Summary
Ce protocole présente une méthode pour la culture et la croissance 3D de cellules de type améloblaste en microgravité afin de maintenir leur forme allongée et polarisée ainsi que l’expression protéique spécifique de l’émail. Les conditions de culture pour la culture de constructions d’ingénierie parodontale et d’organes pulmonaires en microgravité sont également décrites.
Abstract
La gravité est l’un des principaux déterminants de la fonction cellulaire humaine, de la prolifération, de l’architecture et de l’orientation du cytosquelette. Les systèmes de bioréacteurs rotatifs (RCCS) imitent la perte de gravité telle qu’elle se produit dans l’espace et fournissent plutôt un environnement de microgravité grâce à une rotation continue de cellules ou de tissus en culture. Ces RCCS assurent un approvisionnement ininterrompu en nutriments, en facteurs de croissance et de transcription et en oxygène, et corrigent certaines des lacunes des forces gravitationnelles dans les boîtes de culture cellulaire ou d’organe 2D immobiles (bidimensionnelles). Dans la présente étude, nous avons utilisé des RCCS pour co-cultiver des cellules de l’anse cervicale et des cellules de pulpe dentaire pour devenir des améloblastes, pour caractériser les interactions progéniteur parodontal/échafaudage et pour déterminer l’effet de l’inflammation sur les alvéoles pulmonaires. Les environnements RCCS ont facilité la croissance de cellules de type améloblaste, favorisé la prolifération des progéniteurs parodontaux en réponse aux revêtements d’échafaudage et permis d’évaluer les effets des changements inflammatoires sur les alvéoles pulmonaires en culture. Ce manuscrit résume les conditions environnementales, les matériaux et les étapes du processus et met en évidence les aspects critiques et les détails expérimentaux. En conclusion, les RCCS sont des outils innovants pour maîtriser la culture et la croissance 3D (tridimensionnelle) de cellules in vitro et pour permettre l’étude de systèmes cellulaires ou d’interactions non adaptés aux environnements de culture 2D classiques.
Introduction
La gravité affecte tous les aspects de la vie sur Terre, y compris la biologie des cellules individuelles et leur fonction au sein des organismes. Les cellules détectent la gravité à travers les mécanorécepteurs et réagissent aux changements de gravité en reconfigurant les architectures du cytosquelette et en modifiant la division cellulaire 1,2,3. D’autres effets de la microgravité comprennent la pression hydrostatique dans les vésicules remplies de liquide, la sédimentation des organites et la convection du flux et de la chaleurinduite par la flottabilité 4. Des études sur l’effet de la perte de gravité sur les cellules et les organes humains ont été menées à l’origine pour simuler l’environnement en apesanteur de l’espace sur les astronautes lors de missions de vol spatial5. Cependant, ces dernières années, ces technologies de bioréacteurs 3D développées à l’origine par la NASA pour simuler la microgravité sont devenues de plus en plus pertinentes en tant que nouvelles approches pour la culture de populations cellulaires qui ne se prêtent pas autrement aux systèmes de culture 2D.
Les bioréacteurs 3D simulent la microgravité en cultivant des cellules en suspension et créent ainsi un effet de « chute libre » constant. Parmi les autres avantages des bioréacteurs rotatifs, citons l’absence d’exposition à l’air rencontrée dans les systèmes de culture d’organes, une réduction de la contrainte de cisaillement et de la turbulence, et une exposition continue à un approvisionnement changeant en nutriments. Ces conditions dynamiques fournies par un bioréacteur RCCS (Rotary Cell Culture System) favorisent la colocalisation spatiale et l’assemblage tridimensionnel de cellules individuelles en agrégats 6,7.
Des études antérieures ont démontré les avantages d’un bioréacteur rotatif pour la régénération osseuse8, la culture de germes dentaires9 et pour la culture de cellules folliculaires dentaires humaines10. Il y a également eu un rapport suggérant que le RCCS améliore la prolifération et la différenciation des cellules EOE en améloblastes11. Cependant, les cellules différenciées ont été considérées comme des améloblastes en fonction de l’immunofluorescence de l’améloblastine et/ou de l’expression de l’amélogénine seule11 sans tenir compte de leur morphologie allongée ou de la forme polarisée des cellules.
