Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מדידת ה-pH, הכימיות האדומות והיכולת המשפילה של מקרופאינוזום באמצעות מיקרוסקופיה רציומטרית דו-פלואורופור

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/62733
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

Summary

אנו מתארים פרוטוקולים למדידת pH, אירועים חמצוניים ועיכול חלבונים במקרופינוזומים בודדים בתאים חיים. דגשושם על מיקרוסקופיה יחס פלואורופור כפולה ועל היתרונות שהיא מציעה על פני טכניקות מבוססות אוכלוסייה.

Abstract

בשנים האחרונות, תחום המקרופינוציטוזיס גדל במהירות. מקרופינוציטוזיס התפתח כמנגנון מרכזי שבאמצעותו תאי מערכת החיסון המולדים שומרים על הומאוסטזיס אורגניזם וחסינות. בו זמנית, ובניגוד לתפקידו ההומיאוסטטי, הוא יכול גם לנהוג בפתולוגיות שונות, כולל סרטן וזיהומים ויראליים. שלא כמו מצבים אחרים של אנדוציטוזיס, הכלים שפותחו לחקר ההתבגרות של מקרופאינוזום נשארים לא מפותחים. כאן הפרוטוקול מתאר כלים שפותחו לאחרונה לחקר סביבת redox בתוך הלומן של מקרופאינום מוקדמים ומבשרים. מתודולוגיות לשימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנטיות יחסרית בהערכת ה- pH, ייצור מיני חמצן תגובתי ויכולת השפלה בתוך הלומן של מקרופאינוזומים בודדים בתאים חיים מתוארים. מדידות אברונים בודדות מציעות את היתרון של חשיפת הטרוגניות מרחבית, אשר לעתים קרובות הולך לאיבוד עם גישות מבוססות אוכלוסייה. הדגש מושם על העקרונות הבסיסיים של מיקרוסקופיה יחס פלואורופור כפולה, כולל בחירת בדיקה, מכשור, כיול ושיטות חד-תאיות לעומת שיטות מבוססות אוכלוסייה.

Introduction

מקרופינוציטוזיס מתייחס לספיגת כמויות גדולות של נוזל חוץ-תאי לאברונים ציטופלסמיים הקשורים לממברנה הנקראים מקרופאינוזומים1,2. זהו תהליך שמור מאוד המבוצע על ידי אורגניזמים חד-תאיים חיים חופשיים, כגון אמבה דיקטיוסטליום spp. 3, כמו גם אנתוזואים4 ומטאזואנים2. ברוב התאים, מקרופינוציטוזיס הוא אירוע מושרה. קשירת קולטני פני התא גורמת לבולטות של הרחבות קרום פלזמה מונחות אקטין המכונות קפלים. חלק קטן מאותם קפלים, על ידי מנגנון לא מובן, לאטום את הטיפים הדיסטליים שלהם כדי ליצור macropinosomes (אם כי מעבר להיקף נייר שיטות זה, עבור ביקורות מפורטות על המכניקה של macropinocytosis, אנא עיין בהתייחסויות1,2,5,6,7). הגירוי החוץ תאי הגורמים למקרופינוציטוזיס הוא לרוב גורם גדילה מסיס5,8. בהתאם, האירוע המקרופינוציטי מאפשר בליעה של בולוס של חומר חוץ תאי שממנו התא יכול להפיק מטבוליטים שימושיים כדי להקל על הצמיחה. למרבה הצער, מסלול זה לאספקת חומרים מזינים יכול גם לנהוג פתולוגיה. תאים סרטניים מסוימים מכילים מוטציות שגורמות למקרופינוציטוזיס מתמשך או מהווה. המסירה המתמשכת של חומרים מזינים מקלה על התפשטות בלתי מבוקרת של תאים סרטניים ונקשרה לגידולים אגרסיביים במיוחד9,10,11,12,13. באופן דומה, וירוסים יכולים לגרום מקרופינוציטוזיס כדי לקבל גישה לתאים מארחים, ובכך לנהוגפתולוגיה ויראלית 14.

מקרופינוציטוזיס מתפקד גם בשמירה על חסינות לפתוגנים. תאים חיסוניים מולדים מסוימים כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים עוסקים בדגימה מכוננת ואגרסיבית של נוזל חוץ תאי באמצעות מקרופינוציטוזיס6,15,16. מצב זה של מקרופינוציטוזיס פעיל להפליא, ותא דנדריטי יחיד יכול להסתגר בנפח של נוזל חוץ תאי השווה למשקל שלו כל שעה17. למרות הדגימה המכוננת הזו, מקרופאגים ותאים דנדריטיים אינם משתכפלים ללא שליטה כמו גם תאים סרטניים, במקום זאת, נראה שהם מעבדים את החומר החוץ תאי באופן שניתן לחלץ מידע כדי ליידע על נוכחות, או אכן היעדר, של איומים פוטנציאליים. מידע מופק כמו i) דפוסים מולקולריים הקשורים פתוגן שניתן לקרוא על ידי קולטני זיהוי פתוגן תאיים ii) קטעים קצרים של חומצות אמינו שניתן לטעון על מולקולות היסטו-תאימות גדולות להקרנה על ידי תאים של מערכת החיסון אדפטיבית16,18,19. לא ברור אם פתוגנים חתרים תחת מסלול זה לעיבוד מידע על ידי תאי מערכת החיסון.

למרות תפקידים מוגדרים היטב וביקורתיים אלה עבור macropinocytosis הן בשמירה על חסינות הומאוסטזיס ובניגוד למצבים אחרים הנחקרים יותר של אנדוציטוזיס, מעט מהעבודה הפנימית (הזוהרת) של מקרופאינוזומים ידועה. פיתוח פרוטוקולים וכלים סטנדרטיים לחקר הביוכימיה הזוהרת של מקרופאינוזומים לא רק יעזור לנו להבין טוב יותר את הביולוגיה הייחודית שלהם, אלא יספק תובנה שניתן למנף לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות, כולל אספקת תרופות20. שיטה זו תתמקד בכלים שפותחו לאחרונה לנתח, ברמת האברונים הבודדים, היבטים שונים של הביוכימיה הזוהרת של מקרופאינום.

פלואורופורים יכולים לשמש למדידת ביוכימיה ספציפית של אברונים אם i) הם מחולקים באופן מועדף לתוך תא העניין ו /או ii) הם עוברים שינויים ספקטרליים בתגובה לפרמטר העניין. לדוגמה, במקרה של pH, בסיסים חלשים פלואורסצנטיים, כגון כתום אקרידן, סגול סהר, וצבעי LysoTracker מצטברים באופן מועדף אברונים חומציים. לכן, העוצמה היחסית שלהם היא אינדיקציה גסה כי אברון שכותרתו חומצית. פלואורופורים אחרים בעלי תגובה ל-pH, כגון פלואורסצין, pHrodo ו-cypHer5e, עוברים שינויים ספקטרליים עם קשירה לפרוטונים(איור 1A-C). שינויים בפליטת הפלואורסצנטיות של פלואורופורים רגישים ל- pH יכולים אפוא לספק קירוב שימושי של pH. השימוש בפלואורופור יחיד, לעומת זאת, מציג מספר חסרונות. לדוגמה, שינויים במישור המוקד, ההלבנה והשינויים בנפח של אברונים בודדים, תופעה שכיחה במקרופינוזומים21, יכולים לגרום לשינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של פלואורופור יחיד, ולא ניתן לתקן זאת בקלות עבור22. הערכות אורך גל יחיד, אם כי שימושי להדמיה תאים חומציים, ולכן הם איכותיים לחלוטין.

גישה כמותית יותר היא למקד את הפלורופור הרגיש לפרמטר יחד עם פלואורופור התייחסות לאברון העניין. פלואורופור הייחוס הוא באופן אידיאלי חסר רגישות לשינויים ביוכימיים בתוך האברונים (איור 1D-F) ולכן ניתן להשתמש בו כדי לתקן שינויים במישור המוקד, נפח organellar, ובמידה מסוימת, צילום23. באמצעות גישה זו, המכונה פלואורסצנטיות יחסית פלואורופור כפולה, ניתן להשיג תיקון על ידי יצירת יחס של פליטת פלואורסצנטיות של פלואורופור רגיש לפרמטרים לפלואורופור הייחוס.

כאן, הפרוטוקול יהיה ניצול העיקרון של הדמיה יחס פלואורופור כפול כדי למדוד pH, אירועים חמצוניים, השפלת חלבון בתוך מקרופאינוזומים. בכל מקרה, פלואורופור ייבחר כי הוא רגיש לפרמטר של עניין פלואורופור התייחסות. על מנת למקד את הפלורופורים במיוחד למקרופאינוזומים, הם יהיו יחד בשיתוף עם 70 kDa dextran, אשר משולב באופן מועדף מקרופאינוזומים24. כל ההסתה תבוצע בתאי Raw264.7 אך ניתן להתאיםן לסוגי תאים אחרים. במידת האפשר, יחסי הפלואורסצנטיות כוילו כנגד עקומת ייחוס כדי להשיג ערכים מוחלטים. חשוב לציין, כל המדידות יבוצעו בתאים חיים להערכה דינמית וכמותית של הסביבה הזוהרת של מקרופאינום.

בעת בחירת פלואורופורים רגישים ל- pH, יש לשקול מספר שיקולים. הראשון הוא pKa של הפלורופור, אשר מציין את הטווח של ערכי pH שבו הבדיקה תהיה רגישה ביותר. אם ההנחה היא כי זמן קצר לאחר היווצרות, ה- pH של macropinosome יהיה קרוב לזה של המדיום החוץ תאי (~ pH 7.2) וכי הוא יהיה חומצי בהדרגה באמצעות אינטראקציות עם אנדוזומים מאוחרים וליזוזומים (~ pH 5.0), אז בדיקה עם pKa כי הוא רגיש בטווח זה (איור 2C) יש לבחור. פלואורופור פלואורסצ'ין, שיש לו pKa של 6.4, רגיש באופן אופטימלי בטווח זה. זה שימש בהרחבה כדי למדוד אברונים דומים אחרים, כגון phagosomes, ויהיה פלואורופור של בחירה בכתב יד זה22,25. כפלואורופור התייחסות, ייעשה שימוש בטטרםאתיל-רדואמין, דבר שאינו רגיש ל-pH (איור 1E). פלואורופורים אחרים, כגון pHrodo ו cypHer5e עשויים להיות מוחלפים פלואורסצין שבו המאפיינים הספקטרליים של פלואורסצין אכן תואמים משתנים ניסיוניים אחרים. כמה פלואורופורים התייחסות הציע עבור pHrodo ו cypHer5e מוצגים באיור 1.

שיקול שני הוא השיטה שבאמצעותה שני הפלורופורים יכוונו במיוחד למקרופאינוזום. דקסטרן בגודל 70 kDa, בעל רדיוס הידרודינמי של כ-7 ננומטר, אינו נדבק באופן לא ספציפי לתאים ומשולב במקרופינומים, אך לא בורות או מערות מצופים קלאתרין, ולכן מסמן מקרופאינומים (איור 2A ואיור 3A, B)16,24,26. בפרוטוקול זה, פלואורסציין שכותרתו 70 kDa dextran ו tetramethylrhodamine (TMR)-שכותרתו 70 kDa dextran ישמשו בדיקות רגיש pH וייחוס, בהתאמה.

בתאי מערכת החיסון המולדים, מקרופינוציטוזיס ופגוציטוזיס מייצגים את שני המסלולים העיקריים להפנמה של חומר אקסוגני לעיבוד והצגה לאחר מכן לתאים של התגובה החיסונית המסתגלת27. השליטה הקפדנית והמתואמת של הכימיה האדומה של הלומן של פאגוזומים ומקרופינוזומים היא קריטית לעיבוד ספציפי להקשר של חומר אקסוגני. אולי הרגולטור הנחקר ביותר של אירועים חמצוניים בפגוזומים הוא אוקסידאז NADPH, קומפלקס רב-תת-קרקעי גדול המייצר כמויות גדולות של מיני חמצן תגובתי (ROS) בתוך הלומן של פאגוזומים28. ואכן, פעילותה היא מרכזית לעיבוד אנטיגן מתאים בתוך phagosomes29,30. עם זאת, הפעילות של אוקסידאז NADPH על ממברנות macropinosomal לא נחקרה.

בפרוטוקול זה, אסתר הסוצ'ינימידיל H2DCFDA משמשת למדידת אירועים חמצוניים בתוך המקרופאינוזום. זוהי צורה שונה של פלואורסצ'ין (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate), שהוא פלואורסצנטי מינימלי בצורתו המופחתת. לאחר חמצון, פליטת הפלואורסצנטיות שלו עולה באופן משמעותי. עם זאת, ראוי לציין אזהרה משמעותית של H2DCFDA - כפי שהוא מבוסס על פלואורופור פלואורסצין, הפלואורסצנטיות שלו מרווה גם בתאים חומציים, ויש לנקוט זהירות כדי לשלוט על משתנה זה בעת תכנון ניסויים28. בדומה לגישה למדידת pH, אסתר הסוצ'ינימידיל H2DCFDA תוצמד באופן קוולנטי ל- 70 kDa dextran ו- Dextran עם תווית TMR 70 kDa ישמשו כפזור הייחוס (איור 3A).

אובלבומין פלואורסצנטי ישמש למדידת ירידה בחלבון בתוך מקרופאינוזומים. הסגלגל המשמש כאן מסומן בצפיפות עם 4,4-difluoro-4-בורה-3a,4a-דיאזה-s-indacene (BODIPY) FL כי הוא מרווה את עצמו. עם העיכול, פפטידים בצבע פלואורסצנטי חזק משוחררים. כמו אליבאמין לא ניתן להטות בקלות ל 70 kDa dextran, תאים עם TMR מסומן 70 kDa dextran ו אובלבומין שלב נוזל יהיה דגירה משותפת. אות ה-TMR ישמש ליצירת מסכת מקרופאינום במהלך ניתוח שלאחר ההדמיה, והאות המשתחרר מהסגלגל המעוכל יימדד בתוך המסכה (איור 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תאים

  1. לגדול Raw264.7 תאים ב 37 °C ו 5% CO2 עד 70% השפעה ב RPMI בתוספת 10% סרום מומת בחום.
  2. יום אחד לפני ההסתערות, זרע Raw264.7 תאים בצפיפות של 5 x 104 תאים לבאר בצלחת 96-well. ודא כי כל באר מכילה 100 μL של אמצעי צמיחה. ודא כי צלחת 96 טוב יש צדדים שחורים ותחתית זכוכית להדמיה.
    הערה: כאן, לוחות 96-באר שימשו להדמיה. לוחות 96 בארות מאפשרים שימוש בכמויות קטנות יותר של תאים ריגנטים ביחס לתאי הדמיה גדולים יותר. עם זאת, ניתן להשתמש בכל תא המיועד להדמיית תאים חיים, וניתן להגדיל ריאגנטים בהתאם.
  3. ביום הבדיקה, בדוק אם בארות הם לפחות 70% מפגש.

2. מדידת pH מקרופאינום

  1. הכן את התאים כמו בסעיף 1.
  2. לשטוף את כל הבארות עם 100 μL של HBSS ב 37 °C (77 °F).
  3. מלא כל באר עם 100 μL של HBSS המכיל 0.025 מ"ג / מ"ל של TMR מסומן 70 kDa dextran ו 0.025 מ"ג / מ"ל של פלואורסצין תווית 70 kDa dextran.
  4. מניחים את התאים לתוך אינקובטור להגדיר 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות.
  5. הסר את התאים מן האינקובטור לשטוף את התאים 6x עם 100 μL של HBSS.
  6. מלא כל באר עם 100 μL של HBSS ב 37 °C (50 °F).
  7. מניחים את הצלחת על המיקרוסקופ עם במה מחוממת ותא.
  8. התאם את הפרמטרים עירור / פליטה עבור כל פלואורופור לפי הצורך.
    הערה: התנאים האידיאליים לרכישת תמונות ישתנו עם פלואורופורים המשמשים ומיקרוסקופים בודדים. כאן, תמונות נרכשו על מיקרוסקופ לייזר Leica SP5 סריקה קונפוקלית. TMR התרגשה עם קו לייזר 543 ופליטה נאספה מ 610 ננומטר ל 650 ננומטר. פלואורסצ'ין התרגשה מקו לייזר 488 ופליטה נאספה מ-500 ננומטר ל-550 ננומטר. נעשה שימוש במטרה טבילת שמן 63x ונפח Z של 10 מיקרומטר נרכש במרווחי זמן של 0.5 מיקרומטר.
  9. לרכוש תמונה מכל באר, לסירוגין בין פלואורופורים בין כל באר.
  10. לאחר הרכישה הראשונה, בדוק אם כל הבארות נשארו בפוקוס על פני כל הצלחת.
  11. לרכוש תמונות של כל באר במרווחים של 1-15 דקות למשך הזמן הרצוי.

3. בכיול במקום של pH מקרופאינום

  1. במהלך רכישת התמונה, להכין 1 L של אשלגן עשיר (K+-עשיר) פתרון המכיל 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, ו 5 mM גלוקוז. הוסף נפח אחד של 400 מ"ל של פתרון K+עשיר עם 25 mM HEPES (מפתרון מלאי של 1 M, pH 7.2) ונפח נפרד של 400 מ"ל עם 25 מ"מ MES (מפתרון מלאי של 0.5 M, pH 6.0).
  2. כוונן aliquot 50 מ"ל של פתרון K+עשיר חוצץ עם 25mM HEPES ל- pH 7.5 באמצעות 10 M HCl או 10 M KOH לפי הצורך.
  3. כוונן שלושה עליקוטים נפרדים של 50 מ"ל של הפתרון K+עשיר עם 25mM MES ל- pH 6.5, pH 5.5 ו- pH 5.0 באמצעות 10 M HCl או 10 M KOH לפי הצורך.
    הערה: מאגר חומצה אצטט-אצטית עשוי להיות עדיף על פתרונות pH נמוכים יותר.
  4. לאחר השלמת רכישת התמונה, הסר את HBSS מהצלחת 96-well המכילה את התאים והחלף אותו בפתרון K+-rich שנמצא ב- pH 7.5.
  5. הוסף ניז'ריסין לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
    הערה: ניז'ריצין הוא ינופור שמחליף K+ עבור H+. על ידי הגדרת K+ ריכוז של פתרון K+- עשיר לערך המשוער K+ ריכוז של ציטוסול, ניתן להבטיח כי ניז'ריצין יהיה מהדק את ה- pH של macropinosome לזה של ציטסול, אשר בתורו משקף את ה- pH של חיץ הכיול.
  6. הנח את הצלחת בחזרה על המיקרוסקופ ולרכוש תמונות של כל באר באמצעות אותן הגדרות רכישה כמו לעיל.
  7. חזור על שלבים 3.5 ו- 3.6 עבור כל מאגר כיול.

4. ניתוח נתונים עבור pH מקרופאינום

  1. באמצעות תוכנת FIJI, הפחת את הרקע הן מערוץ TMR והן מערוץ הפלואורסצ'ין.
  2. צור מסיכה בערוץ TMR. ליצירת מסיכה, המר את התמונה לתמונה בינארית על-ידי בחירה באפשרות התאם > סף > החל. לאחר מכן, סמן את התמונה הבינארית ובחר ערוך > הבחירה > יצירת מסיכה.
  3. החל אותו הן על תמונות TMR והן על תמונות פלואורסצ'ין. כדי לעשות זאת, סמן את המסיכה ובחר ערוך > בחירה > צור בחירה. לחץ על תמונת TMR והקש Shift + E כדי להחיל את המסיכה על ערוץ TMR. באופן דומה, לחץ על התמונה פלואורסצ'ין ולחץ Shift + E כדי להחיל את המסכה על ערוץ OB.
  4. הקלט את עוצמת TMR ופלואורסצ'ין עבור כל מקרופאינום בתוך המסכות.
  5. חזור על שלבים 4.1-4.3 עבור כל נקודת זמן ממסלול הזמן.
  6. חזור על שלבים 4.1-4.3 עבור התמונות שצולמו בכיול inu.
  7. חלק את עוצמת הפלואורסצ'ין בעוצמת TMR כדי ליצור את יחס פלואורסצ'ין:TMR.
  8. התווה את ה- pH כנגד יחסי הפלואורסין:TMR לתמונות הכיול.
  9. התאם עקומה לנתוני הכיול.
  10. אינטרפולציה הנתונים עבור כל נקודת זמן ממסלול הזמן כדי לקבל ערכי pH מוחלטים.

5. מדידת אירועים חמצוניים בתוך מקרופאינום

  1. הכן את התאים כמו בסעיף 1.
  2. יום אחד לפני ההסמכה, להכין את אסתר תמציתינדיל H2DCFDA שכותרתו 70 kDa dextran על ידי שימוש חוזר 10 מ"ג של 70 kDa dextran-אמינו ב 1 מ"ל של 0.1 M פתרון דו קרבונט נתרן (pH 8.3). הוסיפו מ"ג אחד של אסתר הסוצ'ינימידיל H2DCFDA לתמיסת האמינות דקסטרן ודגרה למשך שעה אחת. Dialyze H2DCFDA שכותרתו 70 kDa dextran נגד PBS. אין לאחסן במשך יותר מיום אחד כמו H2DCFDA-תווית 70 kDa dextran יתחמצן על אחסון.
  3. ביום של ההסתה, לשטוף את כל הבארות עם 100 μL של HBSS ב 37 °C (50 °F).
  4. מלא כל באר עם 100 μL של HBSS המכיל 0.025 מ"ג / מ"ל של TMR תווית 70 kDa דקסטרן ו 0.025 מ"ג / מ"ל של H2DCFDA תווית 70 kDa dextran.
  5. מניחים תאים לתוך אינקובטור להגדיר 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות.
  6. הסר תאים מן האינקובטור לשטוף את התאים 6x עם 100 μL של HBSS.
  7. מלא כל באר עם 100 μL של HBSS ב 37 °C (50 °F).
  8. מניחים את הצלחת על המיקרוסקופ עם שלב ותא מחוממים ומתאימים את הפרמטרים של עירור/פליטה עבור כל פלואורופור לפי הצורך.
    הערה: התנאים האידיאליים לרכישת תמונות ישתנו עם פלואורופורים המשמשים ומיקרוסקופים בודדים. כאן נרכשו תמונות על מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר לייקה SP5. TMR התרגשה עם קו לייזר 543, והפליטה נאספה מ 610 ננומטר ל 650 ננומטר. H2DCFDA היה נרגש עם קו לייזר 488 ופליטה נאספה מ 500 ננומטר ל 550 ננומטר. נעשה שימוש במטרה טבילת שמן 63x, ונפח Z של 10 מיקרומטר נרכש במרווחי זמן של 0.5 מיקרומטר.
  9. לרכוש תמונה מכל באר, לסירוגין בין פלואורופורים בין כל באר.
  10. לאחר הרכישה הראשונה, בדוק אם כל הבארות נשארות בפוקוס על פני כל הצלחת.
  11. לרכוש תמונות של כל באר במרווחים של 1-15 דקות למשך הזמן הרצוי.

6. ניתוח נתונים לאירועי חמצון בתוך מקרופאינום

  1. באמצעות תוכנת FIJI, הפחת את הרקע הן מערוצי TMR והן מערוצי H2DCFDA.
  2. צור מסיכה בערוץ TMR. ליצירת מסיכה, המר את התמונה לתמונה בינארית על-ידי בחירה באפשרות התאם > סף > החל. לאחר מכן, סמן את התמונה הבינארית ובחר ערוך > הבחירה > יצירת מסיכה.
  3. החל את המסכה הן על תמונות TMR והן על תמונות H2DCFDA. כדי לעשות זאת, סמן את המסיכה ובחר ערוך > בחירה > צור בחירה. לחץ על תמונת TMR והקש Shift + E כדי להחיל את המסיכה על ערוץ TMR. באופן דומה, לחץ על תמונת H2DCFDA ולחץ Shift + E כדי להחיל את המסכה על ערוץ H2DCFDA.
  4. הקלט את עוצמת TMR ו- H2DCFDA עבור כל מקרופאינום בתוך המסכות.
  5. חזור על שלבים 4.1-4.3 עבור כל נקודת זמן ממסלול הזמן.
  6. חלק את עוצמת H2DCFDA על ידי עוצמת TMR כדי ליצור H2DCFDA: יחס TMR.
  7. התווה H2DCFDA: יחס TMR נגד הזמן.

7. מדידת עיכול חלבונים בתוך מקרופאינוזומים

  1. הכן את התאים כמו בסעיף 1.
  2. ביום של ההסתה, לשטוף את כל הבארות עם 100 μL HBSS ב 37 °C (50 °F).
  3. להמיס סגלגלים עם תווית BODIPY לריכוז של 4 מ"ג/מ"ל ב-HBSS.
  4. מלא כל באר עם 100 μL של HBSS המכיל 0.025 מ"ג / מ"ל של Dextran 70 kDa עם תווית TMR ו 0.2 מ"ג / מ"ל של אובלבומין עם תווית BODIPY.
  5. מניחים את התאים לתוך אינקובטור להגדיר 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות.
  6. הסר תאים מן האינקובטור לשטוף את התאים 6x עם 100 μL של HBSS.
  7. מלא כל באר עם 100 μL של HBSS ב 37 °C (50 °F).
  8. מניחים את הצלחת על המיקרוסקופ עם שלב ותא מחוממים ומתאימים את הפרמטרים של עירור/פליטה עבור כל פלואורופור לפי הצורך.
    הערה: התנאים האידיאליים לרכישת תמונות ישתנו עם פלואורופורים המשמשים ומיקרוסקופים בודדים. כאן, תמונות נרכשו על מיקרוסקופ לייזר Leica SP5 סריקה קונפוקלית. TMR התרגשה עם קו לייזר 543, והפליטה נאספה מ 610 ננומטר ל 650 ננומטר. BODIPY התרגש עם קו לייזר 488, והפליטה נאספה מ 500 ננומטר ל 550 ננומטר. נעשה שימוש במטרה טבילת שמן 63x ונפח Z של 10 מיקרומטר נרכש במרווחי זמן של 0.5 מיקרומטר.
  9. לרכוש תמונה מכל באר, לסירוגין בין פלואורופורים בין כל באר.
  10. לאחר הרכישה הראשונה, בדוק אם כל הבארות נשארות בפוקוס על פני כל הצלחת.
  11. לרכוש תמונות של כל באר במרווחים של 1-15 דקות למשך הזמן הרצוי.

8. ניתוח נתונים לעיכול חלבונים בתוך מקרופאינוזומים

  1. באמצעות תוכנת FIJI, הפחת את הרקע הן מערוצי TMR והן מערוצי BODIPY.
  2. צור מסיכה בערוץ TMR והחל אותה הן על תמונות TMR והן על תמונות BODIPY כמו בשלבים 6.2 ו- 6.3 לעיל (איור 3B).
  3. הקלט את עוצמת TMR ו- BODIPY עבור כל מקרופאינום בתוך המסכות.
  4. חזור על שלבים 4.1-4.3 עבור כל נקודת זמן ממסלול הזמן.
  5. חלק את עוצמת ה- BODIPY בעוצמת TMR כדי ליצור את יחס BODIPY:TMR.
  6. התווה את יחס BODIPY:TMR נגד הזמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעת מדידת pH macropinosome, יש פרק זמן שבו הדינמיקה של החמצה לא ניתן למדוד. תקופה זו תואמת לשלב הטעינה של dextran (תיבה אפורה באיור 2C ובאיור 3C,D) ותשתנה בהתאם לסוג התא בו נעשה שימוש. אורך שלב הטעינה ישתנה עם (i) הפעילות המקרופינוציטית של התאים ו- (ii) הרגישות של המכשיר המשמש. מומלץ להתאים תקופה זו בתחילת כל ניסוי כך שיחס אות: רעש של גדול מ- 4:1 מושג הן עבור פלואורסצין והן עבור ערוצי TMR. בתאים לא מטופלים, פליטת הפלואורסצ'ין צריכה להיות חלשה יותר ויותר ככל שהמקרופינוזומים חומציים, ואות ה- TMR צריך להישאר קבוע או להיות בהיר יותר. אות TMR עשוי להיות בהיר יותר אם המקרופאינוזומים מתכווצים בגודל16,21. זה לא ישפיע על היחס כמו אות פלואורסצ'ין כפוף לאותן וריאציות בגודל organellar22. יחס הפלורסיין:TMR יקטן בהדרגה ויעלה ב-15 הדקות הראשונות של הרכישה(איור 2C). רמה זו תואמת pH של ~ 5, אשר בערך תואם את ה- pH של ליזוזומים25. בסוף כל רכישה, כיול במקום מבוצע. יחס הפלואורסצ'ין:TMR צריך להיות הגדול ביותר עם מאגר הכיול ב- pH 7.5 ולהיות קטן יותר ויותר ככל שמאגרי הכיול הופכים לחומציים יותר. הדבר מאפשר יצירת עקומת כיול (איור 2B). לאחר מכן ניתן אינטרפולציית יחסי פלואורסצ'ין:TMR עבור pH מקרופינוסומלי(איור 2C).

אירועים חמצוניים בתוך מקרופאינום עשויים גם להשתנות עם סוג התא בשימוש. מומלץ לטעון את התאים עם H2DCFDA-dextran, ולעורר את האוקסידאז NADPH באמצעות פוטבול 12-myristate 13-אצטט (PMA) כמו שליטה חיובית (איור 3C). זה ייתן מושג טוב יותר על הטווח הדינמי של ה- assay ויאפשר התאמה של הגדרות המיקרוסקופ. כמו אירועים חמצוניים להתרחש בתוך macropinosomes, אות H2DCFDA יהפוך בהיר יותר ויותר. אות TMR עשוי להישאר קבוע או להשתנות בהתאם לגודל של macropinosome, כפי שנדון לעיל. היחס בין H2DCFDA:TMR יגדל בהדרגה וסביר להניח שיתייצב בתוך 20-30 הדקות הראשונות בתאי Raw264.7 מומתים(איור 3A,C).

בעת מדידת עיכול חלבון מקרופינוסומולי, אות פלואורסצנטי חזק בהדרגה ישוחרר עם הסגלגל מתעכל. בתאי Raw264.7, העלייה בפלואורסצנטיות המשתחררת מהסגלגלות המעוכלות המסומנות עם תווית BODIPY תעלה בתוך 30 הדקות הראשונות(איור 3B,D). כמו קודם, אות TMR עשוי להישאר קבוע או עשוי להשתנות בהתאם לגודל של macropinosome. כאשר השפלה של אובלבומין מתחילה מיד לאחר סגירת המקרופאינום, שליטה שלילית יכולה להיות שימושית בקביעת הטווח הדינמי של ה- assay. כדי לשים קץ, הידרולסות חומצה בתוך המקרופאינום יכולות להיות מעוכבות באמצעות מעכב של V-ATPase, כגון Concanamycin A (CcA) (איור 3D) או בפילומיצין A.

Figure 1
איור 1: עקרונות ההדמיה היחסית של פלואורופור כפול. (A-C). סריקות ספקטרליות (עירור קבוע, מגוון פליטה) של פלואורופורים רגישים ל- pH המושעים במאגרים של ה- pH המצוין. פלואורסצין, pHrodo, ו cypHer5e משמשים בדרך כלל כחיישנים של pH בבחינת התא. (D-F). סריקות ספקטרליות (עירור קבוע, מגוון פליטה) של פלואורופורים pH-רגישים תלויים במאגרים של ה- pH המצוין. צבעים שאינם משתנים עם pH עושים פלואורופורים התייחסות שימושית. פלואורסצין, אינם רגישים באופן אופטימלי בערכי החומציות החומציים יותר שחווים אנדוזומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מדידות דינמיות של pH macropinosomal. (A)תאים Raw264.7 נטענו עם פלואורסצאין שכותרתו 70 kDa dextran ו- TMR שכותרתו 70 kDa dextran ב 37 °C (500 ng/ mL של Lipopolysaccharide) במשך 15 דקות. הם גם דוגרו עם פלואורסצין שכותרתו 70 kDa dextran ו TMR-שכותרתו 70 kDa dextran ב 4 °C (7 °F) כפקד עבור כריכה לא ספציפית של dextran. Insets מציגים תאים בודדים (סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר). (B) בכיול במקום של Raw264.7 תאים עמוסים בדקסטרן 70 kDa המסומן עם תווית פלואורסצין וניז'ריצין עם תווית TMR של 70 kDa באמצעות K+- מאגרים עשירים ב- pH וניז'ריצין שצוינו. (C)pH מקרופאינום בתאי Raw264.7. Insets מייצגים את יחס פלואורסצן:TMR במקרופינוזומים בודדים. תיבות אפורות מציינות את הזמנים שבהם תאים נטענו ב- dextran. נתונים משני ניסויים עצמאיים שכל אחד מהם מכיל ≥ 80 תאים. נתונים המיוצגים כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידות דינמיות של אירועי חמצון ועיכול חלבונים בתוך הלומן של מקרופאינוזומים. (A)תאי Raw264.7 נטענו עם H2DCFDA שכותרתו 70 kDa dextran ו TMR-תווית 70 kDa dextran ב 37 °C (15 דקות), ואחריו מרדף של 45 דקות ב 37 °C (55 °F). Insets מציגים תמונות ביחס (H2DCFDA /TMR) של מקרופאינוזומים בודדים. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B)תאים Raw264.7 נטענו עם סגלגלים עם תווית BODIPY ו TMR-תווית 70 kDa dextran ב 37 °C (5 °F) במשך 15 דקות, ואחריו מרדף של 45 דקות ב 37 °C (77 °F). ערוץ TMR שימש ליצירת מסיכה, שהוחלה על ערוץ BODIPY. Insets מציגים תאים בודדים. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. (C)חמצון H2DCFDA בתוך לומן של מקרופאינום. תאים היו גם מגורה עם PMA כמו שליטה חיובית. תיבות אפורות מציינות את הזמנים שבהם תאים נטענו ב- dextran. נתונים משני ניסויים עצמאיים, שכל אחד מהם מכיל ≥ 80 תאים. נתונים המיוצגים כממוצע ± SEM. כל נקודת זמן הושוותה לפקד PMA. מבחן tשל סטודנט שימש לניתוח סטטיסטי. (D)השפלת אליבאומיום המסומנת על-ידי BODIPY בתוך מקרופאינום. Concanamycin A (CcA) שימש כשליטה שלילית כפי שהוא מונע את ההפעלה של הידרולסות חומצה זוהרת. נתונים משני ניסויים עצמאיים, שכל אחד מהם מכיל ≥ 80 תאים. נתונים המיוצגים כממוצע ± SEM. כל נקודת זמן הושוותה לפקד CcA. מבחן tשל סטודנט שימש לניתוח סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות שיש מספר פרוטוקולים למדידות תפוקה נמוכה וגבוהה של ספיגה מקרופינוציטית במקרופסגים, פיברובלסטים ואפילו Dictyostelium spp. 3,7,31,32,33,נעשו מעט מאוד ניסיונות למדוד את הביוכימיה הזוהרת של תאים דינמיים אלה. זה ככל הנראה בשל מחסור של בדיקות שניתן למקד ביעילות לתא המקרופינוסומול תוך הימנעות תאים אנדוציטיים אחרים. מתוארות כאן הטכניקות למקד בדיקות פלואורסצנטיות למדידה דינמית של pH, אירועים חמצוניים, ועיכול חלבון בתוך מקרופאינוזומים.

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות רצימטרית הייתה הטכניקה העיקרית שבאמצעותה נמדד pH אנדוסומאלי במשך עשרות שנים. פלואורסצ'ין נמצא בשימוש נרחב למדידת pH אנדוסומלי וממשיך להיות הפלואורופור המועדף שכן ה- pKשלו מאפשר מדידות מדויקות עם הטווח הטיפוסי של ערכי pH אנדוסומליים (~ pH 7.2-4.5). כאן, המחקר העסיק פלואורסצין מצומד ל-70 kDa dextran למדידות pH ספציפיות למקרופאינום. מגבלה של גישה זו היא תקופת הטעינה של 15 דקות dextran שבמהלכה לא ניתן להקליט pH מקרופינוסוal. תקופה זו נדרשת לטעון מספיק דקסטרן בצורת פלואורופור לתא המקרופינוסום, אך למעשה מונעת מדידות pH מוקדמות של מקרופאינום. עם זאת, אין בכך כדי למנוע קביעות של פרמטרים זוהרים שונים כגון יכולת האגירה, דליפת פרוטונים יחסית וכוח שאיבת V-ATPase, שכולם נגזרים ממדידות pH מקרופינוסום. כפי שמוצג באיור 1, ניתן להשתמש במספר פלואורופורים אחרים הרגישים ל-pH גם למדידת רמת החומציות, כולל pHrodo (pKa = 6.8) ו-CypHer5e (pKa = 7.3). עם זאת, מכיוון שיש להם pK a גבוהמשמעותית מאשר פלואורסצין, הם אינם אופטימליים למדידת pH אנדוסומלית בערכי חומציות יותר.

כמו macropinosomes הם אברונים דינמיים מאוד לעבור התכווצות משמעותית זמן קצר לאחר יצירת16,21, פלואורופור יחס פלואורופור פלואורסצנטי נדרש. שינויים בפלואורסצנטיות עקב שינויים בנפח של macropinosomes מתוקנים לשימוש פלואורופור התייחסות בכל ההסתה המוצגת.

אירועים חמצוניים בתאים נמדדו באמצעות מגוון רחב של בדיקות רגישות redox, כולל טטרזוליום חנקן (NBT), לומינול, ו- H2DCFDA. גישות מבוססות לומינול שימושיות במיוחד למדידת ייצור ROS באוכלוסיית תאים, אך קשה להסתגל למדידות ספציפיות לאברונים. NBT יוצר פיקדון בלתי מסיס שניתן לדמיין בקלות שנקרא formazan על חמצון אבל מטשטש אותות פלואורסצנטיים והוא גם לא ליניארי וקשה לוקליזציה. H2DCFDA משחרר אות פלואורסצנטי ליניארי על חמצון וניתן להטות בקלות למעקבים כגון dextran למדידות ספציפיות לאברונים. על ידי צירוף H2DCFDA ל- 70 kDa dextran, ניתן לדמיין אירועים חמצוניים בתוך מקרופאינוזומים בודדים (איור 3B). עם זאת, קיימת אזהרה לגישה זו. כמו H2DCFDA הוא צורה שונה של פלואורסצין, האות משוחרר הוא רגיש ל- pH. למרות הרווח פלואורסצנטיות על חמצון הוא גדול מספיק כדי להיות מזוהה, זה ללא ספק מוסווה על ידי לומן חומצי של macropinosome. גרסה pH-רגישה של H2DCFDA כבר זמין בעבר מסחרית והוא עדיף; עם זאת, בזמן הכנת כתב יד זה, מוצר זה כבר לא היה זמין מסחרית. ROS מתגלה כמולקולת איתות חשובה והיה מעורב בשיפוץ ממברנה, סחר באורגנילר, ולאחרונה בעיבוד החומר על ידי תאים המציגים אנטיגן להצגה לתאי T28,30. השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש לחקר התרומה של ייצור ROS מקרופינוסום לתהליכים פיזיולוגיים שונים אלה.

עיכול חלבונים במקרופינוזומים מעניין את חקר הצגת האנטיגן על ידי תאי מערכת החיסון, כמו גם את המחקר של רכישת חומרים מזינים על ידי תאים סרטניים. לדוגמה, עיכול חלבון אנדוסומאלי על ידי תאים דנדריטיים הוא האמין להגביל את מאגר הפפטידים זמין להצגה לתאי T על מולקולות היסטו-תאימות העיקרית. כמו macropinosomes הם מסלול מרכזי של רכישת אנטיגן, מדידות של עיכול חלבון macropinosomal עשוי לשמש כדי לחקור את המכונות המולקולריות האחראיות על מצגת אנטיגן כוונון עדין. מספר כלים זמינים מסחרית משמשים למדידת עיכול חלבונים בתאים אנדוסומאליים. בדיקות BSA ו- ovalbumin המסומנות ב- BODIPY, שהופכות לפלורסנט חזק עם העיכול, הוכיחו פופולריות במיוחד. הם מצמידים בקלות למעקבים אנדוציטיים וניתן לכוון אותם לתאים אנדוסומאליים ספציפיים, כגון פאגוזומים. הבדיקות, לעומת זאת, אינן מצמידות בקלות ל- dextran ולכן דורשות גישה של לוקליזציה משותפת. גישה זו גורמת לטעינת כל התאים האנוזומיים, כולל מקרופאינום, עם אליבאומיום המסומן על-ידי BODIPY, ומסכה משמשת למדידת ההשפלה הספציפית למקרופאינום. גישה זו דורשת רזולוציה טובה יותר ואינה מורחבת בקלות לניתוחים גדולים וגבוהים יותר. טכניקות כדי covalently זוג כלי השפלת חלבון ל 70 kDa dextran סביר להוכיח שימושי והם מפותחים כעת במעבדה שלנו.

כמו תחום של macropinocytosis ממשיך לגדול34, כלים למדידת דינמית הביוכימיה הזוהרת של מקרופאינוזומים, כולל pH, כימיה redox, עיכול חלבון, ריכוזי יונים, וכימיה שומנים יספק תובנה על הביולוגיה הייחודית של אברונים אלה המתפתחים במהירות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לאוניברסיטת קלגרי על תמיכתה. ברצוננו גם להודות לד"ר רובין ייטס על הגישה לריגנטים, ציוד ודיונים שימושיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black-walled 96 well plate PerkinElmer 6005430
CypHer5e, NHS ester Cytiva PA15401
Dextran-amino 70 kDa Invitrogen D1862
DQ-ovalbumin Invitrogen D12053
FITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1823
HBSS Gibco 14287
Nigericin Sigma Aldrich N7143
OxyBurst Green-SE Invitrogen D2935
pHrodo Red, SE Invitrogen P36600
Raw264.7 cells ATCC TIB-71
RPMI medium Gibco 11875093
SP5 Confocal Microscope Leica -
TRITC-dextran 70 kDa Invitrogen D1819
u-Dish Ibidi 81156

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  2. Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
  3. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
  4. Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
  5. Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
  6. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
  7. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
  8. Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  10. Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
  12. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
  13. Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
  14. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
  15. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
  16. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
  17. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
  18. Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
  19. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
  21. Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
  22. Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
  23. Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
  24. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  25. Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
  26. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
  27. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
  28. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
  29. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
  30. Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
  31. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
  32. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).
  33. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
  34. Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).

Tags

אימונולוגיה וזיהום בעיה 174 מקרופאינוציטוזיס מקרופאינוזום אנדוציטוזיס pH V-ATPase משאבת פרוטון מינים חמצן תגובתי ROS NADPH אוקסידאז פאגוציט מקרופאגיה תא דנדריטי
מדידת ה-pH, הכימיות האדומות והיכולת המשפילה של מקרופאינוזום באמצעות מיקרוסקופיה רציומטרית דו-פלואורופור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring… More

Wilkinson, L., Canton, J. Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy. J. Vis. Exp. (174), e62733, doi:10.3791/62733 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter