Summary
Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l'espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.
Abstract
La gravità è uno dei determinanti chiave della funzione delle cellule umane, della proliferazione, dell'architettura citoscheletrica e dell'orientamento. I sistemi di bioreattori rotanti (RCCS) imitano la perdita di gravità che si verifica nello spazio e forniscono invece un ambiente di microgravità attraverso la rotazione continua di cellule o tessuti in coltura. Questi RCCS assicurano un apporto ininterrotto di nutrienti, fattori di crescita e trascrizione e ossigeno e affrontano alcune delle carenze delle forze gravitazionali in piatti immobili di coltura cellulare o di organi 2D (bidimensionali). Nel presente studio abbiamo utilizzato RCCS per co-coltivare cellule dell'ansa cervicale e cellule della polpa dentale per diventare ameloblasti, per caratterizzare le interazioni progenitore/scaffold parodontale e per determinare l'effetto dell'infiammazione sugli alveoli polmonari. Gli ambienti RCCS hanno facilitato la crescita di cellule simili agli ameloblasti, promosso la proliferazione dei progenitori parodontali in risposta ai rivestimenti dell'impalcatura e hanno permesso una valutazione degli effetti dei cambiamenti infiammatori sugli alveoli polmonari coltivati. Questo manoscritto riassume le condizioni ambientali, i materiali e le fasi lungo il percorso ed evidenzia aspetti critici e dettagli sperimentali. In conclusione, gli RCCS sono strumenti innovativi per padroneggiare la coltura e la crescita 3D (tridimensionale) di cellule in vitro e per consentire lo studio di sistemi cellulari o interazioni non suscettibili di classici ambienti di coltura 2D.
Introduction
La gravità influenza tutti gli aspetti della vita sulla Terra, compresa la biologia delle singole cellule e la loro funzione all'interno degli organismi. Le cellule percepiscono la gravità attraverso i meccanorecettori e rispondono ai cambiamenti di gravità riconfigurando le architetture citoscheletriche e alterando la divisione cellulare 1,2,3. Altri effetti della microgravità includono la pressione idrostatica nelle vescicole piene di liquido, la sedimentazione degli organelli e la convezione guidata dalla galleggiabilità del flusso e del calore4. Gli studi sull'effetto della perdita di gravità sulle cellule e sugli organi umani sono stati originariamente condotti per simulare l'ambiente senza peso dello spazio sugli astronauti durante le missioni di volo spaziale5. Tuttavia, negli ultimi anni, queste tecnologie di bioreattori 3D originariamente sviluppate dalla NASA per simulare la microgravità stanno diventando sempre più rilevanti come nuovi approcci per la coltura di popolazioni cellulari che altrimenti non sarebbero suscettibili di sistemi di coltura 2D.
I bioreattori 3D simulano la microgravità facendo crescere cellule in sospensione e creando così un costante effetto di "caduta libera". Altri vantaggi dei bioreattori rotanti includono la mancanza di esposizione all'aria riscontrata nei sistemi di coltura degli organi, una riduzione dello stress di taglio e della turbolenza e una continua esposizione a un cambiamento dell'apporto di sostanze nutritive. Queste condizioni dinamiche fornite da un bioreattore Rotary Cell Culture System (RCCS) favoriscono la co-localizzazione spaziale e l'assemblaggio tridimensionale di singole cellule in aggregati 6,7.
Studi precedenti hanno dimostrato i vantaggi di un bioreattore rotativo per la rigenerazione ossea8, la coltura di germi dentali9 e per la coltura di cellule follicolari dentali umane10. C'è stato anche un rapporto che suggerisce che RCCS migliora la proliferazione delle cellule EOE e la differenziazione in ameloblasti11. Tuttavia, le cellule differenziate sono state considerate ameloblasti sulla base dell'immunofluorescenza dell'ameloblastina e/o dell'espressione di amelogenina da sola11 senza considerare la loro morfologia allungata o la forma cellulare polarizzata.
