van inflammatoire mediatoren op longalveolaire weefsels in vitro te onderzoeken. Samen benadrukken de resultaten van deze studies de voordelen van op microzwaartekracht gebaseerde rotatiecultuursystemen voor de voortplanting van gedifferentieerde epithelia en voor de beoordeling van milieueffecten op cellen die in vitro zijn gekweekt, inclusief cel/ scaffold-interacties en de weefselrespons op ontstekingsaandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle benodigde institutionele goedkeuring werd verkregen om ervoor te zorgen dat de studie in overeenstemming was met de TAMU-richtlijnen voor institutionele dierverzorging.
1. Bioreactor assemblage en sterilisatie
- Steriliseer vier high aspect ratio vaten (HARV) voor de bioreactor in een autoclaaf op de kunststof instrumentcyclus gedurende 20 minuten bij 121 °C zoals aanbevolen door de fabrikant.
- Monteer na sterilisatie de vaten in een celkweekkap door de schroeven van de bioreactor aan te draaien waarna de vaten klaar zijn voor gebruik.
2. Steigers gebruikt voor het bioreactor co-kweek experiment
- Incubeer de steigers samen met de cellen om ondersteuning te bieden voor celaanhechting die nodig is voor verdere groei.
- Kies uit op PGA gebaseerde steigers, hydroxyapatietsteigers, grafeenvellen, gelatineschijven en op collageen gebaseerde steigers voor co-kweekstudies.
3. Cervicale lus (CL) dissectie en eencellige voorbereiding
- Offer muizen op door onthoofding na ademstilstand door een overdosis CO2 .
OPMERKING: Alle dierstudies zijn in overeenstemming met tamu institutionele dierverzorgingsrichtlijnen. - Dissecteer cervicale lussen van 6 dagen postnatale (DPN) muizen volgens een aangepaste versie van een eerder gepubliceerd protocol23.
OPMERKING: In onze studie is het distale deel van de cervicale lus opgenomen dat niet in het eerder gepubliceerde protocol wordt weergegeven (figuur 3).- Was het ontleedde weefsel met koud steriel PBS voorafgaand aan de spijsvertering met collagenase dispase bij 37 °C gedurende 30 minuten.
- Laat de oplossing door een steriele celzeef van 70 μm lopen en centrifugeer verder bij 800 x g gedurende 10 minuten.
- Gooi het supernatant weg. Centrifugeer de pellet en was tweemaal met koude PBS op 800 x g. Gooi het supernatant weg.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en voeg 1 X 105 cellen per vat toe.
4. Tandpulpcelkweek en cellijnexpansie
- Plaat tandpulpcellen in een weefselkweekplaat van 100 mm bij passage 4 in een concentratie van 1 x 105.
- Bereid media voor op de kweek bestaande uit DMEM-media met hoge glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum / antimycotisch (P / S).
- Wanneer de cellen 85-90% samenvloeiing bereiken, aspirateert u het medium en wast u de platen twee keer met voorverwarmd PBS.
- Voeg na de PBS-wasbeurt een voorverwarmde 0,25% Trypsin-EDTA-oplossing toe aan de plaat en incubeer de tandpulpcelbevattende platen bij 37 °C gedurende 3 minuten.
- Bevestig het loslaten van cellen door visuele inspectie met behulp van een microscoop.
- Verzamel de media samen met de cellen van de kweekplaat en breng via een pipet van 25 ml over naar een steriele conische buis van 50 ml.
- Centrifugeer de cellen op 800 x g gedurende 8 minuten en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in verse media en tel met behulp van een hemocytometer.
- Voor co-kweek met cervicale luscellen, zaai de tandpulpcellen in de bioreactor in een concentratie van 1 x 104 per vat.
5. Co-kweek van cervicale lus/tandpulpcellen op een steiger in de RCCS bioreactor
- Voeg beide celtypen, de cervicale lus en de tandpulp toe aan het kweekmedium dat keratinocyten SFM-media bevat met aangevulde groeifactoren, extracellulaire matrixeiwitten en scaffolds.
