Summary
이 프로토콜은 미세중력에서 아멜로모세포 유사 세포의 배양 및 3D 성장을 통해 길쭉하고 분극된 형태와 에나멜 특이적 단백질 발현을 유지하는 방법을 제시합니다. 미세 중력에서 치주 공학 구조물 및 폐 기관의 배양을위한 배양 조건도 설명됩니다.
Abstract
중력은 인간 세포 기능, 증식, 세포골격 구조 및 방향의 핵심 결정 요인 중 하나입니다. 회전식 생물 반응기 시스템 (RCCS)은 우주에서 발생하는 중력 손실을 모방하고 대신 배양 된 세포 또는 조직의 연속 회전을 통해 미세 중력 환경을 제공합니다. 이러한 RCCS는 영양소, 성장 및 전사 인자, 산소의 중단 없는 공급을 보장하고 움직이지 않는 2D(2차원) 세포 또는 장기 배양 접시에서 중력의 일부 단점을 해결합니다. 본 연구에서 우리는 RCCS를 사용하여 자궁 경부 루프 세포와 치수 세포를 공동 배양하여 ameloblasts가되고, 치주 전구 세포 / 스캐 폴드 상호 작용을 특성화하고, 폐 폐포에 대한 염증의 영향을 결정했습니다. RCCS 환경은 아멜로모세포 유사 세포의 성장을 촉진하고, 스캐폴드 코팅에 반응하여 치주 전구체 증식을 촉진했으며, 배양된 폐포에 대한 염증 변화의 영향을 평가할 수 있었습니다. 이 원고는 환경 조건, 재료 및 단계를 요약하고 중요한 측면과 실험 세부 사항을 강조합니다. 결론적으로, RCCS는 시험관 내 세포의 배양 및 3D(3차원) 성장을 마스터하고 기존의 2D 배양 환경에 적합하지 않은 세포 시스템 또는 상호 작용을 연구할 수 있는 혁신적인 도구입니다.
Introduction
중력은 개별 세포의 생물학과 유기체 내에서의 기능을 포함하여 지구상의 생명체의 모든 측면에 영향을 미칩니다. 세포는 기계 수용체를 통해 중력을 감지하고 세포 골격 구조를 재구성하고 세포 분열 1,2,3을 변경하여 중력 변화에 반응합니다. 미세 중력의 다른 영향으로는 유체로 채워진 소포의 정수압, 세포 기관의 침강, 흐름과 열의 부력 구동 대류4가 있습니다. 인간 세포와 기관에 대한 중력 손실의 영향에 대한 연구는 원래 우주 비행 임무 중 우주 비행사에 대한 우주의 무중력 환경을 시뮬레이션하기 위해 수행되었습니다5. 그러나 최근 몇 년 동안 NASA가 원래 미세 중력을 시뮬레이션하기 위해 개발 한 이러한 3D 생물 반응기 기술은 2D 배양 시스템에 적용 할 수없는 세포 집단의 배양을위한 새로운 접근 방식으로 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다.
3D 바이오리액터는 현탁액에서 세포를 성장시켜 일정한 "자유 낙하" 효과를 생성하여 미세 중력을 시뮬레이션합니다. 회전식 바이오리액터의 다른 장점으로는 장기 배양 시스템에서 발생하는 공기 노출 부족, 전단 응력 및 난류 감소, 변화하는 영양소 공급에 대한 지속적인 노출 등이 있습니다. 회전식 세포 배양 시스템(RCCS) 생물반응기가 제공하는 이러한 동적 조건은 공간 공동 국소화 및 단일 세포를 응집체로 3차원 조립하는 데유리합니다6,7.
이전 연구에서는 뼈 재생8, 치아 배아 배양9 및 인간 치용 여포 세포배양10을 위한 회전식 바이오리액터의 이점을 입증했습니다. RCCS가 EOE 세포 증식 및 ameloblasts11로의 분화를 향상시킨다는 보고도 있었다. 그러나, 분화된 세포는 그들의 길쭉한 형태 또는 편광된 세포 형태를 고려하지 않고 아멜로블라스틴 면역형광 및/또는 아멜로게닌 발현 단독11 에 기초한 아멜로모세포로 간주되었다.
