Summary
우리는 살아있는 세포에 있는 개별 적인 macropinosomes에 있는 pH, 산화 사건 및 단백질 소화를 측정하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이중 불소 경 미세 검사법과 인구 기반 기술에 비해 제공하는 이점에 중점을 둡니까.
Abstract
최근 몇 년 동안, 매크로 피노세포증의 분야는 급속하게 성장하고있다. Macropinocytosis는 선천적인 면역 세포가 유기체 항상성 및 면역을 유지하는 중앙 기계장치로 나타났습니다. 동시에 동종 요법 역할과는 달리 암 및 바이러스 감염을 포함한 다양한 병리를 유발할 수도 있습니다. 다른 내분세포증 모드와 달리, 매크로피노좀의 성숙을 연구하기 위해 개발된 도구는 여전히 저개발 상태입니다. 여기서 이 프로토콜은 조기 및 성숙한 매크로피노좀의 루멘 내에서 레독스 환경을 연구하기 위한 새로 개발된 도구에 대해 설명합니다. pH를 평가하는 비메트릭 형광 현미경 검사를 사용하기 위한 방법론, 반응성 산소 종의 생산 및 살아있는 세포에서 개별 거형의 루멘 내의 분해 용량이 설명되어 있습니다. 단일 세포기관 측정은 인구 기반 접근법으로 종종 손실되는 괄면적 이질성을 드러내는 이점을 제공합니다. 프로브 선택, 계측, 교정 및 단일 세포 대 인구 기반 방법을 포함한 이중 형광비율 현미경검사법의 기본 원리에 중점을 둡히 배치됩니다.
Introduction
Macropinocytosis는 거시화1,2에게불린 막 결합 세포질 세포체로 세포외 유체의 다량의 uptake를 말합니다. 아메바 디티오스텔라늄 spp와같은 자유 생활 단세포 유기체에 의해 수행되는 매우 보존된 과정입니다. 3,뿐만 아니라 안토조안4 및 메타 조아2. 대부분의 세포에서, macropinocytosis는 유도된 사건입니다. 세포 표면 수용체의 결찰은 주름이라고 불리는 액틴 구동 플라즈마 멤브레인 확장의 돌출을 유도합니다. 일부 제대로 이해 메커니즘에 의해, 그 주름의 일부, 거시형을 형성하기 위해 자신의 말단 팁에서 밀봉 (비록이 방법 종이의 범위를 넘어, 매크로 피노 세포증의 역학에 대한 자세한 검토를 위해, 참조참조 를참조하시기 바랍니다1,2,5,6,7). 거시피노세포증을 유도하는 세포외 자극은 가장 자주 용해성장인5,8이다. 따라서, 거시적인 세포질 이벤트는 세포가 성장을 용이하게 하기 위하여 유용한 대사산물을 파생할 수 있는 세포외 물질의 bolus의 섭취를 허용합니다. 불행히도, 영양 전달을 위한 이 통로는 또한 병리학을 이끌어 내수 있습니다. 특정 암세포는 연속또는 구성적인 거대 세포증귀착되는 돌연변이를 항구합니다. 영양소의 지속적인 전달은 암세포의 통제되지 않는 증식을 용이하게 하고 특히 공격적인 종양9,10,11,12,13에연결되었다. 유사하게, 바이러스는 거혈구 세포에 접근하기 위하여 macropinocytosis를 유도할 수 있고, 이에 의해 바이러스성 병리학을 구동할 수 있다14.
Macropinocytosis는 또한 병원체에 대한 면역의 유지 에 기능. 대식세포 및 수지상 세포와 같은 특정 선천성 면역 세포는 대식세포6,15,16을통해 세포외 유체의 구성적이고 공격적인샘플링에종사한다. 이 매크로 피노세포증 의 모드는 믿을 수 없을 만큼 활성화되어 있으며, 단일 수지상 세포세포는 매시간17일마다자체 체중에 상응하는 세포외 유체의 부피로 스스로를 자극할 수 있다. 이 구성 샘플링에도 불구하고, 대식세포 및 수지상 세포는 종양 세포처럼 통제할 수 없는 복제되지 않으며, 대신, 정보를 추출하여 잠재적인 위협에 대해 알리기 위해 세포외 물질을 처리하는 것처럼 보입니다. i) 병원체 인식 수용체 및 ii) 적응형면역계의세포별 스크리닝을 위한 주요 조직적합성 분자에 적재될 수 있는 아미노산의 짧은 스트레칭으로추출된다. 병원균이 면역 세포에 의한 정보 처리를 위해 이 통로를 전복하는지 여부는 현재 불분명합니다.