OPMERKING: Groeifactoren worden toegevoegd in een concentratie van 0,03 μg/ml botmorfogenetisch eiwit 2 (BMP 2), 0,03 μg/ml botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP-4), 10 ng/ml humaan recombinant fibroblastgroeifactor (hFGF) en 15 ng/ml epidermale groeifactor (hEGF), terwijl ECM-componenten 200 μg/ml matrigel, 5 μg/ml laminine en 5 μg/ml fibronectine bevatten. - Bekleed steigers met een mengsel van 500 μL collageengel verrijkt met 1 mg LRAP (Leucine-rijk amelogeninepeptide) peptide, 1 mg gelyofiliseerde vroege stadium glazuurmatrix bereid uit varkenstanden24, 5 μg / ml laminine en 5 μg / ml fibronectine.
OPMERKING: Dit werkte het beste voor onze experimenten. - Voeg na steigercoating zowel cellen als steigers toe aan de bioreactor en vul de bioreactor met 10 ml medium per vat.
- Sluit de vulpoortdop van het bioreactorvat na toevoeging van media, cellen en steigers.
- Bevestig de steriele kleppen aan het begin van het experiment aan de spuitpoorten en houd ze op hun plaats met een deksel tot het einde van het experiment.
- Zodra het vat voor 90% vol is en de vulpoortdoppen gesloten en aangedraaid zijn, opent u de steriele kleppen.
- Gebruik twee steriele spuiten (3 ml) telkens wanneer een mediawissel nodig is. Vul de ene spuit met vers medium terwijl de andere spuit leeg blijft.
- Open beide spuitkleppen en manoeuvreer de bellen voorzichtig naar de lege spuitpoort.
- Zodra het verse medium van de volle spuit voorzichtig in het vat is geïnjecteerd, verwijdert u de bubbels door de lege spuitpoort.
OPMERKING: Deze procedure wordt uitgevoerd totdat alle microbubbels uit de vaten zijn verwijderd. - Sluit de spuitpoorten met doppen en gooi de spuiten weg in een afvalcontainer met scherpe voorwerpen.
- Bevestig elk vat aan de rotatorbasis en plaats de rotatorbasis in een incubator met een temperatuur van 5% CO2 en 37 °C.
- Schakel het vermogen in en stel het toerental in op 10,1 tpm.
OPMERKING: Pas de snelheid aan om ervoor te zorgen dat de steigers in ophanging zijn zonder de vaatwand aan te raken. - Voor mediaverandering plaatst u de vaten in een rechtopstaande positie om ervoor te zorgen dat de cellen zich aan de onderkant nestelen. Open de spuitpoorten en sluit de steriele spuiten aan op de poorten.
- Volg dezelfde procedure door 75% van het voedingsarme medium aan te zuigen en vers medium door de andere poort te injecteren.
6. Longorgaanpreparatie en op bioreactoren gebaseerde kweek
OPMERKING: E15 wild-type muispups werden gebruikt voor de bereiding van longorganen.
- Ontleed het longweefsel na het euthanaseren van een zwangere vrouwelijke muis met CO 2-verstikking.
- Zodra de dood is bevestigd na verstikking door cervicale dislocatie, gebruikt u een scalpel om de thoracale holte bloot te leggen. Verwijder daarna de pups uit de baarmoeder en euthanaseer door onthoofding.
- Bereid na euthanasie de thoracale holte voor door deze te openen met een scalpel om de longen te lokaliseren. Was kleine segmenten longweefsel met steriel PBS en plaats het op een vooraf gesteriliseerd membraan gedurende 2 uur met orgaankweekmedium in een incubator met een temperatuur van 5% CO2 en 37 °C.
- Zodra de longweefsels zich hechten aan het membraan in een 2D-orgaankweekplaat, brengen de monsters over naar het bioreactorvat.
- Bereid de media voor op cultuur.
