Summary
Denne protokollen presenterer en metode for kultur og 3D-vekst av ameloblastlignende celler i mikrogravitasjon for å opprettholde sin langstrakte og polariserte form samt emaljespesifikt proteinuttrykk. Kulturforhold for kulturen av periodontale konstruksjoner og lungeorganer i mikrogravitasjon er også beskrevet.
Abstract
Gravity er en av de viktigste determinanter for menneskelig cellefunksjon, proliferasjon, cytoskeletal arkitektur og orientering. Roterende bioreaktorsystemer (RCCS) etterligner tapet av tyngdekraften når det oppstår i rommet og gir i stedet et mikrogravitasjonsmiljø gjennom kontinuerlig rotasjon av dyrkede celler eller vev. Disse RCCS-ene sikrer en uavbrutt tilførsel av næringsstoffer, vekst- og transkripsjonsfaktorer og oksygen, og adresserer noen av manglene ved gravitasjonskrefter i ubevegelige 2D (todimensjonale) celle- eller organkulturretter. I denne studien har vi brukt RCCS til å samkulturere cervikale sløyfeceller og tannmasseceller til å bli ameloblaster, for å karakterisere periodontale progenitor/stillas-interaksjoner, og for å bestemme effekten av inflammasjon på lungealveoler. RCCS-miljøene lettet veksten av ameloblastlignende celler, fremmet periodontal stamcelleproliferasjon som respons på stillasbelegg, og tillot en vurdering av effekten av inflammatoriske endringer på dyrkede lungealveoler. Dette manuskriptet oppsummerer miljøforholdene, materialene og trinnene underveis og fremhever kritiske aspekter og eksperimentelle detaljer. Avslutningsvis er RCCSer innovative verktøy for å mestre kulturen og 3D (tredimensjonal) vekst av celler in vitro og for å tillate studier av cellulære systemer eller interaksjoner som ikke er mottagelige for klassiske 2D-kulturmiljøer.
Introduction
Gravity påvirker alle aspekter av livet på jorden, inkludert biologien til individuelle celler og deres funksjon i organismer. Celler registrerer tyngdekraften gjennom mekanoreceptorer og reagerer på endringer i tyngdekraften ved å omkonfigurere cytoskeletale arkitekturer og ved å endre celledeling 1,2,3. Andre effekter av mikrogravitasjon inkluderer det hydrostatiske trykket i væskefylte vesikler, sedimentering av organeller og oppdriftsdrevet konveksjon av strømning og varme4. Studier på effekten av tap av tyngdekraften på menneskelige celler og organer ble opprinnelig utført for å simulere det vektløse miljøet i rommet på astronauter under romferder5. Men de siste årene har disse 3D-bioreaktorteknologiene som opprinnelig ble utviklet av NASA for å simulere mikrogravitasjon, blitt stadig mer relevante som nye tilnærminger for kulturen av cellepopulasjoner som ellers ikke er mottagelige for 2D-kultursystemer.
3D-bioreaktorer simulerer mikrogravitasjon ved å dyrke celler i suspensjon og dermed skape en konstant "fritt fall" -effekt. Andre fordeler med de roterende bioreaktorene inkluderer mangel på lufteksponering som oppstår i organkultursystemer, en reduksjon i skjærspenning og turbulens, og en kontinuerlig eksponering for en skiftende tilførsel av næringsstoffer. Disse dynamiske forholdene gitt av en Rotary Cell Culture System (RCCS) bioreaktor favoriserer romlig samlokalisering og tredimensjonal montering av enkeltceller i aggregater 6,7.
Tidligere studier har vist fordelene med en roterende bioreaktor for beinregenerering8, tannkimkultur9 og for kulturen av humane tannfollikelceller10. Det har også vært en rapport som tyder på at RCCS forbedrer EOE-celleproliferasjon og differensiering i ameloblaster11. Imidlertid ble differensierte celler vurdert ameloblaster basert på ameloblastin immunfluorescens og / eller amelogeninuttrykk alene11 uten å vurdere deres langstrakte morfologi eller polariserte celleform.