면역 및 항상성의 유지 보수와 다른 보다 일반적으로 연구된 내분비증 모드와는 대조적으로 거시피노세포증에 대한 이러한 잘 정의되고 중요한 역할에도 불구하고, 매크로 피노좀의 내부 (발광) 작동의 거의 알려져 있다. macropinosomes의 발광 생화학을 연구하는 표준화된 프로토콜 및 도구를 개발하는 것은 우리가 그들의 독특한 생물학을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 약물 전달20을포함하여 새로운 치료 전략에 활용할 수 있는 통찰력을 제공할 것입니다. 이 방법 원고는 단일 세포기관 수준에서, 매크로 피노좀의 발광 생화학의 다양한 양상에서 해부하기 위해 최근에 개발 된 도구에 초점을 맞출 것이다.
형광은 i) 관심의 구획에 우선적으로 분할하는 경우 세포기관의 특정 생화학을 측정하는 데 사용할 수 있습니다 및 ii) 그들은 관심의 매개 변수에 대한 응답으로 스펙트럼 변화를 겪고. 예를 들어, pH의 경우, 아크리딘 오렌지, 크레실 바이올렛 및 LysoTracker 염료와 같은 형광 약한 염기는 산성 세포에서 우대적으로 축적된다. 따라서, 그들의 상대적 강도는 표지된 세포기관이 산성이라는 거친 표시이다. 다른 pH 반응형 형광류는 형광, pHrodo 및 cypHer5e와 같은, 양성자에 결합시 스펙트럼 변화를 겪습니다(도 1A-C). 따라서 pH에 민감한 형광의 형광 방출을 변경하면 pH의 유용한 근사치를 제공할 수 있습니다. 단 하나 형광의 사용은, 그러나, 불이익의 수를 제시합니다. 예를 들어, 초점 평면의 변화, 광표백, 개별 소기관의 부피에 의한 변화,거형(21)의일반적인 발생은 단일 형광구의 형광 강도에 변화를 유도할 수 있으며, 이는22에대해 쉽게 수정할 수 없다. 단일 파장 평가는 산성 구획을 시각화하는 데 유용하지만 순전히 질적입니다.
보다 정량적인 접근법은 관심 있는 세포에 대한 참조 형광소와 함께 매개 변수에 민감한 형광소를 표적으로 하는 것입니다. 참고형 형광소는 세포기관 내의 생화학적 변화에 이상적으로 민감하지않으며(도 1D-F)따라서 초점 평면, 유기체 부피 및 어느 정도, 광표백23의변화를 보정하는 데 사용될 수 있다. 이중 형광경형광이라고 하는 이 접근법을 이용하여, 기준형광소에 대한 파라미터 에 민감한 형광방출의 비율을 생성함으로써 보정이 이루어질 수 있다.
여기서, 프로토콜은 매크로피노좀 내의 pH, 산화 이벤트 및 단백질 분해를 측정하기 위해 이중 플루오로포어 비율 이미징의 원리를 활용하게 될 것이다. 각각의 경우, 관심의 매개 변수및 기준 형광호에 민감한 불소호레가 선택됩니다. 특히 거시피노솜을 대상으로 하기 위해, 70kDa dextran에 공동으로 결합되며, 이는대거피노좀(24)에우선적으로 통합된다. 모든 검사는 Raw264.7 세포에서 수행되지만 다른 세포 유형에 적응할 수 있습니다. 가능하면 형광 비율이 참조 곡선에 대해 보정되어 절대 값을 얻습니다. 중요한 것은, 모든 측정은 매크로 피노좀의 발광 환경의 동적 및 정량적 평가를 위해 살아있는 세포에서 수행될 것이다.
pH 에 민감한 형광을 선택할 때, 고려 사항의 숫자를 무게해야합니다. 첫 번째는 프로브가 가장 민감할 pH 값의 범위를 나타내는 플루오로포어의 pK입니다. 형성 직후, 매크로피노종의 pH가 세포외 배지(~pH 7.2)에 가까우며, 후기 내분 및 리소좀(~pH 5.0)과의 상호작용을 통해 점진적으로 산산화될 것이고, 그 범위 내에서 민감한pK를 가진 프로브(그림2C)를선택해야 한다고 가정한다. 6.4의 pK를 가지고 있는 형광형광체는 그 범위 내에서 최적으로 민감합니다. 그것은 phagosomes와 같은 그밖 유사한 세포기관을 측정하기 위하여 광범위하게 이용되고, 이 원고22에서선택의 불소로 피오로폰이 될 것입니다22,25. 참고형 플루오로포레로서, 테트라메틸lrhodamine이 사용되며, 이는 pH(도1E)에민감하지 않습니다. pHrodo 및 cypHer5e와 같은 다른 형광은 형광체의 스펙트럼 특성이 다른 실험 변수와 일치하는 형광체로 대체 될 수 있습니다. pHrodo 및 cypHer5e에 대한 일부 제안된 참조 형광은 도 1에도시된다.
두 번째 고려 사항은 두 형광이 특히 매크로 피노좀을 대상으로하는 방법입니다. 약 7nm의 유체역학적 반경을 가지는 70kDa 크기의 Dextran은 세포에 특별히 붙어 있지 않고 거시피노솜에 통합되지 않지만 클래트린 코팅 구덩이 나 카볼라에 통합되지 않으므로 거시피노솜(그림 2A 및 도 3A,B)16, 24,26,26을표시한다. 이 프로토콜에서, 형광표지 70 kDa dextran 및 tetramethylrhodamine (TMR)-표지70 kDa dextran는 pH 에민감한 및 참조 프로브로 각각 사용됩니다.
