Summary
Этот протокол представляет собой метод культивирования и 3D-роста амелобластоподобных клеток в условиях микрогравитации для поддержания их удлиненной и поляризованной формы, а также экспрессии белка, специфичной для эмали. Описаны условия культивирования пародонтальных инженерных конструкций и органов легких в условиях микрогравитации.
Abstract
Гравитация является одним из ключевых факторов, определяющих функцию клеток человека, пролиферацию, цитоскелетную архитектуру и ориентацию. Ротационные биореакторные системы (RCCS) имитируют потерю гравитации, как это происходит в космосе, и вместо этого обеспечивают микрогравитационную среду за счет непрерывного вращения культивируемых клеток или тканей. Эти RCCS обеспечивают бесперебойную подачу питательных веществ, факторов роста и транскрипции, а также кислорода и устраняют некоторые недостатки гравитационных сил в неподвижных 2D (двухмерных) чашках для культуры клеток или органов. В настоящем исследовании мы использовали RCCS для совместной культивирования клеток цервикальной петли и клеток пульпы зубов, чтобы стать амелобластами, для характеристики взаимодействий предшественника пародонта / каркаса и для определения влияния воспаления на альвеолы легких. Среда RCCS способствовала росту амелобластоподобных клеток, способствовала пролиферации предшественников пародонта в ответ на покрытия каркасов и позволяла оценить влияние воспалительных изменений на культивируемые альвеолы легких. Эта рукопись обобщает условия окружающей среды, материалы и шаги на этом пути и освещает критические аспекты и экспериментальные детали. В заключение, RCCS являются инновационными инструментами для освоения культуры и 3D (трехмерного) роста клеток in vitro и позволяют изучать клеточные системы или взаимодействия, не поддающиеся классическим средам 2D-культур.
Introduction
Гравитация влияет на все аспекты жизни на Земле, включая биологию отдельных клеток и их функцию в организмах. Клетки ощущают гравитацию через механорецепторы и реагируют на изменения гравитации, реконфигурируя цитоскелетные архитектуры и изменяя деление клеток 1,2,3. Другие эффекты микрогравитации включают гидростатическое давление в заполненных жидкостью везикулах, осаждение органелл и конвекцию потока и тепла, управляемую плавучестью4. Исследования влияния потери гравитации на клетки и органы человека первоначально проводились для моделирования невесомой космической среды на астронавтов во время космических полетов5. Однако в последние годы эти технологии 3D-биореакторов, первоначально разработанные НАСА для моделирования микрогравитации, становятся все более актуальными в качестве новых подходов к культуре клеточных популяций, которые в противном случае не поддаются системам 2D-культур.
3D-биореакторы имитируют микрогравитацию, выращивая клетки в суспензии и, таким образом, создавая постоянный эффект «свободного падения». Другие преимущества вращающихся биореакторов включают отсутствие воздействия воздуха, встречающегося в системах культивирования органов, снижение напряжения сдвига и турбулентности, а также постоянное воздействие изменяющегося запаса питательных веществ. Эти динамические условия, обеспечиваемые биореактором Rotary Cell Culture System (RCCS), способствуют пространственной колокализации и трехмерной сборке отдельных клеток в агрегаты 6,7.
Предыдущие исследования продемонстрировали преимущества ротационного биореактора для регенерации кости8, культуры зародышей зуба9 и для культуры клеток зубного фолликула человека10. Также был опубликован доклад, предполагающий, что RCCS усиливает пролиферацию и дифференцировку клеток EOE в амелобласты11. Однако дифференцированные клетки считали амелобластами на основе иммунофлуоресценции амелобластина и/или экспрессии амелогенина только11 без учета их удлиненной морфологии или поляризованной формы клеток.