I tillegg til den NASA-utviklede roterende veggfartøy (RWV) bioreaktoren, inkluderer andre teknologier for å generere 3D-aggregater fra celler magnetisk levitasjon, tilfeldig posisjoneringsmaskin (RPM) og clinostat12. For å oppnå magnetisk levitasjon leviteres celler merket med magnetiske nanopartikler ved hjelp av en ekstern magnetisk kraft, noe som resulterer i dannelsen av stillasfrie 3D-strukturer som har blitt brukt til biofabrikasjon av adipocyttstrukturer13,14,15. En annen tilnærming til å simulere mikrogravitasjon er genereringen av multidireksjonelle G-krefter ved å kontrollere samtidig rotasjon om to akser, noe som resulterer i en kansellering av den kumulative tyngdekraftvektoren i midten av en enhet kalt clinostat16. Når benmargsstamceller ble dyrket i en clinostat, ble ny beindannelse hemmet gjennom undertrykkelse av osteoblastdifferensiering, noe som illustrerer en av de dedifferentierende effektene av mikrogravitasjon16.
In vitro-systemer for å lette den trofaste kulturen til ameloblaster ville gi et stort skritt fremover mot tannemaljevevsteknikk17. Dessverre har kulturen i ameloblaster til dags dato vært en utfordrende oppgave18,19. Så langt har fem forskjellige ameloblastlignende cellelinjer blitt rapportert, inkludert mus ameloblast-lineage cellelinje (ALC), rotte dental epitelcellelinje (HAT-7), mus LS8 cellelinje20, svin PABSo-E cellelinje 21 og rotte SF2-24 cellelinje22. Imidlertid har flertallet av disse cellene mistet sin karakteristiske polariserte celleform i 2D-kultur.
I denne studien har vi vendt oss til et Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) for å lette veksten av ameloblastlignende celler fra cervical loop epithelia co-dyrket med mesenkymale forfedre og for å overvinne utfordringene i 2D-kultursystemer, inkludert redusert strøm av næringsstoffer og cytoskeletale endringer på grunn av tyngdekraften. I tillegg har RCCS gitt nye veier for studier av celle / stillasinteraksjoner relatert til periodontal vevsteknikk og å undersøke effekten av inflammatoriske mediatorer på lungealveolært vev in vitro. Sammen fremhever resultatene fra disse studiene fordelene med mikrogravitasjonsbaserte rotatoriske kultursystemer for forplantning av differensiert epitel og for vurdering av miljøpåvirkninger på celler dyrket in vitro, inkludert celle / stillas-interaksjoner og vevsrespons på inflammatoriske tilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All nødvendig institusjonell godkjenning ble innhentet for å sikre at studien var i samsvar med TAMU institusjonelle dyrepleieretningslinjer.
1. Bioreaktormontering og sterilisering
- Steriliser fire HARV-beholdere (High Aspect Ratio) for bioreaktoren i en autoklav på plastinstrumentsyklusen i 20 minutter ved 121 °C som anbefalt av produsenten.
- Etter sterilisering, monter karene i en cellekulturhette ved å stramme skruene som følger med bioreaktoren, hvoretter karene er klare til bruk.
2. Stillas brukt til bioreaktor-kokultureksperimentet
- Inkuber stillasene sammen med cellene for å gi støtte til cellefeste som er nødvendig for videre vekst.
- Velg mellom PGA-baserte stillaser, hydroksyapatittstillaser, grafenark, gelatinskiver og kollagenbaserte stillaser for samkulturstudier.
3. Cervical Loop (CL) disseksjon og enkeltcellepreparasjon
- Ofre mus ved halshugging etter åndedrettsstans ved CO2 overdose.
MERK: Alle dyreforsøk er i samsvar med TAMU institusjonelle dyrepleieretningslinjer. - Dissekere cervical looper fra 6 dager postnatal (DPN) mus etter en modifisert versjon av en tidligere publisert protokoll23.
