Summary
Este protocolo apresenta um método para a cultura e crescimento 3D de células semelhantes a ameloblastos em microgravidade para manter sua forma alongada e polarizada, bem como a expressão de proteínas específicas do esmalte. Condições de cultura para a cultura de construções de engenharia periodontal e órgãos pulmonares em microgravidade também são descritas.
Abstract
A gravidade é um dos principais determinantes da função celular humana, proliferação, arquitetura citoesquelética e orientação. Os sistemas de biorreatores rotativos (RCCSs) imitam a perda de gravidade à medida que ocorre no espaço e, em vez disso, fornecem um ambiente de microgravidade através da rotação contínua de células ou tecidos cultivados. Esses RCCSs garantem um suprimento ininterrupto de nutrientes, fatores de crescimento e transcrição e oxigênio, e abordam algumas das deficiências das forças gravitacionais em pratos de cultura de células ou órgãos 2D (bidimensionais) imóveis. No presente estudo, utilizamos RCCSs para co-cultivar células de alça cervical e células da polpa dentária para se tornarem ameloblastos, para caracterizar interações progenitor/andaime periodontal e para determinar o efeito da inflamação nos alvéolos pulmonares. Os ambientes do CCRC facilitaram o crescimento de células semelhantes a ameloblastos, promoveram a proliferação de progenitores periodontais em resposta a revestimentos de andaimes e permitiram uma avaliação dos efeitos das alterações inflamatórias nos alvéolos pulmonares cultivados. Este manuscrito resume as condições ambientais, materiais e etapas ao longo do caminho e destaca aspectos críticos e detalhes experimentais. Em conclusão, os CCRCs são ferramentas inovadoras para dominar a cultura e o crescimento 3D (tridimensional) de células in vitro e para permitir o estudo de sistemas celulares ou interações não passíveis de ambientes clássicos de cultura 2D.
Introduction
A gravidade afeta todos os aspectos da vida na Terra, incluindo a biologia das células individuais e sua função dentro dos organismos. As células sentem a gravidade através de mecanorreceptores e respondem a mudanças na gravidade reconfigurando arquiteturas citoesqueléticas e alterando a divisão celular 1,2,3. Outros efeitos da microgravidade incluem a pressão hidrostática em vesículas cheias de fluido, sedimentação de organelas e convecção de fluxo e calor impulsionada por flutuabilidade4. Estudos sobre o efeito da perda de gravidade em células e órgãos humanos foram originalmente conduzidos para simular o ambiente sem peso do espaço em astronautas durante missões de voo espacial5. No entanto, nos últimos anos, essas tecnologias de biorreatores 3D originalmente desenvolvidas pela NASA para simular a microgravidade estão se tornando cada vez mais relevantes como novas abordagens para a cultura de populações celulares que, de outra forma, não são passíveis de sistemas de cultura 2D.
Os biorreatores 3D simulam a microgravidade cultivando células em suspensão e, assim, criando um efeito constante de "queda livre". Outras vantagens dos biorreatores rotativos incluem a falta de exposição ao ar encontrada em sistemas de cultura de órgãos, uma redução na tensão de cisalhamento e turbulência, e uma exposição contínua a um suprimento variável de nutrientes. Essas condições dinâmicas proporcionadas por um biorreator do Sistema de Cultura de Células Rotativas (CCRC) favorecem a colocalização espacial e a montagem tridimensional de células individuais em agregados 6,7.
Estudos prévios demonstraram as vantagens de um biorreator rotativo para a regeneração óssea8, cultura de germes dentários9 e para a cultura de células do folículo dentário humano10. Também houve um relato sugerindo que o RCCS aumenta a proliferação e diferenciação de células EOE em ameloblastos11. No entanto, células diferenciadas foram consideradas ameloblastos com base na imunofluorescência da ameloblastina e/ou expressão de amelogenina isoladamente11 sem considerar sua morfologia alongada ou forma celular polarizada.
