מוצג כאן פרוטוקול ליצירת רקמות חיבור מהונדסות לתרבות מקבילה של 48 רקמות בלוח רב-בארות עם מוטות כפולים, המתאימים למחקרים מכאניסטיים, מידול מחלות ויישומי סינון. הפרוטוקול תואם פיברובלסטים מאיברים ומינים שונים ומודגם כאן עם פיברובלסטים לב ראשוניים אנושיים.
פיברובלסטים הם תאים דינמיים מאוד פנוטיפיים, אשר במהירות transdifferentiate לתוך myofibroblasts בתגובה גירויים ביוכימיים וביומכניים. ההבנה הנוכחית של תהליכים פיברוטיים, כולל פיברוזיס לב, נותרה גרועה, מה שמעכב את התפתחותם של טיפולים אנטי-פיברוטיים חדשים. מערכות מודל אנושיות ניתנות לשליטה ואמינות חיוניות להבנה טובה יותר של פתולוגיה פיברוזיס. זהו פרוטוקול רב-רב-ממד ליצירת רקמות חיבור מהונדסות (ECT) בלוח יציקה של 48 בארות כדי להקל על מחקרים על פיברובלסטים ועל הפתופיזיולוגיה של רקמה פיברוטית בסביבה תלת-ממדית (תלת-ממדית). ECT נוצרים סביב הקטבים עם נוקשות טונה, המאפשר מחקרים תחת עומס ביומכני מוגדר. תחת תנאי הטעינה המוגדרים, ניתן ללמוד התאמות פנוטיפיות הנשלטות על ידי אינטראקציות מטריצת תאים. בדיקה מקבילה אפשרית בפורמט 48-well עם הזדמנות לניתוח מסלול זמן של פרמטרים מרובים, כגון דחיסת רקמות והתכווצות נגד העומס. מפרמטרים אלה, תכונות ביומכניות כגון נוקשות רקמות וגמישות ניתן ללמוד.
מכשול מרכזי בחקר מחלות פיברוטיות הוא היעדר מודלים ייצוגיים של רקמת תלת-ממד אנושית המספקים תובנה על התנהגותם של פיברובלסטים ונגזרותיהם הפתולוגיות. כדי לחקור תהליכים פיברוטיים, מערכות תרבות 2D סטנדרטיות הן תת-אופטימליות מאז פיברובלסטים מבודדים transdifferentiate במהירות לתוך אקטין שריר חלק α (SMA) – ביטוי myofibroblasts כאשר מתורבת על מצעים 2D שאינם תואמים1,2,3. לכן, פיברובלסטים בתרבות הדו-ממדית הסטנדרטית אינם משקפים פנוטיפ רגיל של רקמות “בריאות”3,4,5,6. תרבויות על מצעים גמישים הוצגו כדי לדמות סביבות רקמות לא סיביות (10 kPa) ופיברוטיות (35 kPa)7, אך אלה חסרות את הממד השלישי, וזה חשוב מאוד ביחס לפתופיזיולוגיה. הנדסת רקמות מספקת את ההזדמנות להתגבר על מגבלה זו על ידי מתן אפשרות לתרבות פיברובלסט בהקשר של מטריצה חוץ-תאית מוגדרת וניסוי טונה (ECM), למשל, על ידי שינויים בתאיות, הרכב ECM וריכוז ECM, שכולם יכולים לקבוע את הביומכניקה של הרקמה.
דגמי תלת-ממד שונים נוצרו באמצעות פיברובלסטים. דיסקים ומיקרוספרות צפים היו בין הראשונים והוכיחו כי קולגן שופץ ונדחס באופן תלוי זמן. פיברובלסטים מפעילים כוחות אחיזה על סיבי קולגן, תהליך אשר ניתן להקל על ידי תוספת של סוכנים פרו-פיברוטיים כגון שינוי גורם גדילה-בטא 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. עם זאת, תרבויות צפות בחופשיות אינן מאפשרות טעינה חיצונית מבוקרת, ולכן מהוות דגמים מתכווצים או דוחסים ללא הרף. רקמות מהונדסות דמויות גיליון פתחו את האפשרות לחקור רגולציה הומאוסטטית של תכונות ביומכניות של רקמות, כלומר באמצעות בדיקות זנים חד, דו-מיניות, רב-זמניות או מחזוריות17,18,19,20. מודלים אלה שימשו, למשל, כדי להדגים את ההשפעה של מספר התא על נוקשות הרקמה, אשר נמצאה בקורלציה חיובית עם שלמות cytoskeleton ו צמצום ציטוסקילטון18,19. עם זאת, חשוב לציין כי המרות כוח למתח מסובכות על ידי עיוות רקמות לא אחיד סביב נקודות מהדק של מתמרים כוח ונקודות עיגון. מגבלה אינהרנטית זו יכולה לעקוף על ידי עצם כלב או רקמות בצורת טבעת, המציעות אכיפת רקמות מסוימת בנקודות עיגון21,22,23. ניתן להכין רקמות בצורת טבעת על ידי הפצת הידרוג’ל קולגן לתא לתבניות בצורת טבעת. כמו הידרוג’ל קומפקטי, רקמה נוצרת סביב המוט הפנימי הבלתי ניתן לריסון של התבנית, אשר מציע עמידות עבור התכווצות רקמות נוספת24,25,26,27. לאחר דחיסה ראשונית ובדרך כלל מקסימלית, רקמות עשויות להיות מועברות גם למרווחים מתכווננים כדי לרסן עוד יותר את ה- ECT המעגלי באורך רקמות מוגדר3,24,25,26,27,28,29,30. תכונות ביופיסיות ניתן להעריך התקנים סטנדרטיים אופקי או אנכי מתח מתח עם תאי עומס מתאימים תחת זן חד כיווני או דינמי3. מכיוון שלרקמות מבנה מעגלי אחיד ברובו וניתן להחזיק אותן על סורגים/ווים (נקודות עיגון ו/או מתמרי כוח), אם כי אלה עשויים עדיין לתחום אזורי דחיסה סביב מוטות הטעינה, פורמט זה מאפשר וריאציית מאמץ אחידה יותר בהשוואה להדק3. יתר על כן, רקמות מעוגנות מעוררות צורת תא דו קוטבי, ותאים מסתגלים לכוחות הרקמה על ידי התארכות לאורך קווי כוח המקדמים אחיזה אניזוטרופית31,32,33,34,35,36. יש לנו בעבר מיושם ECT בצורת טבעת מן חולדה ופיברובלסטים לב אנושיים (CF) סביב מוט נוקשה אחד בניסויים פונקציונליים מתח-זן וביצע רווח ואובדן של מחקרי פונקציה באמצעות פיברובלסטים transduced ויראלי24,25,26 ולימודים פרמקולוגיים37. יתר על כן, אנו יכולים לזהות הבדלי מין בפיברוזיס בתיווך CF במודל ECT27.
הפרוטוקול הבא ליצירת ECT אנושי, המודגם עם CF אנושי ראשוני המתקבל כ- CF cryopreserved מספקים מסחריים (ראה טבלה של חומרים), משלב את היתרונות של רקמות בצורת טבעת עם דרך קלה ומהירה לייצר רקמות מקרוסקופיות עבור פלטפורמה של 48 באר המיועדת לבדיקות מקבילות בעלות תוכן גבוה.
חשוב לציין, מודל ECT אינו מוגבל לסוג פיברובלסט מסוים, עם השימוש המתועד בחקירה של פיברובלסטים אחרים, למשל, פיברובלסטים בעור38,39. יתר על כן, פיברובלסטים מהביופסיות של המטופל פועלים באותה מידה, ובחירת הפיברובלסטים תלויה בסופו של דבר בשאלה המדעית שיש לטפל בה.
הפלטפורמה המשמשת לדור של ECT המתואר בפרוטוקול זה היא לוח תרבית תא/רקמה 48-well זמין מסחרית (איור 1A). השיטות להכנה, culturing, וניטור היווצרות ECT ותפקוד תחת גיאומטריה מוגדרת ועומס מכני בעזרת צלחת 48-well מתוארים. ECT שנוצר מוחזקים על ידי מוטות גמישים משולבים ואת העומס המכני ניתן לכוונן על פי המטרה הסופית באמצעות מוטות עם קשיות שונה (ערך חוף 36-89), המשפיעים על נוקשות הכיפוף שלהם. פולנים עם חוף ערך של 46 מומלצים. הפרוטוקול, בנוסף, תואם עובש עגול מותאם אישית שתואר בעבר, שבו ECT מוחזק סביב מוט נוקשה אחד37. הממדים של עובש זה ניתנים באיור 1B.
איור 1: ייצוג סכמטי של תבניות יציקה. (א) שרטוט טכני ומידות של תבנית יציקה עם שני קטבים גמישים. התבנית כוללת היקף פנימי המופרד על ידי קיר קצר המכיל מוטות תמך כפולים בגוף הראשי של התבנית. לקטבים הגמישים יש מרחק אופקי חופשי זה לזה והם מחוברים בבסיס. התבנית מאפשרת נפח יציקה של 180 μL. הבאר של כל עובש מאפשרת קיבולת נפח של לפחות 600 μL של מדיה תרבותית. קומפוזיציות חומר שונות ניתן להשתמש כדי לייצר קטבים עם נוקשות ספציפית (למשל, TM5MED-TM9MED). (ב) שרטוט טכני ומידות של תבנית בצורת טבעת עם מוט נוקשה יחיד. זוהי תבנית חלופית עם גיאומטריה ברורה וסביבה מכנית, אשר ניתן להשתמש עם פרוטוקול יציקת ECT37. שיטת הרכבת העובש בצורת טבעת הותאמה מתבניות גדולות יותר שפורסמו28,41. בקצרה, השיטה כוללת (1) חותם פוליטרפלואורואתילן (PTFE) דפוס מרווחים (קוטר 8 מ”מ) בפולידימתילסילוקסן (PDMS, סיליקון) שפכו לתוך כלים זכוכית (קוטר 60 מ”מ), ו (2) תיקון מחזיק מוט PDMS (קוטר 1.5 מ”מ) קונצנטרי בתוך החלל החלול שנוצר, אשר משמש (3) להחזיק מוט נשלף (צינור סיליקון קוטר 4 מ”מ). תוצאת החלל החלולה מאפשרת 180 μL של נפח הליהוק. כל צלחת זכוכית יכולה להכיל תבניות מוטבעות מרובות (מוצגות בצורה מופת עם 5 תבניות) ויש לה את היכולת של עד 5 מ”ל של מדיום תרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הפרוטוקול המוצג מתאר את הדור של ECT מ- CF האנושי העיקרי, המאפשר לחקור את ההשפעה המכנית של תאים אלה על סביבת המטריצה החוץ-תאית שלהם ולהיפך.
הפיברובלסטים צריכים להיות מורחבים כדי להניב תאים מספיקים לניסויי ECT המתוכננים (0.75 x 106 תאים / ECT). עבור הרבייה הטובה ביותר, מומלץ מראש תר?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי אגודת הלב הגרמנית (מלגת המחקר DGK ל- GLS) ועל ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG באמצעות פרויקט IRTG 1816 עבור GLS ו- AD; DFG 417880571 ו DFG TI 956/1-1 עבור MT; SFB 1002 TP C04 עבור הר ו- WHZ; SFB 1002 TP S01 עבור WHZ; ו EXC 2067/1-390729940J עבור WHZ). WHZ נתמך על ידי המשרד הפדרלי הגרמני למדע וחינוך (BMBF באמצעות הפרויקט IndiHEART), ואת פונדציה Leducq (20CVD04). MT, WHZ ו- SL נתמכים על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK).
Cell culture reagents: | |||
Accutase Solution | Merk Millipore | SCR005 | |
Dissociation reagent – TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose | Gibco | 12100061 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ | Gibco | 14190144 | |
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
FBM Fibroblast Growth Basal Medium | Lonza | CC-3131 | |
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4126 | |
Fibroblast Growth Medium 3 KIT | PromoCell | C-23130 | |
Fibroblast Basal Medium 3 | PromoCell | C-23230 | |
Growth Medium 3 SupplementPack | PromoCell | C-39350 | |
Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL) | Gibco | 15140122 | |
Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
Cell sources: | |||
Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V) | Lonza | CC-2904 | |
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c) | PromoCell | C-12375 | |
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p) | PromoCell | C-12377 | |
Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1) | ATCC | SCRC- 1041 | |
Collagen sourses: | |||
Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl | LLC Collagen Solutions | FS22024 | 6-7 mg/mL |
Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~4 mg/mL |
Drugs: | |||
Latrunculin-A (Lat-A) | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
Plastic ware: | |||
Cell culture plastic ware | Sarstedt and Starlab | ||
Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm) | Falcon | 352340 | |
myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL) | Corning | 07-200-619 | |
Specific instruments: | |||
Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors | OptoEngineering | TCCR12096 | |
Area scan camera Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |