Summary
Detta protokoll presenterar en metod för odling och 3D-tillväxt av ameloblastliknande celler i mikrogravitation för att bibehålla sin långsträckta och polariserade form samt emaljspecifikt proteinuttryck. Odlingsförhållanden för odling av parodontala ingenjörskonstruktioner och lungorgan i mikrogravitation beskrivs också.
Abstract
Gravitation är en av de viktigaste determinanterna för mänsklig cellfunktion, spridning, cytoskeletal arkitektur och orientering. Roterande bioreaktorsystem (RCCS) efterliknar tyngdkraftsförlusten när den sker i rymden och ger istället en mikrogravitationsmiljö genom kontinuerlig rotation av odlade celler eller vävnader. Dessa RCCS säkerställer en oavbruten tillförsel av näringsämnen, tillväxt- och transkriptionsfaktorer och syre och tar itu med några av bristerna i gravitationskrafter i orörliga 2D (tvådimensionella) cell- eller organodlingsrätter. I den aktuella studien har vi använt RCCS för att samodla cervikala loopceller och tandmassaceller för att bli ameloblaster, för att karakterisera parodontala stam- / ställningsinteraktioner och för att bestämma effekten av inflammation på lungalveoler. RCCS-miljöerna underlättade tillväxten av ameloblastliknande celler, främjade periodontal stamfaderproliferation som svar på ställningsbeläggningar och möjliggjorde en bedömning av effekterna av inflammatoriska förändringar på odlade lungalveoler. Detta manuskript sammanfattar miljöförhållandena, materialen och stegen på vägen och belyser kritiska aspekter och experimentella detaljer. Sammanfattningsvis är RCCS innovativa verktyg för att behärska odling och 3D (tredimensionell) tillväxt av celler in vitro och för att möjliggöra studier av cellulära system eller interaktioner som inte är mottagliga för klassiska 2D-odlingsmiljöer.
Introduction
Gravitationen påverkar alla aspekter av livet på jorden, inklusive biologin hos enskilda celler och deras funktion inom organismer. Celler känner av gravitation genom mekanoreceptorer och svarar på förändringar i tyngdkraften genom att omkonfigurera cytoskelettarkitekturer och genom att ändra celldelning 1,2,3. Andra effekter av mikrogravitation inkluderar det hydrostatiska trycket i vätskefyllda vesiklar, sedimentering av organeller och flytkraftsdriven konvektion av flöde och värme4. Studier om effekten av tyngdkraftsförlust på mänskliga celler och organ genomfördes ursprungligen för att simulera den viktlösa miljön i rymden på astronauter under rymdflygningsuppdrag5. Under de senaste åren har dock dessa 3D-bioreaktortekniker som ursprungligen utvecklats av NASA för att simulera mikrogravitation blivit alltmer relevanta som nya metoder för odling av cellpopulationer som annars inte är mottagliga för 2D-odlingssystem.
3D-bioreaktorer simulerar mikrogravitation genom att odla celler i suspension och därmed skapa en konstant "fritt fall" -effekt. Andra fördelar med de roterande bioreaktorerna inkluderar bristen på luftexponering som uppstår i organodlingssystem, en minskning av skjuvspänning och turbulens och en kontinuerlig exponering för en förändrad tillförsel av näringsämnen. Dessa dynamiska förhållanden som tillhandahålls av en RVCS-bioreaktor (Rotary Cell Culture System) gynnar rumslig samlokalisering och tredimensionell montering av enskilda celler i aggregat 6,7.
Tidigare studier har visat fördelarna med en roterande bioreaktor för benregenerering8, tandgroddsodling9 och för odling av mänskliga tandfollikelceller10. Det har också förekommit en rapport som tyder på att RCCS förbättrar cellproliferation och differentiering av EOE till ameloblaster11. Differentierade celler betraktades emellertid som ameloblaster baserade på ameloblastinimmunofluorescens och/eller ameloginuttryck ensamt11 utan hänsyn till deras långsträckta morfologi eller polariserade cellform.