Além do biorreator de vasos de parede rotativa (RWV) desenvolvido pela NASA, outras tecnologias para gerar agregados 3D a partir de células incluem levitação magnética, a máquina de posicionamento aleatório (RPM) e o clinostato12. Para alcançar a levitação magnética, células marcadas com nanopartículas magnéticas são levitadas por meio de uma força magnética externa, resultando na formação de estruturas 3D livres de andaimes que têm sido utilizadas para a biofabricação de estruturas de adipócitos13,14,15. Outra abordagem para simular a microgravidade é a geração de forças G multidirecionais controlando a rotação simultânea em torno de dois eixos, resultando em um cancelamento do vetor de gravidade cumulativa no centro de um dispositivo chamado clinostato16. Quando as células-tronco da medula óssea foram cultivadas em clinostato, a nova formação óssea foi inibida através da supressão da diferenciação de osteoblastos, ilustrando um dos efeitos desdiferenciadores da microgravidade16.
Sistemas in vitro para facilitar a cultura fiel de ameloblastos proporcionariam um grande passo em direção à engenharia de tecidos de esmalte dentário17. Infelizmente, até hoje, a cultura dos ameloblastos tem sido um empreendimento desafiador18,19. Até agora, cinco linhagens celulares diferentes semelhantes a ameloblastos foram relatadas, incluindo a linhagem celular de linhagem de ameloblastos de camundongo (ALC), a linhagem celular epitelial dentária de ratos (HAT-7), a linhagem celular LS8 20 de camundongos, a linhagem celular PABSo-Esuína 21 ea linhagem celular 22 SF2-24 de ratos. No entanto, a maioria dessas células perdeu sua forma distinta de célula polarizada em cultura 2D.
No presente estudo, recorremos a um Sistema de Biorreator de Cultura de Células Rotativas (CCRC) para facilitar o crescimento de células semelhantes a ameloblastos a partir de epitélios de alça cervical co-cultivados com progenitores mesenquimais e superar os desafios dos sistemas de cultura 2D, incluindo a redução do fluxo de nutrientes e alterações citoesqueléticas devido à gravidade. Além disso, o RCCS forneceu novos caminhos para o estudo das interações célula/andaime relacionadas à engenharia do tecido periodontal e para examinar os efeitos dos mediadores inflamatórios nos tecidos alveolares pulmonares in vitro. Juntos, os resultados desses estudos destacam os benefícios dos sistemas de cultura rotatória baseados em microgravidade para a propagação de epitélios diferenciados e para a avaliação dos efeitos ambientais em células cultivadas in vitro, incluindo interações célula/andaime e a resposta tecidual a condições inflamatórias.
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Protocol
Toda a aprovação institucional necessária foi obtida para garantir que o estudo estivesse em conformidade com as diretrizes institucionais de cuidados com animais da TAMU.
1. Montagem e esterilização do biorreator
- Esterilizar quatro recipientes de alta proporção (HARV) para o biorreator em uma autoclave no ciclo de instrumentos de plástico por 20 minutos a 121 °C, conforme recomendado pelo fabricante.
- Após a esterilização, monte os vasos em um exaustor de cultura de células, apertando os parafusos fornecidos com o biorreator após o qual os vasos estão prontos para uso.
2. Andaimes utilizados para a experiência de co-cultura de biorreactores
- Incubar os andaimes juntamente com as células para fornecer suporte para a fixação celular necessária para o crescimento posterior.
- Escolha entre andaimes à base de PGA, andaimes de hidroxiapatita, folhas de grafeno, discos de gelatina e andaimes à base de colágeno para estudos de cocultura.
3. Dissecção da Alça Cervical (LC) e preparação de célula única
- Sacrificar ratos por decapitação após parada respiratória por overdose de CO2 .
NOTA: Todos os estudos em animais estão em conformidade com as diretrizes institucionais de cuidados com animais da TAMU. - Dissecar alças cervicais de camundongos 6 dias pós-natais (NPD) seguindo uma versão modificada de um protocolo previamente publicado23.
NOTA: Em nosso estudo, a porção distal da alça cervical não mostrada no protocolo previamente publicado está incluída (Figura 3).- Lavar o tecido dissecado com PBS estéril frio antes da digestão com colagenase dispase a 37 °C durante 30 minutos.
- Passar a solução através de um filtro de células estéreis de 70 μm e continuar a centrifugar a 800 x g durante 10 minutos.
- Descarte o sobrenadante. Centrifugar o pellet e lavar duas vezes com PBS frio a 800 x g. Descarte o sobrenadante.
- Conte as células usando um hemocitômetro e adicione 1 X 105 células por vaso.
4. Cultura de células da polpa dentária e expansão da linhagem celular
- Células da polpa dentária em placa de cultura de tecidos de 100 mm na passagem 4 na concentração de 1 x 105.
- Preparar meios para a cultura consistindo de meios de alta glicose DMEM, suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico/antimicótico (P/S).
- Quando as células atingirem 85-90% de confluência, aspirar o meio e lavar as placas duas vezes com PBS pré-aquecido.
- Após a lavagem com PBS, adicionar uma solução pré-aquecida de tripsina-EDTA a 0,25% à placa e incubar as placas contendo células da polpa dentária a 37 °C durante 3 minutos.
- Confirme o descolamento celular por inspeção visual usando um microscópio.
- Recolher o meio juntamente com as células da placa de cultura e transferir através de uma pipeta de 25 ml para um tubo cónico estéril de 50 ml.
- Centrifugar as células a 800 x g durante 8 minutos e eliminar o sobrenadante. Ressuspenda as células em meios frescos e conte usando um hemocitômetro.
- Para co-cultura com células de alça cervical, semear as células da polpa dentária no biorreator a uma concentração de 1 x 104 por vaso.
5. Co-cultura de células da alça cervical/polpa dentária em um andaime dentro do biorreator RCCS
- Adicione ambos os tipos de células, a alça cervical e a polpa dentária ao meio de cultura contendo meio SFM de queratinócitos com fatores de crescimento suplementados, proteínas da matriz extracelular e andaimes.
NOTA: Os fatores de crescimento são adicionados a uma concentração de 0,03 μg/mL de proteína morfogenética óssea 2 (BMP 2), 0,03 μg/mL de proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4), 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos recombinantes humanos (hFGF) e 15 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (hEGF), enquanto os componentes da ECM incluíram 200 μg/mL de Matrigel, 5 μg/mL de laminina e 5 μg/mL de fibronectina. - Suportes de revestimento com uma mistura de 500 μL de gel de colagénio enriquecido com 1 mg de péptido LRAP (Peptídeo de amelogenina rico em leucina), 1 mg de matriz de esmalte em estádio inicial liofilizado preparado a partir de dentes suínos24, 5 μg/ml de laminina e 5 μg/ml de fibronectina.
NOTA: Isso funcionou melhor para nossos experimentos. - Após o revestimento do andaime, adicione células e andaimes ao biorreator e encha o biorreator com 10 mL de meio por vaso.
- Feche a tampa da porta de enchimento do vaso do biorreator após a adição de meios, células e andaimes.
- Fixar as válvulas estéreis às portas da seringa no início da experiência e mantê-las no lugar com uma tampa até ao final da experiência.
- Uma vez que a embarcação esteja 90% cheia e as tampas da porta de enchimento estejam fechadas e apertadas, abra as válvulas estéreis.
- Utilize duas seringas estéreis (3 ml) sempre que for necessária uma mudança de meio. Encha uma seringa com um meio fresco enquanto a outra seringa é deixada vazia.
- Abra ambas as válvulas de seringa e manobrar suavemente as bolhas em direção à porta da seringa vazia.
- Uma vez que o meio fresco da seringa cheia é cuidadosamente injetado no recipiente, remova as bolhas através da porta da seringa vazia.
NOTA: Este procedimento é realizado até que todas as microbolhas sejam removidas dos vasos. - Feche as portas da seringa com tampas e descarte as seringas em um recipiente de resíduos perfurocortantes.
