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Bioengineering

माइक्रोग्रैविटी में दंत और श्वसन कोशिकाओं और अंगों का प्रसार

Published: May 25, 2021 doi: 10.3791/62690
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1, 1
1Center for Craniofacial Research and Diagnosis, Texas A&M College of Dentistry, 2Department of Stomatology, The Fourth Affiliated Hospital, Harbin Medical University, 3Key Laboratory of Oral Medicine, Guangzhou Insititute of Oral Disease, Stomatology Hospital of Guangzhou Medical University

Summary

यह प्रोटोकॉल माइक्रोग्रैविटी में एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं की संस्कृति और 3 डी विकास के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है ताकि उनके लम्बी और ध्रुवीकृत आकार के साथ-साथ तामचीनी-विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति को बनाए रखा जा सके। माइक्रोग्रैविटी में पीरियडोंटल इंजीनियरिंग संरचनाओं और फेफड़ों के अंगों की संस्कृति के लिए संस्कृति की स्थिति भी वर्णित है।

Abstract

गुरुत्वाकर्षण मानव कोशिका समारोह, प्रसार, साइटोस्केलेटल वास्तुकला और अभिविन्यास के प्रमुख निर्धारकों में से एक है। रोटरी बायोरिएक्टर सिस्टम (आरसीसीएस) गुरुत्वाकर्षण के नुकसान की नकल करते हैं क्योंकि यह अंतरिक्ष में होता है और इसके बजाय सुसंस्कृत कोशिकाओं या ऊतकों के निरंतर रोटेशन के माध्यम से एक माइक्रोग्रैविटी वातावरण प्रदान करता है। ये आरसीसीएस पोषक तत्वों, विकास और प्रतिलेखन कारकों और ऑक्सीजन की एक बाधित आपूर्ति सुनिश्चित करते हैं, और गतिहीन 2 डी (दो आयामी) सेल या अंग संस्कृति व्यंजनों में गुरुत्वाकर्षण बलों की कुछ कमियों को संबोधित करते हैं। वर्तमान अध्ययन में हमने आरसीसीएस का उपयोग गर्भाशय ग्रीवा लूप कोशिकाओं और दंत लुगदी कोशिकाओं को एमेलोब्लास्ट बनने के लिए सह-संस्कृति करने, पीरियडोंटल पूर्वज / पाड़ इंटरैक्शन को चिह्नित करने और फेफड़ों के एल्वियोली पर सूजन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया है। आरसीसीएस वातावरण ने एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं के विकास की सुविधा प्रदान की, पाड़ कोटिंग्स के जवाब में पीरियडोंटल पूर्वज प्रसार को बढ़ावा दिया, और सुसंस्कृत फेफड़ों के एल्वियोली पर भड़काऊ परिवर्तनों के प्रभावों के आकलन की अनुमति दी। यह पांडुलिपि पर्यावरणीय परिस्थितियों, सामग्रियों और रास्ते में चरणों को सारांशित करती है और महत्वपूर्ण पहलुओं और प्रयोगात्मक विवरणों पर प्रकाश डालती है। निष्कर्ष में, आरसीसीएस विट्रो में कोशिकाओं की संस्कृति और 3 डी (तीन आयामी) विकास में महारत हासिल करने और सेलुलर सिस्टम या इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति देने के लिए अभिनव उपकरण हैं जो क्लासिक 2 डी संस्कृति वातावरण के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।

Introduction

गुरुत्वाकर्षण पृथ्वी पर जीवन के सभी पहलुओं को प्रभावित करता है, जिसमें व्यक्तिगत कोशिकाओं के जीव विज्ञान और जीवों के भीतर उनके कार्य शामिल हैं। कोशिकाएं मेकेनोसेप्टर्स के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण को महसूस करती हैं और साइटोस्केलेटल आर्किटेक्चर को पुन: कॉन्फ़िगर करके और कोशिका विभाजन 1,2,3 को बदलकर गुरुत्वाकर्षण में परिवर्तन का जवाब देती हैं। माइक्रोग्रैविटी के अन्य प्रभावों में द्रव से भरे पुटिकाओं में हाइड्रोस्टेटिक दबाव, ऑर्गेनेल का अवसादन, और प्रवाहऔर गर्मी के उछाल-संचालित संवहन शामिल हैं। मानव कोशिकाओं और अंगों पर गुरुत्वाकर्षण के नुकसान के प्रभाव पर अध्ययन मूल रूप से अंतरिक्ष उड़ान मिशन5 के दौरान अंतरिक्ष यात्रियों पर अंतरिक्ष के भारहीन वातावरण का अनुकरण करने के लिए आयोजित किया गया था। हालांकि, हाल के वर्षों में, माइक्रोग्रैविटी का अनुकरण करने के लिए नासा द्वारा मूल रूप से विकसित ये 3 डी बायोरिएक्टर प्रौद्योगिकियां सेल आबादी की संस्कृति के लिए नए दृष्टिकोण के रूप में तेजी से प्रासंगिक हो रही हैं जो अन्यथा 2 डी संस्कृति प्रणालियों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं।

3 डी बायोरिएक्टर निलंबन में कोशिकाओं को बढ़ाकर माइक्रोग्रैविटी का अनुकरण करते हैं और इस प्रकार एक निरंतर "फ्री-फॉल" प्रभाव बनाते हैं। घूर्णन बायोरिएक्टर के अन्य लाभों में अंग संस्कृति प्रणालियों में हवा के संपर्क की कमी, कतरनी तनाव और अशांति में कमी और पोषक तत्वों की बदलती आपूर्ति के लिए निरंतर संपर्क शामिल है। रोटरी सेल कल्चर सिस्टम (आरसीसीएस) बायोरिएक्टर द्वारा प्रदान की गई ये गतिशील स्थितियां स्थानिक सह-स्थानीयकरण और एकल कोशिकाओं के तीन-आयामी संयोजन को समुच्चय 6,7 में अनुकूलित करती हैं।