В дополнение к разработанному НАСА биореактору вращающихся стеновых сосудов (RWV), другие технологии для генерации 3D-агрегатов из клеток включают магнитную левитацию, машину случайного позиционирования (RPM) и клиностат12. Для достижения магнитной левитации клетки, помеченные магнитными наночастицами, левитируют с использованием внешней магнитной силы, что приводит к образованию 3D-структур без каркаса, которые были использованы для биофабрикации адипоцитарных структур 13,14,15. Другим подходом к моделированию микрогравитации является генерация разнонаправленных G-сил путем управления одновременным вращением вокруг двух осей, что приводит к отмене кумулятивного вектора гравитации в центре устройства, называемого клиностатом16. Когда стволовые клетки костного мозга культивировали в клиностате, образование новой кости ингибировалось путем подавления дифференцировки остеобластов, что иллюстрирует один из дедифференцирующих эффектов микрогравитации16.
Системы in vitro для облегчения верной культуры амелобластов обеспечат важный шаг вперед к тканевой инженерии зубной эмали17. К сожалению, на сегодняшний день культура амелобластов была сложным делом18,19. До сих пор сообщалось о пяти различных амелобластоподобных клеточных линиях, включая клеточную линию амелобласта мыши (ALC), линию эпителиальных клеток зубов крыс (HAT-7), клеточную линию LS8 мыши20, клеточную линию PABSo-Eсвиней 21 и клеточную линию SF2-24крысы 22. Однако большинство этих клеток потеряли свою отличительную поляризованную форму клеток в 2D-культуре.
В настоящем исследовании мы обратились к системе биореакторов ротационных клеточных культур (RCCS) для облегчения роста амелобластоподобных клеток из эпителия шейного контура, культивируемого совместно с мезенхимальными предшественниками, и для преодоления проблем систем 2D-культур, включая снижение потока питательных веществ и цитоскелетные изменения из-за гравитации. Кроме того, RCCS предоставил новые возможности для изучения взаимодействия клеток / каркасов, связанных с тканевой инженерией пародонта, и для изучения воздействия воспалительных медиаторов на альвеолярные ткани легких in vitro. В совокупности результаты этих исследований подчеркивают преимущества систем ротационных культур на основе микрогравитации для распространения дифференцированного эпителия и для оценки воздействия окружающей среды на клетки, выращенные in vitro, включая взаимодействия клетки / каркас и реакцию тканей на воспалительные состояния.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Было получено все необходимое институциональное одобрение для обеспечения того, чтобы исследование соответствовало руководящим принципам TAMU по уходу за животными.
1. Сборка и стерилизация биореактора
- Стерилизуйте четыре сосуда с высоким соотношением сторон (HARV) для биореактора в автоклаве на цикле пластикового прибора в течение 20 минут при 121 °C в соответствии с рекомендациями производителя.
- После стерилизации соберите сосуды в вытяжку для культивирования клеток, затянув винты, снабженные биореактором, после чего сосуды будут готовы к использованию.
2. Каркасы, используемые для эксперимента с кокультурой биореактора
- Инкубируйте каркасы вместе с клетками, чтобы обеспечить поддержку для прикрепления клеток, необходимых для дальнейшего роста.
- Выбирайте между каркасами на основе PGA, гидроксиапатитовыми каркасами, графеновыми листами, желатиновыми дисками и каркасами на основе коллагена для совместных исследований.
3. Рассечение шейной петли (CL) и одноклеточный препарат
- Жертвоприношение мышей путем обезглавливания после остановки дыхания передозировкой CO2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Все исследования на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами TAMU по уходу за животными. - Рассечение шейных петель у 6-дневных послеродовых (DPN) мышей в соответствии с модифицированной версией ранее опубликованного протокола23.
ПРИМЕЧАНИЕ: В наше исследование включена дистальная часть шейной петли, не показанная в ранее опубликованном протоколе (рисунок 3).- Промыть рассеченную ткань холодной стерильной PBS перед перевариванием с диспазой коллагеназы при 37 °C в течение 30 минут.
- Пропустите раствор через стерильный клеточный сетчатый фильтр 70 мкм и далее центрифугу при 800 х г в течение 10 минут.
- Выбросьте супернатант. Центрифугируйте гранулы и дважды промывайте холодным PBS при 800 х г. Выбросьте супернатант.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и добавьте 1 X 105 клеток на сосуд.
4. Культура клеток пульпы зубов и расширение клеточной линии
- Пластина зубной пульпы клеток в 100 мм тканевая культуральная пластина при прохождении 4 в концентрации 1 х 105.
- Подготовьте среду для культуры, состоящую из сред с высоким содержанием глюкозы DMEM, дополненных 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% антибиотиком / антимикотиком (P / S).
- Когда клетки достигнут 85-90% слияния, аспирируют среду и дважды промывают пластины предварительно нагретым PBS.
- После промывки PBS добавьте в пластину предварительно подогретый 0,25% раствор трипсина-ЭДТА и инкубируйте пластины, содержащие клетки пульпы зуба, при 37 °C в течение 3 минут.
- Подтвердите отсоединение клеток путем визуального осмотра с помощью микроскопа.
- Соберите среду вместе с клетками с культуральной пластины и перенесите через пипетку 25 мл в стерильную коническую трубку объемом 50 мл.
- Центрифугируйте клетки при 800 х г в течение 8 минут и выбросьте супернатант. Повторное суспендирование клеток в свежих средах и подсчет с помощью гемоцитометра.
- Для совместной культивирования с клетками цервикальной петли засеивают клетки пульпы зуба в биореактор в концентрации 1 х 104 на сосуд.
5. Кокультура клеток шейной петли/пульпы зуба на каркасе в биореакторе RCCS
- Добавьте оба типа клеток, шейную петлю и пульпу зуба в культуральную среду, содержащую кератиноцитарные среды SFM с добавлением факторов роста, белков внеклеточного матрикса и каркасов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Факторы роста добавляются в концентрации 0,03 мкг/мл костного морфогенетического белка 2 (BMP 2), 0,03 мкг/мл костного морфогенетического белка 4 (BMP-4), 10 нг/мл человеческого рекомбинантного фактора роста фибробластов (hFGF) и 15 нг/мл эпидермального фактора роста (hEGF), в то время как компоненты ECM включали 200 мкг/мл Матригеля, 5 мкг/мл ламинина и 5 мкг/мл фибронектина. - Покрыть каркас смесью 500 мкл коллагенового геля, обогащенного 1 мг пептида LRAP (богатый лейцином амелогениновый пептид), 1 мг лиофилизированного эмалированного матрикса ранней стадии, приготовленного из зубов свиней24, 5 мкг/мл ламинина и 5 мкг/мл фибронектина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это лучше всего сработало для наших экспериментов. - После нанесения покрытия каркаса добавьте в биореактор как клетки, так и каркасы и заполните биореактор средой 10 мл на сосуд.
- Закройте крышку заполняющего отверстия сосуда биореактора после добавления среды, клеток и каркасов.
- Прикрепите стерильные клапаны к отверстиям шприца в начале эксперимента и держите их на месте с крышкой до конца эксперимента.
- Как только сосуд заполнен на 90% и крышки заправочных отверстий закрыты и затянуты, откройте стерильные клапаны.
- Используйте два стерильных шприца (3 мл) каждый раз, когда требуется смена носителя. Наполните один шприц свежей средой, а другой шприц оставить пустым.
- Откройте оба шприцевых клапана и осторожно маневрируйте пузырьками в направлении пустого отверстия шприца.
- После того, как свежая среда из полного шприца будет тщательно введена в сосуд, удалите пузырьки через пустой шприц-порт.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура выполняется до тех пор, пока все микропузырьки не будут удалены из сосудов. - Закройте шприцевые порты колпачками и выбросьте шприцы в контейнер для отходов острых предметов.
- Прикрепите каждый сосуд к основанию ротатора и поместите основание ротатора в инкубатор с температурой 5% CO2 и 37 °C.
- Включите питание и установите скорость вращения на 10,1 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте скорость, чтобы убедиться, что леса находятся в подвешенном состоянии, не касаясь стенки сосуда. - Для изменения среды поместите сосуды в вертикальное положение, чтобы убедиться, что клетки оседают на дне. Откройте порты шприца и подключите стерильные шприцы к портам.
- Следуйте той же процедуре, аспирируя 75% истощенной питательными веществами среды и вводя свежую среду через другой порт.
6. Подготовка органов легких и культура на основе биореактора
ПРИМЕЧАНИЕ: Детеныши мышей дикого типа E15 использовались для подготовки органов легких.
- Рассечение легочной ткани после эвтаназии беременной самки мыши с удушьемCO2 .
- Как только смерть подтвердится после удушья вывихом шейки матки, используйте скальпель, чтобы обнажить грудную полость. После этого удалите детенышей из матки и усыпните путем обезглавливания.
- После эвтаназии подготовьте грудную полость, открыв ее скальпелем, чтобы найти легкие. Промыть крошечные сегменты легочной ткани стерильным PBS и поместить его на предварительно стерилизованную мембрану на 2 часа с культуральной средой органа в инкубаторе, содержащем 5% CO2 и температурой 37 °C.
- Как только легочные ткани прикрепятся к мембране в 2D-культуральной пластине органа, перенесите образцы в сосуд биореактора.
- Подготовьте СМИ к культуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольная среда DMEM с высоким содержанием глюкозы содержит 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% раствор антибиотиков (P/S) (пенициллин, 100 Ед/мл, стрептомицин, 50 мкг/мл) и 100 мкг/мл аскорбиновой кислоты (АА), а для индукции воспалительных состояний контрольную среду дополняют 5 нг/мл белка IL-6. - Проводят эксперимент с культурой легких в течение 10 дней с изменением среды каждые 48 часов в биореакторе, как описано выше.
7. Каркас, покрытый культурой клеток пародонтальной связки человека (hPDL)
- Культивирование клеток пародонтальной связки человека.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки изолируются и культивируются в нашей лаборатории в соответствии с протоколом, ранее опубликованным25. - Покрыть коллагеновые каркасные диски 30 мкл PBS для контрольной группы и нейропептидом галанином (GAL) в концентрации 10-8 в течение ночи.
- Посейте клетки PDL человека на контрольном и покрытом GAL каркасе в течение 2 часов при 37 °C в культуральной пластине и перенесите засеянные клетками каркасы в сосуд биореактора, как указано выше.
- Культивируйте клеточные посевные каркасы в течение 14 дней в биореакторе перед сбором каркасов для анализа.
8. Очистка и обслуживание биореактора
- После того, как каркасы/клетки собраны из биореактора, удалите шприцевые отверстия из сосуда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Винты вокруг сосудов снимаются, и сосуд аккуратно промывают мыльной водой. - Промойте сосуды чистой водой и еще раз затяните винты.
- Храните сосуды после автоклавирования до следующего использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Внутренняя камера биореактора обеспечивает среду для размножения и дифференцировки клеток, прикрепления к каркасу или скопления для формирования тканевых сборок. Каждый сосуд HARV вмещает до 10 мл среды и способствует постоянной циркуляции питательных веществ, так что каждая клетка имеет отличные шансы на выживание. На фиг.1А показано крепление шприцевых отверстий к передней пластине сосуда, к которой прикреплены стерильные однозапорные клапаны. Эти клапаны выступают в качестве привратников в культурную камеру. Для изменения среды требуется открыть клапан запорного крана для облегчения крепления стерильного шприца, содержащего свежую среду. Среда микрогравитации в биореакторе позволяет клеткам прикрепляться к каркасу внутри сосуда, не требуя предварительного посева на каркасы. Каркас (фиг.1В и 1С), помещенный в биореактор, вращается непрерывно, позволяя клеткам прикрепляться к поверхностям каркаса и образовывать цитоскелетные сети. Мембрана оксигенатора в нижней части пластины сосуда (рисунок 1B) обеспечивает непрерывный газообмен для улучшения выживаемости и долговечности клеток.