Oltre al bioreattore RWV (rotating wall vessels) sviluppato dalla NASA, altre tecnologie per generare aggregati 3D dalle cellule includono la levitazione magnetica, la macchina di posizionamento casuale (RPM) e il clinostato12. Per ottenere la levitazione magnetica, le cellule marcate con nanoparticelle magnetiche vengono levitate utilizzando una forza magnetica esterna, con conseguente formazione di strutture 3D prive di impalcature che sono state utilizzate per la biofabbricazione di strutture adipocitarie13,14,15. Un altro approccio per simulare la microgravità è la generazione di forze G multidirezionali controllando la rotazione simultanea su due assi con conseguente cancellazione del vettore di gravità cumulativo al centro di un dispositivo chiamato clinostat16. Quando le cellule staminali del midollo osseo sono state coltivate in un clinostat, la formazione di nuovo osso è stata inibita attraverso la soppressione della differenziazione degli osteoblasti, illustrando uno degli effetti dedifferenzianti della microgravità16.
I sistemi in vitro per facilitare la coltura fedele degli ameloblasti fornirebbero un importante passo avanti verso l'ingegneria dei tessuti dello smalto dei denti17. Sfortunatamente, fino ad oggi, la cultura degli ameloblasti è stata un'impresa impegnativa18,19. Finora, sono state descritte cinque diverse linee cellulari simili agli ameloblasti, tra cui la linea cellulare di ameloblasti di topo (ALC), la linea cellulare epiteliale dentale del ratto (HAT-7), la linea cellulare LS8 del topo20, la linea cellulare PABSo-E suina 21 e la linea cellulare SF2-24 del ratto22. Tuttavia, la maggior parte di queste cellule ha perso la loro caratteristica forma cellulare polarizzata nella coltura 2D.
Nel presente studio ci siamo rivolti a un sistema di bioreattore di coltura cellulare rotante (RCCS) per facilitare la crescita di cellule simili agli ameloblasti da epiteli dell'ansa cervicale co-coltivati con progenitori mesenchimali e per superare le sfide dei sistemi di coltura 2D, tra cui il ridotto flusso di nutrienti e i cambiamenti citoscheletrici dovuti alla gravità. Inoltre, l'RCCS ha fornito nuove strade per lo studio delle interazioni cellula/scaffold relative all'ingegneria del tessuto parodontale e per esaminare gli effetti dei mediatori infiammatori sui tessuti alveolari polmonari in vitro. Insieme, i risultati di questi studi evidenziano i benefici dei sistemi di coltura rotativa basati sulla microgravità per la propagazione di epiteli differenziati e per la valutazione degli effetti ambientali sulle cellule coltivate in vitro, comprese le interazioni cellula/scaffold e la risposta tissutale alle condizioni infiammatorie.
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Protocol
È stata ottenuta tutta l'approvazione istituzionale necessaria per garantire che lo studio fosse conforme alle linee guida istituzionali per la cura degli animali TAMU.
1. Assemblaggio e sterilizzazione del bioreattore
- Sterilizzare quattro recipienti ad alto rapporto d'aspetto (HARV) per il bioreattore in autoclave sul ciclo dello strumento in plastica per 20 minuti a 121 °C come raccomandato dal produttore.
- Dopo la sterilizzazione, assemblare i vasi in una cappa di coltura cellulare stringendo le viti fornite con il bioreattore dopo di che i vasi sono pronti per l'uso.
2. Scaffold utilizzati per l'esperimento di co-coltura di bioreattori
- Incubare gli scaffold insieme alle cellule per fornire supporto per l'attaccamento cellulare necessario per un'ulteriore crescita.
- Scegli tra scaffold a base di PGA, scaffold di idrossiapatite, fogli di grafene, dischi di gelatina e scaffold a base di collagene per studi di co-coltura.
3. Dissezione dell'ansa cervicale (CL) e preparazione di singole cellule
- Sacrificare topi per decapitazione a seguito di arresto respiratorio per overdose di CO2 .
NOTA: Tutti gli studi sugli animali sono conformi alle linee guida istituzionali TAMU per la cura degli animali. - Sezionare le anse cervicali di topi postnatali (DPN) di 6 giorni seguendo una versione modificata di un protocollo23 precedentemente pubblicato.
NOTA: Nel nostro studio, è inclusa la porzione distale dell'ansa cervicale non mostrata nel protocollo precedentemente pubblicato (Figura 3).- Lavare il tessuto sezionato con PBS sterile freddo prima della digestione con collagenasi dispasi a 37 °C per 30 minuti.