पिछले अध्ययनों ने हड्डी पुनर्जनन 8, दांत रोगाणुसंस्कृति 9, और मानव दंत कूप कोशिकाओंकी संस्कृति के लिए रोटरी बायोरिएक्टर के फायदे का प्रदर्शनकिया है। एक रिपोर्ट यह भी बताती है कि आरसीसीएस ईओई सेल प्रसार और एमेलोब्लास्ट्स11 में भेदभाव को बढ़ाता है। हालांकि, विभेदित कोशिकाओं को उनके लम्बी आकृति विज्ञान या ध्रुवीकृत सेल आकार पर विचार किए बिना अकेले एमेलोब्लास्ट्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस और / या एमेलोजेनिन अभिव्यक्तिके आधार पर एमेलोब्लास्ट माना जाता था।

नासा द्वारा विकसित घूर्णन दीवार वाहिकाओं (आरडब्ल्यूवी) बायोरिएक्टर के अलावा, कोशिकाओं से 3 डी समुच्चय उत्पन्न करने के लिए अन्य तकनीकों में चुंबकीय उत्तोलन, यादृच्छिक स्थिति मशीन (आरपीएम) और क्लिनोस्टेट12 शामिल हैं। चुंबकीय उत्तोलन प्राप्त करने के लिए, चुंबकीय नैनोकणों के साथ लेबल की गई कोशिकाओं को बाहरी चुंबकीय बल का उपयोग करके ले जाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप पाड़-मुक्त 3 डी संरचनाओं का निर्माण होता है जिनका उपयोग एडिपोसाइट संरचनाओं 13,14,15 के जैव निर्माण के लिए किया जाता है। माइक्रोग्रैविटी का अनुकरण करने का एक और तरीका दो अक्षों के बारे में एक साथ रोटेशन को नियंत्रित करके बहुदिशात्मक जी बलों की पीढ़ी है जिसके परिणामस्वरूप क्लिनोस्टेट16 नामक डिवाइस के केंद्र में संचयी गुरुत्वाकर्षण वेक्टर को रद्द कर दिया जाता है। जब अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं को एक क्लिनोस्टेट में सुसंस्कृत किया गया था, तो ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव के दमन के माध्यम से नई हड्डी के गठन को रोक दिया गया था, जो माइक्रोग्रैविटी16 के विभेदक प्रभावों में से एक को दर्शाता है।

इन विट्रो सिस्टम एमेलोब्लास्ट्स की वफादार संस्कृति को सुविधाजनक बनाने के लिए दांत तामचीनी ऊतक इंजीनियरिंग की ओर एक बड़ा कदम प्रदानकरेंगे। दुर्भाग्यवश, आज तक, एमेलोब्लास्ट्स की संस्कृति एक चुनौतीपूर्णउपक्रम रहा है। अब तक, पांच अलग-अलग एमेलोब्लास्ट जैसी सेल लाइनों की सूचना मिली है, जिसमें माउस एमेलोब्लास्ट-वंश सेल लाइन (एएलसी), चूहे दंत उपकला कोशिका रेखा (एचएटी -7), माउस एलएस 8 सेल लाइन20, पोर्सिन पीएबीएसओ-ई सेल लाइन21 और चूहा एसएफ 2-24 सेल लाइन22 शामिल हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश कोशिकाओं ने 2 डी संस्कृति में अपने विशिष्ट ध्रुवीकृत सेल आकार को खो दिया है।

वर्तमान अध्ययन में हमने मेसेनकाइमल पूर्वजों के साथ सह-संवर्धित ग्रीवा लूप एपिथेलिया से एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं के विकास को सुविधाजनक बनाने और गुरुत्वाकर्षण के कारण पोषक तत्वों के कम प्रवाह और साइटोस्केलेटल परिवर्तनों सहित 2 डी कल्चर सिस्टम की चुनौतियों को दूर करने के लिए एक रोटरी सेल कल्चर बायोरिएक्टर सिस्टम (आरसीसीएस) की ओर रुख किया है। इसके अलावा, आरसीसीएस ने पीरियडोंटल ऊतक इंजीनियरिंग से संबंधित सेल / पाड़ इंटरैक्शन के अध्ययन और विट्रो में फेफड़ों के वायुकोशीय ऊतकों पर भड़काऊ मध्यस्थों के प्रभावों की जांच करने के लिए नए रास्ते प्रदान किए हैं। साथ में, इन अध्ययनों के परिणाम विभेदित एपिथेलिया के प्रसार के लिए माइक्रोग्रैविटी-आधारित रोटेटरी कल्चर सिस्टम के लाभों को उजागर करते हैं और विट्रो में उगाए गए कोशिकाओं पर पर्यावरणीय प्रभावों के आकलन के लिए, जिसमें सेल / पाड़ इंटरैक्शन और भड़काऊ स्थितियों के लिए ऊतक प्रतिक्रिया शामिल है।

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Protocol

यह सुनिश्चित करने के लिए सभी आवश्यक संस्थागत अनुमोदन प्राप्त किए गए थे कि अध्ययन टीएएमयू संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुपालन में था।

1. बायोरिएक्टर असेंबली और नसबंदी

  1. निर्माता द्वारा अनुशंसित 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए प्लास्टिक उपकरण चक्र पर एक ऑटोक्लेव में बायोरिएक्टर के लिए चार उच्च पहलू अनुपात वाहिकाओं (एचएआरवी) को निष्फल करें।
  2. नसबंदी के बाद, बायोरिएक्टर के साथ प्रदान किए गए शिकंजे को कसकर एक सेल कल्चर हुड में वाहिकाओं को इकट्ठा करें, जिसके बाद वाहिकाएं उपयोग करने के लिए तैयार हैं।

2. बायोरिएक्टर सह-संस्कृति प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले मचान

  1. आगे के विकास के लिए आवश्यक सेल अटैचमेंट के लिए सहायता प्रदान करने के लिए कोशिकाओं के साथ मचानों को इनक्यूबेट करें।
  2. सह-संस्कृति अध्ययन के लिए पीजीए आधारित मचानों, हाइड्रॉक्सीपैटाइट मचानों, ग्राफीन शीट्स, जिलेटिन डिस्क और कोलेजन आधारित मचानों में से चुनें।

3. सर्वाइकल लूप (सीएल) विच्छेदन और एकल कोशिका तैयारी

  1. सीओ2 ओवरडोज द्वारा श्वसन गिरफ्तारी के बाद चूहों का बलिदान।
    नोट: सभी पशु अध्ययन टीएएमयू संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुपालन में हैं।
  2. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल23 के संशोधित संस्करण के बाद 6 दिन के प्रसवोत्तर (डीपीएन) चूहों से ग्रीवा लूप का विच्छेदन करें।
    नोट: हमारे अध्ययन में, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल में नहीं दिखाए गए ग्रीवा लूप के डिस्टल हिस्से को शामिल किया गया है (चित्रा 3)।
    1. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोलेजनेज डिस्पेज़ के साथ पाचन से पहले ठंडे बाँझ पीबीएस के साथ विच्छेदित ऊतक को धोएं।
  3. घोल को 70 μm बाँझ सेल छन्नी के माध्यम से पारित करें और 10 मिनट के लिए 800 x g पर आगे सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। पेलेट को सेंट्रीफ्यूज करें और 800 x g पर ठंडे पीबीएस के साथ दो बार धोएं। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
  5. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और प्रति पोत 1 x 105 कोशिकाएं जोड़ें।

4. दंत लुगदी सेल संस्कृति और सेल लाइन विस्तार

  1. 1 x 105 की एकाग्रता पर मार्ग 4 पर 100 मिमी ऊतक संवर्धन प्लेट में प्लेट दंत लुगदी कोशिकाएं।
  2. डीएमईएम उच्च ग्लूकोज मीडिया से युक्त संस्कृति के लिए मीडिया तैयार करें, जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 1% एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक (पी / एस) के साथ पूरक है।
  3. जब कोशिकाएं 85-90% संगम तक पहुंच जाती हैं, तो माध्यम को एस्पिरेट करें और प्लेटों को पूर्व-गर्म पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  4. पीबीएस धोने के बाद, प्लेट में एक पूर्व-गर्म 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान जोड़ें, और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर दंत लुगदी सेल युक्त प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  5. माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दृश्य निरीक्षण द्वारा सेल डिटेचमेंट की पुष्टि करें।
  6. कल्चर प्लेट से कोशिकाओं के साथ मीडिया एकत्र करें और 25 एमएल पिपेट के माध्यम से 50 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. कोशिकाओं को 8 मिनट के लिए 800 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। ताजा मीडिया में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती करें।
  8. ग्रीवा लूप कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति के लिए, बायोरिएक्टर में दंत लुगदी कोशिकाओं को 1 x 104 प्रति पोत की एकाग्रता पर बीज दें।

5. आरसीसीएस बायोरिएक्टर के भीतर एक मचान पर ग्रीवा लूप / दंत लुगदी कोशिकाओं की सह-संस्कृति

  1. पूरक विकास कारकों, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और मचानों के साथ केराटिनोसाइट एसएफएम मीडिया युक्त संस्कृति माध्यम में दोनों सेल प्रकार, ग्रीवा लूप और दंत लुगदी जोड़ें।
    नोट: विकास कारकों को 0.03 μg / mL हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन 2 (BMP 2), 0.03 μg / mL हड्डी मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4 (BMP-4), 10 ng / mL मानव पुनः संयोजक फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (hFGF) और 15 ng / mL एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (hEGF) की एकाग्रता पर जोड़ा जाता है, जबकि ईसीएम घटकों में 200 μg / mL matrigel, 5 μg / mL matrigel, 5 μg / mL फाइब्रोनेक्टिन शामिल हैं।
  2. 1 मिलीग्राम एलआरएपी (ल्यूसीन युक्त एमेलोजेनिन पेप्टाइड) पेप्टाइड, 1 मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड प्रारंभिक चरण तामचीनी मैट्रिक्स से समृद्ध कोलेजन जेल के मिश्रण के साथ कोट मचानों को पोर्सिनदांतों से तैयार 24, 5 μg / mL लैमिनिन और फाइब्रोनेक्टिन के 5 μg / mL से समृद्ध किया जाता है।
    नोट: यह हमारे प्रयोगों के लिए सबसे अच्छा काम किया।
  3. पाड़ कोटिंग के बाद, बायोरिएक्टर में कोशिकाओं और मचान दोनों को जोड़ें, और प्रति पोत 10 एमएल माध्यम के साथ बायोरिएक्टर भरें।
  4. मीडिया, कोशिकाओं और मचानों को जोड़ने के बाद बायोरिएक्टर पोत के फिल पोर्ट कैप को बंद करें।
  5. प्रयोग की शुरुआत में बाँझ वाल्व को सिरिंज बंदरगाहों से जोड़ें और प्रयोग के अंत तक उन्हें कवर के साथ रखें।
  6. एक बार जब जहाज 90% भर जाता है और भरण पोर्ट कैप बंद और कस जाते हैं, तो बाँझ वाल्व खोलें।
  7. हर बार मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता होने पर दो बाँझ सिरिंज (3 एमएल) का उपयोग करें। एक सिरिंज को ताजे माध्यम से भरें जबकि दूसरी सिरिंज को खाली छोड़ दिया जाता है।
  8. दोनों सिरिंज वाल्व खोलें और धीरे से खाली सिरिंज बंदरगाह की ओर बुलबुले को पैंतरेबाज़ी करें।
  9. एक बार जब पूर्ण सिरिंज से ताजा माध्यम को बर्तन में सावधानीपूर्वक इंजेक्ट किया जाता है, तो खाली सिरिंज बंदरगाह के माध्यम से बुलबुले हटा दें।
    नोट: यह प्रक्रिया तब तक की जाती है जब तक कि सभी माइक्रोबबल को जहाजों से हटा नहीं दिया जाता है।
  10. सिरिंज बंदरगाहों को कैप के साथ बंद करें और सिरिंज को तेज अपशिष्ट कंटेनर में फेंक दें।
  11. प्रत्येक पोत को घूर्णन आधार से संलग्न करें और 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस तापमान के साथ एक इनक्यूबेटर में रोटेटर बेस रखें।
  12. पावर चालू करें और घूर्णी गति को 10.1 आरपीएम पर सेट करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए गति समायोजित करें कि मचान पोत की दीवार को छूने के बिना निलंबन में हैं।
  13. मीडिया परिवर्तन के लिए, वाहिकाओं को एक सीधी स्थिति में रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोशिकाएं नीचे बस जाएं। सिरिंज पोर्ट खोलें और बाँझ सिरिंज को पोर्ट से कनेक्ट करें।
  14. पोषण-क्षीण माध्यम के 75% को एस्पिरेटेड करके और अन्य बंदरगाह के माध्यम से ताजा माध्यम इंजेक्ट करके उसी प्रक्रिया का पालन करें।