Различные каркасы были протестированы, чтобы определить каркас, наиболее совместимый с ячейками. Каркас на фиг.2A и 2B представляет собой графеновый лист, состоящий из 75% графена и 25% PLG (полимолочного гликолида). Этот электропроводящий каркас часто используется для клеток, которые могут потребовать электрической стимуляции, таких как клетки скелетных мышц26. В наших исследованиях коллагеновый каркас превзошел все другие исследования, протестированные с точки зрения биосовместимости, стимулирования роста тканей и клеточной дифференцировки. Специализированная пористая поверхность этого каркаса на основе коллагена (рисунок 2C и 2D) позволяет клеткам и питательным веществам течь по всему каркасу, увеличивая площадь прикрепления клеток и пролиферации клеток.
Положение шейной петли по отношению к нижней челюсти мыши проиллюстрировано на рисунках 3A и 3B. Чтобы подготовить клетки шейной петли резца мыши, скелетонизированную нижнюю челюсть мыши рассекли и обнажили самую дистальную часть нижнего мышиного резца. Точное положение резецированной шейной петли разграничено в 6-дневном послеродовом резце мыши (рисунок 3B), в то время как аналогичная область в скелетонизированной нижней челюсти взрослой мыши приведена в качестве ссылки на рисунке 3A для целей ориентации. Область соответствующей шейной петли во взрослом скелетонизированном (фиг.3A) и 6 dpn свежеприготовленного мышиного резца обрамлена двумя ломаными линиями (фиг.3A и B). Зубной ряд нижней челюсти состоит из трех нижнечелюстных моляров и постоянно растущего резца, в то время как ниша клеток шейной петли состоит из смешанной клеточной популяции, участвующей в образовании эмали, такой как эпителий внутренней эмали, эпителий наружной эмали, звездчатый ретикулум и интермедиум19 слоя.
На рисунке 4 основное внимание уделяется успешной дифференцировке клеток шейной петли в удлиненные, поляризованные эмалевые белки, секретирующие амелобластоподобные клетки. Данные показали, что успешная дифференцировка удлиненного, поляризованного, эмалированного белка, секретирующих амелобластоподобные клетки, требует совместной культивирования клеток цервикального цикла с мезенхимальными стволовыми клетками, такими как стволовые клетки пульпы зубов. Культивируемые клетки обеспечивали адаптированным микросредой, как описано на этапе 3 протокола, что приводило к образованию поляризованных клеток с ядром на одном конце и длительным клеточным процессом на другом27, что является типичной характеристикой амелобластов (фиг.4A). Применение среды только и без факторов роста и/или покрытия каркаса приводило к образованию клеток шейного цикла, которые секретировали ключевые белки эмали, но не удлинялись и не поляризовывались (рисунок 4B).
Покрытые галанином и не покрытые коллагеновыми каркасами помещали в биореактор с клетками hPDL в течение четырнадцати дней в биореактор. Клетки пережили двухнедельный период культивирования в системе 3D-культуры, а группа каркасов, покрытая галанином, продемонстрировала значительно более высокую скорость пролиферации (рисунок 5B) по сравнению с контрольной группой, содержащей каркасы без покрытия (рисунок 5A). Клетки в экспериментальной группе также продемонстрировали значительно более высокий уровень внеклеточного матрикса, содержащего волокна соединительной ткани, по сравнению с контролем.