- Passare la soluzione attraverso un filtro a cellule sterili da 70 μm e centrifugare ulteriormente a 800 x g per 10 minuti.
- Scartare il surnatante. Centrifugare il pellet e lavare due volte con PBS freddo a 800 x g. Scartare il surnatante.
- Contare le cellule usando un emocitometro e aggiungere 1 X 105 cellule per nave.
4. Coltura cellulare della polpa dentale ed espansione della linea cellulare
- Cellule di polpa dentale su piastra in una piastra di coltura tissutale da 100 mm al passaggio 4 ad una concentrazione di 1 x 105.
- Preparare i terreni per la coltura costituiti da DMEM ad alto contenuto di glucosio, integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di antibiotici / antimicotici (P / S).
- Quando le celle raggiungono l'85-90% di confluenza, aspirare il mezzo e lavare le piastre due volte con PBS preriscaldato.
- Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere una soluzione di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25% alla piastra e incubare le piastre contenenti cellulosa dentale a 37 °C per 3 minuti.
- Confermare il distacco della cellula mediante ispezione visiva utilizzando un microscopio.
- Raccogliere il mezzo insieme alle cellule dalla piastra di coltura e trasferirli tramite una pipetta da 25 mL a un tubo conico sterile da 50 ml.
- Centrifugare le cellule a 800 x g per 8 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in mezzi freschi e contare utilizzando un emocitometro.
- Per la co-coltura con cellule dell'ansa cervicale, seminare le cellule della polpa dentale nel bioreattore ad una concentrazione di 1 x 104 per vaso.
5. Co-coltura di cellule dell'ansa cervicale/polpa dentale su un'impalcatura all'interno del bioreattore RCCS
- Aggiungere entrambi i tipi di cellule, l'ansa cervicale e la polpa dentale al terreno di coltura contenente terreni SFM di cheratinociti con fattori di crescita integrati, proteine della matrice extracellulare e scaffold .
NOTA: I fattori di crescita vengono aggiunti ad una concentrazione di 0,03 μg/mL di proteina morfogenetica ossea 2 (BMP 2), 0,03 μg/mL di proteina morfogenetica ossea 4 (BMP-4), 10 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti umani ricombinanti (hFGF) e 15 ng/mL di fattore di crescita epidermico (hEGF), mentre i componenti della ECM includevano 200 μg/mL Matrigel, 5 μg/mL di laminina e 5 μg/mL di fibronectina. - Scaffold rivestiti con una miscela di 500 μL di gel di collagene arricchita con 1 mg di peptide LRAP (peptide di amelogenina ricco di leucina), 1 mg di matrice di smalto liofilizzata allo stadio iniziale preparata da denti suini24, 5 μg/mL di laminina e 5 μg/ml di fibronectina.
NOTA: questo ha funzionato meglio per i nostri esperimenti. - Dopo il rivestimento dello scaffold, aggiungere entrambe le celle e lo scaffold al bioreattore e riempire il bioreattore con 10 mL di terreno per serbatoio.
- Chiudere il tappo della porta di riempimento del contenitore del bioreattore dopo l'aggiunta di media, celle e impalcature.
- Collegare le valvole sterili alle porte della siringa all'inizio dell'esperimento e tenerle in posizione con un coperchio fino alla fine dell'esperimento.
- Una volta che il recipiente è pieno al 90% e i tappi delle porte di riempimento sono chiusi e serrati, aprire le valvole sterili.
- Utilizzare due siringhe sterili (3 ml) ogni volta che è necessario un cambio di supporto. Riempire una siringa con mezzo fresco mentre l'altra siringa viene lasciata vuota.
- Aprire entrambe le valvole della siringa e manovrare delicatamente le bolle verso la porta vuota della siringa.
- Una volta che il mezzo fresco della siringa piena viene accuratamente iniettato nel recipiente, rimuovere le bolle attraverso la porta vuota della siringa.
NOTA: Questa procedura viene eseguita fino a quando tutte le microbolle vengono rimosse dai vasi. - Chiudere le porte delle siringhe con i tappi e gettare le siringhe in un contenitore per rifiuti taglienti.
- Collegare ciascun recipiente alla base del rotatore e posizionare la base del rotatore in un'incubatrice con una temperatura di CO2 al 5% e 37 °C.
- Accendere l'alimentazione e impostare la velocità di rotazione su 10,1 giri/min.
NOTA: regolare la velocità per assicurarsi che i ponteggi siano in sospensione senza toccare la parete del serbatoio. - Per il cambio dei media, posizionare i vasi in posizione verticale per garantire che le cellule si depositino sul fondo. Aprire le porte delle siringhe e collegare le siringhe sterili alle porte.
- Seguire la stessa procedura aspirando il 75% del terreno impoverito di nutrizione e iniettando terreno fresco attraverso l'altra porta.
6. Preparazione di organi polmonari e coltura basata su bioreattori
NOTA: E15 cuccioli di topo selvatico sono stati utilizzati per la preparazione di organi polmonari.
- Sezionare il tessuto polmonare dopo l'eutanasia di un topo femmina gravido con asfissia da CO2 .
- Una volta confermata la morte a seguito di asfissia da lussazione cervicale, utilizzare un bisturi per esporre la cavità toracica. Successivamente, rimuovere i cuccioli dall'utero e eutanasia per decapitazione.
- Dopo l'eutanasia, preparare la cavità toracica aprendola con un bisturi per localizzare i polmoni. Lavare piccoli segmenti di tessuto polmonare con PBS sterile e posizionarlo su una membrana pre-sterilizzata per 2 ore con terreno di coltura di organi in un'incubatrice contenente il 5% di CO2 e 37 °C di temperatura.
- Una volta che i tessuti polmonari si attaccano alla membrana in una piastra di coltura di organi 2D, trasferire i campioni al contenitore del bioreattore.
- Preparare i media alla cultura.
NOTA: Il mezzo di controllo DMEM ad alto contenuto di glucosio contiene il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di soluzione antibiotica (P / S) (penicillina, 100 U / mL, streptomicina, 50 μg / mL) e 100 μg / mL di acido ascorbico (AA) e per l'induzione di condizioni infiammatorie, il mezzo di controllo è integrato con 5 ng / mL di proteina IL-6. - Effettuare l'esperimento di coltura polmonare per 10 giorni con un cambio di terreno ogni 48 ore nel bioreattore come descritto sopra.
7. Scaffold rivestito con coltura cellulare del legamento parodontale umano (hPDL)
- Colture di cellule legamentose parodontali umane.
NOTA: Le cellule sono isolate e coltivate nel nostro laboratorio secondo il protocollo precedentemente pubblicato25. - Rivestire i dischi di scaffold di collagene con 30 μL di PBS per il gruppo di controllo e il neuropeptide galanina (GAL) ad una concentrazione di 10-8 durante la notte.
- Seminare cellule PDL umane sul controllo e impalcatura rivestita di GAL per 2 ore a 37 °C in una piastra di coltura e trasferire gli scaffold seminati dalle cellule in un contenitore di bioreattore come menzionato sopra.
- Coltura degli scaffold seminati dalla cellula per 14 giorni nel bioreattore prima di raccogliere gli scaffold per l'analisi.
8. Pulizia e manutenzione del bioreattore
- Dopo che gli scaffold / le cellule sono stati raccolti dal bioreattore, rimuovere le porte della siringa dal serbatoio.
NOTA: Le viti attorno ai recipienti vengono tolte e il recipiente viene lavato delicatamente con acqua saponata. - Risciacquare i vasi con acqua pulita e stringere ancora una volta le viti.
- Conservare i recipienti dopo l'autoclave fino al successivo utilizzo.
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Representative Results
La camera interna del bioreattore fornisce un ambiente in cui le cellule possono proliferare e differenziarsi, attaccarsi a un'impalcatura o riunirsi per formare tessuti come assemblaggi. Ogni vaso HARV contiene fino a 10 ml di terreno e facilita una circolazione costante di sostanze nutritive in modo che ogni cellula abbia un'eccellente possibilità di sopravvivere. La figura 1A illustra il fissaggio delle porte della siringa alla piastra anteriore del recipiente in cui sono fissate le valvole sterili one-stop. Queste valvole fungono da portiere della camera di coltura. Il cambio del mezzo richiede l'apertura della valvola del rubinetto di arresto per facilitare il fissaggio di una siringa sterile contenente un mezzo fresco. L'ambiente di microgravità all'interno del bioreattore consente alle cellule di attaccarsi all'impalcatura all'interno del recipiente senza richiedere una previa semina sugli impalcature. L'impalcatura (Figure 1B e 1C) posta nel bioreattore ruota continuamente, consentendo alle cellule di attaccarsi alle superfici dell'impalcatura e formare reti citoscheletriche. La membrana ossigenatrice nella parte inferiore della piastra del vaso (Figura 1B) consente uno scambio continuo di gas per migliorare la sopravvivenza e la longevità delle cellule.
Sono stati testati vari scaffold per identificare l'impalcatura più compatibile con le celle. L'impalcatura nelle figure 2A e 2B è un foglio di grafene composto per il 75% da grafene e per il 25% da PLG (glicolide polilattico). Questa impalcatura elettricamente conduttiva viene spesso utilizzata per le cellule che possono richiedere una stimolazione elettrica, come le cellule muscolari scheletriche26. Nei nostri studi, l'impalcatura di collagene ha superato tutti gli altri studi testati in termini di biocompatibilità, promozione della crescita dei tessuti e differenziazione cellulare. La superficie porosa specializzata di questa impalcatura a base di collagene (Figura 2C e 2D) consente alle cellule e ai nutrienti di fluire attraverso l'impalcatura, aumentando l'area di attaccamento cellulare e la proliferazione cellulare.
La posizione dell'ansa cervicale in relazione alla mandibola del topo è illustrata nelle figure 3A e 3B. Per preparare le cellule dell'ansa cervicale dell'incisivo del topo, è stata sezionata una mandibola di topo scheletrizzata ed è stata esposta la porzione più distale dell'incisivo inferiore del topo. La posizione precisa dell'ansa cervicale resecata è delimitata nell'incisivo di topo postnatale di 6 giorni (Figura 3B), mentre una regione simile in una mandibola di topo scheletrato adulto è fornita come riferimento nella Figura 3A per scopi di orientamento. L'area dell'ansa cervicale corrispondente nello scheletrato adulto (Figura 3A) e l'incisivo di topo appena preparato 6 dpn è incorniciato da due linee spezzate (Figura 3A e B). La dentatura delle mandibole emiche è composta da tre molari mandibolari e un incisivo in continua crescita, mentre la nicchia cellulare dell'ansa cervicale è composta da una popolazione cellulare mista coinvolta nella formazione dello smalto come l'epitelio dello smalto interno, l'epitelio dello smalto esterno, il reticolo stellato e lo strato intermedio19.
La Figura 4 si concentra sulla differenziazione riuscita delle cellule dell'ansa cervicale in cellule allungate, polarizzate, che secernono cellule simili agli ameloblasti. I dati hanno rivelato che la differenziazione riuscita di cellule allungate, polarizzate, che secernono proteine dello smalto simili agli ameloblasti richiede la co-coltura delle cellule dell'ansa cervicale con cellule staminali mesenchimali come le cellule staminali della polpa dentale. Le cellule in coltura sono state dotate di un microambiente su misura come descritto nella fase 3 del protocollo, con conseguente formazione di cellule polarizzate con il nucleo a un'estremità e un lungo processo cellulare all'altra27, una caratteristica tipica degli ameloblasti (Figura 4A). L'applicazione di mezzi da soli e senza fattori di crescita e/o rivestimento di impalcatura ha portato a cellule dell'ansa cervicale che secernono proteine chiave dello smalto ma non si allungano o si polarizzano (Figura 4B).
Gli scaffold di collagene rivestiti e non rivestiti di galanina sono stati collocati in un bioreattore con cellule hPDL per quattordici giorni in un bioreattore. Le cellule sono sopravvissute a un periodo di coltura di due settimane nel sistema di coltura 3D e il gruppo scaffold rivestito di galanina ha dimostrato un tasso di proliferazione significativamente più elevato (Figura 5B) rispetto al gruppo di controllo contenente scaffold non rivestiti (Figura 5A). Le cellule del gruppo sperimentale hanno anche dimostrato un livello significativamente più elevato di matrice extracellulare contenente fibre del tessuto connettivo rispetto al controllo.
L'ambiente del bioreattore si è dimostrato efficace per la crescita dei segmenti polmonari in un ambiente di microgravità 3D (Figura 6). Per questo studio, segmenti di tessuto polmonare raccolti da topi E15 (Figura 6C) sono stati posti su una membrana di nitrocellulosa in un piatto di coltura di organi per due ore. Dopo l'attacco iniziale del tessuto alla membrana, il tessuto polmonare/tessuto composito della membrana nitrocellulare è stato posto nel contenitore del bioreattore ed è stato coltivato con successo per 10 giorni (Figura 6A). Per studiare gli effetti delle condizioni infiammatorie sulla crescita del tessuto polmonare, l'aggiunta di IL-6 al terreno di coltura ha determinato cambiamenti tipici associati all'infiammazione nella morfologia alveolare simili a quelli osservati in vivo (Figura 6B).
Figura 1. Componenti di un contenitore di bioreattore. La figura 1 illustra i componenti chiave di un contenitore di bioreattore e la loro posizione in una fase di pre-assemblaggio. (A) Posizione relativa della camera del reattore, delle porte delle siringhe e dell'impalcatura. (B) Posizione semiaperta della piastra anteriore (coperchio trasparente) e della piastra posteriore (piastra bianca coperta da membrana ossigenante). L'impalcatura è posizionata al centro tra la piastra anteriore e posteriore. L'impalcatura di grafene di colore nero (C) illustra come un'impalcatura viene posizionata all'interno del vaso e utilizzata come supporto per le cellule per proliferare, differenziarsi e formare una rete cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Illustrazioni rappresentative degli scaffold testati in questo studio. Cinque scaffold sono stati testati per i nostri studi sui bioreattori, di cui due esempi sono presentati qui. (A,B) rappresenta lo scaffold di grafene testato per la crescita cellulare simile all'ameloblasto, mentre (C,D) rappresenta lo scaffold di collagene di maggior successo per i nostri studi di coltura cellulare basati su bioreattori. Si noti la struttura porosa dello scaffold di collagene (C,D) rispetto alla matrice parallela di goffrature superficiali nello scaffold di grafene (A,B). (A,C) sono macrografie prese da una prospettiva perpendicolare mentre (B,D) sono state riprese con un angolo di 45°. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Preparazione dell'ansa cervicale. La mandibola di topo adulto scheletrata in A dimostra la regione dell'ansa cervicale utilizzata per preparare la nicchia cellulare per la coltura e la differenziazione cellulare simile all'ameloblasto. Questa macrografia illustra anche la posizione dei marcatori anatomici, tra cui l'incisivo a crescita continua (inc) che copre quasi l'intera lunghezza mandibolare, il primo molare mandibolare (m1) insieme all'angolo della mandibola, il processo coronoideo e la posizione del condilo mandibolare. Questa preparazione scheletrica serve come orientamento anatomico per la regione dell'ansa cervicale preparata in (B). I punti di riferimento includono l'osso mandibolare (mand), il tessuto della papilla dentale (DP), l'angolo della mandibola (Angle) e la posizione dell'ansa cervicale (CL) da cui sono state raccolte le cellule per i nostri studi sul bioreattore ameloblasto. La linea spezzata indica la porzione anteriore e distale della finestra mandibolare fenestrata preparata per la dissezione dell'ansa cervicale nella mandibola adulta scheletrizzata (A) e nella mandibola appena sezionata a 6 dpn (B). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Generazione di cellule simili agli ameloblasti utilizzando un approccio di co-coltura 3D. (A) Differenziazione riuscita di cellule simili ad ameloblasti da cellule dell'ansa cervicale co-coltivate con cellule staminali della polpa dentale in un microambiente adatto. La popolazione cellulare risultante era composta da cellule lunghe, allungate e polarizzate con la capacità di secernere proteine della matrice dello smalto. Queste cellule presentavano un nucleo ad un'estremità (nucl) e un processo cellulare (proc) simile al processo di Tomes come osservato nei veri ameloblasti all'altra estremità (A). (B) illustra una popolazione di cellule del gruppo di controllo che sono state anche sottoposte a condizioni di co-coltura, ma con mezzi privi di fattori di crescita o agenti di differenziazione, risultando in cellule arrotondate non rappresentative dei tipici ameloblasti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Coltura 3D a lungo termine di una popolazione progenitrice parodontale unicellulare (PDL) con superfici di scaffold rivestite e non rivestite. Il rivestimento dello scaffold ha determinato un aumento del tasso di proliferazione delle cellule hPDL nelle cellule coltivate sullo scaffold rivestito di galanina (B) rispetto alle cellule del gruppo di controllo esposte a uno scaffold non rivestito (A). Le cellule del gruppo sperimentale hanno anche secreto più matrice extracellulare contenente fibre del tessuto connettivo rispetto al gruppo di controllo (B contro A). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6. Coltura di tessuto polmonare in un bioreattore. (A) Segmenti di tessuto polmonare E15 coltivati su una membrana di nitrocellulosa in un bioreattore per dieci giorni. (B) Segmenti di tessuto polmonare E15 simili a (A) ma sottoposti a condizioni infiammatorie aggiungendo IL-6 al mezzo (B). (C) Sezione di paraffina di un tessuto polmonare E15 appena sezionato colorato con H & E. Si notano somiglianze nelle morfologie delle cellule alveolari di tipo I e di tipo II quando si confrontano (A) e (C). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I passaggi critici del protocollo per la crescita delle cellule in microgravità includono il bioreattore, lo scaffold, le cellule utilizzate per la coltura 3D e il rivestimento dello scaffold come mezzo per indurre la differenziazione cellulare. Il tipo di bioreattore utilizzato nei nostri studi comprende il bioreattore RCCS-4, una recente modifica dell'originale dispositivo di coltura cilindrica rotante del sistema di coltura cellulare rotante (RCCS) sviluppato dalla NASA per far crescere cellule in microgravità simulata. Questo ambiente RCCS-4 fornisce sollecitazioni di taglio estremamente basse, che migliorano il trasferimento di massa e migliorano le prestazioni della coltura. Questa versione del bioreattore consentiva l'uso simultaneo di quattro vasi per quattro diversi esperimenti contemporaneamente. Il bioreattore RCCS-4 è stato dotato di vasi ad alto rapporto d'aspetto (HARV), che hanno garantito condizioni di coltura semplici e dirette con un numero sufficiente di cellule per i nostri studi.
Un secondo componente critico del nostro approccio sono gli scaffold in quanto forniscono modelli per celle mobili per attaccare e formare assiemi. Mentre l'uso di scaffold nella coltura 2D è limitato a causa della formazione di nuclei necrotici, la maggiore diffusione, flusso di ossigeno e nutrienti in un bioreattore rotante migliora l'applicabilità degli scaffold come vettori per la propagazione di assemblaggi cellulari28,29. Nel presente studio abbiamo esplorato l'efficacia di cinque tipi di scaffold, gli scaffold di acido poli(lattico-co-glicolico (PLGA), uno scaffold collagene e poroso, uno scafold di grafene, nonché un disco di gelatina e un disco di idrodroxyapatite. Inoltre, abbiamo trasferito la membrana dall'ambiente di precoltura degli organi polmonari al bioreattore, con il segmento polmonare coltivato collegato ad esso. Tra questi, l'impalcatura di collagene è emersa come l'impalcatura più favorevole nei nostri studi, probabilmente a causa della sua composizione collagenosa e della sua struttura porosa. L'impalcatura PLGA ha prodotto cellule vitali, mentre gli altri tre scaffold erano meno favorevoli nelle nostre mani. La membrana nitrocellulosa del sistema originale di coltura degli organi polmonari si è dimostrata un'altra impalcatura efficace in quanto ha mantenuto con successo l'integrità del polmone coltivato dopo il trasferimento nell'ambiente del bioreattore 3D.
Una terza componente critica della nostra strategia sono i tipi di cellule utilizzate per seminare il vaso. Per i nostri studi sull'amelogenesi ci siamo affidati a cellule dell'ansa cervicale preparate dagli incisivi di topo in continua crescita che sono stati co-coltivati con cellule polpa dentali. Le cellule dell'ansa cervicale sono state scelte come fonte dei progenitori originali dell'organo dello smalto che vengono continuamente rinnovati nell'incisivo del roditore. L'incisivo di topo o ratto è una notevole fonte di cellule staminali e progenitrici che continua ad esistere per tutta la vita dell'animale mentre le cellule dell'organo dello smalto vengono reintegrate per l'eruzione continua e l'amelogenesi23,30. Sia le cellule progenitrici parodontali che le cellule polpa dentali sono state utilizzate come fonti cellulari di co-coltura. L'uso di popolazioni cellulari di co-coltura mesenchimali per il successo della coltura di cellule epiteliali è ben stabilito31,32. Nei nostri studi, le cellule polpa dentali erano più efficaci nell'indurre la differenziazione degli ameloblasti rispetto ai progenitori del legamento parodontale, anche se in base alle loro caratteristiche mesenchimali, entrambi sono adatti come candidati di co-coltura odontogena e mesenchimale. Quando applicate all'amelogenesi, le cellule polpose dentali come controparte naturale dell'epitelio odontogeno durante lo sviluppo del dente potrebbero aver innescato le appropriate interazioni epiteliali-mesenchimali adatte all'induzione della differenziazione terminale degli ameloblasti33,34. Tuttavia, per lo studio delle interazioni dello scaffold per l'ingegneria del tessuto parodontale, i progenitori parodontali erano ideali in quanto danno origine a fibroblasti del legamento parodontale completamente differenziati25,35. Infine, per la coltura di organi polmonari in un ambiente bioreattore, ci siamo affidati a segmenti polmonari murini embrionali sezionati. Le procedure per la coltura di organi polmonari embrionali in piatti di coltura di organi sono state descritte in precedenza36 e un certo numero di modelli di coltura cellulare bidimensionale che combinano cellule epiteliali polmonari con cellule vascolari o muscolari lisce sono stati esplorati37,38,39. Nel presente studio, il modello di bioreattore 3D ha mantenuto un robusto livello di secrezione di tensioattivi preservando l'integrità del nucleo del blocco di tessuto coltivato, rendendo questo modello adatto allo studio degli effetti ambientali sull'integrità del tessuto polmonare.
Il quarto aspetto significativo del nostro modello è l'applicazione di rivestimenti specifici per tipo di cellula sulle superfici dello scaffold per innescare la differenziazione cellulare simile all'ameloblasto. In particolare, componenti come LRAP e matrice di smalto sono emersi come fattori chiave che contribuiscono alla differenziazione cellulare simile all'ameloblasto poiché la mancanza di rivestimento con LRAP e matrice di smalto iniziale ha impedito la formazione di cellule allungate e polarizzate. Insieme, il rivestimento delle superfici delle impalcature fornisce un potente strumento per promuovere la differenziazione tessuto-specifica di organi complessi nei bioreattori.
L'aspetto più significativo di questo studio è stata la capacità di ripristinare la caratteristica forma cellulare allungata e polarizzata degli ameloblasti. Questo risultato è un vantaggio unico del sistema di bioreattori 3D rispetto ai limiti dei sistemi di coltura 2D che hanno altamente arrotondato le cellule derivate dallo smalto. Questo risultato fornisce ulteriori prove del vantaggio dell'uso di tecnologie di bioreattori quando si coltivano cellule incompatibili con altre tecnologie di coltura40. Attribuiamo il successo degli studi di co-coltura di ameloblasti a diversi attributi unici del sistema di bioreattori rotatori, tra cui la fornitura continua di nutrienti, fattori di crescita e trascrizione e ossigeno, nonché la capacità delle singole cellule di aggregare e formare interazioni sociali tra cellule di vari lignaggi e fasi di sviluppo. Mentre gli studi sono riusciti a far crescere cellule allungate, polarizzate e amelogenine che secernono ameloblasti, le cellule simili agli ameloblasti cresciute qui rimangono isolate e la continuità naturale della fila di cellule ameloblastiche è stata persa. In applicazioni future, cellule simili agli ameloblasti coltivate con questa tecnologia potrebbero essere utilizzate per applicazioni di ingegneria tissutale dello smalto o come modello sperimentale per ricapitolare aspetti dell'amelogenesi dentale.
In conclusione, il bioreattore 3D è emerso come un ambiente di successo per la propagazione di co-colture di pasta cervicale/polpa dentale in ameloblasti, per la crescita di progenitori del legamento parodontale in scaffold rivestiti e per la coltura di interi organi polmonari. Sulla base di questi dati, è probabile che le tecnologie basate sui bioreattori emergano come veicoli importanti per l'ingegneria tissutale avanzata o strategie di test in settori come lo smalto dei denti, la ricerca parodontale e polmonare.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli studi sono stati generosamente sostenuti da sovvenzioni del National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 e R01-DE027930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
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