6. फेफड़े के अंग तैयार करना और बायोरिएक्टर आधारित संस्कृति

नोट: फेफड़ों के अंगों की तैयारी के लिए ई 15 जंगली प्रकार के माउस पिल्ले का उपयोग किया गया था।

  1. सीओ2 श्वासावरोध के साथ एक गर्भवती महिला माउस को यूथेनाइज करने के बाद फेफड़ों के ऊतकों को विच्छेदित करें।
    1. एक बार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा श्वासावरोध के बाद मृत्यु की पुष्टि हो जाने के बाद, वक्ष गुहा को उजागर करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। इसके बाद, पिल्ले को गर्भाशय से निकालें और सिर काटकर इच्छामृत्यु करें।
  2. यूथेनाइजेशन के बाद, फेफड़ों का पता लगाने के लिए स्केलपेल के साथ खोलकर थोरैसिक कैविटी तैयार करें। फेफड़ों के ऊतकों के छोटे खंडों को बाँझ पीबीएस के साथ धोएं और इसे 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस तापमान वाले इनक्यूबेटर में अंग संवर्धन माध्यम के साथ2 घंटे के लिए पूर्व-निष्फल झिल्ली पर रखें।
  3. एक बार जब फेफड़े के ऊतक 2 डी अंग संस्कृति प्लेट में झिल्ली से जुड़ जाते हैं, तो नमूनों को बायोरिएक्टर पोत में स्थानांतरित करें।
  4. संस्कृति के लिए मीडिया को तैयार करें।
    नोट: नियंत्रण डीएमईएम उच्च ग्लूकोज मीडिया में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% एंटीबायोटिक समाधान (पी / एस) (पेनिसिलिन, 100 यू / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन, 50 μg / mL) और 100 μg / mL एस्कॉर्बिक एसिड (एए) शामिल हैं और भड़काऊ स्थितियों के प्रेरण के लिए, नियंत्रण माध्यम को 5 ng / mL IL-6 प्रोटीन के साथ पूरक किया जाता है।
  5. ऊपर वर्णित बायोरिएक्टर में हर 48 घंटे में मीडिया परिवर्तन के साथ 10 दिनों के लिए फेफड़ों की संस्कृति प्रयोग करें।

7. मानव पेरियोडोंटल लिगामेंट (एचपीडीएल) सेल कल्चर के साथ लेपित मचान

  1. संस्कृति मानव पीरियडोंटल लिगामेंट कोशिकाएं।
    नोट: कोशिकाओं को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार हमारी प्रयोगशाला में अलग और सुसंस्कृत किया जाताहै।
  2. नियंत्रण समूह के लिए पीबीएस के 30 μL और रात भर 10-8 की एकाग्रता पर न्यूरोपैप्टाइड गैलानिन (जीएएल) के साथ कोलेजन पाड़ डिस्क को कोट करें।
  3. नियंत्रण पर बीज मानव पीडीएल कोशिकाएं और जीएएल एक संस्कृति प्लेट में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पाड़ लेपित करते हैं, और सेल बीज वाले मचानों को ऊपर वर्णित बायोरिएक्टर पोत में स्थानांतरित करते हैं।
  4. विश्लेषण के लिए मचानों की कटाई से पहले बायोरिएक्टर में 14 दिनों के लिए कोशिका बीज वाले मचानों की संस्कृति करें।

8. बायोरिएक्टर सफाई और रखरखाव

  1. बायोरिएक्टर से मचानों / कोशिकाओं की कटाई के बाद, पोत से सिरिंज बंदरगाहों को हटा दें।
    नोट: जहाजों के चारों ओर स्क्रू को हटा दिया जाता है और बर्तन को धीरे से साबुन के पानी से धोया जाता है।
  2. बर्तनों को साफ पानी से धो लें और एक बार फिर से शिकंजा कस लें।
  3. अगले उपयोग तक आटोक्लेविंग के बाद जहाजों को स्टोर करें।

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Representative Results

बायोरिएक्टर का अंदर कक्ष कोशिकाओं को प्रसार और अंतर करने के लिए एक वातावरण प्रदान करता है, एक मचान से जुड़ता है या ऊतक जैसे संयोजन बनाने के लिए एकत्र होता है। प्रत्येक एचएआरवी पोत 10 एमएल तक मध्यम रखता है और पोषक तत्वों के निरंतर परिसंचरण की सुविधा प्रदान करता है ताकि प्रत्येक कोशिका को जीवित रहने का एक उत्कृष्ट मौका मिले। चित्रा 1 ए पोत की सामने की प्लेट में सिरिंज बंदरगाहों के लगाव को दर्शाता है जहां बाँझ वन-स्टॉप वाल्व जुड़े होते हैं। ये वाल्व संस्कृति कक्ष के द्वारपाल के रूप में कार्य करते हैं। मध्यम परिवर्तन के लिए स्टॉप कॉक वाल्व को खोलने की आवश्यकता होती है ताकि ताजा माध्यम युक्त बाँझ सिरिंज को जोड़ा जा सके। बायोरिएक्टर के भीतर माइक्रोग्रैविटी वातावरण कोशिकाओं को मचानों पर पूर्व सीडिंग की आवश्यकता के बिना पोत के भीतर मचान से जुड़ने की अनुमति देता है। बायोरिएक्टर में रखा पाड़ (चित्रा 1 बी और 1 सी) लगातार घूमता है, जिससे कोशिकाओं को पाड़ सतहों से जुड़ने और साइटोस्केलेटल नेटवर्क बनाने की अनुमति मिलती है। पोत प्लेट (चित्रा 1 बी) के तल पर ऑक्सीजनेटर झिल्ली सेल अस्तित्व और दीर्घायु में सुधार के लिए निरंतर गैस विनिमय की अनुमति देती है।