Среда биореактора оказалась успешной для роста сегментов легких в среде 3D-микрогравитации (рисунок 6). Для этого исследования сегменты легочной ткани, собранные у мышей E15 (рисунок 6C), помещали на нитроцеллюлозную мембрану в чашку для культуры органов в течение двух часов. После первоначального прикрепления ткани к мембране композит легочной ткани/нитроклеточной мембраны помещали в сосуд биореактора и успешно культивировали в течение 10 дней (рисунок 6А). Для изучения влияния воспалительных состояний на рост легочной ткани добавление IL-6 в культуральную среду приводило к типичным воспалительным изменениям альвеолярной морфологии, аналогичным тем, которые наблюдаются in vivo (рисунок 6B).
Рисунок 1. Компоненты сосуда биореактора. На рисунке 1 показаны ключевые компоненты сосуда биореактора и их положение на этапе предварительной сборки. (A) Взаимное положение камеры реактора, шприцевых отверстий и каркаса. (B) Полуоткрытое положение передней пластины (прозрачная крышка) и задней пластины (белая пластина, покрытая мембраной оксигенатора). Каркас расположен в центре между передней и задней панелью. Графеновый каркас черного цвета (C) иллюстрирует, как каркас помещается в сосуд и используется в качестве поддержки для клеток для пролиферации, дифференцировки и формирования сотовой сети. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Репрезентативные иллюстрации строительных лесов, протестированные в этом исследовании. Пять каркасов были протестированы для наших исследований биореакторов, из которых два примера представлены здесь. (A,B) представляют собой графеновый каркас, протестированный на амелобластоподобный рост клеток, в то время как (C,D) представляет собой коллагеновый каркас, наиболее успешный для наших исследований клеточных культур на основе биореактора. Обратите внимание на пористую структуру коллагенового каркаса (C,D) по сравнению с параллельным массивом поверхностных тиснений в графеновом каркасе (A,B). (A,C) - это макрографы, взятые с перпендикулярной перспективы, в то время как (B,D) были изображены под углом 45°. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Подготовка цервикальной петли. Скелетонизированная нижняя челюсть взрослой мыши в А демонстрирует область шейной петли, используемую для подготовки клеточной ниши к амелобластоподобной клеточной культуре и дифференцировке. Этот макрограф также иллюстрирует положение анатомических маркеров, включая непрерывно растущий резец (inc), охватывающий почти всю длину нижней челюсти, первый нижнечелюстной моляр (м1) вместе с углом нижней челюсти, короноидным отростком и положением нижнечелюстного мыщелка. Этот скелетный препарат служит анатомической ориентацией для области шейной петли, подготовленной в (B). Контрольные точки включают нижнечелюстную кость (mand), ткань зубного сосочка (DP), угол нижней челюсти (Angle) и положение шейной петли (CL), из которой были собраны клетки для наших исследований биореактора амелобласта. Ломаная линия указывает на переднюю и дистальную часть фенестрированного нижнечелюстного окна, подготовленного для рассечения шейной петли в скелетированной нижней челюсти взрослого человека (A) и в 6 dpn свежерассеченной нижней челюсти (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Генерация амелобластоподобных клеток с использованием подхода 3D-кокультуры. (A) Успешная дифференцировка амелобластоподобных клеток из клеток шейного цикла, культивируемых совместно со стволовыми клетками пульпы зубов в подходящей микросреде. Полученная клеточная популяция состояла из длинных, вытянутых, поляризованных клеток со способностью секретировать белки эмалевой матрицы. Эти клетки имели ядро на одном конце (nucl) и клеточный процесс (proc), напоминающий процесс Тома, как наблюдается в