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Summary

Qui viene presentato un protocollo per generare tessuti connettivi ingegnerizzati per una coltura parallela di 48 tessuti in una piastra multi-pozzo con doppi poli, adatto per studi meccanicistici, modellazione di malattie e applicazioni di screening. Il protocollo è compatibile con fibroblasti di diversi organi e specie ed è esemplificato qui con fibroblasti cardiaci primari umani.

Abstract

I fibroblasti sono cellule fenotipicamente altamente dinamiche, che si trasdifferentizzano rapidamente in miofibroblasti in risposta a stimoli biochimici e biomeccanici. L’attuale comprensione dei processi fibrotici, compresa la fibrosi cardiaca, rimane scarsa, il che ostacola lo sviluppo di nuove terapie anti-fibrotiche. Sistemi modello umano controllabili e affidabili sono fondamentali per una migliore comprensione della patologia fibrosa. Si tratta di un protocollo altamente riproducibile e scalabile per generare tessuti connettivi ingegnerizzati (ECT) in una piastra di colata a 48 pozzetti per facilitare gli studi sui fibroblasti e la fisiopatologia del tessuto fibrotico in un ambiente tridimensionale (3D). Gli ECT sono generati attorno ai poli con rigidità sintonizzabile, consentendo studi sotto un carico biomeccanico definito. Nelle condizioni di carico definite, possono essere studiati adattamenti fenotipici controllati dalle interazioni cellula-matrice. Il test parallelo è fattibile nel formato a 48 pozzetti con l’opportunità per l’analisi del percorso temporale di più parametri, come la compattazione e la contrazione dei tessuti contro il carico. Da questi parametri è possibile studiare le proprietà biomeccaniche come la rigidità e l’elasticità dei tessuti.

Introduction

Uno dei principali ostacoli nello studio delle malattie fibrotiche è la mancanza di modelli di tessuto 3D umano rappresentativi che forniscano informazioni sul comportamento dei fibroblasti e dei loro derivati patologici. Per studiare i processi fibrotici, i sistemi di coltura 2D standard sono sub-ottimali poiché i fibroblasti isolati si transdifferenziano rapidamente in miofibroblasti che esprimono α-liscia di actina muscolare (SMA) quando coltivati su substrati 2D non ^{conformi1,2,3}. Pertanto, i fibroblasti nella coltura 2D standard non riflettono un fenotipo tissutale “sano” regolare3,4,5,6. Sono state introdotte colture su substrati flessibili per simulare ambienti tissutali non fibrotici (10 kPa) e fibrotici (35 kPa)⁷, ma questi mancano della terza dimensione, che è molto importante per quanto riguarda la fisiopatologia. L’ingegneria tissutale offre l’opportunità di superare questa limitazione consentendo la coltura di fibroblasti in un contesto di matrice extracellulare (ECM) definito e sperimentalmente sintonizzabile, ad esempio mediante alterazioni della cellularità, della composizione ECM e della concentrazione di ECM, che possono determinare la biomeccanica tissutale.