कोशिकाओं के साथ सबसे अधिक संगत मचान की पहचान करने के लिए विभिन्न मचानों का परीक्षण किया गया था। चित्रा 2 ए और 2 बी में मचान एक ग्राफीन शीट है जो 75% ग्राफीन और 25% पीएलजी (पॉली-लैक्टिक ग्लाइकोलाइड) से बना है। यह विद्युत प्रवाहकीय मचान अक्सर उन कोशिकाओं के लिए उपयोग किया जाता है जिन्हें विद्युत उत्तेजना की आवश्यकता हो सकती है, जैसे कि कंकाल की मांसपेशी कोशिकाएं26। हमारे अध्ययनों में, कोलेजन पाड़ ने जैव-रासायनिकता, ऊतक विकास को बढ़ावा देने और सेलुलर भेदभाव के मामले में परीक्षण किए गए अन्य सभी अध्ययनों को पार कर लिया। इस कोलेजन-आधारित मचान (चित्रा 2 सी और 2 डी) की विशेष छिद्रपूर्ण सतह कोशिकाओं और पोषक तत्वों को पूरे मचान में प्रवाह करने की अनुमति देती है, जिससे सेल लगाव और सेल प्रसार का क्षेत्र बढ़ जाता है।

माउस जबड़े के संबंध में ग्रीवा लूप की स्थिति चित्र 3 ए और 3 बी में चित्रित की गई है। माउस छेदक ग्रीवा लूप कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, एक कंकालीकृत माउस जबड़े को विच्छेदित किया गया था और निचले माउस छेदक के सबसे बाहर के हिस्से को उजागर किया गया था। गर्भाशय ग्रीवा लूप की सटीक स्थिति को 6 दिनों के प्रसवोत्तर माउस छेदक (चित्रा 3 बी) में सीमांकित किया गया है, जबकि एक वयस्क कंकालयुक्त माउस जबड़े में एक समान क्षेत्र अभिविन्यास उद्देश्यों के लिए चित्रा 3 ए में संदर्भ के रूप में प्रदान किया गया है। वयस्क कंकालीकृत (चित्रा 3 ए) और 6 डीपीएन ताजा तैयार माउस छेदक में संबंधित ग्रीवा लूप का क्षेत्र दो टूटी हुई रेखाओं (चित्रा 3 ए और बी) द्वारा तैयार किया गया है। हेमी जबड़े के डेंटिटेशन में तीन मैंडिबुलर मोलर और एक लगातार बढ़ते छेदक शामिल होते हैं, जबकि ग्रीवा लूप सेल आला में तामचीनी गठन में शामिल एक मिश्रित कोशिका आबादी शामिल होती है जैसे कि आंतरिक तामचीनी उपकला, बाहरी तामचीनी उपकला, स्टेलेट रेटिकुलम और स्ट्रेटम इंटरमीडियम19।

चित्रा 4 गर्भाशय ग्रीवा लूप कोशिकाओं के सफल भेदभाव पर केंद्रित है जो एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं को स्रावित करने वाले लम्बी, ध्रुवीकृत, तामचीनी प्रोटीन में है। डेटा से पता चला है कि एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं को स्रावित करने वाले लम्बी, ध्रुवीकृत, तामचीनी प्रोटीन के सफल भेदभाव के लिए मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं जैसे दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं के साथ ग्रीवा लूप कोशिकाओं की सह-संस्कृति की आवश्यकता होती है। सुसंस्कृत कोशिकाओं को प्रोटोकॉल के चरण 3 में वर्णित अनुरूप माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ प्रदान किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक छोर पर नाभिक के साथ ध्रुवीकृत कोशिकाओं का गठन और दूसरे27 पर एक लंबी सेलुलर प्रक्रिया, एमेलोब्लास्ट्स की एक विशिष्ट विशेषता (चित्रा 4 ए)। अकेले और विकास कारकों और / या पाड़ कोटिंग के बिना मीडिया के आवेदन के परिणामस्वरूप ग्रीवा लूप कोशिकाएं हुईं जो प्रमुख तामचीनी प्रोटीन का स्राव करती थीं लेकिन लम्बी या ध्रुवीकृत नहीं होती थीं (चित्रा 4 बी)।

गैलानिन-लेपित और गैर-लेपित कोलेजन मचानों को एक बायोरिएक्टर में चौदह दिनों के लिए एचपीडीएल कोशिकाओं के साथ एक बायोरिएक्टर में रखा गया था। कोशिकाएं 3 डी संस्कृति प्रणाली में दो सप्ताह की संस्कृति अवधि से बच गईं और गैलानिन-लेपित पाड़ समूह ने अनकोटेड मचानों वाले नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक प्रसार दर (चित्रा 5 बी) का प्रदर्शन किया (चित्रा 5 ए)। प्रयोगात्मक समूह में कोशिकाओं ने नियंत्रण की तुलना में संयोजी ऊतक फाइबर युक्त बाह्य मैट्रिक्स के काफी उच्च स्तर का भी प्रदर्शन किया।

बायोरिएक्टर वातावरण 3 डी माइक्रोग्रैविटी वातावरण में फेफड़ों के खंडों के विकास के लिए सफल साबित हुआ (चित्रा 6)। इस अध्ययन के लिए, ई 15 चूहों (चित्रा 6 सी) से काटे गए फेफड़ों के ऊतक खंडों को दो घंटे के लिए एक अंग संस्कृति डिश में नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर रखा गया था। झिल्ली से प्रारंभिक ऊतक लगाव के बाद, फेफड़ों के ऊतक / नाइट्रोसेलुलर झिल्ली समग्र को बायोरिएक्टर पोत में रखा गया था और 10 दिनों के लिए सफलतापूर्वक सुसंस्कृत किया गया था (चित्रा 6 ए)। फेफड़ों के ऊतकों के विकास पर भड़काऊ स्थितियों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए, कल्चर माध्यम में आईएल -6 को जोड़ने के परिणामस्वरूप विवो (चित्रा 6 बी) में देखे गए वायुकोशीय आकृति विज्ञान में विशिष्ट सूजन से जुड़े परिवर्तन हुए।

Figure 1
चित्र 1. एक बायोरिएक्टर पोत के घटक। चित्रा 1 एक बायोरिएक्टर पोत के प्रमुख घटकों और पूर्व-असेंबली चरण में उनकी स्थिति को दर्शाता है। (ए) रिएक्टर कक्ष, सिरिंज बंदरगाहों और मचान की सापेक्ष स्थिति। (बी) फ्रंट प्लेट (स्पष्ट कवर) और पीछे की प्लेट (ऑक्सीजनेटर झिल्ली द्वारा कवर की गई सफेद प्लेट) की आधी खुली स्थिति। मचान को सामने और पीछे की प्लेट के बीच केंद्र में स्थित किया गया है। काले रंग का ग्राफीन पाड़ (सी) दिखाता है कि पोत के भीतर एक मचान कैसे रखा जाता है और कोशिकाओं को प्रसार, अंतर और सेलुलर नेटवर्क बनाने के लिए एक समर्थन के रूप में उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. इस अध्ययन में परीक्षण किए गए मचानों के प्रतिनिधि चित्र। हमारे बायोरिएक्टर अध्ययन के लिए पांच मचानों का परीक्षण किया गया था, जिनमें से दो उदाहरण यहां प्रस्तुत किए गए हैं। (ए, बी) एमेलोब्लास्ट जैसे सेल विकास के लिए परीक्षण किए गए ग्राफीन पाड़ का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि (सी, डी) हमारे बायोरिएक्टर आधारित सेल कल्चर अध्ययनों के लिए सबसे सफल कोलेजन पाड़ का प्रतिनिधित्व करता है। ग्राफीन मचान (ए, बी) में सतह के उद्गम की समानांतर सरणी बनाम कोलेजन पाड़ (सी, डी) की छिद्रपूर्ण संरचना पर ध्यान दें। (ए, सी) एक लंबवत परिप्रेक्ष्य से लिए गए मैक्रोग्राफ हैं जबकि (बी, डी) को 45 ° कोण पर चित्रित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3. सर्वाइकल लूप तैयार करना। ए में कंकालीकृत वयस्क माउस जबड़ा एमेलोब्लास्ट जैसी सेल संस्कृति और भेदभाव के लिए सेल आला तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्रीवा लूप क्षेत्र को दर्शाता है। यह मैक्रोग्राफ शारीरिक मार्करों की स्थिति को भी दर्शाता है, जिसमें लगभग पूरी मैंडिबुलर लंबाई में फैले लगातार बढ़ते छेदक (इंक), जबड़े के कोण के साथ पहला मैंडिबुलर मोलर (एम1), कोरोनॉइड प्रक्रिया और मैंडिबुलर कोंडिल की स्थिति शामिल है। यह कंकाल तैयारी (बी) में तैयार ग्रीवा लूप क्षेत्र के लिए एक शारीरिक अभिविन्यास के रूप में कार्य करती है। संदर्भ बिंदुओं में मैंडिबुलर हड्डी (मंड), दंत पैपिला ऊतक (डीपी), जबड़े का कोण (कोण) और ग्रीवा लूप (सीएल) की स्थिति शामिल है, जिसमें से हमारे एमेलोब्लास्ट बायोरिएक्टर अध्ययन के लिए कोशिकाओं को काटा गया था। टूटी हुई रेखा कंकालयुक्त वयस्क जबड़ा (ए) और 6 डीपीएन ताजा विच्छेदित जबड़े (बी) में ग्रीवा लूप विच्छेदन के लिए तैयार फेनेस्टेड मैंडिबुलर विंडो के पूर्ववर्ती और बाहर के हिस्से को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. 3 डी सह-संस्कृति दृष्टिकोण का उपयोग करके एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं का उत्पादन। (ए) गर्भाशय ग्रीवा लूप कोशिकाओं से एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं का सफल विभेदन एक उपयुक्त माइक्रोएन्वायरमेंट में दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित होता है। परिणामस्वरूप कोशिका आबादी में तामचीनी मैट्रिक्स प्रोटीन को स्रावित करने की क्षमता के साथ लंबी, लम्बी, ध्रुवीकृत कोशिकाएं शामिल थीं। इन कोशिकाओं में एक छोर (न्यूक्ल) पर एक नाभिक और टॉम्स प्रक्रिया के समान एक सेलुलर प्रक्रिया (प्रोक) दिखाई देती है जैसा कि दूसरे छोर (ए) पर सच्चे एमेलोब्लास्ट्स में देखा गया है। (बी) नियंत्रण समूह कोशिकाओं की एक आबादी को दर्शाता है जो सह-संस्कृति स्थितियों के अधीन भी थे, लेकिन विकास कारकों या भेदभाव एजेंटों से मुक्त मीडिया के साथ, जिसके परिणामस्वरूप गोल कोशिकाएं विशिष्ट एमेलोब्लास्ट्स का प्रतिनिधि नहीं थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5. लेपित और गैर-लेपित पाड़ सतहों के साथ एकल कोशिका पेरियोडोंटल पूर्वज (पीडीएल) आबादी की दीर्घकालिक 3 डी संस्कृति। पाड़ कोटिंग के परिणामस्वरूप गैर-लेपित मचान (ए) के संपर्क में आने वाले नियंत्रण समूह की कोशिकाओं की तुलना में गैलानिन-लेपित मचान (बी) पर संवर्धित कोशिकाओं में एचपीडीएल सेल प्रसार दर में वृद्धि हुई। प्रयोगात्मक समूह की कोशिकाओं ने नियंत्रण समूह (बी बनाम ए) की तुलना में संयोजी ऊतक फाइबर युक्त अधिक बाह्य मैट्रिक्स का स्राव भी किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6. एक बायोरिएक्टर में फेफड़े के ऊतक संवर्धन। (ए) ई 15 फेफड़ों के ऊतक खंड दस दिनों के लिए एक बायोरिएक्टर में नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर संवर्धित होते हैं। (बी) ई 15 फेफड़ों के ऊतक खंड (ए) के समान हैं, लेकिन मीडिया (बी) में आईएल -6 जोड़कर भड़काऊ स्थितियों के अधीन हैं। (C) H & E से सना हुआ एक ताजा विच्छेदित E15 फेफड़े के ऊतक का पैराफिन खंड। (A) और (C) की तुलना करते समय वायुकोशीय प्रकार I और प्रकार II सेल आकृति विज्ञान में समानताएं नोट करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