Förutom den NASA-utvecklade bioreaktorn för roterande väggkärl (RWV) inkluderar andra tekniker för att generera 3D-aggregat från celler magnetisk levitation, slumpmässig positioneringsmaskin (RPM) och clinostat12. För att uppnå magnetisk levitation leviteras celler märkta med magnetiska nanopartiklar med hjälp av en extern magnetisk kraft, vilket resulterar i bildandet av ställningsfria 3D-strukturer som har använts för biofabricering av adipocytstrukturer13,14,15. Ett annat tillvägagångssätt för att simulera mikrogravitation är genereringen av multidirektionella G-krafter genom att styra samtidig rotation runt två axlar vilket resulterar i en annullering av den kumulativa tyngdkraftsvektorn i mitten av en enhet som kallas clinostat16. När benmärgsstamceller odlades i en kliostat hämmades ny benbildning genom undertryckande av osteoblastdifferentiering, vilket illustrerar en av de dedifferentierande effekterna av mikrogravitation16.
In vitro-system för att underlätta den trogna kulturen av ameloblaster skulle ge ett stort steg framåt mot tandemaljens vävnadsteknik17. Tyvärr har ameloblasternas kultur hittills varit ett utmanande företag18,19. Hittills har fem olika ameloblastliknande cellinjer rapporterats, inklusive musens ameloblast-härstamningscellinje (ALC), råttans dentala epitelcellinje (HAT-7), musens LS8-cellinje20, svin PABSo-E-cellinjen 21 och råttan SF2-24 cellinje22. Majoriteten av dessa celler har dock förlorat sin distinkta polariserade cellform i 2D-odling.
I den aktuella studien har vi vänt oss till ett Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) för att underlätta tillväxten av ameloblastliknande celler från cervikal loopepitel som odlas tillsammans med mesenkymala stamfäder och för att övervinna utmaningarna med 2D-odlingssystem, inklusive minskat flöde av näringsämnen och cytoskelettförändringar på grund av tyngdkraften. Dessutom har RCCS tillhandahållit nya vägar för studier av cell-/ställningsinteraktioner relaterade till parodontal vävnadsteknik och för att undersöka effekterna av inflammatoriska mediatorer på lungalveolära vävnader in vitro. Tillsammans belyser resultaten från dessa studier fördelarna med mikrogravitationsbaserade rotatoriska odlingssystem för förökning av differentierad epitel och för bedömning av miljöeffekter på celler som odlas in vitro, inklusive cell/ ställningsinteraktioner och vävnadssvaret på inflammatoriska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt nödvändigt institutionellt godkännande erhölls för att säkerställa att studien överensstämde med TAMU: s riktlinjer för institutionsvård av djur.
1. Bioreaktormontering och sterilisering
- Sterilisera fyra HARV-kärl (High Aspect Ratio) för bioreaktorn i en autoklav på plastinstrumentcykeln i 20 minuter vid 121 °C enligt tillverkarens rekommendationer.
- Efter sterilisering, montera kärlen i en cellodlingshuv genom att dra åt skruvarna som är försedda med bioreaktorn, varefter kärlen är redo att användas.
2. Ställningar som används för bioreaktorns samodlingsexperiment
- Inkubera ställningarna tillsammans med cellerna för att ge stöd för cellfästning som är nödvändig för ytterligare tillväxt.
- Välj bland PGA-baserade ställningar, hydroxiapatitställningar, grafenark, gelatinskivor och kollagenbaserade ställningar för samodlingsstudier.
3. Cervikal slinga (CL) dissektion och encellsberedning
- Offra möss genom halshuggning efter andningsstillestånd av CO2-överdosering .
OBS: Alla djurstudier överensstämmer med TAMU: s riktlinjer för institutionell djurvård. - Dissekera livmoderhalsslingor från 6 dagars postnatala (DPN) möss efter en modifierad version av ett tidigare publicerat protokoll23.
OBS: I vår studie ingår den distala delen av livmoderhalsslingan som inte visas i det tidigare publicerade protokollet (figur 3).- Tvätta den dissekerade vävnaden med kall steril PBS före matsmältningen med kollagenasdispase vid 37 °C i 30 minuter.
- För lösningen genom en steril cellsil på 70 μm och centrifugera ytterligare vid 800 x g i 10 minuter.
- Kassera supernatanten. Centrifugera pelleten och tvätta två gånger med kall PBS vid 800 x g. Kassera supernatanten.
- Räkna cellerna med en hemocytometer och tillsätt 1 X 105 celler per kärl.
4. Tandmassacellodling och cellinjeutvidgning
- Tandmassaceller av plattor i en 100 mm vävnadsodlingsplatta vid passage 4 i en koncentration av 1 x 105.
- Förbered media för kulturen bestående av DMEM high glukos media, kompletterat med 10% fetal bovint serum (FBS) och 1% antibiotika / antimykotika (P / S).
- När cellerna når 85-90% sammanflöde, aspirera mediet och tvätta plattorna två gånger med förvärmd PBS.
- Efter PBS-tvätt, tillsätt en förvärmd 0,25% Trypsin-EDTA-lösning till plattan och inkubera de tandmassacellinnehållande plattorna vid 37 ° C i 3 minuter.
- Bekräfta cellavskiljning genom visuell inspektion med hjälp av ett mikroskop.
- Samla upp mediet tillsammans med cellerna från odlingsplattan och överför via en 25 ml pipett till ett 50 ml sterilt koniskt rör.
- Centrifugera cellerna vid 800 x g i 8 minuter och kassera supernatanten. Återsuspendera cellerna i färskt media och räkna med hjälp av en hemocytometer.
- För samodling med cervikala slingceller, frö tandmassacellerna i bioreaktorn i en koncentration av 1 x 104 per kärl.
5. Samodling av cervikala slingor/tandmassaceller på en byggnadsställning i RCCS-bioreaktorn
- Lägg till båda celltyperna, livmoderhalsslingan och tandmassan till odlingsmediet som innehåller keratinocyt-SFM-media med kompletterade tillväxtfaktorer, extracellulära matrisproteiner och byggnadsställningar.
OBS: Tillväxtfaktorer tillsätts vid en koncentration av 0,03 μg / ml benmorfogenetiskt protein 2 (BMP 2), 0,03 μg / ml benmorfogenetiskt protein 4 (BMP-4), 10 ng / ml human rekombinant fibroblasttillväxtfaktor (hFGF) och 15 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (hEGF), medan ECM-komponenter inkluderade 200 μg / ml Matrigel, 5 μg / ml laminin och 5 μg / ml fibronektin. - Täck ställningar med en blandning av 500 μl kollagengel berikad med 1 mg LRAP (Leucinrik amelogeninpeptid) peptid, 1 mg frystorkad emaljmatris framställd av svintänder24, 5 μg/ml laminin och 5 μg/ml fibronektin.
OBS: Detta fungerade bäst för våra experiment. - Efter ställningsbeläggning, tillsätt både celler och ställningar till bioreaktorn och fyll bioreaktorn med 10 ml medium per kärl.
- Stäng påfyllningsportens lock på bioreaktorkärlet efter tillsats av media, celler och byggnadsställningar.
- Fäst de sterila ventilerna på sprutportarna i början av experimentet och håll dem på plats med ett lock till slutet av experimentet.
- När kärlet är 90% fullt och påfyllningsportlocken är stängda och åtdragna, öppna sterilventilerna.
- Använd två sterila sprutor (3 ml) varje gång ett mediebyte krävs. Fyll en spruta med nytt medium medan den andra sprutan lämnas tom.
- Öppna upp båda sprutventilerna och manövrera försiktigt bubblorna mot den tomma sprutporten.
- När det färska mediet från hela sprutan försiktigt har injicerats i kärlet, ta bort bubblorna genom den tomma sprutporten.
OBS: Denna procedur utförs tills alla mikrobubblor har tagits bort från kärlen. - Stäng sprutportarna med lock och kassera sprutorna i en avfallsbehållare för vassa föremål.
- Fäst varje kärl på rotatorbasen och placera rotatorbasen i en inkubator med 5% CO2 och 37 °C temperatur.
- Slå på strömmen och ställ in rotationshastigheten till 10,1 varv / min.
OBS: Justera hastigheten för att säkerställa att ställningarna är i upphängning utan att vidröra kärlväggen. - För medieförändring, placera kärlen i upprätt läge för att säkerställa att cellerna sätter sig längst ner. Öppna sprutportarna och anslut sterilsprutorna till portarna.
- Följ samma procedur genom att aspirera 75% av det näringsutarmade mediet och injicera färskt medium genom den andra porten.
6. Lungorganberedning och bioreaktorbaserad kultur
OBS: E15 musungar av vild typ användes för beredning av lungorgan.
- Dissekera lungvävnaden efter avlivning av en gravid kvinnlig mus med CO2-kvävning .
- När dödsfallet har bekräftats efter kvävning genom cervikal dislokation, använd en skalpell för att exponera brösthålan. Ta därefter bort valparna från livmodern och avliva genom halshuggning.
- Efter avlivning, förbered brösthålan genom att öppna den med en skalpell för att lokalisera lungorna. Tvätta små segment av lungvävnad med steril PBS och placera den på ett försteriliserat membran i 2 timmar med organodlingsmedium i en inkubator innehållande 5% CO2 och 37 ° C temperatur.
- När lungvävnaderna fäster vid membranet i en 2D-organodlingsplatta, överför proverna till bioreaktorkärlet.
- Förbered media för kultur.
OBS: Kontroll-DMEM högglukosmedia innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% antibiotikalösning (P / S) (penicillin, 100 U / ml, streptomycin, 50 μg / ml) och 100 μg / ml askorbinsyra (AA) och för induktion av inflammatoriska tillstånd kompletteras kontrollmediet med 5 ng / ml IL-6-protein. - Utför lungodlingsexperimentet i 10 dagar med en medieförändring var 48: e timme i bioreaktorn enligt beskrivningen ovan.
7. Belagd ställning med cellodling av humant parodontalt ligament (hPDL)
- Odla humana parodontala ligamentceller.
OBS: Cellerna isoleras och odlas i vårt laboratorium enligt protokollet som tidigare publicerats25. - Täck kollagenställningsskivorna med 30 μL PBS för kontrollgruppen och neuropeptidgalanin (GAL) i en koncentration av 10-8 över natten.
- Frö mänskliga PDL-celler på kontroll- och GAL-belagd ställning i 2 timmar vid 37 °C i en odlingsplatta och överför de cellsådda ställningarna till ett bioreaktorkärl som nämnts ovan.
- Odla de cellsådda ställningarna i 14 dagar i bioreaktorn innan ställningarna skördas för analys.
8. Rengöring och underhåll av bioreaktorer
- När byggnadsställningarna/cellerna har skördats från bioreaktorn, ta bort sprutportarna från kärlet.
OBS: Skruvarna runt kärlen tas av och kärlet tvättas försiktigt med tvålvatten. - Skölj kärlen med rent vatten och dra åt skruvarna en gång till.
- Förvara kärlen efter autoklavering till nästa användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bioreaktorns inre kammare ger en miljö för cellerna att sprida sig och differentiera, fästa vid en byggnadsställning eller samlas för att bilda vävnadsliknande sammansättningar. Varje HARV-kärl rymmer upp till 10 ml medium och underlättar en konstant cirkulation av näringsämnen så att varje cell har en utmärkt chans att överleva. Figur 1A illustrerar fastsättningen av sprutportarna på kärlets främre platta där sterila one-stop-ventiler är fästa. Dessa ventiler fungerar som dörrvakter till odlingskammaren. Medium förändring kräver att stoppkranventilen öppnas för att underlätta fastsättning av en steril spruta som innehåller färskt medium. Mikrogravitationsmiljön i bioreaktorn gör det möjligt för celler att fästa vid ställningen i kärlet utan att kräva föregående sådd på byggnadsställningarna. Ställningen (figur 1B och 1C) som placeras i bioreaktorn roterar kontinuerligt, vilket gör det möjligt för celler att fästa vid ställningsytor och bilda cytoskelettnätverk. Oxygenatormembranet i botten av kärlplattan (figur 1B) möjliggör kontinuerligt gasutbyte för att förbättra cellöverlevnad och livslängd.
Olika ställningar testades för att identifiera den ställning som är mest kompatibel med cellerna. Ställningen i figur 2A och 2B är ett grafenark som består av 75% grafen och 25% PLG (polymjölkglykolid). Denna elektriskt ledande ställning används ofta för celler som kan kräva elektrisk stimulering, såsom skelettmuskelceller26. I våra studier överträffade kollagenställningen alla andra studier som testats när det gäller biokompatibilitet, främjande av vävnadstillväxt och cellulär differentiering. Den specialiserade porösa ytan på denna kollagenbaserade ställning (figur 2C och 2D) gör att cellerna och näringsämnena kan strömma genom hela byggnadsställningen, vilket ökar området för cellfästning och cellproliferation.
Cervikalslingans position i förhållande till musens underkäke illustreras i figur 3A och 3B. För att förbereda musens framtänder cervikala slingceller dissekerades en skelettiserad musunderkäke och den distala delen av den nedre musens framtand exponerades. Den exakta positionen för den resekterade livmoderhalsslingan avgränsas i 6 dagars postnatal musframtand (figur 3B), medan en liknande region i en vuxen skelettiserad musunderkäke tillhandahålls som referens i figur 3A för orienteringsändamål. Området för motsvarande livmoderhalsslinga i den vuxna skeletten (figur 3A) och den nyberedda mussnitten på 6 dpn är inramad av två brutna linjer (figur 3A och B). Tandprotesen av hemi mandiibles består av tre mandibulära molarer och en kontinuerligt växande snitt, medan cervikal loop cellnisch består av en blandad cellpopulation som är involverad i emaljbildning, såsom det inre emaljepitelet, yttre emaljepitel, stellatretikulum och stratum intermedium19.
Figur 4 fokuserar på den framgångsrika differentieringen av livmoderhalsslingcellerna till långsträckta, polariserade, emaljproteinutsöndrande ameloblastliknande celler. Data avslöjade att framgångsrik differentiering av långsträckta, polariserade, emaljproteinutsöndrande ameloblastliknande celler kräver samodling av livmoderhalsslingcellerna med mesenkymala stamceller, såsom tandmassastamceller. Odlade celler försågs med en skräddarsydd mikromiljö som beskrivs i steg 3 i protokollet, vilket resulterade i bildandet av polariserade celler med kärnan i ena änden och en lång cellulär process i den andra27, en typisk egenskap hos ameloblaster (figur 4A). Applicering av medier ensamt och utan tillväxtfaktorer och/eller ställningsbeläggning resulterade i cervikala slingceller som utsöndrade viktiga emaljproteiner men inte förlängdes eller polariserades (figur 4B).
Galaninbelagda och icke-belagda kollagenställningar placerades i en bioreaktor med hPDL-celler i fjorton dagar i en bioreaktor. Cellerna överlevde en två veckors odlingsperiod i 3D-odlingssystemet och den galaninbelagda ställningsgruppen visade en signifikant högre proliferationshastighet (figur 5B) jämfört med kontrollgruppen som innehöll obelagda ställningar (figur 5A). Cellerna i experimentgruppen visade också en signifikant högre nivå av extracellulär matris innehållande bindvävsfibrer jämfört med kontrollen.