En plus du bioréacteur RWV (rotating wall vessel) développé par la NASA, d’autres technologies permettant de générer des agrégats 3D à partir de cellules comprennent la lévitation magnétique, la machine de positionnement aléatoire (RPM) et le clinostat12. Pour obtenir une lévitation magnétique, les cellules marquées avec des nanoparticules magnétiques sont en lévitation à l’aide d’une force magnétique externe, ce qui entraîne la formation de structures 3D sans échafaudage qui ont été utilisées pour la biofabrication de structures adipocytaires13,14,15. Une autre approche pour simuler la microgravité est la génération de forces G multidirectionnelles en contrôlant la rotation simultanée autour de deux axes, ce qui entraîne une annulation du vecteur de gravité cumulé au centre d’un dispositif appelé clinostat16. Lorsque des cellules souches de moelle osseuse ont été cultivées dans un clinostat, la formation de nouveaux os a été inhibée par la suppression de la différenciation des ostéoblastes, illustrant l’un des effets dédifférenciateurs de la microgravité16.
Les systèmes in vitro visant à faciliter la culture fidèle des améloblastes constitueraient un grand pas en avant vers l’ingénierie tissulaire de l’émaildentaire 17. Malheureusement, à ce jour, la culture des améloblastes a été une entreprise difficile18,19. Jusqu’à présent, cinq lignées cellulaires différentes de type améloblaste ont été signalées, y compris la lignée cellulaire améloblaste de souris (ALC), la lignée cellulaire épithéliale dentaire de rat (HAT-7), la lignée cellulaire LS8 de souris20, la lignée cellulaire porcine PABSo-E 21 et la lignée cellulaire SF2-24 de rat22. Cependant, la majorité de ces cellules ont perdu leur forme cellulaire polarisée distinctive en culture 2D.
Dans la présente étude, nous nous sommes tournés vers un système de bioréacteur de culture cellulaire rotative (RCCS) pour faciliter la croissance de cellules de type améloblaste à partir d’épithéliums de l’anse cervicale co-cultivées avec des progéniteurs mésenchymateux et pour surmonter les défis des systèmes de culture 2D, y compris la réduction du flux de nutriments et les changements cytosquelettiques dus à la gravité. De plus, le RCCS a fourni de nouvelles avenues pour l’étude des interactions cellule/échafaudage liées à l’ingénierie des tissus parodontaux et pour examiner les effets des médiateurs inflammatoires sur les tissus alvéolaires pulmonaires in vitro. Ensemble, les résultats de ces études mettent en évidence les avantages des systèmes de culture rotatoire basés sur la microgravité pour la propagation de l’épithélium différencié et pour l’évaluation des effets environnementaux sur les cellules cultivées in vitro, y compris les interactions cellule/échafaudage et la réponse tissulaire aux conditions inflammatoires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les approbations institutionnelles nécessaires ont été obtenues pour s’assurer que l’étude était conforme aux lignes directrices institutionnelles de TAMU en matière de soins aux animaux.
1. Assemblage et stérilisation du bioréacteur
- Stériliser quatre récipients à rapport d’aspect élevé (HARV) pour le bioréacteur dans un autoclave sur le cycle d’instrument en plastique pendant 20 minutes à 121 ° C comme recommandé par le fabricant.
- Après stérilisation, assembler les récipients dans une hotte de culture cellulaire en serrant les vis fournies avec le bioréacteur après quoi les récipients sont prêts à l’emploi.
2. Échafaudages utilisés pour l’expérience de co-culture du bioréacteur
- Incuber les échafaudages avec les cellules pour fournir un soutien à la fixation cellulaire nécessaire à la croissance ultérieure.
- Choisissez parmi les échafaudages à base de PGA, les échafaudages d’hydroxyapatite, les feuilles de graphène, les disques de gélatine et les échafaudages à base de collagène pour les études de co-culture.
3. Dissection de l’anse cervicale (CL) et préparation unicellulaire
- Sacrifier des souris par décapitation à la suite d’un arrêt respiratoire par surdose de CO2 .
NOTE: Toutes les études sur les animaux sont conformes aux lignes directrices institutionnelles de TAMU sur les soins aux animaux. - Disséquer les anses cervicales de souris 6 jours postnatales (NPD) en suivant une version modifiée d’un protocole23 publié précédemment.
REMARQUE: Dans notre étude, la partie distale de la boucle cervicale non représentée dans le protocole publié précédemment est incluse (Figure 3).- Laver le tissu disséqué avec du PBS stérile froid avant la digestion avec de la collagénase dispase à 37 °C pendant 30 minutes.
- Passer la solution dans une crépine à cellules stériles de 70 μm et centrifuger à 800 x g pendant 10 minutes.
- Jetez le surnageant. Centrifuger la pastille et laver deux fois avec du PBS froid à 800 x g. Jetez le surnageant.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajouter 1 X 105 cellules par vaisseau.
4. Culture cellulaire de pulpe dentaire et expansion de lignée cellulaire
- Plaquettes pulpaires dentaires dans une plaque de culture tissulaire de 100 mm au passage 4 à une concentration de 1 x 105.
- Préparer les milieux pour la culture constitués de milieux DMEM à haute teneur en glucose, complétés par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % d’antibiotiques/antimycotiques (P/S).
- Lorsque les cellules atteignent 85-90% de confluence, aspirez le milieu et lavez les plaques deux fois avec du PBS préchauffé.
- Après le lavage du PBS, ajouter une solution préchauffée de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la plaque et incuber les plaques contenant des cellules de pulpe dentaire à 37 °C pendant 3 minutes.
- Confirmer le détachement des cellules par inspection visuelle à l’aide d’un microscope.
- Prélever le milieu avec les cellules de la plaque de culture et transférer via une pipette de 25 ml dans un tube conique stérile de 50 ml.
- Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 8 minutes et jeter le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un milieu frais et comptez à l’aide d’un hémocytomètre.
- Pour la co-culture avec des cellules de l’anse cervicale, ensemencer les cellules de la pulpe dentaire dans le bioréacteur à une concentration de 1 x 104 par récipient.
5. Co-culture de cellules de l’anse cervicale / de la pulpe dentaire sur un échafaudage dans le bioréacteur RCCS
- Ajouter les deux types de cellules, la boucle cervicale et la pulpe dentaire au milieu de culture contenant des milieux SFM kératinocytaires avec des facteurs de croissance supplémentés, des protéines de matrice extracellulaire et des échafaudages.
REMARQUE : Les facteurs de croissance sont ajoutés à une concentration de 0,03 μg/mL de protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP 2), 0,03 μg/mL de protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP-4), 10 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes recombinants humains (FGFh) et 15 ng/mL de facteur de croissance épidermique (hEGF), tandis que les composants ECM comprenaient 200 μg/mL de matrigel, 5 μg/mL de laminine et 5 μg/mL de fibronectine. - Enduisez les échafaudages d’un mélange de 500 μL de gel de collagène enrichi de 1 mg de peptide LRAP (peptide d’amélogénine riche en leucine), 1 mg de matrice d’émail lyophilisée à un stade précoce préparé à partir de dents de porc24, 5 μg/mL de laminine et 5 μg/mL de fibronectine.
REMARQUE: Cela a mieux fonctionné pour nos expériences. - Après le revêtement d’échafaudage, ajouter les deux cellules et l’échafaudage au bioréacteur et remplir le bioréacteur avec 10 ml de milieu par cuve.
- Fermez le bouchon de l’orifice de remplissage de la cuve du bioréacteur après l’ajout de milieux, de cellules et d’échafaudages.
- Fixez les valves stériles aux orifices de seringue au début de l’expérience et maintenez-les en place avec un couvercle jusqu’à la fin de l’expérience.
- Une fois que le récipient est rempli à 90% et que les bouchons d’orifice de remplissage sont fermés et serrés, ouvrez les vannes stériles.
- Utilisez deux seringues stériles (3 ml) chaque fois qu’un changement de média est nécessaire. Remplissez une seringue avec du milieu frais pendant que l’autre seringue est laissée vide.
- Ouvrez les deux valves de la seringue et manœuvrez doucement les bulles vers l’orifice de la seringue vide.
- Une fois que le milieu frais de la seringue pleine est soigneusement injecté dans le récipient, retirez les bulles par l’orifice de la seringue vide.
REMARQUE: Cette procédure est effectuée jusqu’à ce que toutes les microbulles soient retirées des vaisseaux. - Fermez les orifices de seringue avec des bouchons et jetez-les dans un conteneur à déchets pour objets tranchants.
- Fixez chaque récipient à la base du rotateur et placez la base du rotateur dans un incubateur à 5 % de CO2 et à 37 °C de température.