선천성 면역 세포에서, macropinocytosis 및 phagocytosis는 적응성 면역 반응의 세포에 처리 및 후속 프리젠 테이션을 위한 외인성 물질의 내재화를 위한 2개의 주요 경로를나타낸다(27). 외향성 및 거형의 루멘의 레독스 화학에 대한 신중하고 조정된 제어는 외인성 물질의 컨텍스트 별 처리에 매우 중요합니다. 아마도 phagosomes에서 산화 이벤트의 가장 잘 연구 된 레귤레이터는 NADPH 산화제, phagosomes의 lumen 내에서 반응성 산소 종 (ROS)의 대량을 생산하는 큰 다중 서브 유닛복합체이다 28. 실제로, 그 활동은 식도제 29,30내의 적절한 항원 처리의 중심이다. 그러나, 거형 엽막에 NADPH 산화제의 활동은 탐구되지 않았습니다.
이 프로토콜에서, H2DCFDA succinimidyl 에스테르는 매크로 피노솜 내의 산화 이벤트를 측정하는 데 사용됩니다. 이것은 형광체의 변형 된 형태입니다 (2',7'-디클로로디 하이드로 플루오레세신 diacetate), 이는 감소 된 형태로 최소한의 형광이다. 산화 시 형광 방출이 크게 증가합니다. 그러나 H2DCFDA의 중요한 주의 사항을 주목할 필요가 있습니다 - 형광형형에 기초하기 때문에, 그 형광은 또한 산성 구획에 담금질하고,실험(28)을설계할 때 이 변수를 제어하기 위하여 주의해야 한다. PH 측정 접근법과 유사하게, H2DCFDA succinimidyl 에스테르는 70 kDa dextran 및 TMR 라벨 70 kDa dextran에 공동으로 부착될 것이며, 참고플루오로포어(그림3A)로사용될 것이다.
형광 성 배 소안은 거형 내의 단백질 분해를 측정하는 데 사용됩니다. 여기에 사용되는 ovalbumin는 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL 염료로 조밀하게 표시되어 있습니다. 소화 시, 강하게 형광염염 표지 펩티드가 해방됩니다. ovalbumin은 쉽게 70 kDa dextran에 컨쥬게이트 할 수 없기 때문에, TMR 라벨 70 kDa dextran 및 유체 상 ovalbumin을 가진 세포는 공동 배양될 것입니다. TMR 신호는 이미징 후 분석 중에 거시형 마스크를 생성하는 데 사용되며 소화된 ovalbumin에서 해방된 신호는 마스크 내에서 측정됩니다(도3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 세포 준비
- 37°C에서 Raw264.7 셀을 성장시키고 RPMI의 5% CO2 ~ 70% 결합하여 10%의 열 비활성화 세럼으로 보충합니다.
- 분석 하루 전에, 종자 raw264.7 세포의 밀도에 5 x 104 96 웰 플레이트에서 잘 당 세포. 각 우물에 100 μL의 성장 매체가 포함되어 있는지 확인합니다. 96웰 플레이트에 검은 면과 이미징용 유리 바닥이 있는지 확인합니다.
참고 : 여기에서 96 웰 플레이트가 이미징에 사용되었습니다. 96웰 플레이트는 더 큰 이미징 챔버에 비해 소량의 세포및 시약을 사용할 수 있게 합니다. 그러나, 화상 진찰 살아있는 세포를 위해 디자인된 어떤 챔버든지 이용될 수 있고, 시약을 그에 따라 확장될 수 있습니다. - 분석 당일, 우물이 적어도 70 % 컨실수 있는지 확인하십시오.
2. 매크로 피노솜 pH 측정
- 1절에서와 같이 셀을 준비합니다.
- 37°C에서 HBSS 100 μL로 모든 우물을 씻으실 수 있습니다.
- 각각 100 μL의 TMR 라벨 70 kDa dextran 및 0.025 mg/mL의 TMR 라벨70 kDa dextran 및 0.025 mg/mL의 형광 라벨 70 kDa dextran을 포함하는 HBSS의 100 μL로 각 잘 채웁니다.
- 세포를 37°C로 설정된 인큐베이터에 15분 간 넣습니다.
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 HBSS의 100 μL로 셀 6x를 세척합니다.
- 각각의 HBSS 100 μL을 37°C로 채웁니다.
- 가열 된 단계와 챔버와 현미경에 접시를 배치합니다.
- 필요에 따라 각 불소호에 대한 여기/방출 매개 변수를 조정합니다.