NASA가 개발한 회전 벽 용기(RWV) 바이오리액터 외에도 세포에서 3D 응집체를 생성하는 다른 기술로는 자기 부상, 랜덤 포지셔닝 머신(RPM) 및 clinostat12가 있습니다. 자기 부상 달성을 달성하기 위해, 자성 나노 입자로 표지 된 세포는 외부 자기력을 사용하여 부상되고, 지방 세포 구조13,14,15의 생체 가공에 사용 된 스캐 폴드가없는 3D 구조의 형성을 초래한다. 미세중력을 시뮬레이션하기 위한 또 다른 접근법은 clinostat16이라는 장치의 중심에서 누적 중력 벡터의 상쇄를 초래하는 2개의 축에 대한 동시 회전을 제어함으로써 다방향 G 힘의 생성이다. 골수 줄기세포를 클리노스탯에서 배양하였을 때, 조골세포 분화의 억제를 통해 새로운 골형성이 억제되었으며, 이는 미세중력의 역분화 효과 중 하나를 예시한다16.
ameloblasts의 충실한 배양을 촉진하기위한 시험관 내 시스템은 치아 법랑질 조직 공학17을 향한 중요한 진전을 제공 할 것이다. 불행히도, 현재까지 ameloblasts의 문화는 도전적인 사업이었습니다18,19. 지금까지 마우스 아멜로모세포 계통 세포주(ALC), 래트 치과 상피 세포주(HAT-7), 마우스 LS8 세포주20, 돼지 PABSo-E 세포주 21 및 래트 SF2-24 세포주22를 포함하여 5개의 서로 다른 아멜로모세포 유사 세포주가 보고되었습니다. 그러나 이러한 세포의 대부분은 2D 배양에서 독특한 편광 세포 모양을 잃었습니다.
본 연구에서 우리는 중간엽 전구세포와 공동 배양된 자궁경부 루프 상피에서 아멜로모세포 유사 세포의 성장을 촉진하고 영양분의 흐름 감소 및 중력으로 인한 세포골격 변화를 포함한 2D 배양 시스템의 문제를 극복하기 위해 회전식 세포 배양 생물반응기 시스템(RCCS)으로 전환했습니다. 또한 RCCS는 치주 조직 공학과 관련된 세포/스캐폴드 상호작용을 연구하고 시험관 내에서 폐포 조직에 대한 염증 매개체의 효과를 조사하기 위한 새로운 방법을 제공했습니다. 함께, 이러한 연구의 결과는 분화된 상피의 전파 및 세포/스캐폴드 상호 작용 및 염증 상태에 대한 조직 반응을 포함하여 시험관 내에서 성장한 세포에 대한 환경 영향 평가를 위한 미세 중력 기반 회전 배양 시스템의 이점을 강조합니다.
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Protocol
연구가 TAMU 기관 동물 관리 지침을 준수하는지 확인하기 위해 필요한 모든 기관 승인을 받았습니다.
1. 생물 반응기 조립 및 살균
- 바이오리액터를 위한 4개의 고종횡비 용기(HARV)를 플라스틱 기기 사이클의 오토클레이브에서 제조자가 권장하는 대로 121°C에서 20분 동안 멸균한다.
- 멸균 후, 바이오 리액터와 함께 제공된 나사를 조여 세포 배양 후드에 용기를 조립 한 후 용기를 사용할 준비가됩니다.
2. 생물반응기 공동배양 실험에 사용되는 스캐폴드
- 스캐폴드를 세포와 함께 인큐베이션하여 추가 성장에 필요한 세포 부착을 지지합니다.
- 공동 배양 연구를 위해 PGA 기반 스캐폴드, 하이드록시아파타이트 스캐폴드, 그래핀 시트, 젤라틴 디스크 및 콜라겐 기반 스캐폴드 중에서 선택하십시오.
3. 자궁 경부 루프 (CL) 해부 및 단일 세포 준비
- CO2 과량투여에 의한 호흡정지 후 참수로 마우스를 희생시킨다.
참고: 모든 동물 연구는 TAMU 기관 동물 관리 지침을 준수합니다. - 이전에 공개된 프로토콜23의 수정된 버전에 따라 출생 후 6일(DPN) 마우스에서 자궁 경부 루프를 해부합니다.
참고 : 우리 연구에서는 이전에 발표 된 프로토콜에 표시되지 않은 자궁 경부 루프의 말단 부분이 포함됩니다 (그림 3).- 37°C에서 30분 동안 콜라게나제로 소화하기 전에 해부된 조직을 차가운 멸균 PBS로 세척한다.
- 용액을 70μm 멸균 세포 스트레이너에 통과시키고 800 x g 에서 10분 동안 추가로 원심분리합니다.
- 상청액을 폐기하십시오. 펠릿을 원심분리하고 800 x g의 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 상청액을 폐기하십시오.
- 혈구 측정기를 사용하여 세포를 세고 용기 당 1 X 105 세포를 추가하십시오.
4. 치과용 치수 세포 배양 및 세포주 확장
- 치과용 치수 세포를 100 mm 조직 배양 플레이트에서 계대 4의 농도로 1 x 105의 농도로 플레이트화한다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제/항진균제(P/S)가 보충된 DMEM 고혈당 배지로 구성된 배양용 배지를 준비합니다.
- 세포가 85-90 % 합류에 도달하면 배지를 흡인하고 예열 된 PBS로 플레이트를 두 번 씻습니다.
- PBS 세척 후, 예열된 0.25% 트립신-EDTA 용액을 플레이트에 첨가하고, 치수 세포 함유 플레이트를 3분 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
- 현미경을 사용한 육안 검사로 세포 분리를 확인하십시오.
- 배양 플레이트에서 세포와 함께 배지를 수집하고 25mL 피펫을 통해 50mL 멸균 코니컬 튜브로 옮깁니다.
- 세포를 800 x g 에서 8분 동안 원심분리하고 상청액을 버린다. 세포를 새로운 배지에 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 계수합니다.
- 자궁 경부 루프 세포와의 공동 배양을 위해, 치과 용 펄프 세포를 용기 당 1 x 104 의 농도로 생물 반응기에 시드하십시오.
5. RCCS 바이오리액터 내의 스캐폴드에서 경추 루프/치수 세포의 공동 배양
- 세포 유형, 자궁 경부 루프 및 치수 모두를 보충 성장 인자, 세포 외 기질 단백질 및 스캐폴드가 있는 각질 세포 SFM 배지가 포함된 배양 배지에 추가합니다.
참고: 성장 인자는 0.03 μg/mL 골 형태 형성 단백질 2(BMP 2), 0.03 μg/mL 골 형태 형성 단백질 4(BMP-4), 10 ng/mL 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자(hFGF) 및 15 ng/mL 표피 성장 인자(hEGF)의 농도로 첨가되며, ECM 구성 요소에는 200μg/mL 마트리겔, 5μg/mL 라미닌 및 5μg/mL 피브로넥틴이 포함됩니다. - 1mg의 LRAP(류신이 풍부한 아멜로게닌 펩타이드) 펩타이드, 1mg의 돼지 치아24, 5μg/mL 라미닌 및 5μg/mL의 피브로넥틴으로 제조된 동결건조된 초기 단계 에나멜 매트릭스 1mg이 풍부한 콜라겐 젤 500μL의 혼합물로 스캐폴드를 코팅합니다.
참고 : 이것은 우리의 실험에 가장 효과적이었습니다. - 스캐폴드 코팅 후, 세포와 스캐폴드를 모두 바이오리액터에 첨가하고, 바이오리액터를 용기당 10mL 배지로 채운다.
- 배지, 세포 및 스캐폴드를 추가한 후 생물반응기 용기의 충전 포트 캡을 닫습니다.
- 실험 시작시 멸균 밸브를 주사기 포트에 부착하고 실험이 끝날 때까지 덮개가있는 상태로 유지하십시오.
- 용기가 90% 채워지고 충전 포트 캡이 닫히고 조여지면 멸균 밸브를 엽니다.
- 배지 교체가 필요할 때마다 멸균 주사기 2개(3mL)를 사용하십시오. 한 주사기에 새 배지를 채우고 다른 주사기는 비워 둡니다.
- 두 주사기 밸브를 모두 열고 빈 주사기 포트를 향해 기포를 부드럽게 움직입니다.
- 전체 주사기의 새 배지가 용기에 조심스럽게 주입되면 빈 주사기 포트를 통해 기포를 제거합니다.
알림: 이 절차는 모든 미세 기포가 혈관에서 제거될 때까지 수행됩니다. - 캡으로 주사기 포트를 닫고 주사기를 날카로운 폐기물 용기에 버리십시오.
- 각 용기를 회전기베이스에 부착하고 회전 장치베이스를 5 % CO2 및 37 ° C 온도의 인큐베이터에 놓습니다.
- 전원을 켜고 회전 속도를 10.1rpm으로 설정합니다.