- Allumez l’alimentation et réglez la vitesse de rotation sur 10,1 tr/min.
NOTA : Ajustez la vitesse pour vous assurer que les échafaudages sont en suspension sans toucher la paroi du navire. - Pour le changement de média, placez les vaisseaux en position verticale pour vous assurer que les cellules se déposent au fond. Ouvrez les orifices de seringue et connectez les seringues stériles aux orifices.
- Suivez la même procédure en aspirant 75% du milieu appauvri en nutriments et en injectant du milieu frais par l’autre port.
6. Préparation d’organes pulmonaires et culture à base de bioréacteur
NOTE: Les bébés souris de type sauvage E15 ont été utilisés pour la préparation des organes pulmonaires.
- Disséquer le tissu pulmonaire après avoir euthanasié une souris femelle enceinte asphyxiée au CO2 .
- Une fois le décès confirmé suite à une asphyxie par luxation cervicale, utilisez un scalpel pour exposer la cavité thoracique. Par la suite, retirez les chiots de l’utérus et euthanasiez-les par décapitation.
- Après l’euthanasie, préparez la cavité thoracique en l’ouvrant avec un scalpel pour localiser les poumons. Lavez de minuscules segments de tissu pulmonaire avec du PBS stérile et placez-le sur une membrane préstérilisée pendant 2 heures avec un milieu de culture d’organes dans un incubateur contenant 5% de CO2 et 37 ° C de température.
- Une fois que les tissus pulmonaires se sont attachés à la membrane dans une plaque de culture d’organes 2D, transférez les échantillons dans la cuve du bioréacteur.
- Préparer les médias à la culture.
REMARQUE : Le milieu témoin DMEM à haute teneur en glucose contient 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), une solution antibiotique à 1 % (P/S) (pénicilline, 100 U/mL, streptomycine, 50 μg/mL) et 100 μg/mL d’acide ascorbique (AA) et pour l’induction de conditions inflammatoires, le milieu témoin est complété par 5 ng/mL de protéine IL-6. - Effectuer l’expérience de culture pulmonaire pendant 10 jours avec un changement de milieu toutes les 48 heures dans le bioréacteur comme décrit ci-dessus.
7. Échafaudage recouvert d’une culture cellulaire du ligament parodontal humain (hPDL)
- Culture de cellules ligamentaires parodontales humaines.
NOTE: Les cellules sont isolées et cultivées dans notre laboratoire selon le protocole précédemment publié25. - Enduisez les disques d’échafaudage de collagène avec 30 μL de PBS pour le groupe témoin et le neuropeptide galanine (GAL) à une concentration de 10-8 pendant la nuit.
- Ensemencer les cellules PDL humaines sur l’échafaudage témoin et recouvert de GAL pendant 2 heures à 37 °C dans une plaque de culture, et transférer les échafaudages ensemencés dans une cuve de bioréacteur comme mentionné ci-dessus.
- Culture des échafaudages ensemencés cellulaires pendant 14 jours dans le bioréacteur avant de récolter les échafaudages pour analyse.
8. Nettoyage et entretien des bioréacteurs
- Une fois les échafaudages/cellules récoltés dans le bioréacteur, retirez les orifices de la cuve.
NOTE: Les vis autour des récipients sont enlevés et le récipient est lavé doucement avec de l’eau savonneuse. - Rincez les récipients à l’eau claire et serrez à nouveau les vis.
- Entreposer les récipients après l’autoclavage jusqu’à la prochaine utilisation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La chambre intérieure du bioréacteur fournit un environnement permettant aux cellules de proliférer et de se différencier, de s’attacher à un échafaudage ou de se rassembler pour former des assemblages tissulaires. Chaque vaisseau HARV contient jusqu’à 10 ml de milieu et facilite une circulation constante des nutriments afin que chaque cellule ait une excellente chance de survivre. La figure 1A illustre la fixation des orifices de seringue à la plaque avant du récipient où sont fixées des valves stériles à guichet unique. Ces vannes agissent comme des portiers de la chambre de culture. Le changement de milieu nécessite l’ouverture de la valve du robinet d’arrêt pour faciliter la fixation d’une seringue stérile contenant du milieu frais. L’environnement de microgravité à l’intérieur du bioréacteur permet aux cellules de se fixer à l’échafaudage à l’intérieur de la cuve sans nécessiter d’ensemencement préalable sur les échafaudages. L’échafaudage (Figure 1B et 1C) placé dans le bioréacteur tourne continuellement, ce qui permet aux cellules de se fixer aux surfaces de l’échafaudage et de former des réseaux cytosquelettiques. La membrane oxygénatrice au fond de la plaque vasculaire (Figure 1B) permet un échange gazeux continu pour améliorer la survie et la longévité des cellules.