Bioreaktormiljön visade sig vara framgångsrik för tillväxten av lungsegment i en 3D-mikrogravitationsmiljö (figur 6). För denna studie placerades lungvävnadssegment skördade från E15-möss (figur 6C) på ett nitrocellulosamembran i en organodlingsskål i två timmar. Efter initial vävnadsbindning till membranet placerades lungvävnaden/nitrocellulär membrankompositen i bioreaktorkärlet och odlades framgångsrikt i 10 dagar (figur 6A). För att studera effekterna av inflammatoriska tillstånd på lungvävnadstillväxt resulterade tillägg av IL-6 till odlingsmediet i typiska inflammationsassocierade förändringar i alveolär morfologi som liknar dem som ses in vivo (figur 6B).
Figur 1. Komponenter i ett bioreaktorkärl. Figur 1 illustrerar nyckelkomponenter i ett bioreaktorkärl och deras position vid ett förmonteringsstadium. (A) Reaktorkammarens, sprutportarnas och ställningens relativa läge. (B) Halvöppet läge för frontplattan (genomskinligt lock) och bakplattan (vit platta täckt av syresättarmembran). Ställningen är placerad i mitten mellan fram- och bakplatta. Den svartfärgade grafenställningen (C) illustrerar hur en byggnadsställning placeras i kärlet och används som stöd för cellerna att föröka sig, differentiera och bilda ett cellulärt nätverk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa illustrationer av byggnadsställningar som testats i denna studie. Fem ställningar testades för våra bioreaktorstudier, varav två exempel presenteras här. (A,B) representerar den grafenställning som testats för ameloblastliknande celltillväxt, medan (C,D) representerar den kollagenställning som är mest framgångsrik för våra bioreaktorbaserade cellodlingsstudier. Observera den porösa strukturen hos kollagenställningen (C,D) jämfört med den parallella uppsättningen av ytpräglingar i grafenställningen (A,B). (A,C) är makrografer tagna ur ett vinkelrätt perspektiv medan (B,D) avbildades i 45° vinkel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Cervikal slinga förberedelse. Den skelettiserade vuxna musunderkäken i A visar livmoderhalsslingan som används för att förbereda cellnischen för ameloblastliknande cellodling och differentiering. Denna makrograf illustrerar också positionen för anatomiska markörer, inklusive den kontinuerligt växande snittet (inc) som spänner över nästan hela mandibulärlängden, den första mandibulära molaren (m1) tillsammans med underkäkens vinkel, coronoidprocessen och positionen för den mandibulära kondylen. Detta skelettpreparat fungerar som en anatomisk orientering för livmoderhalsslingan som framställts i (B). Referenspunkter inkluderar mandibulärt ben (mand), tandpapillvävnad (DP), underkäkens vinkel (vinkel) och positionen för livmoderhalsslingan (CL) från vilken cellerna för våra ameloblastbioreaktorstudier skördades. Den brutna linjen indikerar den främre och distala delen av det fenestrerade mandibulära fönstret som är förberett för dissektion av livmoderhalsslingan i den skelettiserade vuxna underkäken (A) och i den 6 dpn nyligen dissekerade underkäken (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Generering av ameloblastliknande celler med hjälp av en 3D-samodlingsmetod. (A) Framgångsrik differentiering av ameloblastliknande celler från cervikala loopceller som samodlas med stamceller från tandmassa i en lämplig mikromiljö. Den resulterande cellpopulationen bestod av långa, långsträckta, polariserade celler med förmågan att utsöndra emaljmatrisproteiner. Dessa celler innehöll en kärna i ena änden (nucl) och en cellulär process (proc) som liknar Tomes Process som observerats i sanna ameloblaster i den andra änden (A). B) illustrerar en population av kontrollgruppsceller som också utsattes för samodlingsförhållanden men med medier som var fria från tillväxtfaktorer eller differentieringsmedel, vilket resulterade i rundade celler som inte är representativa för typiska ameloblaster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Långsiktig 3D-odling av en encells parodontal stamfader (pdl) med belagda och icke-belagda ställningsytor. Ställningsbeläggning resulterade i en ökning av hPDL-cellproliferationshastigheten i celler odlade på den galaninbelagda ställningen (B) jämfört med kontrollgruppens celler som exponerades för en icke-belagd byggnadsställning (A). Cellerna från experimentgruppen utsöndrade också mer extracellulär matris innehållande bindvävsfibrer jämfört med kontrollgruppen (B mot A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Lungvävnadsodling i en bioreaktor. (A) E15 lungvävnadssegment odlade på ett nitrocellulosamembran i en bioreaktor i tio dagar. (B) E15 lungvävnadssegment som liknar (A) men utsätts för inflammatoriska tillstånd genom att tillsätta IL-6 till mediet (B). (C) Paraffinsektionen i en nyligen dissekerad E15-lungvävnad färgad med H&E. Observera likheter i alveolära cellmorfologier av typ I och typ II när man jämför (A) och (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet för tillväxt av celler i mikrogravitation inkluderar bioreaktorn, byggnadsställningen, cellerna som används för 3D-odling och ställningsbeläggningen som ett sätt att inducera celldifferentiering. Den typ av bioreaktor som används i våra studier omfattar RCCS-4-bioreaktorn, en ny modifiering av den ursprungliga roterande cylindriska vävnadsodlingsanordningen (Rotary Cell Culture System) som utvecklats av NASA för att odla celler i simulerad mikrogravitation. Denna RCCS-4-miljö ger extremt låga skjuvspänningar, vilket förbättrar massöverföringen och förbättrar kulturens prestanda. Denna version av bioreaktorn möjliggjorde samtidig användning av fyra kärl för fyra olika experiment samtidigt. RCCS-4-bioreaktorn var utrustad med HARV-kärl (High Aspect Ratio), vilket säkerställde enkla och raka odlingsförhållanden med ett tillräckligt antal celler för våra studier.
En andra kritisk komponent i vårt tillvägagångssätt är byggnadsställningarna eftersom de tillhandahåller mallar för flytande celler att fästa och bilda sammansättningar. Medan användningen av byggnadsställningar i 2D-odling är begränsad på grund av bildandet av nekrotiska kärnor, förbättrar det förbättrade diffusions-, syre- och näringsflödet i en roterande bioreaktor tillämpligheten av byggnadsställningar som bärare för förökning av cellaggregat28,29. I den aktuella studien undersökte vi effekten av fem typer av byggnadsställningar, poly(mjölksyra-co-glykolsyra (PLGA) ställningar, en kollagenös och porös ställning, en grafenställning, samt en gelatinskiva och en hydrodroxyapatitskiva. Dessutom överförde vi membranet från lungorganets förodlingsmiljö till bioreaktorn, med det odlade lungsegmentet fäst vid det. Bland dessa framstod kollagenställningen som den mest gynnsamma ställningen i våra studier, möjligen på grund av dess kollagenösa sammansättning och porösa struktur. PLGA-ställningen gav livskraftiga celler, medan de andra tre ställningarna var mindre gynnsamma i våra händer. Nitrocellulosamembranet i det ursprungliga lungorganodlingssystemet visade sig vara en annan effektiv byggnadsställning eftersom det framgångsrikt upprätthöll integriteten hos den odlade lungan efter överföring till 3D-bioreaktormiljön.
En tredje kritisk komponent i vår strategi är de typer av celler som används för att så kärlet. För våra amelogenesstudier förlitade vi oss på livmoderhalsslingceller framställda från de kontinuerligt växande mussnedställningarna som samodlades med tandmassaceller. Cervikala slingceller valdes som källa till de ursprungliga emaljorganförfäderna som kontinuerligt förnyas i gnagarens snitt. Mus- eller råttsnittet är en anmärkningsvärd källa till stam- och stamceller som fortsätter att existera under hela djurets liv medan cellerna i emaljorganet fylls på för kontinuerlig utbrott och amelogenes23,30. Både parodontala stamceller och tandmassaceller användes som cellkällor för samkultur. Användningen av mesenkymala samodlingscellpopulationer för framgångsrik odling av epitelceller är väl etablerad31,32. I våra studier var tandmassaceller mer effektiva för att inducera ameloblastdifferentiering än parodontala ligamentförfäder även om båda baserat på deras mesenkymala egenskaper är lämpliga som odontogena och mesenkymala samodlingskandidater. När de appliceras mot amelogenes kan tandmassaceller som den naturliga motsvarigheten till odontogena epitel under tandutveckling ha utlöst lämpliga epitel-mesenkymala interaktioner som är lämpliga för induktion av terminal ameloblastdifferentiering33,34. För studier av ställningsinteraktioner för parodontal vävnadsteknik var dock parodontala stamfäder idealiska eftersom de ger upphov till helt differentierade parodontala ligamentfibroblaster25,35. Slutligen, för odling av lungorgan i en bioreaktormiljö, förlitade vi oss på dissekerade embryonala murina lungsegment. Procedurer för att odla embryonala lungorgan i organodlingsskålar har beskrivits tidigare36 och ett antal tvådimensionella cellodlingsmodeller som kombinerar lungepitelceller med vaskulära eller glattmuskelceller har undersökts37,38,39. I den aktuella studien upprätthöll 3D-bioreaktormodellen en robust nivå av ytaktivt utsöndring samtidigt som integriteten hos kärnan i det odlade vävnadsblocket bevarades, vilket gjorde denna modell lämplig för studier av miljöeffekter på lungvävnadens integritet.
Den fjärde viktiga aspekten av vår modell är appliceringen av celltypspecifika beläggningar på ställningsytorna för att utlösa ameloblastliknande celldifferentiering. Specifikt framkom komponenter som LRAP och emaljmatris som viktiga bidragande faktorer mot ameloblastliknande celldifferentiering eftersom brist på beläggning med LRAP och initial emaljmatris förbjöd bildandet av långsträckta och polariserade celler. Tillsammans ger beläggningen av ställningsytor ett kraftfullt verktyg för att främja den vävnadsspecifika differentieringen av komplexa organ i bioreaktorer.
Den viktigaste aspekten av denna studie var förmågan att återställa den distinkta långsträckta och polariserade cellformen hos ameloblaster. Detta resultat är en unik fördel med 3D-bioreaktorsystemet jämfört med begränsningarna hos 2D-odlingssystem som mycket rundade emalj-organderivatceller. Detta resultat ger ytterligare bevis för fördelen med att använda bioreaktorteknik vid odling av celler som är oförenliga med andra odlingstekniker40. Vi tillskriver framgången för ameloblast-samodlingsstudierna till flera unika attribut hos det roterande bioreaktorsystemet, inklusive kontinuerlig tillförsel av näringsämnen, tillväxt- och transkriptionsfaktorer och syre, samt enskilda cellers förmåga att aggregera och bilda sociala interaktioner mellan celler av olika släktlinjer och utvecklingsstadier. Medan studierna lyckades växa långsträckta, polariserade och amelogenin som utsöndrar ameloblastliknande celler, förblir de ameloblastliknande cellerna som odlas här isolerade och den naturliga kontinuiteten i ameloblastcellraden gick förlorad. I framtida tillämpningar kan ameloblastliknande celler som odlas med denna teknik användas för emaljvävnadstekniska applikationer eller som en experimentell modell för att rekapitulera aspekter av tandamelogenes.
Sammanfattningsvis framkom 3D-bioreaktorn som en framgångsrik miljö för spridning av samkulturer av livmoderhalsslinga/tandmassa till ameloblaster, för tillväxt av parodontala ligamentförfäder i belagda byggnadsställningar och för odling av hela lungorgan. Baserat på dessa data kommer bioreaktorbaserad teknik sannolikt att dyka upp som viktiga fordon för avancerad vävnadsteknik eller teststrategier inom områden som tandemaljen, periodontal och lungforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Studierna stöddes generöst av bidrag från National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 och R01-DE027930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -y, Wang, X. -m, Li, X. -y An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au - Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