알림: 비계가 용기 벽에 닿지 않고 매달려 있는지 확인하기 위해 속도를 조정하십시오. - 배지 교체의 경우 세포가 바닥에 정착하도록 혈관을 똑바로 세웁니다. 주사기 포트를 열고 멸균 주사기를 포트에 연결합니다.
- 영양이 고갈된 배지의 75%를 흡인하고 다른 포트를 통해 새 배지를 주입하여 동일한 절차를 따르십시오.
6. 폐 기관 준비 및 생물 반응기 기반 배양
참고: E15 야생형 마우스 새끼는 폐 기관의 준비에 사용되었습니다.
- 임신한 암컷 마우스를CO2 질식으로 안락사시킨 후 폐 조직을 해부한다.
- 자궁 경부 탈구에 의한 질식 후 사망이 확인되면 메스를 사용하여 흉강을 노출시킵니다. 그 후, 자궁에서 새끼를 제거하고 참수로 안락사시킵니다.
- 안락사 후 폐를 찾기 위해 메스로 흉강을 열어 흉강을 준비하십시오. 멸균 PBS로 폐 조직의 작은 부분을 세척하고 5 %CO2 및 37 °C 온도를 포함하는 인큐베이터에서 장기 배양 배지로 2 시간 동안 사전 멸균 된 멤브레인에 놓습니다.
- 폐 조직이 2D 장기 배양 플레이트의 멤브레인에 부착되면 샘플을 생물 반응기 용기로 옮깁니다.
- 문화권에 맞게 미디어를 준비합니다.
참고: 대조군 DMEM 고포도당 배지에는 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 항생제 용액(P/S)(페니실린, 100U/mL, 스트렙토마이신, 50μg/mL) 및 100μg/mL 아스코르브산(AA)이 포함되어 있으며 염증 상태의 유도를 위해 대조군 배지에는 5ng/mL IL-6 단백질이 보충됩니다. - 상기와 같이 생물반응기에서 48시간마다 배지를 교체하여 10일 동안 폐배양 실험을 수행한다.
7. 인간 치주 인대(hPDL) 세포 배양으로 코팅된 스캐폴드
- 인간 치주 인대 세포를 배양하십시오.
참고: 세포는 이전에 발표된 프로토콜25에 따라 우리 실험실에서 분리되고 배양됩니다. - 콜라겐 스캐폴드 디스크를 대조군용 PBS 30 μL와 뉴로펩타이드 갈라닌(GAL)을 밤새 10-8 의 농도로 코팅합니다.
- 대조군 상에 인간 PDL 세포를 GAL 코팅된 스캐폴드 상에서 배양 플레이트에서 37°C에서 2시간 동안 하고, 세포 시드된 스캐폴드를 상기에서 언급한 바와 같은 생물반응기 용기로 옮긴다.
- 분석을 위해 스캐폴드를 수확하기 전에 생물반응기에서 14일 동안 세포 시드된 스캐폴드를 배양한다.
8. 생물 반응기 청소 및 유지 보수
- 스캐폴드/세포가 바이오리액터로부터 수확된 후, 용기로부터 주사기 포트를 제거한다.
알림: 용기 주변의 나사를 제거하고 용기를 비눗물로 부드럽게 씻습니다. - 깨끗한 물로 용기를 헹구고 나사를 한 번 더 조입니다.
- 다음 사용 때까지 오토 클레이브 후 용기를 보관하십시오.
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Representative Results
생물 반응기의 내부 챔버는 세포가 증식 및 분화하거나 스캐 폴드에 부착되거나 집합체와 같은 조직을 형성하기 위해 모일 수있는 환경을 제공합니다. 각 HARV 용기는 최대 10 mL의 배지를 담을 수 있으며 영양소의 지속적인 순환을 촉진하여 각 세포가 생존할 수 있는 탁월한 기회를 제공합니다. 그림 1A 는 멸균 원스톱 밸브가 부착된 용기의 전면 플레이트에 주사기 포트를 부착하는 것을 보여줍니다. 이 밸브는 배양실의 문지기 역할을합니다. 매체를 변경하려면 새로운 매체가 들어있는 멸균 주사기를 쉽게 부착 할 수 있도록 스톱 콕 밸브를 열어야합니다. 바이오리액터 내의 미세중력 환경은 세포가 스캐폴드 상에 사전 시딩을 요구하지 않고 용기 내의 스캐폴드에 부착되도록 한다. 바이오리액터에 배치된 스캐폴드(그림 1B 및 1C)는 연속적으로 회전하여 세포가 스캐폴드 표면에 부착되어 세포골격 네트워크를 형성할 수 있습니다. 용기 플레이트 하단의 산소 공급기 멤브레인(그림 1B)은 지속적인 가스 교환을 허용하여 세포 생존과 수명을 향상시킵니다.