Différents échafaudages ont été testés pour identifier l’échafaudage le plus compatible avec les cellules. L’échafaudage des figures 2A et 2B est une feuille de graphène composée de 75% de graphène et de 25% de PLG (glycolure polylactique). Cet échafaudage électriquement conducteur est fréquemment utilisé pour les cellules qui peuvent nécessiter une stimulation électrique, telles que les cellules musculaires squelettiques26. Dans nos études, l’échafaudage de collagène a surpassé toutes les autres études testées en termes de biocompatibilité, de promotion de la croissance tissulaire et de différenciation cellulaire. La surface poreuse spécialisée de cet échafaudage à base de collagène (Figure 2C et 2D) permet aux cellules et aux nutriments de circuler dans l’échafaudage, augmentant ainsi la zone de fixation cellulaire et la prolifération cellulaire.
La position de la crête cervicale par rapport à la mandibule de la souris est illustrée aux figures 3A et 3B. Pour préparer les cellules de l’anse cervicale de l’incisive de souris, une mandibule de souris squelettée a été disséquée et la partie la plus distale de l’incisive inférieure de la souris a été exposée. La position précise de la boucle cervicale réséquée est délimitée dans l’incisive de souris postnatale de 6 jours (Figure 3B), tandis qu’une région similaire dans une mandibule de souris squelettée adulte est fournie comme référence à la figure 3A à des fins d’orientation. La zone de la boucle cervicale correspondante chez l’adulte squeletté (Figure 3A) et l’incisive de souris fraîchement préparée à 6 dpn est encadrée par deux lignes brisées (Figure 3A et B). La dentition des hémimandibules est composée de trois molaires mandibulaires et d’une incisive à croissance continue, tandis que la niche cellulaire de la crête cervicale est composée d’une population cellulaire mixte impliquée dans la formation de l’émail comme l’épithélium interne de l’émail, l’épithélium externe de l’émail, le réticulum étoilé et la strate intermédiaire19.
La figure 4 se concentre sur la différenciation réussie des cellules de l’anse cervicale en cellules allongées, polarisées, sécrétant des protéines d’émail de type améloblaste. Les données ont révélé que la différenciation réussie des cellules allongées, polarisées, sécrétant des protéines d’émail sécrétant des améloblastes nécessite la co-culture des cellules de l’anse cervicale avec des cellules souches mésenchymateuses telles que les cellules souches de la pulpe dentaire. Les cellules en culture ont bénéficié d’un microenvironnement adapté tel que décrit à l’étape 3 du protocole, ce qui a entraîné la formation de cellules polarisées avec le noyau à une extrémité et un long processus cellulaire à l’autre27, une caractéristique typique des améloblastes (Figure 4A). L’application de milieux seuls et sans facteurs de croissance et/ou revêtement d’échafaudage a donné lieu à des cellules de l’anse cervicale qui sécrétaient des protéines clés de l’émail, mais qui ne s’allongeaient pas ou ne se polarisaient pas (figure 4B).
Des échafaudages de collagène enrobés et non enrobés de galanine ont été placés dans un bioréacteur avec des cellules hPDL pendant quatorze jours dans un bioréacteur. Les cellules ont survécu à une période de culture de deux semaines dans le système de culture 3D et le groupe d’échafaudage recouvert de galanine a démontré un taux de prolifération significativement plus élevé (Figure 5B) que le groupe témoin contenant des échafaudages non revêtus (Figure 5A). Les cellules du groupe expérimental ont également démontré un niveau significativement plus élevé de matrice extracellulaire contenant des fibres de tissu conjonctif par rapport au groupe témoin.