OPMERKING: De controle DMEM hoge glucose media bevat 10% foetaal runderserum (FBS), 1% antibioticumoplossing (P / S) (penicilline, 100 U / ml, streptomycine, 50 μg / ml) en 100 μg / ml ascorbinezuur (AA) en voor de inductie van ontstekingsaandoeningen wordt het controlemedium aangevuld met 5 ng / ml IL-6-eiwit. - Voer het longkweekexperiment gedurende 10 dagen uit met een mediaverandering om de 48 uur in de bioreactor zoals hierboven beschreven.
7. Gecoate steiger met humane parodontale ligament (hPDL) celkweek
- Kweek menselijke parodontale ligamentcellen.
OPMERKING: De cellen worden geïsoleerd en gekweekt in ons laboratorium volgens het eerder gepubliceerde protocol25. - Bedek de collageensteigerschijven met 30 μL PBS voor de controlegroep en het neuropeptide galanine (GAL) in een concentratie van 10-8 's nachts.
- Zaai menselijke PDL-cellen op de controle- en GAL-gecoate steiger gedurende 2 uur bij 37 °C in een kweekplaat en breng de met cellen gezaaide steigers over naar een bioreactorvat zoals hierboven vermeld.
- Kweek de cel gezaaide steigers gedurende 14 dagen in de bioreactor voordat de steigers worden geoogst voor analyse.
8. Reiniging en onderhoud van bioreactoren
- Nadat de steigers/cellen uit de bioreactor zijn geoogst, verwijdert u de spuitpoorten uit het vat.
OPMERKING: De schroeven rond de vaten worden eraf gehaald en het vat wordt voorzichtig gewassen met zeepwater. - Spoel de vaten af met schoon water en draai de schroeven nogmaals aan.
- Bewaar de vaten na het autoclaveren tot het volgende gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De binnenkamer van de bioreactor biedt een omgeving voor de cellen om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren, zich aan een steiger te hechten of samen te komen om weefselachtige assemblages te vormen. Elk HARV-vat bevat tot 10 ml medium en vergemakkelijkt een constante circulatie van voedingsstoffen, zodat elke cel een uitstekende kans heeft om te overleven. Figuur 1A illustreert de bevestiging van de spuitpoorten aan de voorplaat van het vat waar steriele eenstopkleppen zijn bevestigd. Deze kleppen fungeren als deurwachters van de kweekkamer. Mediumverandering vereist dat de stopkraanklep wordt geopend om de bevestiging van een steriele spuit met vers medium te vergemakkelijken. De microzwaartekrachtomgeving in de bioreactor stelt cellen in staat om zich aan de steiger in het vat te hechten zonder dat ze vooraf op de steigers hoeven te worden gezaaid. De steiger (figuur 1B en 1C) die in de bioreactor is geplaatst, roteert continu, waardoor cellen zich aan steigeroppervlakken kunnen hechten en cytoskeletale netwerken kunnen vormen. Het oxygenatormembraan aan de onderkant van de vaatplaat (figuur 1B) zorgt voor continue gasuitwisseling om de overleving en levensduur van de cel te verbeteren.
Verschillende steigers werden getest om de steiger te identificeren die het meest compatibel is met de cellen. De steiger in figuur 2A en 2B is een grafeenplaat bestaande uit 75% grafeen en 25% PLG (poly-melkglycollide). Deze elektrisch geleidende steiger wordt vaak gebruikt voor cellen die mogelijk elektrische stimulatie nodig hebben, zoals skeletspiercellen26. In onze studies overtrof de collageensteiger alle andere studies die werden getest op het gebied van biocompatibiliteit, bevordering van weefselgroei en cellulaire differentiatie. Het gespecialiseerde poreuze oppervlak van deze op collageen gebaseerde steiger (figuur 2C en 2D) zorgt ervoor dat de cellen en voedingsstoffen door de steiger kunnen stromen, waardoor het gebied van celaanhechting en celproliferatie toeneemt.