세포와 가장 상용성인 스캐폴드를 확인하기 위해 다양한 스캐폴드를 시험하였다. 도 2A 및 2B의 스캐폴드는 75% 그래핀과 25% PLG(폴리락트글리콜라이드)로 구성된 그래핀 시트이다. 이러한 전기 전도성 스캐폴드는 골격근 세포(26)와 같이 전기 자극을 필요로 할 수 있는 세포에 자주 사용된다. 우리의 연구에서 콜라겐 스캐폴드는 생체 적합성, 조직 성장 촉진 및 세포 분화 측면에서 테스트된 다른 모든 연구를 능가했습니다. 이 콜라겐 기반 스캐폴드의 특수 다공성 표면(그림 2C 및 2D)은 세포와 영양소가 스캐폴드 전체에 흐르도록 하여 세포 부착 및 세포 증식 영역을 증가시킵니다.
마우스 하악골에 대한 관계에서 자궁 경부 루프의 위치는 도 3A 및 3B에 도시되어 있다. 마우스 앞니 경추 루프 세포를 준비하기 위해, 골격화된 마우스 하악골을 해부하고 마우스 하부 앞니의 가장 말단 부분을 노출시켰다. 절제된 경추 루프의 정확한 위치는 출생 후 6일 마우스 앞니(그림 3B)에서 구분되는 반면, 성인 골격화된 마우스 하악골의 유사한 영역은 오리엔테이션 목적으로 그림 3A에 참조로 제공됩니다. 성인 골격화 (그림 3A)와 6 dpn 새로 준비된 마우스 절치에서 해당 자궁 경부 루프의 영역은 두 개의 파선으로 구성됩니다 (그림 3A 및 B). 하악골의 치열은 3 개의 하악 어금니와 지속적으로 성장하는 앞니로 구성되며, 자궁 경부 루프 세포 틈새는 내부 법랑질 상피, 외부 법랑질 상피, 별 모양 세망 및 지층 중간19와 같은 법랑질 형성에 관여하는 혼합 세포 집단으로 구성됩니다.
그림 4는 자궁 경부 루프 세포가 ameloblast-like 세포를 분비하는 길쭉한, 분극 된, 법랑질 단백질로의 성공적인 분화에 초점을 맞추고 있습니다. 데이터는 ameloblast-like 세포를 분비하는 길쭉하고 분극화 된 법랑질 단백질의 성공적인 분화를 위해서는 경추 루프 세포와 치과 용 펄프 줄기 세포와 같은 중간 엽 줄기 세포의 공동 배양이 필요하다는 것을 밝혀 냈습니다. 배양된 세포는 프로토콜의 3단계에 설명된 대로 맞춤형 미세환경을 제공받았고, 그 결과 한쪽 끝에 핵이 있고 다른쪽 끝에 긴 세포 과정이 있는 편광 세포가 형성되었으며, 이는 ameloblasts의 전형적인 특성입니다(그림 4A). 성장 인자 및/또는 스캐폴드 코팅 없이 배지만 적용하면 주요 법랑질 단백질을 분비하지만 늘어나거나 분극화되지 않는 자궁 경부 루프 세포가 생성되었습니다(그림 4B).
갈라닌-코팅된 및 코팅되지 않은 콜라겐 스캐폴드를 바이오리액터에서 14일 동안 hPDL 세포와 함께 바이오리액터에 두었다. 세포는 3D 배양 시스템에서 2주 배양 기간 동안 생존했으며 갈라닌 코팅 스캐폴드 그룹은 코팅되지 않은 스캐폴드를 포함하는 대조군에 비해 훨씬 더 높은 증식률(그림 5B)을 보여주었습니다(그림 5A). 실험군의 세포는 또한 대조군과 비교하여 결합 조직 섬유를 포함하는 세포외 기질의 상당히 높은 수준을 입증했습니다.