- Fixar cada recipiente à base do rotador e colocar a base do rotador numa incubadora com 5% de CO2 e temperatura de 37 °C.
- Ligue a alimentação e defina a velocidade de rotação para 10,1 rpm.
NOTA: Ajuste a velocidade para garantir que os andaimes estão em suspensão sem tocar na parede da embarcação. - Para a mudança de mídia, coloque os vasos em uma posição vertical para garantir que as células se estabeleçam no fundo. Abra as portas da seringa e ligue as seringas estéreis às portas.
- Siga o mesmo procedimento, aspirando 75% do meio esgotado em nutrição e injetando meio fresco através do outro porto.
6. Preparação de órgãos pulmonares e cultura baseada em biorreatores
NOTA: Filhotes de camundongos do tipo selvagem E15 foram utilizados para o preparo dos órgãos pulmonares.
- Dissecar o tecido pulmonar após a eutanásia de uma rata grávida com asfixia por CO2 .
- Uma vez que a morte é confirmada após asfixia por luxação cervical, use um bisturi para expor a cavidade torácica. Depois disso, remova os filhotes do útero e eutanasie por decapitação.
- Após a eutanásia, prepare a cavidade torácica, abrindo-a com um bisturi para localizar os pulmões. Lave pequenos segmentos de tecido pulmonar com PBS estéril e coloque-o em uma membrana pré-esterilizada por 2 horas com meio de cultura de órgãos em uma incubadora contendo 5% de CO2 e temperatura de 37 °C.
- Uma vez que os tecidos pulmonares se ligam à membrana em uma placa de cultura de órgãos 2D, transfira as amostras para o vaso do biorreator.
- Prepare a mídia para a cultura.
NOTA: O meio de controle DMEM de alta glicose contém 10% de soro fetal bovino (FBS), solução antibiótica a 1% (P/S) (penicilina, 100 U/mL, estreptomicina, 50 μg/mL) e 100 μg/mL de ácido ascórbico (AA) e para a indução de condições inflamatórias, o meio controle é suplementado com 5 ng/mL de proteína IL-6. - Realizar o experimento de cultura pulmonar por 10 dias com uma troca de meio a cada 48 horas no biorreator, conforme descrito acima.
7. Andaime revestido com cultura de células do ligamento periodontal humano (hPDL)
- Cultura de células do ligamento periodontal humano.
NOTA: As células são isoladas e cultivadas em nosso laboratório de acordo com o protocolo publicado anteriormente25. - Revestir os discos de andaime de colágeno com 30 μL de PBS para o grupo controle e o neuropeptídeo galanina (GAL) a uma concentração de 10-8 durante a noite.
- Semear células PDL humanas no andaime de controle e revestido de GAL por 2 horas a 37 °C em uma placa de cultura e transferir os andaimes semeados de células para um vaso de biorreator, conforme mencionado acima.
- Cultive os andaimes semeados de células por 14 dias no biorreator antes de colher os andaimes para análise.
8. Limpeza e manutenção de biorreatores
- Depois que os andaimes/células forem colhidos do biorreator, remova as portas da seringa do navio.
NOTA: Os parafusos ao redor dos vasos são retirados e o recipiente é suavemente lavado com água e sabão. - Lave os recipientes com água limpa e aperte os parafusos mais uma vez.
- Armazenar os recipientes após a autoclave até a próxima utilização.
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Representative Results
A câmara interna do biorreator fornece um ambiente para as células proliferarem e se diferenciarem, se ligarem a um andaime ou se reunirem para formar tecidos como conjuntos. Cada vaso HARV comporta até 10 mL de meio e facilita uma circulação constante de nutrientes para que cada célula tenha uma excelente chance de sobreviver. A figura 1A ilustra a fixação das portas da seringa à placa frontal do recipiente, onde estão fixadas válvulas de balcão único estéreis. Essas válvulas atuam como porteiros da câmara de cultura. A troca média requer que a válvula da torneira de parada seja aberta para facilitar a fixação de uma seringa estéril contendo meio fresco. O ambiente de microgravidade dentro do biorreator permite que as células se liguem ao andaime dentro do vaso sem exigir semeadura prévia nos andaimes. O andaime (Figura 1B e 1C) colocado no biorreator gira continuamente, permitindo que as células se fixem às superfícies do andaime e formem redes citoesqueléticas. A membrana oxigenadora no fundo da placa do vaso (Figura 1B) permite trocas gasosas contínuas para melhorar a sobrevivência e a longevidade celular.