MERK: I vår studie er distale del av cervikalsløyfen som ikke er vist i tidligere publisert protokoll inkludert (figur 3).- Vask det dissekerte vevet med kald steril PBS før fordøyelsen med kollagenasedispase ved 37 °C i 30 minutter.
- Pass løsningen gjennom en 70 μm steril cellesil og videre sentrifuge ved 800 x g i 10 minutter.
- Kast supernatanten. Sentrifuge pelleten og vask to ganger med kald PBS ved 800 x g. Kast supernatanten.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og tilsett 1 X 105 celler per fartøy.
4. Dental massecellekultur og utvidelse av cellelinjer
- Platetannmasseceller i en 100 mm vevskulturplate ved passasje 4 i en konsentrasjon på 1 x 105.
- Forbered media for kulturen som består av DMEM høyt glukosemedium, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika / antimykotisk (P / S).
- Når cellene når 85-90% sammenløp, aspirerer mediet og vasker platene to ganger med forvarmet PBS.
- Etter PBS-vask, tilsett en forvarmet 0,25% Trypsin-EDTA-løsning på platen, og inkuber de tannmassecelleholdige platene ved 37 ° C i 3 minutter.
- Bekreft celleløsrivelse ved visuell inspeksjon ved hjelp av et mikroskop.
- Samle mediet sammen med cellene fra kulturplaten og overfør via en 25 ml pipette til et 50 ml sterilt konisk rør.
- Sentrifuge cellene ved 800 x g i 8 minutter og kast supernatanten. Resuspend cellene i friske medier og telle ved hjelp av et hemocytometer.
- For samkultur med cervikale sløyfeceller, frø tannmassecellene i bioreaktoren i en konsentrasjon på 1 x 104 per kar.
5. Samkultur av cervikalløkke-/tannmasseceller på et stillas i RCCS-bioreaktoren
- Legg til begge celletyper, livmorhalssløyfen og tannmassen til kulturmediet som inneholder keratinocytt SFM-medier med supplerte vekstfaktorer, ekstracellulære matriksproteiner og stillaser.
MERK: Vekstfaktorer tilsettes i en konsentrasjon på 0,03 μg/ml benmorfogenetisk protein 2 (BMP 2), 0,03 μg/ml benmorfogenetisk protein 4 (BMP-4), 10 ng/ml human rekombinant fibroblastvekstfaktor (hFGF) og 15 ng/ml epidermal vekstfaktor (hEGF), mens ECM-komponenter inkluderte 200 μg/ml Matrigel, 5 μg/ml laminin og 5 μg/ml fibronektin. - Belegg stillaser med en blanding av 500 μL kollagengel beriket med 1 mg LRAP (Leucinrikt amelogeninpeptid) peptid, 1 mg lyofilisert emaljematrise i tidlig stadium fremstilt fra svinetenner24, 5 μg / ml laminin og 5 μg / ml fibronektin.
MERK: Dette fungerte best for våre eksperimenter. - Etter stillasbelegg, tilsett både celler og stillas til bioreaktoren, og fyll bioreaktoren med 10 ml medium per fartøy.
- Lukk fyllporthetten på bioreaktorbeholderen etter tilsetning av medier, celler og stillaser.
- Fest de sterile ventilene til sprøyteportene i begynnelsen av forsøket og hold dem på plass med et deksel til slutten av forsøket.
- Når beholderen er 90% full og påfyllingsporthettene er lukket og strammet, åpner du de sterile ventilene.
- Bruk to sterile sprøyter (3 ml) hver gang det er nødvendig å bytte medier. Fyll en sprøyte med nytt medium mens den andre sprøyten er tom.
- Åpne begge sprøyteventilene og manøvrer boblene forsiktig mot den tomme sprøyteporten.
- Når det ferske mediet fra hele sprøyten er forsiktig injisert i beholderen, fjernes boblene gjennom den tomme sprøyteporten.