생물 반응기 환경은 3D 미세 중력 환경에서 폐 세그먼트의 성장에 성공한 것으로 입증되었습니다 (그림 6). 이 연구를 위해, E15 마우스로부터 수확 된 폐 조직 세그먼트 (그림 6C)를 2 시간 동안 장기 배양 접시의 니트로 셀룰로오스 막에 놓았다. 막에 대한 초기 조직 부착 후, 폐 조직/니트로세포막 복합체를 생물반응기 용기에 넣고 10일 동안 성공적으로 배양하였다(그림 6A). 폐 조직 성장에 대한 염증 상태의 영향을 연구하기 위해 배양 배지에 IL-6를 첨가하면 생체 내에서 보이는 것과 유사한 폐포 형태에서 전형적인 염증 관련 변화가 발생했습니다(그림 6B).
그림 1. 생물 반응기 용기의 구성 요소. 그림 1은 생물 반응기 용기의 주요 구성 요소와 사전 조립 단계에서의 위치를 보여줍니다. (A) 반응기 챔버, 주사기 포트 및 스캐폴드의 상대적 위치. (B) 전면 플레이트 (투명 커버)와 후면 플레이트 (산소 공급기 막으로 덮인 흰색 플레이트)의 반 개방 위치. 비계는 앞판과 뒷면 사이의 중앙에 위치합니다. 검은 색 그래 핀 스캐 폴드 (C)는 스캐 폴드가 용기 내에 배치되고 세포가 증식, 분화 및 세포 네트워크를 형성하기위한 지지체로 사용되는 방법을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 본 연구에서 시험한 비계의 대표적인 예시. 바이오리액터 연구를 위해 5개의 스캐폴드를 테스트했으며 그 중 2개의 예가 여기에 제시되어 있습니다. (A,B)는 아멜로모세포 유사 세포 성장을 위해 테스트된 그래핀 스캐폴드를 나타내고, (C,D)는 당사의 바이오리액터 기반 세포 배양 연구에서 가장 성공적인 콜라겐 스캐폴드를 나타냅니다. 콜라겐 스캐폴드(C,D)의 다공성 구조와 그래핀 스캐폴드(A,B)의 표면 엠보싱의 평행 배열에 주목하십시오. (A,C)는 수직 관점에서 찍은 매크로 그래프이고 (B,D)는 45° 각도로 이미지화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 자궁 경부 루프 준비. A의 골격화된 성체 마우스 하악골은 ameloblast-like 세포 배양 및 분화를 위한 세포 틈새를 준비하는 데 사용되는 자궁 경부 루프 영역을 보여줍니다. 이 매크로 그래프는 또한 거의 전체 하악 길이에 걸쳐 지속적으로 성장하는 앞니 (inc), 하악의 각도와 함께 첫 번째 하악 어금니 (m1), 코로 노이드 과정 및 하악 과두의 위치를 포함하여 해부학 적 마커의 위치를 보여줍니다. 이 골격 준비는 (B)에서 준비된 자궁 경부 루프 영역에 대한 해부학 적 방향으로서 작용한다. 기준점에는 하악골(mand), 유두 조직(DP), 하악의 각도(각도) 및 ameloblast 생물 반응기 연구를 위한 세포를 수확한 경추 루프(CL)의 위치가 포함됩니다. 파선은 골격화 된 성인 하악골 (A)과 6 dpn 새로 해부 된 하악골 (B)에서 자궁 경부 루프 해부를 위해 준비된 하악 창의 전방 및 원위 부분을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 3D 공동 배양 접근법을 사용한 아멜로모세포 유사 세포 생성. (A) 적절한 미세 환경에서 치수 줄기 세포와 공동 배양 된 자궁 경부 루프 세포로부터 ameloblast-like 세포의 성공적인 분화. 생성 된 세포 집단은 에나멜 매트릭스 단백질을 분비하는 능력을 가진 길고 길쭉한 분극 된 세포로 구성되었습니다. 