माइक्रोग्रैविटी में कोशिकाओं के विकास के लिए प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में बायोरिएक्टर, पाड़, 3 डी संस्कृति के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं और सेल भेदभाव को प्रेरित करने के साधन के रूप में पाड़ कोटिंग शामिल हैं। हमारे अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टर के प्रकार में आरसीसीएस -4 बायोरिएक्टर शामिल है, जो नासा द्वारा सिम्युलेटेड माइक्रोग्रैविटी में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए विकसित मूल रोटरी सेल कल्चर सिस्टम (आरसीसीएस) घूर्णन बेलनाकार ऊतक संस्कृति उपकरण का एक हालिया संशोधन है। यह आरसीसीएस -4 वातावरण बेहद कम कतरनी तनाव प्रदान करता है, जो बड़े पैमाने पर हस्तांतरण को बढ़ाता है और संस्कृति प्रदर्शन में सुधार करता है। बायोरिएक्टर के इस संस्करण ने एक ही समय में चार अलग-अलग प्रयोगों के लिए चार जहाजों के एक साथ उपयोग की अनुमति दी। आरसीसीएस -4 बायोरिएक्टर उच्च पहलू अनुपात (एचएआरवी) जहाजों से लैस था, जिसने हमारे अध्ययन के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं के साथ सरल और सीधे आगे की संस्कृति की स्थिति सुनिश्चित की।

हमारे दृष्टिकोण का एक दूसरा महत्वपूर्ण घटक मचान हैं क्योंकि वे फ्लोटिंग कोशिकाओं को संलग्न करने और असेंबली बनाने के लिए टेम्पलेट प्रदान करते हैं। जबकि नेक्रोटिक कोर के गठन के कारण 2 डी संस्कृति में मचानों का उपयोग सीमित है, एक रोटरी बायोरिएक्टर में बढ़ा हुआ प्रसार, ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रवाह सेल असेंबली28,29 के प्रसार के लिए वाहक के रूप में मचानों की प्रयोज्यता में सुधार करता है। वर्तमान अध्ययन में हमने पांच प्रकार के मचानों की प्रभावकारिता का पता लगाया, पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड (पीएलजीए) मचान, एक कोलेजनस और छिद्रपूर्ण मचान, एक ग्राफीन मचान, साथ ही एक जिलेटिन डिस्क और एक हाइड्रोड्रोक्सीपेटाइट डिस्क। इसके अलावा, हमने फेफड़ों के अंग प्रीकल्चर वातावरण से झिल्ली को बायोरिएक्टर में स्थानांतरित कर दिया, जिसमें सुसंस्कृत फेफड़े का खंड जुड़ा हुआ था। इनमें से, कोलेजन मचान हमारे अध्ययन में सबसे अनुकूल मचान के रूप में उभरा, संभवतः इसकी कोलेजनस संरचना और छिद्रपूर्ण संरचना के कारण। पीएलजीए पाड़ ने व्यवहार्य कोशिकाओं का उत्पादन किया था, जबकि अन्य तीन मचान हमारे हाथों में कम अनुकूल थे। मूल फेफड़े के अंग संस्कृति प्रणाली की नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली एक और प्रभावी मचान होने का प्रमाण है क्योंकि इसने 3 डी बायोरिएक्टर वातावरण में स्थानांतरण के बाद सुसंस्कृत फेफड़े की अखंडता को सफलतापूर्वक बनाए रखा।

हमारी रणनीति का एक तीसरा महत्वपूर्ण घटक पोत को बीज देने के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं के प्रकार हैं। हमारे एमेलोजेनेसिस अध्ययनों के लिए हमने लगातार बढ़ते माउस छेदक से तैयार ग्रीवा लूप कोशिकाओं पर भरोसा किया जो दंत लुगदी कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत थे। ग्रीवा लूप कोशिकाओं को मूल तामचीनी अंग पूर्वजों के स्रोत के रूप में चुना गया था जो कृंतक छेदक में लगातार नवीनीकृत होते हैं। माउस या चूहे छेदक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं का एक उल्लेखनीय स्रोत है जो जानवर के पूरे जीवन में मौजूद रहता है जबकि तामचीनी अंग की कोशिकाओं को निरंतर विस्फोट और एमेलोजेनेसिस23,30 के लिए फिर से भर दिया जाता है। दोनों पीरियडोंटल पूर्वज कोशिकाओं और दंत लुगदी कोशिकाओं का उपयोग सह-संस्कृति कोशिका स्रोतों के रूप में किया गया था। उपकला कोशिकाओं की सफल संस्कृति के लिए मेसेनकाइमल सह-संस्कृति कोशिका आबादी का उपयोग अच्छी तरहसे स्थापित है 31,32. हमारे अध्ययनों में, दंत लुगदी कोशिकाएं पेरियोडोंटल लिगामेंट पूर्वजों की तुलना में एमेलोब्लास्ट भेदभाव को प्रेरित करने में अधिक प्रभावी थीं, भले ही उनकी मेसेनकाइमल विशेषताओं के आधार पर, दोनों ओडोन्टोजेनिक और मेसेनकाइमल सह-संस्कृति उम्मीदवारों के रूप में उपयुक्त हैं। जब एमेलोजेनेसिस की ओर लागू किया जाता है, तो दांत के विकास के दौरान ओडोन्टोजेनिक एपिथेलियम के प्राकृतिक समकक्ष के रूप में दंत लुगदी कोशिकाओं ने टर्मिनल एमेलोब्लास्ट भेदभाव33,34 के प्रेरण के लिए उपयुक्त उपकला-मेसेनकाइमल इंटरैक्शन को ट्रिगर किया हो सकता है। हालांकि, पेरियोडोंटल ऊतक इंजीनियरिंग के लिए पाड़ इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए, पीरियडोंटल पूर्वज आदर्श रूप से अनुकूल थे क्योंकि वे पूरी तरह से विभेदित पेरियोडोंटल लिगामेंट फाइब्रोब्लास्ट25,35 को जन्म देते हैं। अंत में, एक बायोरिएक्टर वातावरण में फेफड़ों के अंगों की संस्कृति के लिए, हमने विच्छेदित भ्रूण मुराइन फेफड़ों के खंडों पर भरोसा किया। अंग संवर्धन व्यंजनों में भ्रूण के फेफड़ों के अंगों को कल्चर करने की प्रक्रियाओं को पहले36 से वर्णित किया गया है और संवहनी या चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के साथ फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं के संयोजन वाले कई दो-आयामी सेल कल्चर मॉडल37,38,39 का पता लगाया गया है। वर्तमान अध्ययन में, 3 डी बायोरिएक्टर मॉडल ने सुसंस्कृत ऊतक ब्लॉक के कोर की अखंडता को संरक्षित करते हुए सर्फेक्टेंट स्राव का एक मजबूत स्तर बनाए रखा, जिससे यह मॉडल फेफड़ों के ऊतक अखंडता पर पर्यावरणीय प्रभावों के अध्ययन के लिए उपयुक्त हो गया।