참고: 이미지 수집을 위한 이상적인 조건은 사용되는 형광및 개별 현미경 셋업에 따라 다릅니다. 여기서, 이미지는 라이카 SP5 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 취득되었다. TMR은 543 레이저 라인으로 흥분하고 방출은 610 nm에서 650 nm로 수집되었습니다. 플루오레스세인은 488레이저 라인으로 흥분했고, 500nm에서 550nm까지 배출을 수집했다. 63배 오일 침수 목표가 사용되었고 0.5 μm 간격으로 10 μm Z-부피를 획득했습니다. - 각 우물에서 이미지를 획득하여 각 우물 사이에 형광을 번갈아 가며 합니다.
- 첫 번째 인수 후 모든 우물이 전체 플레이트에 초점을 맞추고 있는지 확인하십시오.
- 원하는 시간 동안 1-15분 간격으로 각 웰의 이미지를 획득합니다.
3. 매크로 피노솜 pH의 시투 교정
- 영상 습득 시 140mM KCl, 1mM MgCl2,1mM CaCl2및 5mM 포도당을 함유한 칼륨이 풍부한(K+-rich)용액 1L을 준비한다. K+풍부한 솔루션 1개(1M, pH 7.2 스톡 솔루션)와 25mM MES(0.5M, pH 6.0 스톡 솔루션)가 있는 별도의 400mL 부피를 보완합니다.
- 필요에 따라 10M HCl 또는 10M KOH를 사용하여 25m HEPES로 버퍼링된 K+풍부한 용액의 50mL 알리쿼트를 pH 7.5로 조정합니다.
- 필요에 따라 10M HCl 또는 10M KOH를 사용하여 25m MES로 버퍼링된 K+풍부한 솔루션 3개(PH 6.5, pH 5.5 및 pH 5.0)를 조정한다.
참고: 아세테이트-아세트산 버퍼는 낮은 pH 용액에 바람직할 수 있다. - 이미지 수집이 완료된 후, 세포를 포함하는 96웰 플레이트에서 HBSS를 제거하고 pH 7.5에 있는 K+풍부한 용액으로 교체한다.
- 10 μg/mL의 최종 농도에 니제르신을 추가합니다.
참고 : 나이지리아는H+ 에 대한 K+ 교환 ionophore입니다 . K+리치 용액의 K+ 농도를 시토솔의 K+ 농도에 근접한 값으로 설정함으로써, 나이지리아인이 시토솔의 pH를 시토솔의 pH에 고정시켜 교정 버퍼의 pH를 반영하도록 보장할 수 있다. - 플레이트를 현미경에 다시 배치하고 위와 동일한 획득 설정을 사용하여 각 웰의 이미지를 획득합니다.
- 각 교정 버퍼에 대해 3.5 및 3.6 단계를 반복합니다.
4. 매크로 피노솜 pH에 대한 데이터 분석
- FIJI 소프트웨어를 사용하여 TMR 및 형광 채널 모두에서 배경을 뺍니다.
- TMR 채널에서 마스크를 생성합니다. 마스크를 생성하려면 > 임계값 조정을 선택하여 이미지를 바이너리 이미지로 변환하여 적용>. 그런 다음 이진 이미지를 강조 표시하고 > 선택 편집을 선택하여 마스크를 만들 >.
- TMR 및 형광이미지에 모두 적용하십시오. 이렇게 하려면 마스크를 강조 표시하고 선택 > 선택 > 선택 만들기를 > 선택 편집을 선택합니다. TMR 이미지를 클릭하고 Shift + E를 눌러 마스크를 TMR 채널에 적용합니다. 마찬가지로, 형광 이미지를 클릭하고 SHIFT + E를 눌러 OB 채널에 마스크를 적용합니다.
- 마스크 내의 각 매크로피노좀에 대한 TMR 및 형광 강도를 기록합니다.
- 시간 코스에서 각 시간 지점에 대해 4.1-4.3 단계를 반복합니다.
- 시투 교정에서 캡처된 이미지의 경우 4.1-4.3단계를 반복합니다.
- 형광강도를 TMR 강도로 나누어 형광율을 생성한다:TMR 비율을 생성한다.
- 교정 이미지에 대한 형광:TMR 비율에 대해 pH를 플롯합니다.
- 보정 데이터에 곡선을 맞춥시게 합니다.
- 절대 pH 값을 얻으려면 시간 코스에서 각 시간 지점에 대한 데이터를 보간합니다.
5. 매크로피노좀 내의 산화 이벤트 측정
- 1절에서와 같이 셀을 준비합니다.
- 분석 하루 전에, H2DCFDA succinimidyl 에스테르 라벨 70 kDa dextran을 다시 중단 하 여 10 70 kDa dextran-amino의 1 mL에 0.1 M 나트륨 중탄산염 용액 (pH 8.3)을 준비합니다. Dextran-amino 솔루션에 H2DCFDA succinimidyl 에스테르 1 mg을 추가하고 1 시간 동안 인큐베이션하십시오. PbS에 대한 H2DCFDA 라벨 70 kDa dextran을 투석. H2DCFDA 라벨 70 kDa dextran이 저장 시 산화되어 있기 때문에 1 일 이상 보관하지 마십시오.