이 세포들은 한쪽 끝(nucl)의 핵과 다른 쪽 끝(A)의 진정한 ameloblasts에서 관찰되는 Tomes Process와 유사한 세포 과정(proc)을 특징으로 합니다. (B)는 공동 배양 조건도 받았지만 성장 인자 또는 분화 인자가없는 배지를 사용하여 전형적인 ameloblasts를 대표하지 않는 둥근 세포를 초래 한 대조군 세포 집단을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 코팅된 스캐폴드 표면과 코팅되지 않은 스캐폴드 표면을 가진 단일 세포 치주 전구체(pdl) 집단의 장기 3D 배양. 스캐폴드 코팅은 코팅되지 않은 스캐폴드(A)에 노출된 대조군 세포에 비해 갈라닌 코팅된 스캐폴드(B) 상에서 배양된 세포에서 hPDL 세포 증식 속도의 증가를 초래하였다. 실험군의 세포는 또한 대조군에 비해 결합 조직 섬유를 포함하는 세포 외 기질을 더 많이 분비했습니다 (B 대 A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 생물 반응기에서 폐 조직 배양. (a) E15 폐 조직 세그먼트를 10일 동안 생물반응기에서 니트로셀룰로스 막 상에서 배양하였다. (B) E15 폐 조직 절편은 (A)와 유사하지만 IL-6를 배지 (B)에 첨가하여 염증 상태를 실시한다. (C) H & E로 염색 된 새로 해부 된 E15 폐 조직의 파라핀 절편. (A)와 (C)를 비교할 때 폐포 유형 I 및 유형 II 세포 형태의 유사성에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미세중력에서 세포의 성장을 위한 프로토콜의 중요한 단계는 세포 분화를 유도하는 수단으로서 생물반응기, 스캐폴드, 3D 배양에 사용되는 세포, 및 스캐폴드 코팅을 포함한다. 우리 연구에 사용 된 생물 반응기의 유형은 시뮬레이션 된 미세 중력에서 세포를 성장시키기 위해 NASA가 개발 한 원래의 회전 세포 배양 시스템 (RCCS) 회전 원통형 조직 배양 장치의 최근 수정 인 RCCS-4 생물 반응기로 구성됩니다. 이 RCCS-4 환경은 매우 낮은 전단 응력을 제공하여 물질 전달을 향상시키고 배양 성능을 향상시킵니다. 이 버전의 생물 반응기는 동시에 4 개의 다른 실험을 위해 4 개의 용기를 동시에 사용할 수있었습니다. RCCS-4 바이오리액터에는 높은 종횡비(HARV) 용기가 장착되어 있어 연구를 위한 충분한 수의 세포로 간단하고 직접적인 배양 조건을 보장했습니다.
우리 접근 방식의 두 번째 중요한 구성 요소는 플로팅 셀이 어셈블리를 부착하고 형성할 수 있는 템플릿을 제공하는 스캐폴드입니다. 2D 배양에서 스캐폴드의 사용은 괴사성 코어의 형성으로 인해 제한되지만, 회전식 바이오리액터에서의 향상된 확산, 산소 및 영양소 흐름은 세포 어셈블리(28,29)의 전파를 위한 운반체로서 스캐폴드의 적용성을 향상시킨다. 본 연구에서는 5가지 유형의 스캐폴드, 폴리(락틱-코-글리콜산(PLGA) 스캐폴드, 콜라겐 및 다공성 스캐폴드, 그래핀 스캐폴드, 젤라틴 디스크 및 하이드로드록시아파타이트 디스크의 효능을 탐구했습니다. 또한 폐 장기 사전 배양 환경에서 배양 된 폐 세그먼트가 부착 된 생물 반응기로 막을 옮겼습니다. 이 중 콜라겐 스캐폴드는 콜라겐 구성과 다공성 구조로 인해 우리 연구에서 가장 유리한 스캐폴드로 등장했습니다. PLGA 스캐폴드는 생존 가능한 세포를 산출한 반면, 다른 3개의 스캐폴드는 우리 손에 덜 유리했습니다. 원래 폐 장기 배양 시스템의 니트로셀룰로오스 막은 3D 생물반응기 환경으로 이식된 후 배양된 폐의 무결성을 성공적으로 유지함에 따라 또 다른 효과적인 스캐폴드로 입증되었습니다.