Vários andaimes foram testados para identificar o andaime mais compatível com as células. O andaime das Figuras 2A e 2B é uma folha de grafeno composta por 75% de grafeno e 25% de PLG (glicolídeo polilático). Esse andaime eletricamente condutor é frequentemente utilizado para células que podem necessitar de estimulação elétrica, como as células musculares esqueléticas26. Em nossos estudos, o andaime de colágeno superou todos os outros estudos testados em termos de biocompatibilidade, promoção do crescimento tecidual e diferenciação celular. A superfície porosa especializada deste andaime à base de colágeno (Figura 2C e 2D) permite que as células e nutrientes fluam por todo o andaime, aumentando a área de fixação celular e proliferação celular.
A posição da alça cervical em relação à mandíbula do rato é ilustrada nas Figuras 3A e 3B. Para preparar as células da alça cervical incisiva do rato, foi dissecada uma mandíbula esqueletizada do rato e exposta a porção mais distal do incisivo inferior do rato. A posição precisa da alça cervical ressecada é demarcada no incisivo de camundongo pós-natal de 6 dias (Figura 3B), enquanto uma região semelhante em uma mandíbula adulta de camundongo esqueletizado é fornecida como referência na Figura 3A para fins de orientação. A área da alça cervical correspondente no adulto esqueletizado (Figura 3A) e no incisivo de camundongo recém-preparado 6 dpn é emoldurada por duas linhas quebradas (Figura 3A e B). A dentição das hemimandíbulas é composta por três molares mandibulares e um incisivo em crescimento contínuo, enquanto o nicho celular da alça cervical é composto por uma população celular mista envolvida na formação do esmalte, como o epitélio interno do esmalte, o epitélio externo do esmalte, o retículo estrelado e o estrato intermédio19.
A Figura 4 enfoca a diferenciação bem-sucedida das células da alça cervical em células alongadas, polarizadas e secretoras de proteína do esmalte semelhantes a ameloblastos. Os dados revelaram que a diferenciação bem-sucedida de células ameloblásticas secretoras de proteínas de esmalte alongadas, polarizadas, requer a co-cultura das células da alça cervical com células-tronco mesenquimais, como células-tronco da polpa dentária. As células cultivadas receberam um microambiente sob medida, conforme descrito na etapa 3 do protocolo, resultando na formação de células polarizadas com o núcleo em uma extremidade e um longo processo celular na outra27, característica típica dos ameloblastos (Figura 4A). A aplicação de meios isolados e sem fatores de crescimento e/ou revestimento de andaimes resultou em células de alça cervical que secretaram proteínas-chave do esmalte, mas não alongaram ou polarizaram (Figura 4B).
Andaimes de colágeno revestidos e não revestidos com galanina foram colocados em um biorreator com células hPDL por quatorze dias em um biorreator. As células sobreviveram a um período de cultura de duas semanas no sistema de cultura 3D e o grupo de andaimes revestidos de galanina demonstrou uma taxa de proliferação significativamente maior (Figura 5B) em comparação com o grupo controle contendo andaimes não revestidos (Figura 5A). As células do grupo experimental também demonstraram um nível significativamente maior de matriz extracelular contendo fibras do tecido conjuntivo em comparação com o controle.