L’environnement du bioréacteur s’est avéré efficace pour la croissance des segments pulmonaires dans un environnement de microgravité 3D (Figure 6). Pour cette étude, des segments de tissu pulmonaire prélevés sur des souris E15 (figure 6C) ont été placés sur une membrane de nitrocellulose dans une boîte de culture d’organes pendant deux heures. Après la fixation initiale des tissus à la membrane, le composite tissu pulmonaire/membrane nitrocellulaire a été placé dans la cuve du bioréacteur et a été cultivé avec succès pendant 10 jours (figure 6A). Pour étudier les effets des affections inflammatoires sur la croissance du tissu pulmonaire, l’ajout d’IL-6 au milieu de culture a entraîné des changements typiques de la morphologie alvéolaire associés à l’inflammation similaires à ceux observés in vivo (Figure 6B).
Graphique 1. Composants d’une cuve de bioréacteur. La figure 1 illustre les composants clés d’une cuve de bioréacteur et leur position à l’étape du préassemblage. (A) Position relative de la chambre du réacteur, des orifices et de l’échafaudage. (B) Position semi-ouverte de la plaque avant (couvercle transparent) et de la plaque arrière (plaque blanche recouverte d’une membrane oxygénateur). L’échafaudage est positionné au centre entre la plaque avant et arrière. L’échafaudage en graphène de couleur noire (C) illustre comment un échafaudage est placé dans le vaisseau et utilisé comme support pour que les cellules prolifèrent, se différencient et forment un réseau cellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Illustrations représentatives d’échafaudages testés dans cette étude. Cinq échafaudages ont été testés pour nos études sur les bioréacteurs, dont deux exemples sont présentés ici. (A, B) représente l’échafaudage de graphène testé pour la croissance cellulaire de type améloblaste, tandis que (C, D) représente l’échafaudage de collagène le plus réussi pour nos études de culture cellulaire basées sur des bioréacteurs. Notez la structure poreuse de l’échafaudage de collagène (C, D) par rapport au réseau parallèle de reliefs de surface dans l’échafaudage de graphène (A, B). (A,C) sont des macrographes prises d’une perspective perpendiculaire tandis que (B,D) ont été imagées à un angle de 45°. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Préparation de la boucle cervicale. La mandibule de souris adulte squelettée dans A montre la région de la boucle cervicale utilisée pour préparer la niche cellulaire à la culture cellulaire et à la différenciation de type améloblaste. Cette macrographe illustre également la position des marqueurs anatomiques, y compris l’incisive (inc) en croissance continue couvrant presque toute la longueur mandibulaire, la première molaire mandibulaire (m1) ainsi que l’angle de la mandibule, le processus coronoïde et la position du condyle mandibulaire. Cette préparation squelettique sert d’orientation anatomique pour la région de l’anse cervicale préparée en (B). Les points de référence comprennent l’os mandibulaire (mand), le tissu de la papille dentaire (DP), l’angle de la mandibule (Angle) et la position de la boucle cervicale (CL) à partir de laquelle les cellules de nos études sur le bioréacteur d’ameloblast ont été récoltées. La ligne brisée indique la partie antérieure et distale de la fenêtre mandibulaire fenestrée préparée pour la dissection de l’anse cervicale dans la mandibule adulte squelettée (A) et dans la mandibule 6 dpn fraîchement disséquée (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 4. Génération de cellules de type améloblaste à l’aide d’une approche de co-culture 3D. (A) Différenciation réussie de cellules de type améloblaste de cellules de l’anse cervicale co-cultivées avec des cellules souches de pulpe dentaire dans un microenvironnement approprié. La population cellulaire résultante était composée de cellules longues, allongées et polarisées capables de sécréter des protéines de la matrice de l’émail. Ces cellules présentaient un noyau à une extrémité (nucl) et un processus cellulaire (proc) ressemblant au processus Tomes observé dans les améloblastes