हमारे मॉडल का चौथा महत्वपूर्ण पहलू एमेलोब्लास्ट जैसे सेल भेदभाव को ट्रिगर करने के लिए पाड़ सतहों पर सेल-प्रकार विशिष्ट कोटिंग्स का अनुप्रयोग है। विशेष रूप से, एलआरएपी और तामचीनी मैट्रिक्स जैसे घटक एमेलोब्लास्ट जैसे सेल भेदभाव की दिशा में महत्वपूर्ण योगदान कारकों के रूप में उभरे क्योंकि एलआरएपी और प्रारंभिक तामचीनी मैट्रिक्स के साथ कोटिंग की कमी ने लम्बी और ध्रुवीकृत कोशिकाओं के गठन को प्रतिबंधित कर दिया। साथ में, पाड़ सतहों की कोटिंग बायोरिएक्टर में जटिल अंगों के ऊतक-विशिष्ट भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है।

इस अध्ययन का सबसे महत्वपूर्ण पहलू एमेलोब्लास्ट्स के विशिष्ट लम्बी और ध्रुवीकृत सेल आकार को बहाल करने की क्षमता थी। यह परिणाम 2 डी संस्कृति प्रणालियों की सीमाओं पर 3 डी बायोरिएक्टर सिस्टम का एक अनूठा लाभ है जो तामचीनी-अंग व्युत्पन्न कोशिकाओं को अत्यधिक गोल करता है। यह परिणाम अन्य संस्कृति प्रौद्योगिकियों के साथ असंगत कोशिकाओं की खेती करते समय बायोरिएक्टर प्रौद्योगिकियों का उपयोग करने के लाभ के लिए और सबूत प्रदान करताहै। हम एमेलोब्लास्ट सह-संस्कृति अध्ययन की सफलता का श्रेय रोटेटरी बायोरिएक्टर सिस्टम की कई अनूठी विशेषताओं को देते हैं, जिसमें पोषक तत्वों, विकास और प्रतिलेखन कारकों और ऑक्सीजन की निरंतर आपूर्ति के साथ-साथ विभिन्न वंशों और विकास चरणों की कोशिकाओं के बीच सामाजिक बातचीत बनाने के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं की क्षमता शामिल है। जबकि अध्ययन एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं को स्रावित करने वाले लम्बी, ध्रुवीकृत और एमेलोजेनिन को बढ़ने में सफल रहे, यहां उगाई गई एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाएं अलगाव में रहती हैं, और एमेलोब्लास्ट सेल पंक्ति की प्राकृतिक निरंतरता खो गई थी। भविष्य के अनुप्रयोगों में, इस तकनीक के साथ विकसित एमेलोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं का उपयोग तामचीनी ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए या दांतों के एमेलोजेनेसिस के पहलुओं को पुन: उत्पन्न करने के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में किया जा सकता है।

अंत में, 3 डी बायोरिएक्टर गर्भाशय ग्रीवा लूप / दंत लुगदी सह-संस्कृतियों के एमेलोब्लास्ट्स में प्रसार के लिए, लेपित मचानों में पीरियडोंटल लिगामेंट पूर्वजों के विकास के लिए और पूरे फेफड़ों के अंगों की संस्कृति के लिए एक सफल वातावरण के रूप में उभरा। इन आंकड़ों के आधार पर, बायोरिएक्टर-आधारित प्रौद्योगिकियां दांत तामचीनी, पीरियडोंटल और फेफड़ों के अनुसंधान जैसे क्षेत्रों में उन्नत ऊतक इंजीनियरिंग या परीक्षण रणनीतियों के लिए महत्वपूर्ण वाहनों के रूप में उभरने की संभावना है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड क्रैनियोफेशियल रिसर्च (यूजी 3-डीई028869 और आर01-डीई027930) से अनुदान द्वारा उदारतापूर्वक समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-antimycotic ThermoFisher Scientfic 15240096
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4544
BGJb Fitton-Jackson Modification media ThermoFisher Scientfic 12591
BIOST PGA scaffold Synthecon Custom Available from the company through a custom order
BMP-2 R&D Systems 355-BM
BMP-4 R&D Systems 314-BP
DMEM Media Sigma Aldrich D6429-500mL
FBS ThermoFisher Scientfic 16140071
Fibricol Advanced Biomatrix 5133-20mL
Fibronectin Corning 354008
Galanin Sigma Aldrich G-0278
Gelatin disc Advanced Biomatrix CytoForm 500
Graphene sheets Advanced Biomatrix CytoForm 300
hEGF Peprotech AF-100-15
hFGF ThermoFisher Scientfic AA1-155
Hydroxyapatite disc Advanced Biomatrix CytoForm 200
Il-6 protein PeproTech 200-06
Keratinocyte SFM media (1X) ThermoFisher Scientfic 17005042
Laminin Corning 354259
LRAP peptide Peptide 2.0 Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT
PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL
PLEAWPATDKTKREEVD
Matrigel Corning 354234
Millipore Nitrocellulose membrane Merck Millipore AABP04700
RCCS Bioreactor Synthecon RCCS 4HD
SpongeCol Advanced Biomatrix 5135-25EA
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock Smiths Medical MX5-61L
Syringes with needle 3cc McKESSON 16-SN3C211
Trypsin EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientfic 25200056

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बायोइंजीनियरिंग अंक 171
माइक्रोग्रैविटी में दंत और श्वसन कोशिकाओं और अंगों का प्रसार
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