De positie van de cervicale lus ten opzichte van de onderkaak van de muis wordt geïllustreerd in figuur 3A en 3B. Om de cervicale luscellen van de snijtand van de muis voor te bereiden, werd een geskeletiseerde muizenkaak ontleed en werd het distale grootste deel van de onderste muizensnijder blootgelegd. De precieze positie van de gereseceerde cervicale lus wordt afgebakend in de postnatale muissnijder van 6 dagen (figuur 3B), terwijl een vergelijkbaar gebied in een volwassen geskeletiseerde muiskaak als referentie wordt gegeven in figuur 3A voor oriëntatiedoeleinden. Het gebied van de overeenkomstige cervicale lus in de volwassen geskeletiseerde (figuur 3A) en de 6 dpn vers bereide muizensnijtand wordt omlijst door twee gebroken lijnen (figuur 3A en B). Het gebit van de hemi-kaken bestaat uit drie mandibulaire kiezen en een continu groeiende snijtand, terwijl de cervicale luscelnis bestaat uit een gemengde celpopulatie die betrokken is bij glazuurvorming, zoals het binnenste glazuurepitheel, het buitenste glazuurepitheel, stellaat reticulum en stratum intermedium19.
Figuur 4 richt zich op de succesvolle differentiatie van de cervicale luscellen in langwerpige, gepolariseerde, glazuureiwitafscheidende ameloblastachtige cellen. De gegevens onthulden dat succesvolle differentiatie van langwerpige, gepolariseerde, glazuureiwitafscheidende ameloblastachtige cellen de co-kweek van de cervicale luscellen met mesenchymale stamcellen zoals tandpulpstamcellen vereist. Gekweekte cellen werden voorzien van een op maat gemaakte micro-omgeving zoals beschreven in stap 3 van het protocol, wat resulteerde in de vorming van gepolariseerde cellen met de kern aan het ene uiteinde en een lang cellulair proces aan de andere27, een typisch kenmerk van ameloblasten (figuur 4A). Toepassing van media alleen en zonder groeifactoren en/of steigercoating resulteerde in cervicale luscellen die belangrijke glazuureiwitten afscheidden, maar niet langer of polariseerden (figuur 4B).
Galanine-gecoate en niet-gecoate collageensteigers werden veertien dagen lang in een bioreactor met hPDL-cellen in een bioreactor geplaatst. De cellen overleefden een kweekperiode van twee weken in het 3D-kweeksysteem en de met galanine gecoate steigergroep vertoonde een significant hogere proliferatiesnelheid (figuur 5B) in vergelijking met de controlegroep met ongecoate steigers (figuur 5A). De cellen in de experimentele groep vertoonden ook een significant hoger niveau van extracellulaire matrix met bindweefselvezels in vergelijking met de controle.
De bioreactoromgeving bleek succesvol voor de groei van longsegmenten in een 3D-microzwaartekrachtomgeving (figuur 6). Voor deze studie werden longweefselsegmenten geoogst van E15-muizen (figuur 6C) gedurende twee uur op een nitrocellulosemembraan in een orgaankweekschaal geplaatst. Na de eerste weefselaanhechting aan het membraan werd het longweefsel/nitrocellulaire membraancomposiet in het bioreactorvat geplaatst en gedurende 10 dagen met succes gekweekt (figuur 6A). Om de effecten van ontstekingsaandoeningen op de groei van longweefsel te bestuderen, resulteerde de toevoeging van IL-6 aan het kweekmedium in typische ontstekingsgerelateerde veranderingen in de alveolaire morfologie vergelijkbaar met die in vivo (figuur 6B).
Figuur 1. Componenten van een bioreactorvat. Figuur 1 illustreert de belangrijkste componenten van een bioreactorvat en hun positie in een pre-assemblagefase. (A) Relatieve positie van de reactorkamer, spuitpoorten en de steiger. (B) Halfopen positie van de voorplaat (doorzichtige afdekking) en de achterplaat (witte plaat bedekt met oxygenatormembraan). De steiger bevindt zich in het midden tussen de voor- en achterplaat. De zwartgekleurde grafeensteiger (C) illustreert hoe een steiger in het vat wordt geplaatst en wordt gebruikt als ondersteuning voor de cellen om zich te vermenigvuldigen, te differentiëren en een cellulair netwerk te vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Representatieve illustraties van steigers getest in deze studie. Vijf steigers werden getest voor onze bioreactorstudies, waarvan hier twee voorbeelden worden gepresenteerd. (A,B) vertegenwoordigen de grafeensteiger die is getest op ameloblastachtige celgroei, terwijl (C,D) de collageensteiger vertegenwoordigt die het meest succesvol is voor onze op bioreactoren gebaseerde celkweekstudies. Let op de poreuze structuur van collageensteiger (C,D) versus de parallelle reeks oppervlakte-reliëfs in de grafeensteiger (A,B). (A,C) zijn macrofoto's genomen vanuit een loodrecht perspectief, terwijl (B,D) werden afgebeeld onder een hoek van 45°. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Cervicale lusvoorbereiding. De geskeletiseerde volwassen muizenkaak in A demonstreert het cervicale lusgebied dat wordt gebruikt om de celniche voor te bereiden op ameloblastachtige celcultuur en differentiatie. Deze macrograaf illustreert ook de positie van anatomische markers, waaronder de continu groeiende snijtand (inc) die bijna de gehele mandibulaire lengte, de eerste mandibulaire kies (m1) beslaat, samen met de hoek van de onderkaak, het coronoïde proces en de positie van de mandibulaire condylus. Dit skeletpreparaat dient als anatomische oriëntatie voor het cervicale lusgebied bereid in (B). Referentiepunten zijn het mandibulaire bot (mand), tandheelkundig papillaweefsel (DP), de hoek van de onderkaak (Hoek) en de positie van de cervicale lus (CL) waaruit de cellen voor onze ameloblastbioreactorstudies werden geoogst. De gebroken lijn geeft het voorste en distale gedeelte aan van het gefesteerde mandibulaire venster dat is voorbereid op cervicale lusdissectie in de geskeletiseerde volwassen onderkaak (A) en in de 6 dpn vers ontlede onderkaak (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Generatie van ameloblast-achtige cellen met behulp van een 3D co-kweekbenadering. (A) Succesvolle differentiatie van ameloblastachtige cellen uit cervicale luscellen die samen met tandpulpstamcellen zijn gekweekt in een geschikte micro-omgeving. De resulterende celpopulatie bestond uit lange, langwerpige, gepolariseerde cellen met het vermogen om glazuurmatrixeiwitten uit te scheiden. Deze cellen hadden een kern aan het ene uiteinde (nucl) en een cellulair proces (proc) dat leek op het Tomes-proces zoals waargenomen in echte ameloblasten aan het andere uiteinde (A). (B) illustreert een populatie van cellen uit de controlegroep die ook werden blootgesteld aan cokweekomstandigheden, maar met media die vrij zijn van groeifactoren of differentiatiemiddelen, wat resulteert in afgeronde cellen die niet representatief zijn voor typische ameloblasten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Langdurige 3D-kweek van een eencellige parodontale voorloper (pdl) populatie met gecoate en niet-gecoate steigeroppervlakken. Scaffold coating resulteerde in een toename van de hPDL-celproliferatiesnelheid in cellen gekweekt op de galanine-gecoate steiger (B) in vergelijking met de controlegroepcellen blootgesteld aan een niet-gecoate steiger (A). De cellen uit de experimentele groep scheidden ook meer extracellulaire matrix uit die bindweefselvezels bevatte in vergelijking met de controlegroep (B versus A). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Longweefselkweek in een bioreactor. (A) E15-longweefselsegmenten gekweekt op een nitrocellulosemembraan in een bioreactor gedurende tien dagen. (B) E15 longweefselsegmenten vergelijkbaar met (A), maar onderworpen aan ontstekingsaandoeningen door toevoeging van IL-6 aan de media (B). (C) Paraffine sectie van een vers ontleed E15 longweefsel gekleurd met H&E. Let op overeenkomsten in alveolaire type I en type II celmorfologieën bij het vergelijken van (A) en (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen van het protocol voor de groei van cellen in microzwaartekracht zijn de bioreactor, de steiger, de cellen die worden gebruikt voor 3D-cultuur en de steigercoating als middel om celdifferentiatie te induceren. Het type bioreactor dat in onze studies wordt gebruikt, omvat de RCCS-4-bioreactor, een recente wijziging van het originele roterende celkweeksysteem (RCCS) roterende cilindrische weefselkweekapparaat dat door NASA is ontwikkeld om cellen in gesimuleerde microzwaartekracht te laten groeien. Deze RCCS-4-omgeving biedt extreem lage schuifspanningen, wat de massaoverdracht verbetert en de kweekprestaties verbetert. Deze versie van de bioreactor maakte het gelijktijdig gebruik van vier vaten voor vier verschillende experimenten tegelijkertijd mogelijk. De RCCS-4 bioreactor was uitgerust met hoge beeldverhouding (HARV) vaten, die eenvoudige en ongecompliceerde kweekomstandigheden met een voldoende aantal cellen voor onze studies verzekerden.
Een tweede cruciaal onderdeel van onze aanpak zijn de steigers, omdat ze sjablonen bieden voor zwevende cellen om te bevestigen en assemblages te vormen. Hoewel het gebruik van steigers in 2D-cultuur beperkt is vanwege de vorming van necrotische kernen, verbetert de verbeterde diffusie- zuurstof- en nutriëntenstroom in een roterende bioreactor de toepasbaarheid van steigers als dragers voor de voortplanting van celassemblages28,29. In deze studie onderzochten we de werkzaamheid van vijf soorten steigers, de poly(melkzuur-co-glycolzuur (PLGA) steigers, een collageen en poreuze steiger, een grafeensteiger, evenals een gelatineschijf en een hydrodroxyapatietschijf. Daarnaast hebben we het membraan van de longorgaanvoorteeltomgeving overgebracht naar de bioreactor, met het gekweekte longsegment eraan vast. Onder deze, de collageen scaffold kwam naar voren als de meest gunstige steiger in onze studies, mogelijk vanwege de collageensamenstelling en poreuze structuur. De PLGA-steiger kreeg levensvatbare cellen, terwijl de andere drie steigers minder gunstig waren in onze handen. Het nitrocellulosemembraan van het oorspronkelijke longorgaankweeksysteem bleek een ander effectief schavot te zijn, omdat het met succes de integriteit van de gekweekte long na overdracht in de 3D-bioreactoromgeving handhaafde.
Een derde cruciaal onderdeel van onze strategie zijn de soorten cellen die worden gebruikt om het vat te zaaien. Voor onze amelogenesestudies vertrouwden we op cervicale luscellen bereid uit de continu groeiende muizensnijtanden die werden gecokweekt met tandpulpcellen. Cervicale luscellen werden gekozen als de bron van de oorspronkelijke glazuurorgaanvoorlopers die voortdurend worden vernieuwd in de knaagdier snijtand. De snijtand van de muis of rat is een opmerkelijke bron van stam- en voorlopercellen die gedurende het hele leven van het dier blijft bestaan, terwijl de cellen van het glazuurorgaan worden aangevuld voor continue uitbarsting en amelogenese23,30. Zowel parodontale voorlopercellen als tandpulpcellen werden gebruikt als co-kweekcelbronnen. Het gebruik van mesenchymale co-kweekcelpopulaties voor de succesvolle kweek van epitheelcellen is goed ingeburgerd31,32. In onze studies waren tandpulpcellen effectiever in het induceren van ameloblastdifferentiatie dan parodontale ligamentvoorlopers, hoewel beide op basis van hun mesenchymale kenmerken geschikt zijn als odontogene en mesenchymale co-kweekkandidaten. Wanneer toegepast op amelogenese, kunnen tandpulpcellen als de natuurlijke tegenhanger van odontogeen epitheel tijdens de ontwikkeling van tanden de juiste epitheliaal-mesenchymale interacties hebben veroorzaakt die geschikt zijn voor de inductie van terminale ameloblastdifferentiatie33,34. Voor de studie van scaffoldinteracties voor parodontale weefseltechnologie waren parodontale voorlopercellen echter bij uitstek geschikt omdat ze aanleiding geven tot volledig gedifferentieerde parodontale ligamentfibroblasten25,35. Ten slotte vertrouwden we voor de kweek van longorganen in een bioreactoromgeving op ontleedde embryonale muizenlongsegmenten. Procedures om embryonale longorganen te kweken in orgaankweekschalen zijn eerder beschreven36 en een aantal tweedimensionale celkweekmodellen die longepitheelcellen combineren met vasculaire of gladde spiercellen zijn onderzocht 37,38,39. In de huidige studie handhaafde het 3D-bioreactormodel een robuust niveau van oppervlakteactieve secretie met behoud van de integriteit van de kern van het gekweekte weefselblok, waardoor dit model geschikt is voor de studie van milieueffecten op de integriteit van longweefsel.