Vari modelli 3D sono stati generati utilizzando fibroblasti. I dischi galleggianti e le microsfere sono stati tra i primi e dimostrano che il collagene viene rimodellato e compattato in modo dipendente dal tempo. I fibroblasti esercitano forze di trazione sulle fibrille di collagene, un processo che può essere facilitato dall’aggiunta di agenti pro-fibrotici come il fattore di crescita trasformante-beta 1 (TGF-β1)^{8,9,10,11,12,13,14,15,16}. Tuttavia, le colture liberamente fluttuanti non consentono il carico esterno controllato e, pertanto, costituiscono modelli in continua contrazione o compattazione. I tessuti ingegnerizzati simili a fogli hanno aperto la possibilità di studiare la regolazione omeostatica delle proprietà biomeccaniche dei tessuti, in particolare attraverso test di deformazione uni, bi, multiassiale o ciclica^17,18,19,20. Questi modelli sono stati utilizzati, ad esempio, per dimostrare l’influenza del numero di cellule sulla rigidità del tessuto, che è risultata correlata positivamente con l’integrità del citoscheletro e la contrattilità del citoscheletro dell’actomiosina.^18,19. Tuttavia, è importante notare che le conversioni forza-deformazione sono complicate dalla deformazione tissutale non uniforme attorno ai punti di serraggio dei trasduttori di forza e dei punti di ancoraggio. Questa limitazione intrinseca può essere aggirata da ossa di cane o tessuti a forma di anello, offrendo una certa applicazione dei tessuti nei punti di ancoraggio^21,22,23. I tessuti a forma di anello possono essere preparati distribuendo un idrogel di collagene cellulare in stampi a forma di anello. Mentre l’idrogel si compatta, un tessuto si forma attorno all’asta interna incomprimibile dello stampo, che offre resistenza per un’ulteriore contrazione del tessuto^24,25,26,27. Dopo la compattazione iniziale e tipicamente massima, i tessuti possono anche essere trasferiti a distanziali regolabili per trattenere ulteriormente l’ECT circolare a una lunghezza di tessuto definita.^{3,24,25,26,27,28,29,30}. Le proprietà biofisiche possono essere valutate in dispositivi standard orizzontali o verticali di deformazione-sollecitazione con celle di carico appropriate sotto deformazione unidirezionale o dinamica³. Poiché i tessuti hanno una struttura circolare ampiamente uniforme e possono essere tenuti su barre/ganci (punti di ancoraggio e/o trasduttori di forza), sebbene questi possano ancora racchiudere aree di compressione attorno alle barre di carico, questo formato consente una variazione di deformazione più uniforme rispetto al serraggio³. Inoltre, i tessuti ancorati suscitano una forma cellulare bipolare e le cellule si adattano alle forze tissutali per allungamento lungo le linee di forza promuovendo la trazione anisotropica.^{31,32,33,34,35,36}. In precedenza abbiamo applicato ECT a forma di anello da fibroblasti cardiaci (CF) di ratto e umani attorno a un singolo polo rigido in esperimenti di stress funzionale e abbiamo eseguito studi di guadagno e perdita di funzione utilizzando fibroblasti trasdotti viralmente^24,25,26 e studi farmacologici³⁷. Inoltre, potremmo identificare le differenze sessuali nella fibrosi cf-mediata nel modello ECT²⁷.

Il seguente protocollo per la generazione di ECT umano, esemplificato con CF umano primario ottenuto come CF crioconservato da fornitori commerciali (vedi Tabella dei materiali), combina i vantaggi dei tessuti a forma di anello con un modo semplice e veloce di produrre tessuti macroscopici per una piattaforma a 48 pozzi progettata per test paralleli ad alto contenuto.

È importante sottolineare che il modello ECT non è limitato a un tipo specifico di fibroblasti, con l’uso documentato nello studio di altri fibroblasti, ad esempio fibroblasti ^cutanei38,39. Inoltre, i fibroblasti delle biopsie del paziente funzionano altrettanto bene e la scelta dei fibroblasti dipende in ultima analisi dalla questione scientifica da affrontare.

La piattaforma utilizzata per la generazione di ECT descritta in questo protocollo è una piastra di coltura cellulare/tissutale 3D a 48 pozzetti disponibile in commercio (Figura 1A). Vengono descritti i metodi per la preparazione, la coltivazione e il monitoraggio della formazione e della funzione dell’ECT sotto una geometria definita e un carico meccanico con l’aiuto della piastra a 48 pozzetti. Gli ECT formati sono tenuti da pali flessibili integrati e il carico meccanico può essere messo a punto in base allo scopo finale utilizzando pali con diversa durezza (shore A valore 36-89), influenzandone le rigidità di flessione. Si raccomandano pali con una riva Un valore di 46. Il protocollo è, inoltre, compatibile con uno stampo circolare personalizzato precedentemente descritto, in cui l’ECT è tenuto attorno a una singola asta ^rigida37. Le dimensioni di questo stampo sono indicate nella Figura 1B.

Figura 1: Rappresentazione schematica degli stampi di fusione. (A) Disegno tecnico e dimensioni di uno stampo di colata con due poli flessibili. Lo stampo comprende una circonferenza interna delimitata da una parete corta che contiene doppi pali di ritenzione sul corpo principale dello stampo. I poli flessibili hanno una distanza orizzontale libera l’uno dall’altro e sono collegati alla base. Lo stampo consente un volume di fusione di 180 μL. Il pozzetto di ogni stampo consente una capacità volumetrica di almeno 600 μL di terreno di coltura. Diverse composizioni di materiali possono essere utilizzate per produrre pali con rigidità specifiche (ad esempio, TM5MED-TM9MED). (B) Disegno tecnico e dimensioni di uno stampo a forma di anello con una singola asta rigida. Si tratta di uno stampo alternativo con geometria e ambiente meccanico distinti, che può essere utilizzato con il protocollo di fusione ^ECT37. Il metodo di assemblaggio dello stampo a forma di anello è stato adattato dai formati più grandi ^{pubblicati28,41}. In breve, il metodo include (1) l’imprinting di distanziali di stampaggio in politetrafluoroetilene (PTFE) (diametro 8 mm) in polidimetilsilossano (PDMS, silicone) versato in piatti di vetro (diametro 60 mm) e (2) il fissaggio di un supporto per palo PDMS (diametro 1,5 mm) concentricamente all’interno della cavità cava formata, che serve a (3) tenere un palo rimovibile (tubo in silicone di 4 mm di diametro). Lo spazio vuoto risultante consente 180 μL di volume di colata. Ogni piatto di vetro può contenere più stampi impressi (mostrati in modo esemplare con 5 stampi) e ha la capacità di raggiungere fino a 5 ml di terreno di coltura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Tutte le fasi devono essere intraprese in cappe di biosicurezza di classe II installate in laboratori di livello di contenimento 1. A seconda delle normative locali e del tipo di manipolazioni da eseguire, come il trasferimento genico mediato da virus, il livello di contenimento deve essere aumentato al livello di biosicurezza 2 o 3. Tutte le colture sono mantenute a 37 °C in un incubatore di colture cellulari con un’atmosfera umidificata del 5 % di CO2 nell’aria. Si noti che i volumi (passaggi 1 e 2) sono fo…

Representative Results

L’ECT raggiunge circa il 95% di compattazione rispetto al volume iniziale di idrogel di collagene cellulare entro le prime 24 ore. La compattazione e la contrazione tissutale in condizioni di controllo e in presenza di FCS si verificano poche ore dopo la colata e aumentano notevolmente fino al giorno 5 (Figura 5A). La deflessione del polo può aumentare ulteriormente durante i successivi 15 giorni (20 giorni è stato il tempo più lungo testato). L’entità della deflessione del polo dipende …

Discussion

Il protocollo presentato descrive la generazione di ECT da CF umano primario, che consente di studiare l’impatto meccanico di queste cellule sul loro ambiente di matrice extracellulare e viceversa.

I fibroblasti devono essere espansi per produrre cellule sufficienti per gli esperimenti ECT pianificati (0,75 x ¹⁰⁶ cellule / ECT). Per la migliore riproducibilità, si consiglia di pre-coltivare fibroblasti congelati o derivati da tessuti in coltura monostrato 2D per una durata standard…

Materials

Cell culture reagents:
Accutase Solution	Merk Millipore	SCR005
Dissociation reagent – TrypLE Express	Gibco	12604013
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose	Gibco	12100061
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+	Gibco	14190144
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3132
FBM Fibroblast Growth Basal Medium	Lonza	CC-3131
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors	Lonza	CC-4126
Fibroblast Growth Medium 3 KIT	PromoCell	C-23130
Fibroblast Basal Medium 3	PromoCell	C-23230
Growth Medium 3 SupplementPack	PromoCell	C-39350
Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL)	Gibco	15140122
Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770-100ML
Cell sources:
Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)	Lonza	CC-2904
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)	PromoCell	C-12375
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)	PromoCell	C-12377
Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)	ATCC	SCRC- 1041
Collagen sourses:
Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl	LLC Collagen Solutions	FS22024	6-7 mg/mL
Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl	Corning	354236	~4 mg/mL
Drugs:
Latrunculin-A (Lat-A)	Enzo Life Sciences	BML-T119-0100
Plastic ware:
Cell culture plastic ware	Sarstedt and Starlab
Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm)	Falcon	352340
myrPlate-uniform	myriamed GmbH	TM5 med
Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)	Corning	07-200-619
Specific instruments:
Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors	OptoEngineering	TCCR12096
Area scan camera Basler ace acA4024	Basler	107404