vrais à l’autre extrémité (A). (B) illustre une population de cellules du groupe témoin qui ont également été soumises à des conditions de co-culture mais avec des milieux exempts de facteurs de croissance ou d’agents de différenciation, ce qui a donné des cellules arrondies non représentatives des améloblastes typiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 5. Culture 3D à long terme d’une population monocellulaire de progéniteurs parodontaux (pdl) avec des surfaces d’échafaudage enrobées et non revêtues. Le revêtement d’échafaudage a entraîné une augmentation du taux de prolifération des cellules hPDL dans les cellules cultivées sur l’échafaudage recouvert de galanine (B) par rapport aux cellules du groupe témoin exposées à un échafaudage non revêtu (A). Les cellules du groupe expérimental ont également sécrété plus de matrice extracellulaire contenant des fibres de tissu conjonctif par rapport au groupe témoin (B contre A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 6. Culture de tissus pulmonaires dans un bioréacteur. (A) Segments de tissu pulmonaire E15 cultivés sur une membrane de nitrocellulose dans un bioréacteur pendant dix jours. (B) Segments de tissu pulmonaire E15 similaires à (A) mais soumis à des conditions inflammatoires en ajoutant de l’IL-6 au milieu (B). (C) Coupe de paraffine d’un tissu pulmonaire E15 fraîchement disséqué coloré avec H&E. Notez les similitudes dans les morphologies cellulaires alvéolaires de type I et de type II lors de la comparaison (A) et (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les étapes critiques du protocole pour la croissance des cellules en microgravité comprennent le bioréacteur, l’échafaudage, les cellules utilisées pour la culture 3D et le revêtement d’échafaudage comme moyen d’induire la différenciation cellulaire. Le type de bioréacteur utilisé dans nos études comprend le bioréacteur RCCS-4, une modification récente du dispositif de culture tissulaire cylindrique rotatif original Rotary Cell Culture System (RCCS) développé par la NASA pour cultiver des cellules en microgravité simulée. Cet environnement RCCS-4 fournit des contraintes de cisaillement extrêmement faibles, ce qui améliore le transfert de masse et améliore les performances de culture. Cette version du bioréacteur permettait l’utilisation simultanée de quatre cuves pour quatre expériences différentes en même temps. Le bioréacteur RCCS-4 était équipé de cuves à rapport d’aspect élevé (HARV), ce qui garantissait des conditions de culture simples et directes avec un nombre suffisant de cellules pour nos études.
Un deuxième élément essentiel de notre approche sont les échafaudages, car ils fournissent des modèles pour les cellules flottantes pour attacher et former des assemblages. Alors que l’utilisation d’échafaudages en culture 2D est limitée en raison de la formation de noyaux nécrotiques, la diffusion, le flux d’oxygène et de nutriments améliorés dans un bioréacteur rotatif améliorent l’applicabilité des échafaudages en tant que supports pour la propagation des assemblages cellulaires28,29. Dans la présente étude, nous avons exploré l’efficacité de cinq types d’échafaudages, les échafaudages poly(acide co-glycolique (PLGA), un échafaudage collagène et poreux, un échafaudage de graphène, ainsi qu’un disque de gélatine et un disque d’hydrodroxyapatite. De plus, nous avons transféré la membrane de l’environnement de préculture des organes pulmonaires dans le bioréacteur, avec le segment pulmonaire cultivé qui y est attaché. Parmi ceux-ci, l’échafaudage de collagène est apparu comme l’échafaudage le plus favorable dans nos études, peut-être en raison de sa composition collagène et de sa structure poreuse. L’échafaudage PLGA a donné des cellules viables, tandis que les trois autres échafaudages étaient moins favorables entre nos mains. La membrane de nitrocellulose du système de culture d’organes pulmonaires d’origine s’est avérée être un autre échafaudage efficace, car elle a réussi à maintenir l’intégrité du poumon cultivé après le transfert dans l’environnement du bioréacteur 3D.