- 분석 당일, 모든 우물을 37°C에서 HBSS 100 μL로 세척합니다.
- 각각 100 μL의 TMR 라벨 70 kDa dextran 및 0.025 mg/mL의 TMR 라벨70 kDa dextran 및 H2DCFDA 라벨 70 kDa dextran의 0.025 mg/mL을 포함하는 HBSS의 100 μL로 각 잘 채웁니다.
- 세포를 37°C로 설정된 인큐베이터에 15분 간 놓습니다.
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 HBSS의 100 μL로 셀 6x를 세척합니다.
- 각각의 HBSS 100 μL을 37°C로 채웁니다.
- 가열 된 단계와 챔버와 현미경에 접시를 배치하고 필요에 따라 각 형광에 대한 흥분 / 방출 매개 변수를 조정합니다.
참고: 이미지 수집을 위한 이상적인 조건은 사용되는 형광및 개별 현미경 셋업에 따라 다릅니다. 여기에 이미지는 라이카 SP5 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 획득되었다. TMR은 543 레이저 라인으로 흥분했고, 방출은 610 nm에서 650 nm로 수집되었습니다. H2DCFDA는 488 레이저 라인으로 흥분하고 방출은 500 nm에서 550 nm로 수집되었습니다. 63배 오일 침수 목표가 사용되었고, 10 μm Z-부피가 0.5 μm 간격으로 획득되었다. - 각 우물에서 이미지를 획득하여 각 우물 사이에 형광을 번갈아 가며 합니다.
- 첫 번째 인수 후 모든 우물이 전체 플레이트에 초점을 맞추고 있는지 확인하십시오.
- 원하는 시간 동안 1-15분 간격으로 각 웰의 이미지를 획득합니다.
6. 매크로 피노솜 내의 산화 이벤트에 대한 데이터 분석
- FIJI 소프트웨어를 사용하여 TMR 및 H2DCFDA 채널 모두에서 배경을 뺍니다.
- TMR 채널에서 마스크를 생성합니다. 마스크를 생성하려면 > 임계값 조정을 선택하여 이미지를 바이너리 이미지로 변환하여 적용>. 그런 다음 이진 이미지를 강조 표시하고 > 선택 편집을 선택하여 마스크를 만들 >.
- TMR 및 H2DCFDA 이미지모두에 마스크를 적용합니다. 이렇게 하려면 마스크를 강조 표시하고 선택 > 선택 > 선택 만들기를 > 선택 편집을 선택합니다. TMR 이미지를 클릭하고 Shift + E를 눌러 마스크를 TMR 채널에 적용합니다. 마찬가지로 H2DCFDA 이미지를 클릭하고 Shift + E를 눌러 H2DCFDA 채널에 마스크를 적용합니다.
- 마스크 내의 각 매크로피노좀에 대해 TMR 및 H2DCFDA 강도를 기록합니다.
- 시간 코스에서 각 시간 지점에 대해 4.1-4.3 단계를 반복합니다.
- H2DCFDA 강도를 TMR 강도로 나누어 H2DCFDA: TMR 비율을 생성합니다.
- H2DCFDA: 시간에 대한 TMR 비율을 플롯합니다.
7. 매크로피노좀 내 단백질 소화 측정
- 1절에서와 같이 셀을 준비합니다.
- 분석 당일, 모든 우물을 37°C에서 100 μL HBSS로 세척합니다.
- HBSS에서 4 mg/mL의 농도에 BODIPY 라벨 ovalbumin을 용해.
- 각각 100 μL의 BMR 라벨 70 kDa dextran 및 BODIPY 라벨 ovalbumin의 0.2 mg/mL을 포함하는 HBSS의 100 μL을 채웁니다.
- 세포를 37°C로 설정된 인큐베이터에 15분 간 넣습니다.
- 인큐베이터에서 세포를 제거하고 HBSS의 100 μL로 셀 6x를 세척합니다.
- 각각의 HBSS 100 μL을 37°C로 채웁니다.
- 가열 된 단계와 챔버와 현미경에 접시를 배치하고 필요에 따라 각 형광에 대한 흥분 / 방출 매개 변수를 조정합니다.
참고: 이미지 수집을 위한 이상적인 조건은 사용되는 형광및 개별 현미경 셋업에 따라 다릅니다. 여기서, 이미지는 라이카 SP5 레이저 스캐닝 공초점 현미경에 취득되었다. TMR은 543 레이저 라인으로 흥분했고, 방출은 610 nm에서 650 nm로 수집되었습니다. BODIPY는 488 레이저 라인으로 흥분했으며 500 nm에서 550 nm로 배출되었습니다. 63배 오일 침수 목표가 사용되었고 0.5 μm 간격으로 10 μm Z-부피를 획득했습니다. - 각 우물에서 이미지를 획득하여 각 우물 사이에 형광을 번갈아 가며 합니다.
- 첫 번째 인수 후 모든 우물이 전체 플레이트에 초점을 맞추고 있는지 확인하십시오.
- 원하는 시간 동안 1-15분 간격으로 각 웰의 이미지를 획득합니다.
8. 매크로피노좀 내의 단백질 소화를 위한 데이터 분석
- FIJI 소프트웨어를 사용하여 TMR 및 BODIPY 채널 모두에서 배경을 뺍니다.
- TMR 채널에서 마스크를 생성하고 위의 6.2 및 6.3 단계(그림 3B)에서와같이 TMR 및 BODIPY 이미지 모두에 적용합니다.
- 마스크 내의 각 매크로피노솜에 대해 TMR 및 BODIPY 강도를 기록합니다.
- 시간 코스에서 각 시간 지점에 대해 4.1-4.3 단계를 반복합니다.
- BODIPY 강도를 TMR 강도로 나누어 BODIPY:TMR 비율을 생성합니다.
- 시간에 대해 BODIPY:TMR 비율을 플롯합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
거형 pH를 측정할 때 산성화의 역학을 측정할 수 없는 기간이 있습니다. 이 기간은 dextran 로딩 상(도 2C 및 도 3C, D의회색 상자)에 해당하며 사용되는 셀 유형에 따라 달라집니다. 로딩 상의 길이는 (i) 세포의 대식세포 활성 및 (ii) 사용되는 계측기의 감도에 따라 달라집니다. 각 실험의 시작 시 이 기간을 조정하여 형광및 TMR 채널 모두에 대해 4:1 이상의 신호:노이즈 비가 달성되는 것을 권장합니다. 처리되지 않은 세포에서, 형광 방출은 거형이 산성화함에 따라 점진적으로 약해져야 하며, TMR 신호는 일정하게 유지되거나 밝아져야 합니다. 매크로피노좀의크기(16,21)에서수축하면 TMR 신호가 밝아질 수 있다. 이는 형광 신호가 유기체크기(22)의동일한 변이에 따라 다르기 때문에 비에 영향을 미치지 않는다. 형광:TMR 비율은 점진적으로 작아지고 처음 15분 이내에 고원이 될것이다(그림 2C). 이 고원은 대략리소좀(25)의pH와 일치하는 ~5의 pH에 해당한다. 각 인수가 끝나면 내부 보정이 수행됩니다. 형광:TMR 비율은 pH 7.5의 교정 버퍼를 가진 가장 크어야 하며 교정 버퍼가 산성화됨에 따라 점진적으로 작아져야 합니다. 이렇게 하면 교정곡선(도 2B)의생성이 가능합니다. 형광:TMR 비율은 다음 거형 피노소말 pH(도 2C)에대한 보간 될 수있다.
매크로 피노좀 내의 산화 적 이벤트는 또한 사용되는 세포 유형에 따라 다를 가능성이 있다. H2DCFDA-dextran으로 세포를 로드하고, phorbol 12-myristate 13-아세테이트(PMA)를 사용하여 NADPH 산화를 자극하는 것이좋습니다(도 3C). 이것은 분석의 동적 범위의 더 나은 아이디어를 제공하고 현미경 설정의 조정을 허용할 것입니다. 산화 이벤트가 거시피노솜 내에서 발생함에 따라 H2DCFDA 신호는 점진적으로 밝아질 것입니다. TMR 신호는 위에서 설명한 대로 일정하게 유지되거나 매크로피노종의 크기에 따라 다를 수 있다. H2DCFDA:TMR의 비율은 점진적으로 더 커지며, 불활성화 된 raw264.7 세포에서 처음 20-30 분 이내에 고원이 될 가능성이 높습니다(그림 3A,C).
거형 단백질 소화를 측정할 때, ovalbumin이 소화됨에 따라 점진적으로 강한 형광 신호가 해방됩니다. Raw264.7 세포에서, 소화된 BODIPY-라벨ovalbumin로부터 해방된 형광의 증가는 처음 30분 이내에 고원(도3B,D)이될 것이다. 이전과 마찬가지로, TMR 신호는 일정하게 유지될 수 있거나 거시적인 크기에 따라 달라질 수 있다. 대식세포 폐쇄 직후ovalbumin의 분해가 시작됨에 따라, 음의 제어는 분석의 동적 범위를 결정하는 데 유용할 수 있다. 이를 위해, 거형 내의 산성 수압은 콘카나마이신 A(CcA)(도 3D)또는 바필로마이신 A와 같은 V-ATPase의 억제제를 사용하여 억제될 수 있다.
그림 1: 이중 불소 비율이미징의 원리. (A-C). 표시된 pH의 완충제에 매달린 pH 에 민감한 형광의 스펙트럼 스캔(여기 고정, 방출-다양) 플루오레스세인, pHrodo 및 cypHer5e는 일반적으로 세포 분해에서 pH센서로 사용됩니다. (D-F). 표시된 pH의 완충제에서 일시 중단된 pH-감광의 스펙트럼 스캔(주분 고정, 방출-다양) pH와 다르지 않은 염료는 유용한 참조 형광을 합니다. 플루오레스세인은 내모성에서 경험되는 산성 pH 값에서 최적으로 민감하지 않다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 매크로 피노소말 pH의 동적 측정 (A)raw264.7 세포는 15 분 리포 폴리사카라이드 (LPS)의 존재 또는 부재에 37 °C에서 불소 라벨 70 kDa dextran 및 TMR 라벨 70 kDa dextran로로드하였다. 또한 4°C에서 형광표 70kDa dextran 및 TMR 라벨 70 kDa dextran을 dextran의 비특이적 결합을 위한 대조군으로 배양하였다. 인셋은 개별 셀을 표시합니다(배율 막대 = 20 μm). (B)플루오레신 라벨70 kDa dextran 및 TMR 라벨 70 kDa dextran을 사용하여 표시된 pH 및 니제리신에서 풍부한 버퍼를 사용하여 Raw264.7 세포의 시투 교정에서. (C)Raw264.7 셀에서 매크로 피노솜 pH. 인셋은 개별 거형에서 형광:TMR 비율을 나타냅니다. 회색 상자는 세포가 dextran으로 로드되는 시간을 나타냅니다. ≥ 각각 80개의 셀을 포함하는 두 개의 독립적인 실험에서 얻은 데이터. 평균 ± SEM으로 표시된 데이터는 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 3: 매크로 피노좀의 루멘 내에서 산화 이벤트 및 단백질 소화의 동적 측정. (A)raw264.7 세포는 H2DCFDA 라벨 70 kDa dextran 및 TMR 라벨 70 kDa dextran37 °C에서 37 °C로 로드된 후 37 °C에서 45 분 추격. Inset은 개별 매크로 피노좀의 비율 이미지(H2DCFDA/TMR)를 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. (B)Raw264.7 세포는 BODIPY 라벨이 부착된 ovalbumin 및 TMR 라벨 70 kDa dextran을 37°C에서 15분 동안 적재하고 37°C에서 45분 추격하였다. TMR 채널은 BODIPY 채널에 적용된 마스크를 생성하는 데 사용되었습니다. Inset은 개별 셀을 표시합니다. 스케일 바 = 20 μm. (C)매크로피노좀의 루멘 내에서 H2DCFDA 산화. 세포는 또한 긍정적인 대조군으로 PMA로 자극되었다. 회색 상자는 세포가 dextran으로 로드되는 시간을 나타냅니다. 각각 80개의 세포를 ≥ 포함하는 두 개의 독립적인 실험에서 얻은 데이터. 평균 ± SEM으로 표현되는 데이터입니다. 각 시간 지점은 PMA 컨트롤과 비교되었습니다. 학생의 t-테스트는통계 분석에 사용되었습니다. (D)BODIPY 라벨이 부착된 ovalbumin 분해가 거시성 내의 분해. 콘카나마이신 A(CcA)는 발광산 수수로의 활성화를 방지하기 때문에 음의 대조군으로 사용되었다. 각각 80개의 세포를 ≥ 포함하는 두 개의 독립적인 실험에서 얻은 데이터. 평균 ± SEM으로 표현되는 데이터입니다. 각 시간 지점은 CcA 컨트롤과 비교되었습니다. 학생의 t-테스트는통계 분석에 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
대식세포, 섬유아세포, 심지어 Dictyostelium spp에서 대식세포 섭취의 저처리량 측정과 높은 처리량 측정을 위한 프로토콜의 수가 많지만. 3,7,31,32,33,이러한 동적 구획의 발광 생화학을 측정하기 위한 시도는 거의 이루어지지 않았습니다. 이는 다른 내식 구획을 피하면서 거시적인 구획을 효율적으로 표적으로 삼을 수 있는 프로브의 빈약함 때문일 수 있습니다. 여기에 설명된 기술은 거시피노솜 내의 pH, 산화 이벤트 및 단백질 소화의 동적 측정을 위한 형광 프로브를 표적으로 하는 기술이다.
비측정형 현미경 검사는 내시경 pH가 수십 년 동안 측정된 1차 기술이었습니다. 플루오레스세인은 내뇌 pH 측정에 널리 사용되어 왔으며pK로서 선택의 형광로계속되어 내도 pH 값(~pH 7.2-4.5)의 전형적인 범위로 정확한 측정을 가능하게 한다. 여기서, 연구 결과는 매크로 피노좀 특정 pH 측정을 위한 70 kDa dextran에 공인된 형광을 채택했습니다. 이 방법의 제한은 매크로 피노소말 pH를 기록할 수 없는 15분 dextran 로딩 기간입니다. 이 기간은 거시피노소말 구획에 충분한 불소소표지 라벨드엑스트라를 로드하는 데 필요하지만 초기 거시적 pH 측정을 효과적으로 배제합니다. 그러나 버퍼링 용량, 상대 양성자 누출 및 V-ATPase 펌핑 전력과 같은 다양한 발광 파라미터의 판정을 배제하지는 않으며, 모두 거시피노소말 pH 측정에서 파생됩니다. 도 1에도시된 바와 같이, 다수의 다른 pH 민감형 형광은 pHrodo(pKa = 6.8) 및 CypHer5e(pKa = 7.3)를 포함하는 pH를 측정하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 형광보다pK가 훨씬 높기 때문에, 더 산성 pH 값에서 내도 pH를 측정하는 것이 최적이 지 않다.
거형세포는 매우 역동적인 세포기관이고 형성 직후16,21,이중 형광률형형이 요구된다. 매크로피노좀의 부피의 변화로 인한 형광의 변화는 제시된 모든 애약에서 참조 형광소를 사용하기 위해 수정된다.
세포의 산화 적 이벤트는 니트로 블루 테트라졸륨 (NBT), 루미놀 및 H2DCFDA를 포함한 다양한 레독스 민감 프로브를 사용하여 측정되었습니다. Luminol 기지를 둔 접근은 세포의 인구에 있는 ROS 생산을 측정하기 위하여 특히 유용하지만 세포 기관 특정 측정에 적응하기 어렵습니다. NBT는 산화 시 포르마잔이라고 쉽게 시각화된 불용성 퇴적물(formazan)을 형성하지만 형광 신호를 모호하게 하며 비선형적이고 국소화가 어렵습니다. H2DCFDA는 산화 시 선형 형광 신호를 해방하고 세포세포 별 측정을 위해 dextran과 같은 트레이서에 쉽게 접합할 수 있습니다. H2DCFDA를 70kDa dextran에 부착함으로써 개별 거형 인(도 3B)내에서 산화 이벤트가 시각화 될 수 있습니다. 그러나 이 접근 방식에는 주의해야 할 점이 있습니다. H2DCFDA는 형광의 변형 된 형태이기 때문에 해방 된 신호는 pH에 민감합니다. 산화에 형광의 이득은 검출될 정도로 크더라도, 그것은 의심할 여지없이 매크로 피노종의 산성 루멘에 의해 가려져 있습니다. H2DCFDA의 pH 무감각 변종은 이전에 상용화되어 왔으며 바람직하다; 그러나 이 원고를 준비할 때 이 제품은 더 이상 시판되지 않았습니다. ROS는 중요한 신호 분자로서 부상하고 멤브레인 리모델링, 유기자 인신 매매, 그리고 최근에는 T 세포에 대한 프리젠 테이션을위한 항원 제시 세포에 의해 물질의 처리에 연루되어있다 28,30. 여기에 제시된 방법은 이러한 다양한 생리적 과정에 대한 대식체 피노소말 ROS 생산의 기여도를 연구하는 데 사용될 수 있다.
macropinosomes에서 단백질 소화는 암세포에 의한 영양 취득의 연구 뿐만 아니라 면역 세포에 의한 항원 프리젠 테이션의 연구에 관심이 있습니다. 예를 들어, 수지상 세포에 의한 내인장 단백질 소화는 주요 조직적합성 분자에 T 세포에 프리젠 테이션에 사용할 수있는 펩티드의 풀을 제한하는 것으로 추정된다. macropinosomes는 항원 취득의 주요 경로이기 때문에, macropinosomal 단백질 소화의 측정은 미세 조정 항원 프리젠 테이션을 담당하는 분자 기계를 탐구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 내도 수납칸에서 단백질 소화를 측정하는 데 사용할 수 있는 다양한 도구가 사용됩니다. 소화 시 강하게 형광이 되는 BODIPY 라벨 BSA 및 ovalbumin 프로브는 특히 인기가 입증되었습니다. 그들은 쉽게 내세포 추적자에 결합하고 특정 내피 구획을 대상으로 할 수있다, 이러한 phagosomes. 그러나 프로브는 쉽게 결합되지 않으므로 공동 지역화 접근 방식이 필요합니다. 이 방법은 BODIPY 라벨 ovalbumin와 매크로 피놀을 포함한 모든 내구 구획의 적재를 초래하고, 마스크는 거시적 특이적 저하를 측정하는 데 사용됩니다. 이 방법은 더 나은 해상도가 필요하며 더 크고 더 높은 처리량 분석을 위해 쉽게 확장되지 않습니다. 단백질 분해 도구를 70 kDa dextran에 공유하게 결합하는 기술은 유용할 가능성이 있으며 현재 실험실에서 개발되고 있습니다.
macropinocytosis의 분야가34계속증가함에 따라 pH, 레독스 화학, 단백질 소화, 이온 농도 및 지질 화학을 포함한 매크로 피노좀의 발광 생화학을 동적으로 측정하기위한 도구는 빠르게 진화하는 이러한 세포기관의 독특한 생물학에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 캘거리 대학의 지원에 감사드립니다. 또한 시약, 장비 및 유용한 토론에 대한 로빈 예이츠 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | - | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
References
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A.
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al.
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A.
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C.
- Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S.
