Summary
Vi beskriver protokoll för mätning av pH, oxidativa händelser och protein matsmältning i enskilda makropinosomer i levande celler. Tonvikten läggs på dubbelfluoroforkvotetrisk mikroskopi och de fördelar den erbjuder jämfört med befolkningsbaserade tekniker.
Abstract
Under de senaste åren har området makropinocytos vuxit snabbt. Macropinocytosis har dykt upp som en central mekanism genom vilken medfödda immunceller upprätthåller organismisk homeostas och immunitet. Samtidigt, och i motsats till dess homeostatiska roll, kan det också driva olika patologier, inklusive cancer och virusinfektioner. Till skillnad från andra lägen av endocytos förblir verktygen som utvecklats för att studera mognad av makropinosomer underutvecklade. Här beskriver protokollet nyutvecklade verktyg för att studera redoxmiljön inom lumen av tidiga och mogna makropinosomer. Metoder för användning av ratiometric fluorescensmikroskopi vid bedömning av pH, produktion av reaktiva syre arter och den nedbrytbara kapaciteten inom lumen av enskilda makropinosomer i levande celler beskrivs. Enstaka organelle mätningar erbjuder fördelen att avslöja spatiotemporal heterogenitet, som ofta går förlorad med befolkningsbaserade metoder. Tonvikten läggs på de grundläggande principerna för dubbel fluorfor ratiometric mikroskopi, inklusive sondval, instrumentering, kalibrering och encelliga kontra befolkningsbaserade metoder.
Introduction
Makropinocytos avser upptag av stora mängder extracellulär vätska i membranbundna cytoplasmaorganeller som kallas makropinosomer1,2. Det är en mycket bevarad process som utförs av frilevande encelliga organismer, såsom amoeba Dictyostelium spp. 3, liksom anthozoans4 och metazoaner2. I de flesta celler är makropinocytos en inducerad händelse. Ligaturen av cell-ytreceptorer inducerar utskjutning av aktindrivna plasmamembranförlängningar som kallas volanger. En bråkdel av dessa volanger, av någon dåligt förstådd mekanism, förseglar vid sina distala tips för att bilda makropinosomer (även om det ligger utanför tillämpningsområdet för detta metodpapper, för detaljerade recensioner om mekaniken för makropinocytos, se referenser1,2,5,6,7). Den extracellulära stimulansen som inducerar makropinocytos är oftast en löslig tillväxtfaktor5,8. Följaktligen möjliggör den makropinocytiska händelsen intag av en bolus av extracellulärt material från vilket cellen kan härleda användbara metaboliter för att underlätta tillväxten. Tyvärr kan denna väg för näringstillförsel också driva patologi. Vissa cancerceller hyser mutationer som resulterar i kontinuerlig eller konstituerande makropinocytos. Kontinuerlig leverans av näringsämnen underlättar okontrollerad spridning av cancerceller och har kopplats till särskilt aggressiva tumörer9,10,11,12,13. På samma sätt kan virus inducera makropinocytos för att få tillgång till värdceller, vilket driver viral patologi14.
Makropinocytos fungerar också vid upprätthållande av immunitet mot patogener. Vissa medfödda immunceller som makrofager och dendritiska celler deltar i den konstituerande och aggressiva provtagningen av extracellulär vätska via makropinocytos6,15,16. Detta läge av makropinocytos är otroligt aktivt, och en enda dendritisk cell kan engorge sig med en volym extracellulär vätska som motsvarar sin egen vikt varje timme17. Trots denna konstituerande provtagning replikerar makrofager och dendritiska celler inte okontrollerat liksom tumörceller, istället verkar de bearbeta det extracellulära materialet på ett sådant sätt att information kan extraheras för att informera om förekomsten, eller för den delen frånvaron, av potentiella hot. Information extraheras som i) patogen-associerade molekylära mönster som kan läsas av intracellulära patogen erkännande receptorer och ii) korta sträckor av aminosyror som kan laddas på stora histocompatibility molekyler för screening av celler i det adaptiva immunsystemet16,18,19. Huruvida patogener undergräver denna väg för informationsbehandling av immunceller är för närvarande oklart.
Trots dessa väldefinierade och kritiska roller för makropinocytos i både upprätthållandet av immunitet och homeostas och i motsats till andra vanligare studerade lägen av endocytos, är lite av de inre (luminal) arbete av makropinosomer känt. Att utveckla standardiserade protokoll och verktyg för att studera makropinosomernas luminala biokemi kommer inte bara att hjälpa oss att förstå deras unika biologi bättre utan kommer att ge insikt som kan utnyttjas för nya terapeutiska strategier, inklusive läkemedelsleverans20. Detta metodmanuskript kommer att fokusera på nyligen utvecklade verktyg för att på enorganellnivå dissekera olika aspekter av makropinosomernas luminalbiokemi.
Fluorforer kan användas för att mäta specifika biokemier av organeller om i) de delar företrädesvis in i det intresseområde och/eller ii) de genomgår spektralförändringar som svar på den parameter som är av intresse. Till exempel, när det gäller pH, fluorescerande svaga baser, såsom acridine apelsin, cresyl violett, och LysoTracker färgämnen ackumuleras företrädesvis i sura organeller. Därför är deras relativa intensitet en grov indikation på att den märkta organellen är sur. Andra pH-responsiva fluorforer, såsom fluorescein, pHrodo och cypHer5e, genomgår spektralförändringar vid bindning till protoner (figur 1A-C). Förändringar i fluorescensutsläppet av pH-känsliga fluorforer kan därför ge en användbar approximation av pH. Användningen av enstaka fluorforer innebär dock ett antal nackdelar. Till exempel kan ändringar i fokalplanet, fotoblekning och förändringar i volymen av enskilda organeller, en vanlig förekomst i makropinosomer21, inducera förändringar i fluorescensintensiteten hos enstaka fluorforer, och detta kan inte enkelt korrigeras för22. Envågiga bedömningar, även om de är användbara för visualisering av sura fack, är därför rent kvalitativa.
Ett mer kvantitativt tillvägagångssätt är att rikta in sig på den parameterkänsliga fluorforen tillsammans med en referensfluorofor till organellen av intresse. Referensfluorforen är idealiskt okänslig för biokemiska förändringar inom organellen (figur 1D-F) och kan därför användas för att korrigera för förändringar i brännplanet, organellär volym och i viss utsträckning fotoblekning23. Med hjälp av detta tillvägagångssätt, som kallas dubbelfluorforförhållandet fluorescens, kan korrigering uppnås genom att generera ett förhållande mellan fluorescensutsläppet av parameterkänslig fluorfor och referensfluorforen.
Här kommer protokollet att använda principen om dubbelfluorfor ratiometric imaging för att mäta pH, oxidativa händelser och protein nedbrytning inom makropinosomer. I varje enskilt fall väljs en fluorofor som är känslig för parametern av intresse och en referensfluorofor. För att rikta fluorforerna specifikt till makropinosomer kommer de att kovaly kopplas till 70 kDa dextran, som företrädesvis införlivas i makropinosomer24. Alla analyser kommer att utföras i Raw264,7-celler men kan anpassas till andra celltyper. Om möjligt kalibreras fluorescenskvoterna mot en referenskurva för att få absoluta värden. Viktigt är att alla mätningar utförs i levande celler för dynamisk och kvantitativ bedömning av makropinosomernas luminala miljö.
Vid val av pH-känsliga fluorforer måste ett antal överväganden vägas. Den första är pKa av fluorforen, som anger intervallet av pH-värden vid vilka sonden kommer att vara mest känslig. Om det antas att makropinosomens pH kort efter bildandet kommer att ligga nära det extracellulära mediet (~pH 7.2) och att det gradvis kommer att försuras genom interaktioner med sena endosomer och lysosomer (~pH 5.0), bör en sond med en pKa som är känslig inom det intervallet (figur 2C) väljas. Fluorforfluorescein, som har en pKa på 6,4, är optimalt känslig inom det intervallet. Det har använts i stor utsträckning för att mäta andra liknande organeller, såsom fagosomer, och kommer att vara fluorforen i detta manuskript22,25. Som referensfluorfor kommer tetrametritylramhodamin att användas, vilket är okänsligt för pH(figur 1E). Andra fluorforer, såsom pHrodo och cypHer5e, kan ersätta fluorescein där fluoresceins spektralegenskaper matchar andra experimentella variabler. Några föreslagna referensfluoroforer för pHrodo och cypHer5e visas i figur 1.
En andra faktor är den metod genom vilken de två fluorforerna kommer att riktas specifikt mot makropinosomer. Dextran av storleken 70 kDa, som har en hydrodynamisk radie på ungefär 7 nm, håller sig inte specifikt till celler och ingår i makropinosomer, men inte clathrinbelagda gropar eller grottor, och markerar därför makropinosomer (figur 2A och figur 3A, B)16,24,26. I detta protokoll kommer fluoresceinmärkt 70 kDa dextran- och tetramethylrhodamine (TMR)-märkta 70 kDa dextran att användas som pH-känsliga respektive referenssonder.
I medfödda immunceller representerar makropinocytos och fagocytos de två viktigaste vägarna för internalisering av exogent material för bearbetning och efterföljande presentation till celler i det adaptiva immunsvaret27. Noggrann och samordnad kontroll av redox kemin av lumen av phagosomes och makropinosomer är avgörande för den kontextspecifika bearbetningen av exogent material. Kanske den mest studerade regulatorn av oxidativa händelser i faagosomer är NADPH-oxidasen, ett stort multiunderavdelningskomplex som producerar stora mängder reaktiva syrearter (ROS) inom lumen av phagosomer28. Dess verksamhet är i själva hand central för lämplig antigenbearbetning inom phagosomerna29,30. Ändå har aktiviteten hos NADPH-oxidasen på makropinosomala membran inte utforskats.
I detta protokoll används H2DCFDA succinimidyl ester för att mäta oxidativa händelser inom makropinosomen. Detta är en modifierad form av fluorescein (2',7'-diklordihydrofluorescein diacetat), som är minimalt fluorescerande i sin reducerade form. Vid oxidation ökar dess fluorescensutsläpp avsevärt. Det är dock värt att notera en betydande varning om H2DCFDA - eftersom den är baserad på fluorforfluorescein, är dess fluorescens också släckt i sura fack, och man måste vara noga med att kontrollera denna variabel när man utformar experiment28. I likhet med metoden för mätning av pH kommer H2DCFDA-succinimidylestern att kovaleras till 70 kDa dextran- och TMR-märkta 70 kDa dextran användas som referensfluorfor (figur 3A).
Fluorescerande ovalbumin kommer att användas för att mäta proteinnedbrytning inom makropinosomer. Ovalbumin som används här är tätt märkt med ett 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL färgämne som är självsläckt. Vid matsmältningen frigörs starkt fluorescerande färgmärkta peptider. Eftersom ovalbumin inte lätt kan konjugeras till 70 kDa dextran, kommer celler med TMR-märkta 70 kDa dextran och fluidfas ovalbumin att vara saminkuberade. TMR-signalen kommer att användas för att generera en makropinosommask under analysen efter avbildningen, och signalen som frigörs från den smälta ovalbuminen mäts i masken (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av celler
- Odla Raw264,7 celler vid 37 °C och 5% CO2 till 70% sammanflöde i RPMI kompletterat med 10% värmeinaktiverat serum.
- En dag före analysen, så frön Raw264.7 celler med en densitet av 5 x 104 celler per brunn i en 96-brunnsplatta. Se till att varje brunn innehåller 100 μL tillväxtmedium. Se till att 96-brunnsplattan har svarta sidor och en glasbotten för avbildning.
OBS: Här användes 96-brunnsplattor för avbildning. 96-brunnsplattorna möjliggör användning av mindre mängder celler och reagenser i förhållande till större bildkammare. Alla kammare som är utformade för avbildning av levande celler kan dock användas, och reagenser kan skalas upp i enlighet därmed. - På testdagen, kontrollera om brunnarna är minst 70% konfluenta.
2. Mäta makropinosom pH
- Förbered cellerna som i avsnitt 1.
- Tvätta alla brunnar med 100 μL HBSS vid 37 °C.
- Fyll varje brunn med 100 μL HBSS innehållande 0,025 mg/ml TMR-märkt 70 kDa dextran och 0,025 mg/ml fluoresceinmärkt 70 kDa dextran.
- Placera cellerna i en inkubator inställd på 37 °C i 15 minuter.
- Ta bort cellerna från inkubatorn och tvätta cellerna 6x med 100 μL HBSS.
- Fyll varje brunn med 100 μL HBSS vid 37 °C.
- Placera plattan på mikroskopet med en uppvärmd scen och kammare.
- Justera excitations-/emissionsparametrarna för varje fluorfor efter behov.