Het vierde belangrijke aspect van ons model is de toepassing van celtypespecifieke coatings op de steigeroppervlakken om ameloblastachtige celdifferentiatie te activeren. In het bijzonder kwamen componenten zoals LRAP en glazuurmatrix naar voren als belangrijke bijdragende factoren voor ameloblastachtige celdifferentiatie, omdat een gebrek aan coating met LRAP en initiële glazuurmatrix de vorming van langwerpige en gepolariseerde cellen verbood. Samen biedt de coating van steigeroppervlakken een krachtig hulpmiddel om de weefselspecifieke differentiatie van complexe organen in bioreactoren te bevorderen.
Het belangrijkste aspect van deze studie was het vermogen om de kenmerkende langwerpige en gepolariseerde celvorm van ameloblasten te herstellen. Deze uitkomst is een uniek voordeel van het 3D-bioreactorsysteem ten opzichte van de beperkingen van 2D-kweeksystemen die sterk afgeronde glazuur-orgaanderivatencellen bevatten. Deze uitkomst levert verder bewijs voor het voordeel van het gebruik van bioreactortechnologieën bij het kweken van cellen die onverenigbaar zijn met andere kweektechnologieën40. We schrijven het succes van de ameloblast co-kweekstudies toe aan verschillende unieke kenmerken van het roterende bioreactorsysteem, waaronder de continue toevoer van voedingsstoffen, groei- en transcriptiefactoren en zuurstof, evenals het vermogen van individuele cellen om sociale interacties tussen cellen van verschillende afstammingslijnen en ontwikkelingsstadia te aggregeren en te vormen. Hoewel de studies erin slaagden om langwerpige, gepolariseerde en amelogenine afscheidende ameloblastachtige cellen te laten groeien, blijven de hier gekweekte ameloblastachtige cellen geïsoleerd en ging de natuurlijke continuïteit van de ameloblastcelrij verloren. In toekomstige toepassingen kunnen ameloblastachtige cellen die met deze technologie zijn gekweekt, worden gebruikt voor glazuurweefseltechnologietoepassingen of als een experimenteel model om aspecten van tandmelogenese samen te vatten.
Concluderend kwam de 3D-bioreactor naar voren als een succesvolle omgeving voor de voortplanting van cervicale lus / tandpulp co-culturen in ameloblasten, voor de groei van parodontale ligamentvoorlopers in gecoate steigers en voor de cultuur van hele longorganen. Op basis van deze gegevens zullen bioreactorgebaseerde technologieën waarschijnlijk naar voren komen als belangrijke voertuigen voor geavanceerde weefseltechnologie of teststrategieën op gebieden zoals tandglazuur, parodontaal en longonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Studies werden genereus ondersteund door subsidies van het National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 en R01-DE027930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -y, Wang, X. -m, Li, X. -y An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au - Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