우리 전략의 세 번째 중요한 구성 요소는 혈관을 파종하는 데 사용되는 세포 유형입니다. 우리의 amelogenesis 연구를 위해 우리는 치과 용 펄프 세포와 공동 배양 된 지속적으로 성장하는 마우스 앞니에서 준비된 자궁 경부 루프 세포에 의존했습니다. 자궁 경부 루프 세포는 설치류 앞니에서 지속적으로 재생되는 원래의 법랑질 장기 전구 세포의 공급원으로 선택되었습니다. 마우스 또는 쥐 앞니는 동물의 일생 동안 계속 존재하는 줄기 및 전구 세포의 놀라운 공급원이며 법랑질 기관의 세포는 지속적인 분화 및 amelogenesis23,30을 위해 보충됩니다. 치주 전구 세포와 치수 세포 모두 공동 배양 세포 공급원으로 사용되었습니다. 상피 세포의 성공적인 배양을 위한 중간엽 공동배양 세포 집단의 사용은 잘 확립되어 있다31,32. 우리 연구에서 치수 세포는 중간엽 특성에 따라 치열 및 중간엽 공동 배양 후보로 적합함에도 불구하고 치주 인대 전구 세포보다 아멜로모세포 분화를 유도하는 데 더 효과적이었습니다. amelogenesis에 적용될 때, 치아 발달 동안 치성 상피에 대한 자연적인 대응물로서 치과 용 치수 세포는 말단 ameloblast 분화33,34의 유도에 적합한 적절한 상피-중간 엽 상호 작용을 유발했을 수 있습니다. 그러나, 치주 조직 공학을위한 스캐 폴드 상호 작용의 연구를 위해, 치주 전구 세포는 완전히 분화 된 치주 인대 섬유 아세포25,35를 생성하기 때문에 이상적으로 적합했다. 마지막으로, 생물 반응기 환경에서 폐 기관의 배양을 위해, 우리는 해부 된 배아 쥐 폐 세그먼트에 의존했다. 장기 배양 접시에서 배아 폐 기관을 배양하는 절차는 앞서 설명되었으며(36) 폐 상피 세포와 혈관 또는 평활근 세포를 결합한 다수의 2차원 세포 배양 모델이 탐구되었다(37,38,39). 본 연구에서 3D 생물 반응기 모델은 배양 된 조직 블록의 코어의 무결성을 보존하면서 강력한 수준의 계면 활성제 분비를 유지하여이 모델을 폐 조직 무결성에 대한 환경 영향 연구에 적합하게 만들었습니다.
우리 모델의 네 번째 중요한 측면은 아멜로모세포 유사 세포 분화를 유발하기 위해 스캐폴드 표면에 세포 유형 특정 코팅을 적용하는 것입니다. 특히, LRAP 및 법랑질 매트릭스와 같은 구성 요소는 LRAP로 코팅되지 않아 길쭉하고 분극 된 세포의 형성을 금지함에 따라 ameloblast-like 세포 분화에 대한 주요 기여 요인으로 나타났습니다. 함께, 비계 표면의 코팅은 생물 반응기에서 복잡한 장기의 조직 특이 적 분화를 촉진하는 강력한 도구를 제공합니다.
이 연구의 가장 중요한 측면은 ameloblasts의 독특한 길쭉하고 편광 된 세포 모양을 복원하는 능력이었습니다. 이러한 결과는 에나멜-장기 유도체 세포를 고도로 둥글게 하는 2D 배양 시스템의 한계에 비해 3D 바이오리액터 시스템의 고유한 이점입니다. 이러한 결과는 다른 배양 기술40과 양립할 수 없는 세포를 배양할 때 생물반응기 기술을 사용하는 이점에 대한 추가의 증거를 제공한다. 우리는 ameloblast 공동 배양 연구의 성공을 영양소, 성장 및 전사 인자, 산소의 지속적인 공급뿐만 아니라 다양한 혈통 및 발달 단계의 세포 간의 사회적 상호 작용을 응집하고 형성하는 개별 세포의 능력을 포함하여 회전 생물 반응기 시스템의 몇 가지 고유 한 속성에 기인합니다. 연구는 아멜로모세포 유사 세포를 분비하는 길쭉하고 분극화된 아멜로게닌을 성장시키는 데 성공했지만 여기에서 성장한 아멜로모세포 유사 세포는 분리된 상태로 유지되고 아멜로모세포 세포 열의 자연적인 연속성이 손실되었습니다. 미래의 응용 분야에서는 이 기술로 성장한 아멜로모세포 유사 세포가 법랑질 조직 공학 응용 분야 또는 치아 유색 형성의 측면을 요약하기 위한 실험 모델로 사용될 수 있습니다.
결론적으로, 3D 바이오리액터는 자궁경부 루프/치수 공동 배양을 ameloblasts로 전파하고, 코팅된 스캐폴드에서 치주 인대 전구체의 성장 및 전체 폐 장기의 배양을 위한 성공적인 환경으로 부상했습니다. 이러한 데이터를 바탕으로 생물 반응기 기반 기술은 치아 법랑질, 치주 및 폐 연구와 같은 분야에서 고급 조직 공학 또는 테스트 전략을위한 중요한 수단으로 부상 할 가능성이 높습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
연구는 국립 치과 및 두개 안면 연구소 (UG3-DE028869 및 R01-DE027930)의 보조금으로 아낌없이 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -y, Wang, X. -m, Li, X. -y An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au - Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