Un troisième élément essentiel de notre stratégie sont les types de cellules utilisées pour ensemencer le vaisseau. Pour nos études sur l’amélogenèse, nous nous sommes appuyés sur des cellules de l’anse cervicale préparées à partir d’incisives de souris en croissance continue qui ont été co-cultivées avec des cellules de pulpe dentaire. Les cellules de l’anse cervicale ont été choisies comme source des progéniteurs originaux des organes de l’émail qui sont continuellement renouvelés dans l’incisive du rongeur. L’incisive de souris ou de rat est une source remarquable de cellules souches et progénitrices qui continue d’exister tout au long de la vie de l’animal tandis que les cellules de l’organe de l’émail sont reconstituées pour une éruption continue et une amélogenèse23,30. Les cellules progénitrices parodontales et les cellules pulpaires dentaires ont été utilisées comme sources de cellules de co-culture. L’utilisation de populations de cellules de co-culture mésenchymateuses pour la culture réussie de cellules épithéliales est bien établie31,32. Dans nos études, les cellules de la pulpe dentaire étaient plus efficaces pour induire la différenciation de l’ameloblast que les progéniteurs du ligament parodontal, même si, sur la base de leurs caractéristiques mésenchymateuses, les deux conviennent comme candidats de co-culture odontogènes et mésenchymateuses. Lorsqu’elles sont appliquées à l’amélogenèse, les cellules de la pulpe dentaire en tant que contrepartie naturelle de l’épithélium odontogène pendant le développement de la dent pourraient avoir déclenché les interactions épithéliales-mésenchymateuses appropriées adaptées à l’induction de la différenciation terminale de l’ameloblast33,34. Cependant, pour l’étude des interactions des échafaudages pour l’ingénierie des tissus parodontaux, les progéniteurs parodontaux étaient parfaitement adaptés car ils donnent naissance à des fibroblastes du ligament parodontal complètement différenciés25,35. Enfin, pour la culture d’organes pulmonaires dans un environnement de bioréacteur, nous nous sommes appuyés sur des segments pulmonaires murins embryonnaires disséqués. Les procédures de culture d’organes pulmonaires embryonnaires dans des boîtes de culture d’organes ont été décrites précédemment36 et un certain nombre de modèles de culture cellulaire bidimensionnelle combinant des cellules épithéliales pulmonaires avec des cellules vasculaires ou musculaires lisses ont été explorés37,38,39. Dans la présente étude, le modèle de bioréacteur 3D a maintenu un niveau robuste de sécrétion de surfactant tout en préservant l’intégrité du cœur du bloc tissulaire cultivé, ce qui rend ce modèle approprié pour l’étude des effets environnementaux sur l’intégrité des tissus pulmonaires.
Le quatrième aspect important de notre modèle est l’application de revêtements spécifiques au type cellulaire sur les surfaces de l’échafaudage pour déclencher la différenciation cellulaire de type améloblaste. Plus précisément, des composants tels que le LRAP et la matrice d’émail sont apparus comme des facteurs clés contribuant à la différenciation cellulaire de type améloblaste, car un manque de revêtement avec LRAP et matrice d’émail initiale empêchait la formation de cellules allongées et polarisées. Ensemble, le revêtement des surfaces d’échafaudage fournit un outil puissant pour promouvoir la différenciation tissulaire d’organes complexes dans les bioréacteurs.
L’aspect le plus important de cette étude était la capacité de restaurer la forme cellulaire allongée et polarisée distinctive des améloblastes. Ce résultat est un avantage unique du système de bioréacteur 3D par rapport aux limites des systèmes de culture 2D qui arrondissent les cellules dérivées d’organes de l’émail. Ce résultat fournit des preuves supplémentaires des avantages de l’utilisation de technologies de bioréacteurs lors de la culture de cellules incompatibles avec d’autres technologies de culture40. Nous attribuons le succès des études de co-culture d’ameloblast à plusieurs attributs uniques du système de bioréacteur rotatif, y compris l’approvisionnement continu en nutriments, facteurs de croissance et de transcription et oxygène, ainsi que la capacité des cellules individuelles à agréger et à former des interactions sociales entre les cellules de différentes lignées et stades de développement. Alors que les études ont réussi à développer des cellules allongées, polarisées et sécrétant de l’amélogénine de type améloblaste, les cellules améloblastiques cultivées ici restent isolées et la continuité naturelle de la rangée de cellules de l’ameloblast a été perdue. Dans les applications futures, les cellules de type améloblaste cultivées avec cette technologie pourraient être utilisées pour des applications d’ingénierie tissulaire de l’émail ou comme modèle expérimental pour récapituler les aspects de l’amélogenèse dentaire.
En conclusion, le bioréacteur 3D est apparu comme un environnement réussi pour la propagation des co-cultures de l’anse cervicale / pulpe dentaire dans les améloblastes, pour la croissance des progéniteurs du ligament parodontal dans des échafaudages revêtus et pour la culture d’organes pulmonaires entiers. Sur la base de ces données, les technologies basées sur les bioréacteurs sont susceptibles de devenir des véhicules importants pour l’ingénierie tissulaire avancée ou les stratégies de test dans des domaines tels que l’émail des dents, la parodontie et la recherche pulmonaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les études ont été généreusement soutenues par des subventions de l’Institut national de recherche dentaire et craniofaciale (UG3-DE028869 et R01-DE027930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -y, Wang, X. -m, Li, X. -y An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au - Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