MERK: Denne prosedyren utføres til alle mikroboblene er fjernet fra karene. - Lukk sprøyteportene med korker og kast sprøytene i en avfallsbeholder for skarpe gjenstander.
- Fest hvert fartøy til rotatorbasen og plasser rotatorbasen i en inkubator med 5% CO2 og 37 ° C temperatur.
- Slå på strømmen og sett rotasjonshastigheten til 10,1 o / min.
MERK: Juster hastigheten for å sikre at stillasene er i suspensjon uten å berøre fartøyets vegg. - For medieendring, plasser fartøyene i oppreist stilling for å sikre at cellene legger seg nederst. Åpne sprøyteportene og koble de sterile sprøytene til portene.
- Følg samme prosedyre ved å aspirere 75% av det næringsfattige mediet og injisere ferskt medium gjennom den andre porten.
6. Lungeorganpreparasjon og bioreaktorbasert kultur
MERK: E15 villtype musevalper ble brukt til fremstilling av lungeorganer.
- Disseker lungevevet etter å ha avlivet en gravid hunnmus med CO2-kvelning .
- Når dødsfallet er bekreftet etter kvelning ved cervikal dislokasjon, bruk en skalpell for å eksponere brysthulen. Deretter fjerner du valpene fra livmoren og avliver ved halshugging.
- Etter avlivning, klargjør brysthulen ved å åpne den med en skalpell for å lokalisere lungene. Vask små segmenter av lungevev med steril PBS og legg det på en presterilisert membran i 2 timer med organkulturmedium i en inkubator som inneholder 5% CO2 og 37 ° C temperatur.
- Når lungevevvet festes til membranen i en 2D-organkulturplate, overfører du prøvene til bioreaktorbeholderen.
- Forbered media for kultur.
MERK: Kontrollen DMEM høy glukose media inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% antibiotikaoppløsning (P / S) (penicillin, 100 U / ml, streptomycin, 50 μg / ml) og 100 μg / ml askorbinsyre (AA) og for induksjon av inflammatoriske tilstander suppleres kontrollmedium med 5 ng / ml IL-6 protein. - Utfør lungekultureksperimentet i 10 dager med en medieendring hver 48. time i bioreaktoren som beskrevet ovenfor.
7. Belagt stillas med humant periodontalt ligament (hPDL) cellekultur
- Kultur menneskelige periodontale ligamentceller.
MERK: Cellene er isolert og dyrket i laboratoriet vårt i henhold til protokollen som tidligere ble publisert25. - Belegge kollagenstillasskivene med 30 μL PBS for kontrollgruppen og nevropeptidet galanin (GAL) i en konsentrasjon på 10-8 over natten.
- Frø humane PDL-celler på kontroll- og GAL-belagt stillas i 2 timer ved 37 °C i en kulturplate, og overfør cellefrøede stillaser til et bioreaktorkar som nevnt ovenfor.
- Dyrk cellen sådde stillas i 14 dager i bioreaktoren før høsting av stillasene for analyse.
8. Rengjøring og vedlikehold av bioreaktor
- Etter at stillasene/cellene er høstet fra bioreaktoren, fjern sprøyteportene fra beholderen.
MERK: Skruene rundt karene tas av og karet vaskes forsiktig med såpevann. - Skyll karene med rent vann og stram skruene igjen.
- Oppbevar fartøyene etter autoklavering til neste bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det indre kammeret i bioreaktoren gir et miljø for cellene å spre seg og differensiere, feste seg til et stillas eller samles for å danne vev som forsamlinger. Hvert HARV-fartøy holder opptil 10 ml medium og letter en konstant sirkulasjon av næringsstoffer slik at hver celle har en utmerket sjanse til å overleve. Figur 1A illustrerer festingen av sprøyteportene til frontplaten på karet der sterile ett-stopp-ventiler er festet. Disse ventilene fungerer som dørvakter til kulturkammeret. Middels forandring krever at stoppkranventilen åpnes for å lette festingen av en steril sprøyte som inneholder nytt medium. Mikrogravitasjonsmiljøet i bioreaktoren gjør det mulig for celler å feste seg til stillaset i karet uten å kreve forutgående såing på stillasene. Stillaset (figur 1B og 1C) plassert i bioreaktoren roterer kontinuerlig, slik at celler kan feste seg til stillasflater og danne cytoskeletale nettverk. Oksygenatormembranen i bunnen av karplaten (figur 1B) muliggjør kontinuerlig gassutveksling for å forbedre celleoverlevelse og levetid.
Ulike stillaser ble testet for å identifisere stillaset som er mest kompatibelt med cellene. Stillaset i figur 2A og 2B er et grafenark sammensatt av 75% grafen og 25% PLG (poly-melketisk glykolid). Dette elektrisk ledende stillaset brukes ofte til celler som kan kreve elektrisk stimulering, for eksempel skjelettmuskelceller26. I våre studier overgikk kollagen stillaset alle andre studier testet med hensyn til biokompatibilitet, fremme av vevsvekst og cellulær differensiering. Den spesialiserte porøse overflaten av dette kollagenbaserte stillaset (figur 2C og 2D) gjør at cellene og næringsstoffene kan strømme gjennom stillaset, og øker området for cellefeste og celleproliferasjon.
Plasseringen av livmorhalssløyfen i forhold til musemandibelen er illustrert i figur 3A og 3B. For å forberede musens cervikale sløyfeceller ble en skjelettert musemandibel dissekert og den distale delen av den nedre musesnittet ble utsatt. Den nøyaktige posisjonen til den resekterte livmorhalssløyfen er avgrenset i 6 dager postnatal musesnitt (figur 3B), mens en lignende region i en voksen skjelettert musemandibel er gitt som referanse i figur 3A for orienteringsformål. Arealet av den korresponderende livmorhalssløyfen i den voksne skeletonized (figur 3A) og 6 dpn nypreparert musesnitt er innrammet av to brutte linjer (figur 3A og B). Tannprotesen til hemi-mandiblene består av tre mandibulære molarer og et kontinuerlig voksende snitt, mens livmorhalssløyfecellenisjen består av en blandet cellepopulasjon involvert i emaljedannelse som det indre emaljeepitelet, ytre emaljeepitel, stellatretikulum og stratum intermedium19.
Figur 4 fokuserer på vellykket differensiering av livmorhalssløyfecellene til langstrakte, polariserte, emaljeprotein som utskiller ameloblastlignende celler. Dataene viste at vellykket differensiering av langstrakte, polariserte, emaljeproteinutskillende ameloblastlignende celler krever samkulturen av livmorhalssløyfecellene med mesenkymale stamceller som tannmasse stamceller. Kultiverte celler ble forsynt med et skreddersydd mikromiljø som beskrevet i trinn 3 i protokollen, noe som resulterte i dannelsen av polariserte celler med kjernen i den ene enden og en lang cellulær prosess i den andre27, en typisk egenskap for ameloblaster (figur 4A). Påføring av medier alene og uten vekstfaktorer og/eller stillasbelegg resulterte i cervikale sløyfeceller som utskilte viktige emaljeproteiner, men som ikke forlenget eller polariserte (figur 4B).
Galaninbelagte og ikke-belagte kollagen stillaser ble plassert i en bioreaktor med hPDL-celler i fjorten dager i en bioreaktor. Cellene overlevde en to ukers dyrkningsperiode i 3D-kultursystemet, og den galaninbelagte stillasgruppen viste en signifikant høyere proliferasjonsrate (figur 5B) sammenlignet med kontrollgruppen med ubelagte stillaser (figur 5A). Cellene i forsøksgruppen viste også et signifikant høyere nivå av ekstracellulær matriks som inneholdt bindevevsfibre sammenlignet med kontrollen.