OBS: Idealiska förutsättningar för bildförvärv varierar med fluororer som används och enskilda mikroskopuppsättningar. Här förvärvades bilder på ett Leica SP5 laserskanning confocal mikroskop. TMR var exalterad med en 543-laserlinje och utsläpp samlades in från 610 nm till 650 nm. Fluorescein var upphetsad med en 488-laserlinje och utsläpp samlades in från 500 nm till 550 nm. Ett mål på 63x oljesänkning användes och en Z-volym på 10 μm förvärvades med 0,5 μm intervall. - Få en bild från varje brunn, alternerande mellan fluorforer mellan varje brunn.
- Efter det första förvärvet, kontrollera om alla brunnar förblev i fokus över hela plattan.
- Skaffa bilder av varje brunn med 1-15 minuters intervall under önskad tid.
3. In situ-kalibrering av makropinosom pH
- Under bildförvärvet, förbered 1 L kaliumrik (K+-rik) lösning som innehåller 140 mM KCl, 1 mM MgCl2,1 mM CaCl2och 5 mM glukos. Komplettera en 400 ml volym av K+-rik lösning med 25 mM HEPES (från en 1 M, pH 7,2 lagerlösning) och en separat 400 mL volym med 25 mM MES (från en 0,5 M, pH 6,0 lagerlösning).
- Justera en 50 ml alikvot av K+-rik lösning buffrad med 25mM HEPES till pH 7,5 med 10 M HCl eller 10 M KOH efter behov.
- Justera tre separata 50 ml alikvoter av K+-rik lösning buffrad med 25mM MES till pH 6,5, pH 5,5 och pH 5,0 med 10 M HCl eller 10 M KOH efter behov.
OBS: En acetat-ättiksyrabuffert kan vara att föredra för lägre pH-lösningar. - Efter avslutad bildförvärv, ta bort HBSS från 96-brunnsplattan som innehåller cellerna och ersätt den med K+-rik lösning som är vid pH 7.5.
- Tillsätt nigericin till en slutlig koncentration på 10 μg/ml.
OBS: Nigericin är en jonofor som utbyter K+ mot H+. Genom att ställa in K+ koncentrationen av K+-rik lösning till ett värde som approximerar cytosolens K+ koncentration kan det säkerställas att nigericin klämmer fast makropinosomens pH-värde till cytosolens, vilket i sin tur återspeglar kalibreringsbuffertens pH. - Placera tillbaka plattan på mikroskopet och skaffa bilder av varje brunn med samma förvärvsinställningar som ovan.
- Upprepa steg 3.5 och 3.6 för varje kalibreringsbuffert.
4. Dataanalys för makropinosom pH
- Använd FIJI-programvara, subtrahera bakgrunden från både TMR och fluoresceinkanalen.
- Generera en mask på TMR-kanalen. Om du vill generera en mask konverterar du bilden till en binär bild genom att välja Justera > tröskelvärde > Tillämpa. Markera sedan den binära bilden och välj Redigera > markering > skapa mask.
- Applicera den på både TMR- och fluoresceinbilderna. Det gör du genom att markera masken och välja Redigera > markering > skapa markering. Klicka på TMR-bilden och tryck på Skift + E för att applicera masken på TMR-kanalen. På samma sätt klickar du på fluoresceinbilden och trycker på Skift + E för att applicera masken på OB-kanalen.
- Registrera TMR- och fluoresceinintensiteten för varje makropinosom i maskerna.
- Upprepa steg 4.1-4.3 för varje tidpunkt från tidskursen.
- Upprepa steg 4.1-4.3 för de bilder som tagits i in situ-kalibreringen.
- Dividera fluoresceinintensiteten med TMR-intensiteten för att generera fluorescein:TMR-förhållandet.
- Rita pH-talet mot fluorescein:TMR-förhållanden för kalibreringsbilderna.
- Anpassa en kurva till kalibreringsdata.
- Interpolera data för varje tidpunkt från tidskursen för att få absoluta pH-värden.
5. Mätning av oxidativa händelser inom makropinosomer
- Förbered cellerna som i avsnitt 1.
- En dag före analysen, förbered H2DCFDA succinimidyl ester märkt 70 kDa dextran genom att återanvända 10 mg 70 kDa dextran-amino i 1 ml 0,1 M natriumbikarbonatlösning (pH 8,3). Tillsätt 1 mg H2DCFDA succinimidyl ester till dextran-aminolösningen och inkubera i 1 h. Dialyze den H2DCFDA-märkta 70 kDa dextran mot PBS. Förvara inte i mer än 1 dag eftersom H2DCFDA-märkt 70 kDa dextran oxiderar vid lagring.
- På testdagen tvättar du alla brunnar med 100 μL HBSS vid 37 °C.
- Fyll varje brunn med 100 μL HBSS innehållande 0,025 mg/ml TMR-märkt 70 kDa dextran och 0,025 mg/ml H2DCFDA-märkt 70 kDa dextran.
- Placera cellerna i en inkubator inställd på 37 °C i 15 minuter.
- Ta bort celler från inkubatorn och tvätta cellerna 6x med 100 μL HBSS.
- Fyll varje brunn med 100 μL HBSS vid 37 °C.
- Placera plattan på mikroskopet med ett uppvärmt steg och kammare och justera excitations-/emissionsparametrarna för varje fluorfor efter behov.
OBS: Idealiska förutsättningar för bildförvärv varierar med fluororer som används och enskilda mikroskopuppsättningar. Här förvärvades bilder på ett Leica SP5 laser scanning confocal mikroskop. TMR var exalterad med en 543-laserlinje och utsläpp samlades in från 610 nm till 650 nm. H2DCFDA var upphetsad med en 488-laserlinje och utsläpp samlades in från 500 nm till 550 nm. Ett mål på 63x oljesänkning användes och en Z-volym på 10 μm förvärvades med 0,5 μm intervall. - Få en bild från varje brunn, alternerande mellan fluorforer mellan varje brunn.
- Efter det första förvärvet, kontrollera om alla brunnar förblir i fokus över hela plattan.
- Skaffa bilder av varje brunn med 1-15 minuters intervall under önskad tid.
6. Dataanalys för oxidativa händelser inom makropinosomer
- Använd FIJI-programvara och subtrahera bakgrunden från både TMR- och H2DCFDA-kanalerna.
- Generera en mask på TMR-kanalen. Om du vill generera en mask konverterar du bilden till en binär bild genom att välja Justera > tröskelvärde > Tillämpa. Markera sedan den binära bilden och välj Redigera > markering > skapa mask.
- Applicera masken på både TMR- och H2DCFDA-avbildningarna. Det gör du genom att markera masken och välja Redigera > markering > skapa markering. Klicka på TMR-bilden och tryck på Skift + E för att applicera masken på TMR-kanalen. På samma sätt klickar du på H2DCFDA-bilden och trycker på Skift + E för att applicera masken på H2DCFDA-kanalen.
- Registrera TMR- och H2DCFDA-intensiteten för varje makropinosom i maskerna.
- Upprepa steg 4.1-4.3 för varje tidpunkt från tidskursen.
- Dividera H2DCFDA-intensiteten med TMR-intensiteten för att generera en H2DCFDA: TMR-förhållande.
- Rita H2DCFDA: TMR-förhållandet mot tiden.
7. Mätning av proteinsammanfattning inom makropinosomer
- Förbered cellerna som i avsnitt 1.
- På testdagen tvättar du alla brunnar med 100 μL HBSS vid 37 °C.
- Lös upp BODIPY-märkt ovalbumin till en koncentration av 4 mg/ml i HBSS.
- Fyll varje brunn med 100 μL HBSS som innehåller 0,025 mg/ml TMR-märkt 70 kDa dextran och 0,2 mg/ml BODIPY-märkt ovalbumin.
- Placera cellerna i en inkubator inställd på 37 °C i 15 minuter.
- Ta bort celler från inkubatorn och tvätta cellerna 6x med 100 μL HBSS.
- Fyll varje brunn med 100 μL HBSS vid 37 °C.
- Placera plattan på mikroskopet med ett uppvärmt steg och kammare och justera excitations-/emissionsparametrarna för varje fluorfor efter behov.
OBS: Idealiska förutsättningar för bildförvärv varierar med fluororer som används och enskilda mikroskopuppsättningar. Här förvärvades bilder på ett Leica SP5 laserskanning confocal mikroskop. TMR var exalterad med en 543-laserlinje och utsläpp samlades in från 610 nm till 650 nm. BODIPY var exalterad över en 488-laserlinje och utsläpp samlades in från 500 nm till 550 nm. Ett mål på 63x oljesänkning användes och en Z-volym på 10 μm förvärvades med 0,5 μm intervall. - Få en bild från varje brunn, alternerande mellan fluorforer mellan varje brunn.
- Efter det första förvärvet, kontrollera om alla brunnar förblir i fokus över hela plattan.
- Skaffa bilder av varje brunn med 1-15 minuters intervall under önskad tid.
8. Dataanalys för proteinsammanfattning inom makropinosomer
- Använd FIJI-programvara, subtrahera bakgrunden från både TMR- och BODIPY-kanalerna.
- Generera en mask på TMR-kanalen och applicera den på både TMR- och BODIPY-bilderna enligt steg 6.2 och 6.3 ovan (Figur 3B).
- Registrera TMR- och BODIPY-intensiteten för varje makropinosom i maskerna.
- Upprepa steg 4.1-4.3 för varje tidpunkt från tidskursen.
- Dividera BODYPY-intensiteten med TMR-intensiteten för att generera BODYPY:TMR-förhållandet.
- Rita BODYPY:TMR-förhållandet mot tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid mätning av makropinosom pH finns det en tidsperiod för vilken försurningsdynamiken inte kan mätas. Denna period motsvarar dextran-inläsningsfasen (grå ruta i figur 2C och figur 3C,D) och varierar beroende på vilken celltyp som används. Belastningsfasens längd varierar med i) cellernas makropinocytiska aktivitet och ii) känsligheten hos det instrument som används. Det rekommenderas att justera denna period i början av varje experiment så att ett signal:brusförhållande på mer än 4:1 uppnås för både fluorescein- och TMR-kanalerna. I obehandlade celler bör fluoresceinutsläppet gradvis bli svagare när makropinosomerna försurar, och TMR-signalen bör förbli antingen konstant eller bli ljusare. TMR-signalen kan bli ljusare om makropinosomerna krymper i storlek16,21. Detta kommer inte att påverka förhållandet eftersom fluoresceinsignalen utsätts för samma variationer i organell storlek22. Fluorescein:TMR-förhållandet blir gradvis mindre och kommer att platå inom de första 15 minuters förvärv (Figur 2C). Denna platå motsvarar ett pH på ~ 5, som ungefär matchar pH av lysosomer25. I slutet av varje förvärv utförs en in situ-kalibrering. Fluorescein:TMR-förhållandet bör vara störst med kalibreringsbufferten vid pH 7.5 och bli gradvis mindre när kalibreringsbuffertarna blir surare. Detta möjliggör generering av en kalibreringskurva (figur 2B). Fluorescein:TMR-förhållanden kan sedan interpoleras för makropinosomalt pH (figur 2C).
Oxidativa händelser inom makropinosomer kommer sannolikt också att variera med den celltyp som används. Det rekommenderas att ladda cellerna med H2DCFDA-dextran, och att stimulera NADPH oxidas med phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) som en positiv kontroll (Figur 3C). Detta ger en bättre uppfattning om det dynamiska intervallet för analysen och möjliggör justering av mikroskopinställningarna. När oxidativa händelser inträffar inom makropinosomerna kommer H2DCFDA-signalen att bli gradvis ljusare. TMR-signalen kan förbli konstant eller variera med storleken på makropinosom, som diskuterats ovan. Förhållandet mellan H2DCFDA:TMR kommer att bli gradvis större och kommer sannolikt att platå inom de första 20-30 min i inaktiverade Raw264.7 celler (Figur 3A,C).
Vid mätning av makropinosomal protein matsmältning, en progressivt stark fluorescerande signal kommer att frigöras som ovalbumin smälts. I Raw264.7-celler kommer ökningen av fluorescens befriad från den smälta BODIPY-märkta ovalbuminen att platå inom de första 30 min (Figur 3B, D). Liksom tidigare kan TMR-signalen förbli konstant eller variera med storleken på makropinosomen. När nedbrytningen av ovalbumin börjar omedelbart efter makropinosomstängningen kan en negativ kontroll vara användbar för att bestämma det dynamiska intervallet för analysen. I detta syfte kan sura hydrolaser i makropinosomen hämmas med hjälp av en hämmare av V-ATPase, såsom Concanamycin A (CcA) (Figur 3D) eller Bafilomycin A.
Figur 1: Principer för dubbelfluorforförhållandemetrisk avbildning. A-C). Spektralskanningar (excitations-fasta, utsläpps-varierade) av pH-känsliga fluorforer upphängda i buffertar av det angivna pH. Fluorescein, pHrodo och cypHer5e används ofta som sensorer av pH i cellulära analyser. (D-F). Spektralskanningar (excitation-fasta, utsläpps varierade) av pH-okänsliga fluorforer upphängda i buffertar av det angivna pH- systemet. Färgämnen som inte varierar med pH gör användbara referensfluorforer. Fluorescein, är inte optimalt känsliga vid de mer sura pH-värdena som upplevs i endosomer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Dynamiska mätningar av makropinosomalt pH. (A) Raw264,7 celler laddades med fluoresceinmärkta 70 kDa dextran och TMR-märkta 70 kDa dextran vid 37 °C i närvaro eller frånvaro av 500 ng/ml Lipopolysackarid (LPS) i 15 min. De inkuberades också med fluoresceinmärkta 70 kDa dextran och TMR-märkta 70 kDa dextran vid 4 °C som en kontroll för den icke-specifika bindningen av dextran. Insets visar enskilda celler (Skalstänger = 20 μm). B) In situ-kalibrering av Raw264.7-celler laddade med fluoresceinmärkta 70 kDa dextran- och TMR-märkta 70 kDa dextran med K+-rika buffertar vid angiven pH och nigericin. (C) Makropinosom pH i Raw264,7 celler. Insets representerar fluorescein:TMR-förhållandet i enskilda makropinosomer. Grå rutor anger de tider då celler laddades med dextran. Data från två oberoende experiment som var och en innehåller ≥ 80 celler. Data som representeras som ± SEM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3:Dynamiska mätningar av oxidativa händelser och proteinsammanfattning inom lumen av makropinosomer. (A) Raw264,7 celler var laddade med H2DCFDA-märkta 70 kDa dextran och TMR-märkta 70 kDa dextran vid 37 °C i 15 min, följt av en 45 minuters jakt vid 37 °C. Insets visar ransonerade bilder (H2DCFDA/TMR) av enskilda makropinosomer. Skalstänger = 20 μm. B)Raw264,7 celler var laddade med BODIPY-märkt ovalbumin och TMR-märkta 70 kDa dextran vid 37 °C i 15 min, följt av en 45 minuters jakt vid 37 °C. TMR-kanalen användes för att generera en mask som tillämpades på BODIPY-kanalen. Insets visar enskilda celler. Skalstänger = 20 μm. C)H2DCFDA-oxidation inom makropinosomens lumen. Celler stimulerades också med PMA som en positiv kontroll. Grå rutor anger de tider då celler laddades med dextran. Data från två oberoende experiment, som var och en innehåller ≥ 80 celler. Data representerade som ± SEM. Varje tidpunkt jämfördes med PMA-kontrollen. En elevs t-testanvändes för statistisk analys. D)Bodipy-märkt ovalbuminnedbrytning inom makropinosomer. Concanamycin A (CcA) användes som en negativ kontroll eftersom det förhindrar aktivering av luminalsyrahydrolaser. Data från två oberoende experiment, som var och en innehåller ≥ 80 celler. Data representerade som ± SEM. Varje tidpunkt jämfördes med CcA-kontrollen. En elevs t-testanvändes för statistisk analys. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även om det finns ett antal protokoll för både låg och hög genomströmning mätningar av makropinocytic upptag i makrofager, fibroblaster och även Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, mycket få försök har gjorts att mäta den luminala biokemin i dessa dynamiska fack. Detta beror sannolikt på en brist på sonder som effektivt kan riktas till makropinosomalfacket samtidigt som andra endocytiska fack undviks. Beskrivs här är teknikerna för att rikta fluorescerande sonder för dynamisk mätning av pH, oxidativa händelser och protein matsmältning inom makropinosomer.
Ratiometric fluorescensmikroskopi har varit den primära tekniken genom vilken endosomal pH har mätts i årtionden. Fluorescein har använts i stor utsträckning för att mäta endosomalt pH och fortsätter att vara den fluorfor som dess pKa möjliggör exakta mätningar med det typiska intervallet av endosomala pH-värden (~ pH 7,2-4,5). Här använde studien fluorescein konjugerat till 70 kDa dextran för makropinosomspecifika pH-mätningar. En begränsning av detta tillvägagångssätt är den 15 min dextran laddningsperiod under vilken makropinosomal pH inte kan registreras. Denna period krävs för att ladda tillräcklig fluorofor-märkt dextran i makropinosomal facket men utesluter effektivt tidiga makropinosom pH mätningar. Detta utesluter dock inte bestämningar av olika luminala parametrar såsom buffringskapacitet, relativ protonläckage och V-ATPase-pumpkraft, som alla härrör från makropinosomala pH-mätningar. Som visas i figur 1kan ett antal andra pH-känsliga fluorforer också användas för att mäta pH, inklusive pHrodo (pKa = 6,8) och CypHer5e (pKa = 7,3). Men eftersom de har en betydligt högre pKa än fluorescein, de är inte optimala för att mäta endosomal pH vid mer sura pH värden.
Eftersom makropinosomer är mycket dynamiska organeller och genomgår betydande krympning kort efter att habildat 16,21, krävs dubbelfluorofor ratiometrisk fluorescens. Förändringar i fluorescens på grund av förändringar i volymen av makropinosomer korrigeras för att använda en referensfluorofor i alla de analyser som presenteras.
Oxidativa händelser i celler har uppmätts med hjälp av en mängd olika redoxkänsliga sonder, inklusive nitroblue tetrazolium (NBT), luminol och H2DCFDA. Luminol-baserade metoder är särskilt användbara för att mäta ROS-produktion i en population av celler men är svåra att anpassa sig till organellespecifika mätningar. NBT bildar en lätt visualiserad olöslig deposition kallad formazan vid oxidation men skymmer fluorescerande signaler och är både icke-linjär och svår att lokalisera. H2DCFDA frigör en linjär fluorescerande signal vid oxidation och kan lätt konjugeras till spårämnen som dextran för organellespecifika mätningar. Genom att fästa H2DCFDA på 70 kDa dextran kan oxidativa händelser inom enskilda makropinosomer (figur 3B) visualiseras. Det finns dock en varning för detta tillvägagångssätt. Eftersom H2DCFDA är en modifierad form av fluorescein är signalen frigjord pH-känslig. Även om vinsten i fluorescens vid oxidation är tillräckligt stor för att detekteras, maskeras den utan tvekan av makropinosomens sura lumen. En pH-okänslig variant av H2DCFDA har tidigare varit kommersiellt tillgänglig och är att föredra; Vid tidpunkten för utarbetandet av detta manuskript var denna produkt dock inte längre kommersiellt tillgänglig. ROS framträder som en viktig signalmolekyl och har varit inblandad i membranrenovering, organell handel och mer nyligen i bearbetningen av materialet genom antigen-presentera celler för presentation till T-celler28,30. Metoden som presenteras här kan användas för att studera bidraget från makropinosomal ROS-produktion till dessa olika fysiologiska processer.
Protein matsmältningen i makropinosomer är av intresse i studien av antigen presentation av immunceller samt studiet av näringsförvärv av cancerceller. Till exempel tros endosomal protein matsmältning av dendritiska celler begränsa poolen av peptider tillgängliga för presentation till T-celler på stora histokompatibilitet molekyler. Eftersom makropinosomer är en viktig väg för antigenförvärv, mätningar av makropinosomal protein matsmältning kan användas för att undersöka de molekylära maskiner som ansvarar för finjustering antigen presentation. Ett antal kommersiellt tillgängliga verktyg används för att mäta proteinsammanfattning i endosomalfack. De BODIPY-märkta BSA- och ovalbuminsonderna, som blir starkt fluorescerande vid matsmältningen, har visat sig vara särskilt populära. De är lätt kopplade till endocytiska spårämnen och kan riktas till specifika endosomal fack, såsom fagosomer. Sonderna är dock inte lätt kopplade till dextran och kräver därför en samlokaliseringsmetod. Detta tillvägagångssätt resulterar i inläsning av alla endosomal fack, inklusive makropinosomer, med BODIPY-märkta ovalbumin, och en mask används för att mäta makropinosom-specifika nedbrytning. Detta tillvägagångssätt kräver bättre upplösning och skalas inte lätt upp för större, mer högpresterande genomströmningsanalyser. Tekniker för att kovalent koppla proteinnedbrytningsverktyg till 70 kDa dextran kommer sannolikt att visa sig vara användbara och utvecklas för närvarande i vårt laboratorium.
När området makropinocytos fortsätter attväxa 34, kommer verktyg för dynamisk mätning av makropinosomernas luminalbiokemi, inklusive pH, redoxkemi, proteinsammanfattning, jonkoncentrationer och lipidkemier att ge insikt i den unika biologin hos dessa snabbt växande organeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar University of Calgary för dess stöd. Vi vill också tacka Dr. Robin Yates för tillgång till reagenser, utrustning och användbara diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | - | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
References
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A.
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al.
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A.
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P.
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C.
- Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S.