O ambiente do biorreator mostrou-se bem-sucedido para o crescimento de segmentos pulmonares em um ambiente de microgravidade 3D (Figura 6). Para este estudo, segmentos de tecido pulmonar colhidos de camundongos E15 (Figura 6C) foram colocados em uma membrana de nitrocelulose em um prato de cultura de órgãos por duas horas. Após a fixação inicial do tecido à membrana, o composto tecido pulmonar/membrana nitrocelular foi colocado no vaso do biorreator e cultivado com sucesso por 10 dias (Figura 6A). Para estudar os efeitos das condições inflamatórias no crescimento do tecido pulmonar, a adição de IL-6 ao meio de cultura resultou em alterações típicas associadas à inflamação na morfologia alveolar semelhantes às observadas in vivo (Figura 6B).
Figura 1. Componentes de um vaso de biorreator. A Figura 1 ilustra os principais componentes de um vaso de biorreator e sua posição em um estágio de pré-montagem. (A) Posição relativa da câmara do reator, das portas da seringa e do andaime. (B) Posição semiaberta da placa frontal (tampa transparente) e da placa traseira (placa branca coberta por membrana oxigenadora). O andaime é posicionado no centro entre a placa frontal e traseira. O andaime de grafeno de cor preta (C) ilustra como um andaime é colocado dentro do vaso e usado como suporte para as células proliferarem, se diferenciarem e formarem uma rede celular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ilustrações representativas de andaimes testados neste estudo. Cinco andaimes foram testados para nossos estudos de biorreatores, dos quais dois exemplos são apresentados aqui. (A,B) representam o andaime de grafeno testado para o crescimento de células semelhantes a ameloblastos, enquanto (C,D) representa o andaime de colágeno mais bem sucedido para nossos estudos de cultura celular baseados em biorreatores. Observe a estrutura porosa do andaime de colágeno (C,D) versus a matriz paralela de relevos de superfície no andaime de grafeno (A,B). (A,C) são macrógrafos tirados de uma perspectiva perpendicular, enquanto (B,D) foram fotografados em um ângulo de 45°. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Preparação da alça cervical. A mandíbula de camundongo adulto esqueletizado em A demonstra a região da alça cervical usada para preparar o nicho celular para a cultura e diferenciação de células semelhantes a ameloblastos. Esta macrografia também ilustra a posição dos marcadores anatômicos, incluindo o incisivo em contínuo crescimento (inc) abrangendo quase todo o comprimento mandibular, o primeiro molar mandibular (m1) juntamente com o ângulo da mandíbula, o processo coronóide e a posição do côndilo mandibular. Esta preparação esquelética serve como uma orientação anatômica para a região da alça cervical preparada em (B). Os pontos de referência incluem o osso mandibular (mand), o tecido da papila dentária (DP), o ângulo da mandíbula (Ângulo) e a posição da alça cervical (CL) a partir da qual as células para nossos estudos de biorreator ameloblasto foram colhidas. A linha quebrada indica a porção anterior e distal da janela mandibular fenestrada preparada para a dissecção da alça cervical na mandíbula adulta esqueletizada (A) e na mandíbula recém-dissecada (B) de 6 dpn. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Geração de células semelhantes a ameloblastos usando uma abordagem de co-cultura 3D. (A) Diferenciação bem-sucedida de células semelhantes a ameloblastos de células de alça cervical co-cultivadas com células-tronco da polpa dentária em um microambiente adequado. A população celular resultante foi composta de células longas, alongadas e polarizadas com a capacidade de secretar proteínas da matriz do esmalte. Essas células apresentavam um núcleo em uma extremidade (nucl) e um processo celular (proc) semelhante ao Processo de Tomes, como observado em ameloblastos verdadeiros na outra extremidade (A). (B) ilustra uma população de células do grupo controle que também foram submetidas a condições de cocultura, mas com meios livres de fatores de crescimento ou agentes de diferenciação, resultando em células arredondadas não representativas dos ameloblastos típicos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Cultura 3D de longo prazo de uma população de progenitor periodontal (pdl) de célula única com superfícies de andaimes revestidas e não revestidas. O revestimento do andaime resultou em um aumento na taxa de proliferação celular hPDL em células cultivadas no andaime revestido de galanina (B) em comparação com as células do grupo controle expostas a um andaime não revestido (A). As células do grupo experimental também secretaram mais matriz extracelular contendo fibras de tecido conjuntivo em comparação com o grupo controle (B versus A). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Cultura de tecido pulmonar em um biorreator. (A) Segmentos de tecido pulmonar E15 cultivados em uma membrana de nitrocelulose em um biorreator por dez dias. (B) Segmentos de tecido pulmonar E15 semelhantes a (A), mas submetidos a condições inflamatórias pela adição de IL-6 ao meio (B). (C) Seção de parafina de um tecido pulmonar E15 recém-dissecado corado com H&E. Observe semelhanças nas morfologias celulares alveolares tipo I e tipo II ao comparar (A) e (C). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As etapas críticas do protocolo para o crescimento de células em microgravidade incluem o biorreator, o andaime, as células usadas para cultura 3D e o revestimento de andaimes como um meio de induzir a diferenciação celular. O tipo de biorreator usado em nossos estudos compreende o biorreator RCCS-4, uma modificação recente do dispositivo de cultura de tecidos cilíndricos rotativos do Sistema de Cultura de Células Rotativas (RCCS) original desenvolvido pela NASA para cultivar células em microgravidade simulada. Este ambiente RCCS-4 fornece tensões de cisalhamento extremamente baixas, o que melhora a transferência de massa e melhora o desempenho da cultura. Esta versão do biorreator permitiu o uso simultâneo de quatro vasos para quatro experimentos diferentes ao mesmo tempo. O biorreator RCCS-4 foi equipado com vasos de alta proporção (HARV), o que garantiu condições de cultura simples e diretas com um número suficiente de células para nossos estudos.
Um segundo componente crítico de nossa abordagem são os andaimes, pois eles fornecem modelos para células flutuantes para anexar e formar montagens. Embora o uso de andaimes em cultura 2D seja limitado devido à formação de núcleos necróticos, o aumento da difusão, do fluxo de oxigênio e nutrientes em um biorreator rotativo melhora a aplicabilidade dos andaimes como portadores para a propagação de conjuntos celulares28,29. No presente estudo, exploramos a eficácia de cinco tipos de andaimes, os andaimes poli(ácido lático-co-glicólico (PLGA), um andaime colagenoso e poroso, um andaime de grafeno, bem como um disco de gelatina e um disco de hidrodroxiapatita. Além disso, transferimos a membrana do ambiente de pré-cultura de órgãos pulmonares para o biorreator, com o segmento pulmonar cultivado ligado a ela. Dentre estes, o andaime de colágeno emergiu como o andaime mais favorável em nossos estudos, possivelmente devido à sua composição colágena e estrutura porosa. O andaime PLGA produziu células viáveis, enquanto os outros três andaimes foram menos favoráveis em nossas mãos. A membrana de nitrocelulose do sistema original de cultura de órgãos pulmonares provou ser outro andaime eficaz, pois manteve com sucesso a integridade do pulmão cultivado após a transferência para o ambiente do biorreator 3D.