Bioreaktormiljøet viste seg å være vellykket for veksten av lungesegmenter i et 3D-mikrogravitasjonsmiljø (figur 6). For denne studien ble lungevevsegmenter høstet fra E15-mus (figur 6C) plassert på en nitrocellulosemembran i en organkulturskål i to timer. Etter initial vevsfeste til membranen ble lungevevet/nitrocellulær membrankompositt plassert i bioreaktorkaret og ble vellykket dyrket i 10 dager (figur 6A). For å studere effekten av inflammatoriske tilstander på lungevevsvekst, resulterte tillegg av IL-6 til kulturmediet i typiske betennelsesassosierte endringer i alveolær morfologi lik de som er sett in vivo (figur 6B).
Figur 1. Komponenter i et bioreaktorfartøy. Figur 1 illustrerer nøkkelkomponenter i et bioreaktorkar og deres posisjon i et formonteringsstadium. (A) Relativ plassering av reaktorkammeret, sprøyteportene og stillaset. (B) Halvåpen posisjon av frontplaten (klart deksel) og bakplaten (hvit plate dekket av oksygenatormembran). Stillaset er plassert i midten mellom front- og bakplaten. Det svartfargede grafenstillaset (C) illustrerer hvordan et stillas plasseres i karet og brukes som støtte for cellene til å spre seg, differensiere og danne et mobilnettverk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative illustrasjoner av stillaser testet i denne studien. Fem stillas ble testet for våre bioreaktorstudier, hvorav to eksempler er presentert her. (A,B) representerer grafenstillaset som er testet for ameloblastlignende cellevekst, mens (C,D) representerer kollagenstillaset som er mest vellykket for våre bioreaktorbaserte cellekulturstudier. Legg merke til den porøse strukturen til kollagen stillas (C, D) versus den parallelle matrisen av overflatepreg i grafen stillas (A, B). (A,C) er makrografer tatt fra et vinkelrett perspektiv mens (B,D) ble avbildet i en 45° vinkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Cervical loop forberedelse. Den skeletoniserte voksne musemandibelen i A demonstrerer livmorhalssløyfeområdet som brukes til å forberede cellenisjen for ameloblastlignende cellekultur og differensiering. Denne makrografen illustrerer også posisjonen til anatomiske markører, inkludert det kontinuerlig voksende snittet (inc) som spenner over nesten hele mandibulærlengden, den første mandibulære molaren (m1) sammen med mandibelens vinkel, koronoidprosessen og posisjonen til mandibulærkondylen. Dette skjelettpreparatet tjener som en anatomisk orientering for livmorhalssløyfeområdet fremstilt i (B). Referansepunkter inkluderer mandibulært bein (mand), dental papillavev (DP), vinkelen på mandibelen (Angle) og posisjonen til livmorhalssløyfen (CL) som cellene for våre ameloblastbioreaktorstudier ble høstet fra. Den brutte linjen indikerer den fremre og distale delen av det fenestrerte mandibulære vinduet forberedt for cervikal sløyfedisseksjon i skjelettisert voksenmandibel (A) og i 6 dpn nydissekert mandibel (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Generering av ameloblast-lignende celler ved hjelp av en 3D-kokulturtilnærming. (A) Vellykket differensiering av ameloblastlignende celler fra cervikale sløyfeceller dyrket sammen med tannmasse stamceller i et egnet mikromiljø. Den resulterende cellepopulasjonen besto av lange, langstrakte, polariserte celler med evnen til å utskille emaljematriseproteiner. Disse cellene inneholdt en kjerne i den ene enden (nukl) og en cellulær prosess (proc) som lignet Tomes Process som observert i ekte ameloblaster i den andre enden (A). (B) illustrerer en populasjon av kontrollgruppeceller som også ble utsatt for samkulturforhold, men med medier uten vekstfaktorer eller differensieringsmidler, noe som resulterte i avrundede celler som ikke var representative for typiske ameloblaster. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Langsiktig 3D-kultur av en enkeltcellet periodontal stamfar (pdl) populasjon med belagte og ikke-belagte stillasflater. Stillasbelegg resulterte i en økning i hPDL-celleproliferasjonshastigheten i celler dyrket på det galaninbelagte stillaset (B) sammenlignet med kontrollgruppecellene utsatt for et ikke-belagt stillas (A). Cellene fra forsøksgruppen utskilte også mer ekstracellulær matriks som inneholdt bindevevsfibre sammenlignet med kontrollgruppen (B versus A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Lungevevskultur i en bioreaktor. (A) E15 lungevevssegmenter dyrket på en nitrocellulosemembran i en bioreaktor i ti dager. (B) E15 lungevev segmenter som ligner på (A), men utsatt for inflammatoriske tilstander ved å legge IL-6 til media (B). (C) Parafinseksjon av et nydissekert E15 lungevev farget med H&E. Merk likheter i alveolær type I og type II cellemorfologier ved sammenligning (A) og (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen for vekst av celler i mikrogravitasjon inkluderer bioreaktoren, stillaset, cellene som brukes til 3D-kultur og stillasbelegget som et middel til å indusere celledifferensiering. Den type bioreaktor som brukes i våre studier omfatter RCCS-4 bioreaktor, en nylig modifikasjon av den opprinnelige Rotary Cell Culture System (RCCS) roterende sylindrisk vev kultur enhet utviklet av NASA for å vokse celler i simulert mikrogravitasjon. Dette RCCS-4-miljøet gir ekstremt lave skjærspenninger, noe som forbedrer masseoverføringen og forbedrer kulturens ytelse. Denne versjonen av bioreaktoren tillot samtidig bruk av fire fartøy for fire forskjellige eksperimenter samtidig. RCCS-4 bioreaktoren var utstyrt med HARV-kar (High Aspect Ratio), som sikret enkle og rett frem kulturforhold med et tilstrekkelig antall celler for våre studier.
En annen kritisk komponent i vår tilnærming er stillasene, da de gir maler for flytende celler for å feste og danne sammenstillinger. Mens bruken av stillaser i 2D-kultur er begrenset på grunn av dannelsen av nekrotiske kjerner, forbedrer den forbedrede diffusjonen, oksygen- og næringsstrømmen i en roterende bioreaktor anvendeligheten av stillaser som bærere for forplantning av cellesamlinger28,29. I denne studien undersøkte vi effekten av fem typer stillaser, poly(melke-ko-glykolsyre (PLGA)-stillas, et kollagenøst og porøst stillas, et grafenstillas, samt en gelatinskive og en hydrodroksyapatittskive. I tillegg overførte vi membranen fra lungeorganets prekulturmiljø til bioreaktoren, med det dyrkede lungesegmentet festet til det. Blant disse fremsto kollagenstillaset som det gunstigste stillaset i våre studier, muligens på grunn av dets kollagenøse sammensetning og porøse struktur. PLGA-stillaset ble gitt levedyktige celler, mens de tre andre stillasene var mindre gunstige i våre hender. Nitrocellulosemembranen i det opprinnelige lungeorgankultursystemet viste seg å være et annet effektivt stillas, da det vellykket opprettholdt integriteten til den dyrkede lungen etter overføring til 3D-bioreaktormiljøet.