истинных амелобластах на другом конце (A). (B) иллюстрирует популяцию клеток контрольной группы, которые также подвергались условиям совместной культивирования, но со средами, свободными от факторов роста или агентов дифференцировки, в результате чего округлые клетки не были репрезентативными для типичных амелобластов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Долгосрочная 3D-культура популяции одноклеточных пародонтальных предшественников (pdl) с покрытыми и непокрытыми поверхностями каркасов. Покрытие каркаса привело к увеличению скорости пролиферации клеток hPDL в клетках, культивируемых на каркасе с галаниновой оболочкой (B), по сравнению с клетками контрольной группы, подвергшимися воздействию каркаса без покрытия (A). Клетки из экспериментальной группы также секретировали больше внеклеточного матрикса, содержащего волокна соединительной ткани, по сравнению с контрольной группой (B против A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6. Культивирование легочной ткани в биореакторе. (A) Сегменты легочной ткани E15 культивируют на нитроцеллюлозной мембране в биореакторе в течение десяти дней. (B) Сегменты легочной ткани E15 аналогичны (A), но подвержены воспалительным состояниям путем добавления IL-6 в среду (B). (C) Парафиновый участок свежерассеченной легочной ткани E15, окрашенной H&E. Обратите внимание на сходство в альвеолярных морфологиях клеток типа I и типа II при сравнении (A) и (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические этапы протокола для роста клеток в условиях микрогравитации включают биореактор, каркас, клетки, используемые для 3D-культуры, и покрытие каркаса в качестве средства для индуцирования дифференцировки клеток. Тип биореактора, используемого в наших исследованиях, включает в себя биореактор RCCS-4, недавнюю модификацию оригинальной ротационной системы культур клеток (RCCS), вращающейся цилиндрической культуры тканей, разработанной НАСА для выращивания клеток в моделируемой микрогравитации. Эта среда RCCS-4 обеспечивает чрезвычайно низкие напряжения сдвига, что усиливает массообмен и улучшает производительность культуры. Этот вариант биореактора позволял одновременно использовать четыре сосуда для четырех различных экспериментов одновременно. Биореактор RCCS-4 был оснащен сосудами с высоким соотношением сторон (HARV), что обеспечило простые и прямые условия культивирования с достаточным количеством клеток для наших исследований.
Вторым важным компонентом нашего подхода являются каркасы, поскольку они предоставляют шаблоны для плавающих ячеек для присоединения и формирования сборок. В то время как использование каркасов в 2D-культуре ограничено из-за образования некротических кернов, усиленная диффузия, кислород и поток питательных веществ в ротационном биореакторе улучшают применимость каркасов в качестве носителей для распространения клеточных сборок 28,29. В настоящем исследовании мы изучили эффективность пяти типов каркасов: каркасов поли(молочно-когликолевой кислоты) (PLGA), коллагеновых и пористых каркасов, графеновых каркасов, а также желатинового диска и гидродроксиапатитового диска. Кроме того, мы перенесли мембрану из прекультурной среды легочного органа в биореактор с прикрепленным к нему сегментом культивируемого легкого. Среди них коллагеновый каркас стал наиболее благоприятным каркасом в наших исследованиях, возможно, из-за его коллагенового состава и пористой структуры. Эшафот PLGA дал жизнеспособные ячейки, в то время как другие три каркаса были менее благоприятными в наших руках. Нитроцеллюлозная мембрана оригинальной системы культивирования органов легких оказалась еще одним эффективным каркасом, поскольку она успешно поддерживала целостность культивируемого легкого после переноса в среду 3D-биореактора.
Третьим критическим компонентом нашей стратегии являются типы клеток, используемых для засева сосуда. Для наших исследований амелогенеза мы полагались на клетки цервикальной петли, полученные из постоянно растущих мышиных резцов, которые культивировались совместно с клетками пульпы зуба. В качестве источника исходных предшественников эмалевых органов были выбраны клетки цервикальной петли, которые непрерывно обновляются в резце грызуна. Мышиный или крысиный резец является замечательным источником стволовых и прогениторных клеток, которые продолжают существовать на протяжении всей жизни животного, в то время как клетки эмалевого органа пополняются для непрерывного извержения и амелогенеза23,30. Как пародонтальные клетки-предшественники, так и клетки пульпы зубов использовались в качестве источников клеток кокультуры. Использование мезенхимальных кокультурных клеточных популяций для успешной культивирования эпителиальных клеток хорошо известно31,32. В наших исследованиях клетки пульпы зубов были более эффективными в индуцировании дифференцировки амелобласта, чем предшественники пародонтальной связки, хотя, основываясь на их мезенхимальных характеристиках, оба они подходят в качестве одонтогенных и мезенхимальных кандидатов на кокультуру. При применении к амелогенезу клетки пульпы зубов как естественный аналог одонтогенного эпителия во время развития зубов могли вызвать соответствующие эпителиально-мезенхимальные взаимодействия, подходящие для индукции терминальной дифференцировки амелобласта33,34. Однако для изучения каркасных взаимодействий для тканевой инженерии пародонта идеально подходили предшественники пародонта, поскольку они дают начало полностью дифференцированным фибробластам пародонтальной связки25,35. Наконец, для культивирования органов легких в среде биореактора мы полагались на рассеченные эмбриональные сегменты легких мышей. Процедуры культивирования эмбриональных органов легких в блюдах для культуры органов были описаны ранее36, а ряд двумерных моделей клеточных культур, объединяющих эпителиальные клетки легких с сосудистыми или гладкомышечными клетками, были изучены 37,38,39. В настоящем исследовании модель 3D-биореактора поддерживала надежный уровень секреции поверхностно-активных веществ при сохранении целостности ядра культивируемого тканевого блока, что делает эту модель пригодной для изучения воздействия окружающей среды на целостность легочной ткани.
Четвертым важным аспектом нашей модели является нанесение специфических покрытий клеточного типа на поверхности каркасов для запуска дифференцировки клеток, подобных амелобласту. В частности, такие компоненты, как LRAP и эмалевая матрица, стали ключевыми факторами, способствующими дифференцировке клеток, подобных амелобластам, поскольку отсутствие покрытия LRAP и исходной эмалевой матрицей препятствовало образованию удлиненных и поляризованных клеток. Вместе покрытие поверхностей каркасов обеспечивает мощный инструмент для содействия тканеспецифической дифференцировке сложных органов в биореакторах.
Наиболее значимым аспектом этого исследования была способность восстанавливать отличительную удлиненную и поляризованную форму клеток амелобластов. Этот результат является уникальным преимуществом системы 3D-биореактора по сравнению с ограничениями систем 2D-культур, которые сильно округляли производные клетки эмали-органа. Этот результат предоставляет дополнительные доказательства пользы использования технологий биореакторов при культивировании клеток, несовместимых с другими технологиями культивирования40. Мы приписываем успех исследований кокультур амелобласта нескольким уникальным атрибутам системы вращательного биореактора, включая непрерывное поступление питательных веществ, факторы роста и транскрипции и кислорода, а также способность отдельных клеток агрегировать и формировать социальные взаимодействия между клетками различных линий и стадий развития. В то время как исследования преуспели в выращивании вытянутых, поляризованных и амелогенин-секретирующих амелобластоподобных клеток, амелобластоподобные клетки, выращенные здесь, остаются в изоляции, и естественная непрерывность клеточного ряда амелобласта была потеряна. В будущих применениях амелобластоподобные клетки, выращенные с помощью этой технологии, могут быть использованы для эмалевой тканевой инженерии или в качестве экспериментальной модели для повторения аспектов амелогенеза зубов.
В заключение, 3D-биореактор стал успешной средой для размножения кокультур цервикальной петли / пульпы зубов в амелобласты, для роста предшественников периодонтальной связки в покрытых каркасах и для культивирования целых органов легких. Основываясь на этих данных, технологии на основе биореакторов, вероятно, станут важными инструментами для передовых тканевых инженерии или стратегий тестирования в таких областях, как исследования зубной эмали, пародонта и легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Исследования были щедро поддержаны грантами Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (UG3-DE028869 и R01-DE027930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -y, Wang, X. -m, Li, X. -y An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au - Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