Um terceiro componente crítico de nossa estratégia são os tipos de células usadas para semear o vaso. Para nossos estudos de amelogênese, contamos com células de alça cervical preparadas a partir dos incisivos de camundongos em crescimento contínuo que foram co-cultivados com células da polpa dentária. As células da alça cervical foram escolhidas como a fonte dos progenitores originais do órgão do esmalte que são continuamente renovados no incisivo do roedor. O incisivo de camundongo ou rato é uma fonte notável de células-tronco e progenitoras que continua a existir ao longo da vida do animal, enquanto as células do órgão do esmalte são reabastecidas para erupção contínua e amelogênese23,30. Tanto as células progenitoras periodontais quanto as células da polpa dentária foram utilizadas como fontes celulares de cocultura. O uso de populações celulares de cocultura mesenquimal para o sucesso do cultivo de células epiteliais está bem estabelecido31,32. Em nossos estudos, as células da polpa dentária foram mais eficazes na indução da diferenciação de ameloblastos do que os progenitores do ligamento periodontal, embora com base em suas características mesenquimais, ambos sejam adequados como candidatos à cocultura odontogênica e mesenquimal. Quando aplicadas em direção à amelogênese, as células da polpa dentária como contrapartida natural do epitélio odontogênico durante o desenvolvimento dentário podem ter desencadeado as interações epitelial-mesenquimais apropriadas para a indução da diferenciação de ameloblastos terminais33,34. No entanto, para o estudo das interações de andaimes para a engenharia do tecido periodontal, os progenitores periodontais foram ideais para dar origem a fibroblastos do ligamento periodontal totalmente diferenciados25,35. Finalmente, para a cultura de órgãos pulmonares em ambiente de biorreator, contamos com segmentos pulmonares murinos embrionários dissecados. Procedimentos para cultura de órgãos pulmonares embrionários em placas de cultura de órgãos foram descritos anteriormente36 e vários modelos de cultura celular bidimensional combinando células epiteliais pulmonares com células vasculares ou musculares lisas foram explorados37,38,39. No presente estudo, o modelo de biorreator 3D manteve um nível robusto de secreção de surfactante, preservando a integridade do núcleo do bloco tecidual cultivado, tornando este modelo adequado para o estudo dos efeitos ambientais sobre a integridade do tecido pulmonar.
O quarto aspecto significativo do nosso modelo é a aplicação de revestimentos específicos do tipo celular nas superfícies do andaime para desencadear a diferenciação celular semelhante a um ameloblasto. Especificamente, componentes como LRAP e matriz de esmalte emergiram como fatores-chave que contribuíram para a diferenciação celular semelhante a ameloblastos, já que a falta de revestimento com LRAP e matriz inicial de esmalte proibiu a formação de células alongadas e polarizadas. Juntos, o revestimento de superfícies de andaimes fornece uma ferramenta poderosa para promover a diferenciação tecidual específica de órgãos complexos em biorreatores.
O aspecto mais significativo deste estudo foi a capacidade de restaurar a forma celular alongada e polarizada distinta dos ameloblastos. Este resultado é um benefício único do sistema de biorreator 3D sobre as limitações dos sistemas de cultura 2D que arredondaram altamente as células derivadas de órgãos de esmalte. Esse resultado fornece mais evidências para o benefício do uso de tecnologias de biorreatores ao cultivar células incompatíveis com outras tecnologias de cultura40. Atribuímos o sucesso dos estudos de co-cultura de ameloblastos a vários atributos únicos do sistema de biorreator rotatório, incluindo o fornecimento contínuo de nutrientes, fatores de crescimento e transcrição e oxigênio, bem como a capacidade de células individuais de agregar e formar interações sociais entre células de várias linhagens e estágios de desenvolvimento. Enquanto os estudos conseguiram cultivar células alongadas, polarizadas e secretoras de amelogenina semelhantes a ameloblastos, as células semelhantes a ameloblastos cultivadas aqui permanecem isoladas, e a continuidade natural da fileira de células de ameloblastos foi perdida. Em aplicações futuras, células semelhantes a ameloblastos cultivadas com essa tecnologia podem ser usadas para aplicações de engenharia de tecido de esmalte ou como um modelo experimental para recapitular aspectos da amelogênese dentária.
Em conclusão, o biorreator 3D surgiu como um ambiente bem-sucedido para a propagação de coculturas de alça cervical/polpa dentária em ameloblastos, para o crescimento de progenitores do ligamento periodontal em andaimes revestidos e para a cultura de órgãos pulmonares inteiros. Com base nesses dados, as tecnologias baseadas em biorreatores provavelmente surgirão como veículos importantes para a engenharia avançada de tecidos ou estratégias de teste em áreas como esmalte dentário, periodontal e pesquisa pulmonar.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Os estudos foram generosamente apoiados por doações do Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial (UG3-DE028869 e R01-DE027930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
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