En tredje kritisk komponent i vår strategi er hvilke typer celler som brukes til å så fartøyet. For våre amelogenesestudier stolte vi på livmorhalssløyfeceller utarbeidet fra de kontinuerlig voksende musefortennene som ble dyrket sammen med tannmasseceller. Cervical loop celler ble valgt som kilde til de opprinnelige emalje organ forfedrene som kontinuerlig fornyes i gnager fortenn. Mus- eller rotteinnsnittet er en bemerkelsesverdig kilde til stam- og stamceller som fortsetter å eksistere gjennom hele dyrets liv mens cellene i emaljeorganet etterfylles for kontinuerlig utbrudd og amelogenese23,30. Både periodontale stamceller og tannmasseceller ble brukt som kokulturcellekilder. Bruken av mesenkymale kokulturcellepopulasjoner for vellykket kultur av epitelceller er godt etablert31,32. I våre studier var tannmasseceller mer effektive til å indusere ameloblastdifferensiering enn periodontale ligamentprogenitorer, selv om begge er egnet som odontogene og mesenkymale kokulturkandidater basert på deres mesenkymale egenskaper. Når de brukes mot amelogenese, kan tannmasseceller som det naturlige motstykket til odontogent epitel under tannutvikling ha utløst passende epitel-mesenkymale interaksjoner egnet for induksjon av terminal ameloblastdifferensiering33,34. For studiet av stillasinteraksjoner for periodontal vevsteknikk var imidlertid periodontale forfedre ideelle da de gir opphav til fullt differensierte periodontale ligamentfibroblaster25,35. Til slutt, for kulturen av lungeorganer i et bioreaktormiljø, stolte vi på dissekerte embryonale murine lungesegmenter. Prosedyrer for å dyrke embryonale lungeorganer i organkulturskåler er beskrevet tidligere36, og en rekke todimensjonale cellekulturmodeller som kombinerer lungeepitelceller med vaskulære eller glatte muskelceller er utforsket37,38,39. I denne studien opprettholdt 3D-bioreaktormodellen et robust nivå av overflateaktivt sekresjon samtidig som integriteten til kjernen i den dyrkede vevsblokken ble bevart, noe som gjorde denne modellen egnet for studier av miljøeffekter på lungevevets integritet.
Det fjerde viktige aspektet ved vår modell er anvendelsen av celletypespesifikke belegg på stillasflatene for å utløse ameloblastlignende celledifferensiering. Spesielt oppstod komponenter som LRAP og emaljematrise som viktige medvirkende faktorer mot ameloblastlignende celledifferensiering, da mangel på belegg med LRAP og innledende emaljematrise forbød dannelsen av langstrakte og polariserte celler. Sammen gir belegget av stillasflater et kraftig verktøy for å fremme vevsspesifikk differensiering av komplekse organer i bioreaktorer.
Det viktigste aspektet ved denne studien var evnen til å gjenopprette den karakteristiske langstrakte og polariserte celleformen til ameloblaster. Dette resultatet er en unik fordel med 3D-bioreaktorsystemet over begrensningene i 2D-kultursystemer som svært avrundede emaljeorganderivatceller. Dette resultatet gir ytterligere bevis for fordelen ved bruk av bioreaktorteknologier når man dyrker celler som er uforenlige med andre kulturteknologier40. Vi tilskriver suksessen til ameloblast-kokulturstudiene til flere unike egenskaper ved det roterende bioreaktorsystemet, inkludert kontinuerlig tilførsel av næringsstoffer, vekst- og transkripsjonsfaktorer og oksygen, samt individuelle cellers evne til å aggregere og danne sosiale interaksjoner mellom celler av forskjellige avstamninger og utviklingsstadier. Mens studiene lyktes i å vokse langstrakte, polariserte og amelogenin som utskiller ameloblastlignende celler, forblir de ameloblastlignende cellene som vokser her isolert, og den naturlige kontinuiteten til ameloblastcelleraden gikk tapt. I fremtidige applikasjoner kan ameloblastlignende celler dyrket med denne teknologien brukes til emaljevevstekniske applikasjoner eller som en eksperimentell modell for å rekapitulere aspekter av tannamelogenese.
Avslutningsvis oppsto 3D-bioreaktoren som et vellykket miljø for forplantning av cervikal sløyfe / tannmasse co-kulturer i ameloblaster, for vekst av periodontale ligamentprogenitorer i belagte stillaser og for kulturen av hele lungeorganer. Basert på disse dataene vil bioreaktorbaserte teknologier sannsynligvis dukke opp som viktige kjøretøy for avansert vevsteknikk eller teststrategier på områder som tannemalje, periodontal og lungeforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Studier ble sjenerøst støttet av tilskudd fra National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 og R01-DE027930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -y, Wang, X. -m, Li, X. -y An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au - Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
